CN111190006A - 组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途。HDAC6作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物，可以评估腹透患者腹膜纤维化、血管新生、腹膜正常结构破坏、腹膜间皮细胞损伤以及腹膜炎症等病理改变，判断患者目前的腹膜结构和功能损伤程度，辅助临床诊断，可做到早期、全面、无创性检测，且所得的结果优于现有的腹膜功能检测手段。

Description

组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹 膜功能的标志物中的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种生物学标记物，具体来说是组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途。

背景技术

腹膜透析基于腹膜的半渗透性作用，通过腹腔透析液和毛细血管中溶质的扩散和水的渗透作用，达到清除体内代谢产物、毒性物质及纠正水、电解质平衡紊乱的目的。由于腹膜透析对血流动力学影响小、能有效地保护残余肾功能，并且具有操作简便、经济、患者生活质量高等优点，已成为终末期肾脏病患者的主要替代治疗方法之一。

腹膜是一薄层透明膜，主要由腹膜单层间皮细胞层以及间皮下区域组成。腹膜间皮下区域包括细胞外基质、纤维细胞、固有免疫细胞及毛细血管、淋巴管等结构。间皮细胞具有上皮细胞的形态功能特性，由其下的基底膜支撑，阻止其与间皮下的纤维细胞接触。然而，长期暴露于非生理性腹膜透析液中，低pH值、高糖、乳酸盐、葡萄糖降解产物、糖基化终末期产物会造成腹膜间皮细胞损伤及脱落，并刺激分泌大量炎症因子和促纤维化因子，导致腹膜炎症和腹膜纤维化的发生。同时，尿毒症患者自身的微炎症状态，毒素产物的蓄积以及营养不良等因素会进一步加重腹膜炎症反应。此外大量的腹膜新生血管形成及血管通透性增加，引起腹膜有效滤过表面积增加，提高小分子物质的转运率，导致葡萄糖的吸收速率加快，渗透压梯度迅速下降，继而出现超滤失败。因此，在临床长期腹膜透析过程中出现的腹膜间皮细胞损伤、炎症、纤维化、血管新生等病理过程，会造成腹膜正常结构和功能的破坏，导致腹膜超滤丧失及转运功能衰竭，最终迫使患者退出腹膜透析。

目前临床上对于长期腹膜透析患者所出现的腹膜纤维化、血管新生、腹膜正常结构破坏、腹膜间皮细胞损伤等病理改变并没有明确的检测方法和确诊依据，无法进行早期的损伤程度评估和干预治疗。当此类患者出现腹膜超滤衰竭时，其腹膜结构和功能已处于损伤后期，形成不可逆的腹膜病变，严重影响其生活质量和预后转归。因此，如何早期评估维持性腹膜透析患者腹膜功能及结构损伤程度是一个急需解决的临床问题。

既往研究已在腹透流出液中发现多个与腹膜功能和结构改变相关的指标，包括促腹膜纤维化因子TGF-β1、炎症指标IL-6、血管新生促进因子VEGF，以及与腹膜间皮细胞数量与功能密切相关的CA125指标。这些腹透流出液中检测到的指标含量，在一定条件下能反应腹膜功能和结构的损伤程度。

组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6) 是组蛋白去乙酰化酶家族中独具特色的一员。该酶具有两个去乙酰化功能区, 可特异性催化非组蛋白底物, 参与并调节众多生理或病理进程。HDAC6 具有独特的结构和底物特异性, 其表达和功能的改变与多种疾病密切相关。

在本发明中，我们着重关注HDAC6与腹透患者腹膜功能和结构损伤的相关性分析，以期望HDAC6能成为临床维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的非创伤性生物学标志物。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中对于评估维持性腹膜透析患者腹膜的功能和结构的损伤程度缺乏有效手段的技术问题。

本发明提供了组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途。

本发明以HDAC6作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物，弥补现有的诊断技术无法做到早期的腹膜功能检测，无法判断腹膜纤维化、血管新生、腹膜正常结构破坏、腹膜间皮细胞损伤等病理改变的具体进展程度，从而延误腹透患者相关并发症的最佳干预治疗时机。

HDAC6作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物，可以评估腹透患者腹膜纤维化、血管新生、腹膜正常结构破坏、腹膜间皮细胞损伤以及腹膜炎症等病理改变，判断患者目前的腹膜结构和功能损伤程度，辅助临床诊断、治疗及预后转归。

本发明收集临床并发腹膜炎的腹透患者腹膜组织标本，以及不同腹透龄的腹透流出液标本，进行生物学检测及相关性分析。结果证实HDAC6高表达于腹膜炎患者的腹膜组织中，并和纤维化指标α-SMA存在荧光共表达现象；腹透流出液的免疫印迹结果显示，HDAC6和纤维化指标Collagen I高表达于长期腹膜透析患者的腹透流出液中，并随着腹透龄的增加，HDAC6和Collagen I的含量也逐渐升高；使用ELISA试剂盒检测HDAC6及腹膜损伤相关细胞因子在腹透流出液中的含量，结果发现HDAC6和促纤维化因子TGF-β1、炎症指标IL-6、血管新生促进因子VEGF在腹透流出液中的含量都随着腹透龄的增加而升高，而腹膜间皮细胞标志物CA125的含量则随着腹透龄的增加而逐渐降低，其在大于3年腹透龄的流出液标本中的含量显著低于1年腹透龄以下的患者。

进一步对上述指标做统计学相关性分析，我们发现腹透流出液中HDAC6的含量与TGF-β1、VEGF、IL-6呈正相关，而与CA125呈负相关，分析结果都具有统计学差异性。故我们认为HDAC6与腹透患者腹膜纤维化、血管新生、腹膜间皮细胞损伤以及腹膜炎症密切相关，可以反应腹膜损伤的程度和病变进展，预测其腹膜功能。因此，HDAC6可以作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物。

