CN111187805A - 一种辅助突变引物的设计方法及其应用 - Google Patents

一种辅助突变引物的设计方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助突变引物的设计方法及其应用，该设计方法包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；从而使DNA聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了Bst DNAP olymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；使用该方法设计CYP2C19*2和CYP2C19*3基因检测的引物组，并将该引物组用于制备基因突变检测试剂盒。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。

Description

一种辅助突变引物的设计方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种辅助突变引物的设计方法及其应用。
背景技术
CYP2C19基因定位于人类10号染色体长臂第24区，基因长度约90.21Kb，含9个外显子和8个内含子，可编码由490个氨基酸组成的功能蛋白。CYP2C19基因具有高度的多态性，目前已经发现的有CYP2C19*2、*3、*4、*6、*9、*10、*17等多个突变等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3是中国人群中最主要的等位基因型。CYP2C19*2等位基因突变是指CYP2C19基因第5外显子681G>A突变，该突变引起转录过程中一段碱基序列的丢失，导致CYP2C19酶活降低。CYP2C19*3等位基因突变是CYP2C19基因第4外显子636G>A突变，该突变导致原本的色氨酸密码子突变为终止密码子，导致CYP2C19酶的合成提前终止。因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3的突变均会导致CYP2C19酶活性的降低或丧失，导致其代谢底物的能力减弱，从而引起相关药物代谢速率的个体化差异。
在人体中，CYP2C19参与的药物代谢主要包括：氯吡格雷、苯妥英、伏立康唑和安定等。氯吡格雷是一种前体药物，必须经过肝细胞色素P450酶(CYP450)代谢为活性物质，才能发挥其抗血小板聚集的作用。由于CYP2C19的基因多态性，患者对氯吡格雷的代谢能力也呈现个体化差异，弱代谢能力服用氯吡格雷则不能达到应有的疗效。因此，美国FDA建议在用药前对患者进行CYP2C19基因分型是非常必要的，对氯吡格雷弱代谢型患者建议采用其他抗凝血药物。苯妥英一种临床上常用的抗癫痫药，研究表明苯妥英的代谢能力与CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型密切相关。伏立康唑是一种广普型抗真菌药物，其代谢途径同样受CYP2C19调控，美国FDA批准的药物说明书中特别指出，在使用伏立康唑前需要对CYP2C19基因进行基因型检测，以确保安全用药。人体内60％的安定是通过N-去甲基代谢途径生成去甲安定，这一过程主要受CYP2C19和CYP3A调控。
综上所述，CYP2C19基因型的确定在多种药物选择或剂量确定方面具有非常显著的意义。然而目前CYP2C19基因型的检测多采用PCR荧光探针法、PCR毛细管电泳分析法和焦磷酸测序法等，普遍具有价格昂贵、耗时长、操作繁琐、对操作人员技能要求较高等不足，无法在基层医疗单位进行推广。环介导等温扩增技术(Loop-Mediated IsothermalAmplification,LAMP)由于其对检测设备的要求较低，操作简便，以及高灵敏度，目前已经广泛应用于病原微生物的检测中。近年来也研究报道利用LAMP法检测基因突变，但仍存在较为明显的不足。如专利文献CN 105861690 A利用肽核酸(PNA)制备的探针与DNA或RNA能够形成稳定的复合体，而单碱基突变能够引起该复合体较大Tm值变化的原理，与LAMP技术结合。但目前肽核酸合成技术仍不成熟，合成的PNA纯度一般仅能达到90％-95％，同时，肽核酸合成成本较高，合成50nmol的费用高达5000-6000元左右，检测费用高。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种辅助突变引物的设计方法，并使用该方法对CYP2C19-2和CYP2C19-3基因检测的引物组进行设计，将所得的引物组用于制备基因突变检测的试剂盒，解决现有的基因突变检测技术检测耗时长、费用高、设备依赖度高等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种辅助突变引物的设计方法，该方法主要包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；
所述的辅助突变引物为F3、B3、FIP或BIP中的任意一条；突变的碱基为A、T、C和G四种碱基中除自身以外的其他三种碱基的任意一种。
本发明还公开了一种采用上述方法设计得到的引物组，具体是：采用该方法用于设计CYP2C19*2和CYP2C19*3基因检测的引物组，所述的引物组为如下组合中的任一种：
F3-2和F3-3组合、F3-2和B3-3组合、F3-2和FIP-3组合、F3-2和BIP-3组合、B3-2和F3-3组合、B3-2和B3-3组合、B3-2和FIP-3组合、B3-2和BIP-3组合、FIP-2和F3-3组合、FIP-2和B3-3组合、FIP-2和FIP-3组合、FIP-2和BIP-3组合、BIP-2和F3-3组合、BIP-2和B3-3组合、BIP-2和FIP-3组合、BIP-2和BIP-3组合；
所述的F3-2包括A-CYP2C19*2-F3-W、A-CYP2C19*2-F3-M、A-CYP2C19*2-B3、A-CYP2C19*2-FIP、A-CYP2C19*2-BIP、A-CYP2C19*2-LF和A-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
A-CYP2C19*2-F3-W:5’-CACTATCATTGATTATTTCCDG-3’；
A-CYP2C19*2-F3-M:5’-CACTATCATTGATTATTTCCDA-3’；
A-CYP2C19*2-B3:5’-GTAAACACAAAACTAGTCAATGA-3’；
A-CYP2C19*2-FIP:5’-CATCGATTCTTGGTGTTCTTTTCCATAACAAATTACTTAAAAACCT-3’；
A-CYP2C19*2-BIP:5’-CCTCGGGACTTTATTGATTGCTCGCAAGCAGTCACATAACTAA-3’；
A-CYP2C19*2-LF:5’-TCTCCAAAATATCACTTTCCATA-3’；
A-CYP2C19*2-LB:5’-GGAGAAGGTAAAATGTTAACAAA-3’；
A-CYP2C19*2-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，A-CYP2C19*2-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的F3-3包括A-CYP2C19*3-F3-W、A-CYP2C19*3-F3-M、A-CYP2C19*3-B3、A-CYP2C19*3-FIP、A-CYP2C19*3-BIP、A-CYP2C19*3-LF、A-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
A-CYP2C19*3-F3-W:5’-GATTGTAAGCACCCCCTHG-3’；
A-CYP2C19*3-F3-M:5’-GATTGTAAGCACCCCCTHA-3’；
A-CYP2C19*3-B3:5’-CATTTCCTGTGCATAAAATAAAG-3’；
A-CYP2C19*3-FIP:5’-ATATAGAATTTTGGATTTCCCAGAACCAGGTAAGGCCAAGTTTTTT-3’；
A-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTTGCCATCTTTTCCAGATATTCA-3’；
A-CYP2C19*3-LF:5’-AGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3’；
