CN111195231A - 一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其包括如下操作步骤：1)用离子水浸泡防风，取上清液进行抽滤、浓缩，再加入无水乙醇沉淀，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；2)将大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和磷酸盐缓冲溶液，后经超声处理至乙醚挥发完全，得成品。本发明通过调整防风多糖脂质体的制备方法，有效提高了防风多糖的纯度和口服生物利用率，同时使其具有细胞穿透力强、易降解、稳定性好等优点，适用于作为禽流感疫苗的免疫增强剂，有效缓解禽流感疫苗的应激反应和弥补禽流感疫苗的免疫空白期。

Description

一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种免疫增强剂的制备方法。
背景技术
目前，市场上使用的禽流感疫苗大多为油乳剂灭活苗，其安全性好,不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型AIV的攻击，给免疫家禽群提供良好的免疫保护，但机体注射这种疫苗会产生强烈的应激反应。且灭活疫苗需要多次免疫才能够剌激机体产生保护性免疫，只接种一剂产生的保护性有限。另一方面，禽流感免疫空白期长，期间缺乏有效的免疫保护。
近代药理学研究结果表明，防风多糖在调节免疫、抗应激、抗病毒以及抗疲劳等方面发挥着重要作用。但目前传统的中药多糖制剂存在着对细胞穿透力弱、易被降解、口服生物利用度低以及稳定性差等缺陷。脂质体是由磷脂和胆固醇组成的，具有类似生物膜双分子层结构的超微球型载体，无害无毒、具有靶向释药、缓释以及生物组织相容性等优点。所以脂质体有望能够弥补玉屏风多糖的缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种防风多糖脂质体免疫剂的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其包括如下操作步骤：
1)用离子水浸泡防风0.5～1.5h，经超声处理，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩，再加入无水乙醇沉淀10～15h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；
2)将3～5:1的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，经减压旋转蒸发使容器内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和磷酸盐缓冲溶液，充分混匀得混合溶液，后经超声处理60～120s至乙醚挥发完全，得乳白色的成品。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)所述离子水与防风的添加量按质量份计为(8～12):1。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)所述超声处理为置于80～95℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)所述浓缩为抽滤后滤液体积的1/20。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中乙醚、防风多糖和磷酸盐缓冲溶液的添加量按质量份计为(8～10):15:100。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mg/mL。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述混合溶液的pH值为7.4。
本发明的有益效果是：本发明通过调整防风多糖脂质体的制备方法，有效提高了防风多糖的纯度和口服生物利用率，同时使其具有细胞穿透力强、易降解、稳定性好等优点，适用于作为禽流感疫苗的免疫增强剂，有效缓解禽流感疫苗的应激反应和弥补禽流感疫苗的免疫空白期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其包括如下操作步骤：
1)按质量份计为10:1用离子水浸泡防风1h，置于90℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩为抽滤后滤液体积的1/20，再加入无水乙醇沉淀12h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；
2)将4:1的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，经减压旋转蒸发使容器内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和浓度为10mg/mL的磷酸盐缓冲溶液，其中乙醚、防风多糖和磷酸盐缓冲溶液的添加量按质量份计为10:15:100，充分混匀得pH值为7.4的混合溶液，后经超声处理90s至乙醚挥发完全，得乳白色的实施例1成品。
对比例1
一种防风多糖制剂的制备方法，其包括如下操作步骤：按质量份计为10:1用离子水浸泡防风1h，置于90℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩为抽滤后滤液体积的1/20，再加入无水乙醇沉淀12h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得对比例1成品。
实施例2
一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其包括如下操作步骤：
1)按质量份计为8:1用离子水浸泡防风1.5h，置于80℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩为抽滤后滤液体积的1/20，再加入无水乙醇沉淀15h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；
2)将3:1的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，经减压旋转蒸发使容器内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和浓度为10mg/mL的磷酸盐缓冲溶液，其中乙醚、防风多糖和磷酸盐缓冲溶液的添加量按质量份计为8:15:100，充分混匀得pH值为7.4的混合溶液，后经超声处理120s至乙醚挥发完全，得乳白色的实施例2成品。
实施例3
一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其包括如下操作步骤：
1)按质量份计为12:1用离子水浸泡防风0.5h，置于95℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩为抽滤后滤液体积的1/20，再加入无水乙醇沉淀10h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；
2)将5:1的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，经减压旋转蒸发使容器内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和浓度为10mg/mL的磷酸盐缓冲溶液，其中乙醚、防风多糖和磷酸盐缓冲溶液的添加量按质量份计为9:15:100，充分混匀得pH值为7.4的混合溶液，后经超声处理60s至乙醚挥发完全，得乳白色的实施例3成品。
实施例4：效果试验
用实施例1成品、对比例1成品分别作为防风多糖脂质体组和防风多糖组，并引入空白对照组，将270只13日龄麻黄雏鸡随机分为3组，即防风多糖脂质体组、防风多糖组和空白对照组，每组90只。
试验开始时，肌肉注射禽流感病毒灭活疫苗，与此同时将防风多糖脂质体和防风多糖分别混于饲料给药，连续给药14d。每周检测禽流感的抗体效价，在试验第28d利用ELISA试剂盒检测外周血GM-CSF、G-CSF和M-CSF的质量浓度和流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和Bu-1+B淋巴细胞比例，其试验结果如下表1所示，表明防风多糖脂质体组集落刺激因子GM-CSF、G-CSF和M-CSF均显著高于防风多糖组和空白对照组。
表1各试验组相关项目的试验结果
Figure BDA0002380733260000041
Figure BDA0002380733260000051
注：同一列中，肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

Claims (7)

1.一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤：
1)用离子水浸泡防风0.5～1.5h，经超声处理，纱布过滤后沉淀完全，取上清液进行抽滤、浓缩，再加入无水乙醇沉淀10～15h，沉淀物经大孔树脂纯化后真空冷冻干燥，得防风多糖；
2)将3～5:1的大豆卵磷脂和胆固醇溶于氯仿，经减压旋转蒸发使容器内壁形成一层半透明的淡黄色脂质薄膜，加入乙醚溶解，在加入步骤1)所得的防风多糖和磷酸盐缓冲溶液，充分混匀得混合溶液，后经超声处理60～120s至乙醚挥发完全，得乳白色的成品。
2.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤1)所述离子水与防风的添加量按质量份计为8～12:1。
3.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤1)所述超声处理为置于80～95℃温度下通过超声机浸提60min并重复3次。
4.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤1)所述浓缩为抽滤后滤液体积的1/20。
5.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤2)中乙醚、防风多糖和磷酸盐缓冲溶液的添加量按质量份计为(8～10):15:100。
6.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种防风多糖脂质体免疫增强剂的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述混合溶液的pH值为7.4。
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