与现有的腹膜平衡试验相比，腹膜平衡试验更侧重于腹膜滤过功能的检测，评估腹膜对葡萄糖和毒性物质的滤过功能，而无法检测腹膜其他病变程度。以HDAC6为生物学标志物，通过检测腹透流出液中其表达水平并做相关性分析，可以评估腹膜纤维化、血管新生、腹膜间皮细胞损伤以及腹膜炎症等腹膜病理损伤，从而更全面地评价腹透患者腹膜功能和组织病变，为临床医师提供更多有价值的诊断信息。同时，HDAC6的评估仅需收集部分腹透流出液即可完成检测，不会对患者造成有创性损伤，故以HDAC6作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物，可做到早期、全面、无创性检测，且所得的结果优于现有的腹膜功能检测手段。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明将HDAC6作为临床维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物，通过检测临床标本中HDAC6的含量，来预测患者的腹膜功能，评价腹膜纤维化、炎症、血管新生、腹膜间皮细胞损伤程度，并为临床诊断、治疗及预后转归的判断提供辅助性依据。

附图说明：

图1：HDAC6与α-SMA荧光共表达于腹膜炎患者腹膜组织。

图2：HDAC6与Collagen I高表达于临床腹膜透析患者腹透流出液中。

图3：随着腹透龄的增加，HDAC6、TGF-β1、IL-6、VEGF的表达逐渐升高，而CA125的表达逐渐降低。

图4：临床维持性腹膜透析患者腹透流出液中HDAC6的含量与TGF-β1、VEGF、IL-6呈正相关，而与CA125呈负相关。

具体实施方式

实施例1：材料与方法

筛选入组2017年至2019年间在上海市东方医院、上海市第一人民医院宝山分院和上海市松江区中心医院行腹膜透析的患者（腹透液为Baxter 1.5%或2.5%；腹膜透析稳定至少3个月；近1个月无腹膜炎或其他干扰疾病；完整的个人资料及实验室检查数据）。收集腹膜炎患者腹腔镜下撤管时留取的腹膜组织标本，免疫荧光共染色检测HDAC6与α-SMA的表达；收集不同腹透龄患者的腹透流出液标本，使用免疫印迹特异性抗体HDAC6、Collagen I、α-Tubulin检测相关蛋白表达水平；ELISA试剂盒检测不同腹透龄患者腹透流出液中HDAC6、TGF-β1、IL-6、VEGF、CA125的含量，并分别计算HDAC6与TGF-β1、HDAC6与IL-6、HDAC6与VEGF、HDAC6与CA125之间的相关性系数与差异p值。

实施例2：HDAC6与α-SMA荧光共表达于腹膜炎患者腹膜组织

腹膜炎患者腹膜组织免疫荧光共染色结果提示，α-SMA阳性的成纤维细胞高表达于腹膜组织中，且HDAC6的阳性表达主要定位于细胞核（图1）。将α-SMA和HDAC6的荧光染色做Overlay共定位分析后发现，α-SMA阳性的成纤维细胞其部分细胞核高表达HDAC6（箭头所指）。这提示HDAC6与腹膜纤维化相关，可以评估腹透患者腹膜纤维化病变程度。

实施例3：HDAC6与Collagen I高表达于临床腹膜透析患者腹透流出液中

收集不同腹透龄患者的腹透流出液标本进行免疫印迹检测，并根据灰度值进行柱形图量化计算。1年腹透龄及以下的患者其腹透流出液中HDAC6的含量处于较低水平，1年至3年腹透龄患者其HDAC6表达有大幅度升高，而3年以上的患者其表达量处于最高水平，是1年以下患者的5倍左右（图2A和2B）。同样，Collagen I的表达水平也随着腹透龄的增加而逐渐升高（图2A和2C）。以上结果再次证明，腹透流出液中HDAC6的水平可以反应腹膜纤维化程度，与纤维化指标变化趋势相一致。

实施例4：随着腹透龄的增加，HDAC6、TGF-β1、IL-6、VEGF的表达逐渐升高，而CA125的表达逐渐降低

进一步使用ELISA试剂盒检测腹透流出液中HDAC6及相关细胞因子的含量，并做不同腹透龄组间的统计学分析。数据分析结果证实HDAC6（图3A）、TGF-β1（图3B）、IL-6（图3C）、VEGF（图3D）四者在腹透流出液中的含量随着腹透龄的增加而逐渐升高，3年以上腹透龄的患者上述指标的含量显著高于另两组患者。而与腹膜间皮细胞密切相关的CA125指标，则随着腹透龄的增加而逐渐减少（图3E）。这部分结果提示腹透时间越长的患者，其腹膜纤维化、腹膜炎症、血管新生、腹膜间皮细胞损伤程度都更加严重，其腹膜功能进一步恶化。

实施例5：临床维持性腹膜透析患者腹透流出液中HDAC6的含量与TGF-β1、VEGF、IL-6呈正相关，而与CA125呈负相关

进一步对上述ELISA指标做相关性分析，明确HDAC6与相关损伤指标间的作用关系。统计学分析发现腹透流出液中HDAC6的含量与TGF-β1（图4A）、IL-6（图4B）、VEGF（图4C）呈正相关，而与CA125（图4D）呈负相关。这一结果再次肯定了HDAC6与腹膜损伤有直接相关性，可以作为维持性腹膜透析患者腹膜功能评估的新型生物学标志物。

Claims (1)

1.组蛋白去乙酰化酶6在制备用于评估维持性腹膜透析患者腹膜功能的标志物中的用途。

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