A-CYP2C19*3-LB:5’-CAGTCTTGCCTAGACAGCC-3’；
A-CYP2C19*3-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，A-CYP2C19*3-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；
所述的B3-2包括B-CYP2C19*2-F3、B-CYP2C19*2-B3-W、B-CYP2C19*2-B3-M、B-CYP2C19*2-FIP、B-CYP2C19*2-BIP、B-CYP2C19*2-LF和B-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
B-CYP2C19*2-F3：5’-CTCAAATCTTGTATAATCAGAGA-3’；
B-CYP2C19*2-B3-W：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTCDC-3’；
B-CYP2C19*2-B3-M：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTCDT-3’；
B-CYP2C19*2-FIP:5’-GCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAACTACACATGTACAATAAAAATTTC-3’；
B-CYP2C19*2-BIP:5’-GTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTCAATGATAGTGGGAAAATTATTG-3’；
B-CYP2C19*2-LF：5’-TATAAATATAAATAAAATATATTGTATAT-3’；
B-CYP2C19*2-LB：5’-TAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGAT-3’；
B-CYP2C19*2-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，B-CYP2C19*2-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、T、G中的任意一个碱基；
所述的B3-3包括B-CYP2C19*3-F3、B-CYP2C19*3-B3-W、B-CYP2C19*3-B3-M、B-CYP2C19*3-FIP、B-CYP2C19*3-BIP、B-CYP2C19*3-LF、B-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
B-CYP2C19*3-F3:5’-CTAATGTTTACTCATATTTTAAAATT-3’；
B-CYP2C19*3-B3-W:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAVC-3’；
B-CYP2C19*3-B3-M:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAVT-3’；
B-CYP2C19*3-FIP:5’-GAGCAGATCACATTGCAGGGACCAATCATTTAGCTTCACCCT-3’；
B-CYP2C19*3-BIP:5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAAGGTGCTTACAATCCTGATGTT-3’；
B-CYP2C19*3-LF:5’-CAGCCCAGGATGAAAGTGG-3’；
B-CYP2C19*3-LB:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAAT-3’；
B-CYP2C19*3-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，B-CYP2C19*3-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基；
所述的FIP-2包括C-CYP2C19*2-F3、C-CYP2C19*2-B3、C-CYP2C19*2-FIP-W、C-CYP2C19*2-FIP-M、C-CYP2C19*2-BIP、C-CYP2C19*2-LF和C-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
C-CYP2C19*2-F3:5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAAT-3’；
C-CYP2C19*2-B3:5’-CAGTCACATAACTAAGCTTTTG-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-W:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCATTGATTATTTCCDG-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-M:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCATTGATTATTTCCDA-3’；
C-CYP2C19*2-BIP:5’-ACACCAAGAATCGATGGACATCACCTTCTCCATTTTGATCAGG-3’；
C-CYP2C19*2-LF:5’-GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTA-3’；
C-CYP2C19*2-LB:5’-CTCGGGACTTTATTGATTGCT-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，C-CYP2C19*2-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的FIP-3包括C-CYP2C19*3-F3、C-CYP2C19*3-B3、C-CYP2C19*3-FIP-W、C-CYP2C19*3-FIP-M、C-CYP2C19*3-BIP、C-CYP2C19*3-LF和C-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
C-CYP2C19*3-F3:5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACAT-3’；
C-CYP2C19*3-B3:5’-CCTGTGCATAAAATAAAGAACTT-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-W:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAAGCACCCCCTHG-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-M:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAAGCACCCCCTHA-3’；
C-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTCCATCTTTTCCAGATATTCACC-3’；
C-CYP2C19*3-LF:5’-GGAAGCAAAAAACTTGGCCTT-3’；
C-CYP2C19*3-LB:5’-CTACAGTCTTGCCTAGACAG-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，C-CYP2C19*3-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；
所述的BIP-2包括D-CYP2C19*2-F3、D-CYP2C19*2-B3、D-CYP2C19*2-FIP、D-CYP2C19*2-BIP-W、D-CYP2C19*2-BIP-M、D-CYP2C19*2-LF和D-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
D-CYP2C19*2-F3:5’-GAGAATTACTACACATGTACAAT-3’；
D-CYP2C19*2-B3:5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAA-3’；
D-CYP2C19*2-FIP:5’-GGTATAGATACAATATGCCAAGCTTCCCCATCAAGATATACAATATA-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-W:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAATTTGTTATGGGTTCDC-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-M:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAATTTGTTATGGGTTCDT-3’；
D-CYP2C19*2-LF:5’-GGTTGTAATTTAAAACTATAAATATA-3’；
D-CYP2C19*2-LB:5’-GCAATAATTTTCCCACTATCATT-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，D-CYP2C19*2-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的BIP-3包括D-CYP2C19*3-F3、D-CYP2C19*3-B3、D-CYP2C19*3-FIP、D-CYP2C19*3-BIP-W、D-CYP2C19*3-BIP-M、D-CYP2C19*3-LF和D-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
D-CYP2C19*3-F3：5’-TTCACCCTGTGATCCCACTT-3’；
D-CYP2C19*3-B3：5’-GTAAGTGGTTTCTCAGGAAGC-3’；
D-CYP2C19*3-FIP:5’-GCTGATCTTTATAATCGAAACGTTTCCTGGGCTGTGCTCCCT-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-W:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGGCCTTACCTGGAVC-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-M:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGGCCTTACCTGGAVT-3’；
D-CYP2C19*3-LF：5’-TGGAAAATAATGGAGCAGATCA-3’；
D-CYP2C19*3-LB：5’-AACATCAGGATTGTAAGCACC-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，D-CYP2C19*3-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基。
本发明还公开一种上述设计方法或引物组用于制备基因突变检测试剂盒的应用。
具体的，所述的试剂盒为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的试剂盒，所述的试剂盒包括权利要求2所述的引物组、Bst DNA Polymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；
所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
具体的，所述的16种引物组每一组中的F3的浓度与B3的浓度相同，为0.8～1.6μmol/L；LF和LB的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；FIP与BIP的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L。
具体的，所述的Bst DNA Polymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；
所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％。
具体的，所述的SYBR Green I浓度为1×～5×；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10～30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L。
具体的，所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过LAMP技术将待测碱基设计位于引物3’端，同时人为的突变待测碱基相邻位置的碱基，从而使DNA聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了Bst DNA Polymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；
(2)本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，因此，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放DNA即可作为模板进行扩增，不需采集血液标本。
(3)本发明无需进行DNA提取操作，口腔拭子经过煮沸即可作为模板，结合冷冻干燥技术，整个检测过程只需加入少量的口腔拭子粗提液和反应缓冲液即可，极大的简化了操作步骤。
(4)本发明的检测方法能够有效区分纯合突变、纯合正常、杂合突变，并且对检测设备没有特殊要求，仅需一台水浴锅或其他能够提供恒温条件的设备和一台蓝光灯即可。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。
附图说明
图1为本发明试剂盒在检测过程中检测点突变示意图。A：野生型引物可以扩增野生型模板；B：突变型引物不能扩增野生型模板；C：野生型引物不能扩增突变型模板；D：突变型引物可以扩增突变型模板。
图2是实施例1的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图3是实施例2的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：B-CYP2C19*3-B3-W扩增CYP2C19*3-G；D：B-CYP2C19*3-B3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：B-CYP2C19*3-B3-W扩增样品。
图4是实施例3的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：C-CYP2C19*3-FIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增样品。
图5是实施例4的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：D-CYP2C19*3-BIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增样品。
图6是实施例5的检测结果图。A：B-CYP2C19*2-B3-W扩增CYP2C19*2-G；B：B-CYP2C19*2-B3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：B-CYP2C19*2-B3-W扩增样品；F：B-CYP2C19*2-B3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图7是实施例6的检测结果图。A：B-CYP2C19*2-B3-W扩增CYP2C19*2-G；B：B-CYP2C19*2-B3-M扩增CYP2C19*2-A；C：B-CYP2C19*3-B3-W扩增CYP2C19*3-G；D：B-CYP2C19*3-B3-M扩增CYP2C19*3-A；E：B-CYP2C19*2-B3-W扩增样品；F：B-CYP2C19*2-B3-M扩增样品；G：B-CYP2C19*3-B3-W扩增样品。
图8是实施例7的检测结果图。A：B-CYP2C19*2-B3-W扩增CYP2C19*2-G；B：B-CYP2C19*2-B3-M扩增CYP2C19*2-A；C：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：C-CYP2C19*3-FIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：B-CYP2C19*2-B3-W扩增样品；F：B-CYP2C19*2-B3-M扩增样品；G：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增样品。
图9是实施例8的检测结果图。A：B-CYP2C19*2-B3-W扩增CYP2C19*2-G；B：B-CYP2C19*2-B3-M扩增CYP2C19*2-A；C：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：D-CYP2C19*3-BIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：B-CYP2C19*2-B3-W扩增样品；F：B-CYP2C19*2-B3-M扩增样品；G：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增样品。
图10是实施例9的检测结果图。A：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增样品；F：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图11是实施例10的检测结果图。A：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：B-CYP2C19*3-B3-W扩增CYP2C19*3-G；D：B-CYP2C19*3-B3-M扩增CYP2C19*3-A；E：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增样品；F：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增样品；G：B-CYP2C19*3-B3-W扩增样品。
图12是实施例11的检测结果图。A：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：C-CYP2C19*3-FIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增样品；F：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增样品；G：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增样品。
图13是实施例12的检测结果图。图9是实施例8的检测结果图。A：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：D-CYP2C19*3-BIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：C-CYP2C19*2-FIP-W扩增样品；F：C-CYP2C19*2-FIP-M扩增样品；G：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增样品。
图14是实施例13的检测结果图。A：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增样品；F：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图15是实施例14的检测结果图。A：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：B-CYP2C19*3-B3-W扩增CYP2C19*3-G；D：B-CYP2C19*3-B3-M扩增CYP2C19*3-A；E：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增样品；F：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增样品；G：B-CYP2C19*3-B3-W扩增样品。
图16是实施例15的检测结果图。A：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：C-CYP2C19*3-FIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增样品；F：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增样品；G：C-CYP2C19*3-FIP-W扩增样品。
图17是实施例16的检测结果图。A：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增CYP2C19*2-G；B：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增CYP2C19*2-A；C：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增CYP2C19*3-G；D：D-CYP2C19*3-BIP-M扩增CYP2C19*3-A；E：D-CYP2C19*2-BIP-W扩增样品；F：D-CYP2C19*2-BIP-M扩增样品；G：D-CYP2C19*3-BIP-W扩增样品。
图18是实施例17的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图19是实施例18的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品。
图20是实施例19的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品；a：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-A；b：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-G；c：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-A；d：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-G；h：A-CYP2C19*3-F3-M扩增样品。
图21是实施例20的检测结果图。A：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-G；B：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-A；C：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-G；D：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-A；E：A-CYP2C19*2-F3-W扩增样品；F：A-CYP2C19*2-F3-M扩增样品；G：A-CYP2C19*3-F3-W扩增样品；a：A-CYP2C19*2-F3-W扩增CYP2C19*2-A；b：A-CYP2C19*2-F3-M扩增CYP2C19*2-G；c：A-CYP2C19*3-F3-W扩增CYP2C19*3-A；d：A-CYP2C19*3-F3-M扩增CYP2C19*3-G；h：A-CYP2C19*3-F3-M扩增样品。
具体实施方式
本发明的提出的辅助突变引物的设计方法，包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；本发明方法中的辅助突变引物为F3、B3、FIP或BIP中的任意一条；突变的碱基为A、T、C和G四种碱基中除自身以外的其他三种碱基的任意一种。图1所示为本发明的检测点突变示意图，辅助突变碱基在辅助突变引物3’端第二个碱基上，得到的引物在扩增过程中即可准确识别位于引物3’端的待测碱基。
本发明中用于检测未反生突变的扩增引物称为野生型引物，用W表示，如CYP2C19*2-F3-W表示检测CYP2C19*2野生型引物。用于检测发生突变的扩增引物称为突变型引物。辅助突变碱基在野生型引物和突变型引物中均存在，且为同一碱基，可以是除本身碱基以外的其他三种碱基，如本身为A，则可以是T、C或G。
本发明中，以F3-2进行说明，F3-2中的CYP2C19*2-B3、CYP2C19*2-FIP、CYP2C19*2-BIP、CYP2C19*2-LF和CYP2C19*2-LB是当突变引物为F3时检测CYP2C19*2基因型的其他共用引物，即F3-W和F3-M共用这五种引物，F3-3、B3-2、B3-3、FIP-2、FIP-3、BIP-2、BIP-3的情况相同，文中将不再赘述。
基于上述基因设计方法，以下以CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突变检测为例，对CYP2C19*2和CYP2C19*3引物的设计进行详细说明，需要说明的是本发明方法并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例公开的试剂盒包括：Bst DNA Polymerase、dNTP、引物组、缓冲液、指示剂和添加剂；其中，Bst DNA Polymerase为0.32U/μl，dNTP为1.4mmol/L，缓冲液由20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、50mmol/L KCl、质量份数为0.1％的Tween-20、8mmol/LMgSO4组成，指示剂为2×SYBR Green I，添加剂由0.1mmol/L海藻糖和0.5mg/ml BSA组成。
本实施例的引物组为F3-2和F3-3组合，该引物组中F3-W、F3-M、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
使用本实施例的试剂盒检测CYP2C19-2和CYP2C19-3基因，具体包括：
首选，制备DNA模板：将口腔拭子放入TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mMEDTA)中涡旋震荡1min，100℃加热5min，取5μl作为LAMP扩增的模板。
阳性对照的制备：分别将CYP2C19-2(A)、CYP2C19-2(G)、CYP2C19-3(A)和CYP2C19-3(G)连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，即为阳性对照。
将制备的待测模板加入到LAMP反应体系中，并以含有CYP2C19-2(A)、CYP2C19-2(G)、CYP2C19-3(A)和CYP2C19-3(G)的pUC57质粒作为阳性对照，以无菌超纯水作为阴性对照。整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec(采集荧光)，共反应60个循环；然后85℃反应5min，荧光通道选择SYBR Green I。
本实施例的检测结果如图2所示，从图2可以看出，A-CYP2C19*2-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，A-CYP2C19*2-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，A-CYP2C19*3-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，A-CYP2C19*3-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例2
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和B3-3组合，该引物组中，F3-W、F3-M、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图3所示，从图3可以看出，A-CYP2C19*2-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，A-CYP2C19*2-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，B-CYP2C19*3-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，B-CYP2C19*3-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例3
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3-W、F3-M、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图4所示，从图4可以看出，A-CYP2C19*2-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，A-CYP2C19*2-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，C-CYP2C19*3-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，C-CYP2C19*3-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例4
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3-W、F3-M、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图5所示，从图5可以看出，A-CYP2C19*2-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，A-CYP2C19*2-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，D-CYP2C19*3-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，D-CYP2C19*3-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例5
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3-W、F3-M、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图6所示，从图6可以看出，B-CYP2C19*2-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，B-CYP2C19*2-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，A-CYP2C19*3-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，A-CYP2C19*3-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例6
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图7所示，从图7可以看出，B-CYP2C19*2-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，B-CYP2C19*2-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，B-CYP2C19*3-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，B-CYP2C19*3-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例7
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图8所示，从图8可以看出，B-CYP2C19*2-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，B-CYP2C19*2-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，C-CYP2C19*3-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，C-CYP2C19*3-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例8
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图9所示，从图9可以看出，B-CYP2C19*2-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，B-CYP2C19*2-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，D-CYP2C19*3-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，D-CYP2C19*3-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例9
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3-W、F3-M、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图10所示，从图10可以看出，C-CYP2C19*2-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，C-CYP2C19*2-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，A-CYP2C19*3-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，A-CYP2C19*3-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例10
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图11所示，从图11可以看出，C-CYP2C19*2-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，C-CYP2C19*2-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，B-CYP2C19*3-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，B-CYP2C19*3-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例11
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图12所示，从图12可以看出，C-CYP2C19*2-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，C-CYP2C19*2-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，C-CYP2C19*3-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，C-CYP2C19*3-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例12
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图13所示，从图13可以看出，C-CYP2C19*2-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，C-CYP2C19*2-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，D-CYP2C19*3-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，D-CYP2C19*3-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例13
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图14所示，从图14可以看出，D-CYP2C19*2-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，D-CYP2C19*2-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，A-CYP2C19*3-F3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，A-CYP2C19*3-F3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例14
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图15所示，从图15可以看出，D-CYP2C19*2-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，D-CYP2C19*2-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，B-CYP2C19*3-B3-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，B-CYP2C19*3-B3-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例15
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图16所示，从图16可以看出，D-CYP2C19*2-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，D-CYP2C19*2-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，C-CYP2C19*3-FIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，C-CYP2C19*3-FIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
实施例16
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为F3-2和FIP-3组合，该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测结果如图17所示，从图17可以看出，D-CYP2C19*2-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*2-G，D-CYP2C19*2-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*2-A，D-CYP2C19*3-BIP-W能够特异性扩增CYP2C19*3-G，D-CYP2C19*3-BIP-M能够特异性扩增CYP2C19*3-A。同时，检测样品的结果显示其CYP2C19*2基因型为GA，而CYP2C19*3基因型为GG。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.1mol/L海藻糖。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图18所示，单独使用0.1mol/L时对LAMP扩增具有一定程度的抑制作用。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.5mg/ml BSA。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图19所示，单独使用0.5mg/ml BSA时对LAMP扩增具有一定程度的抑制作用。
综合实施例1、对比例1与对比例2的检测结果可以看出，在单独使用海藻糖和BSA的时候对反应也轻微的抑制作用。但是，当海藻糖和BSA联合使用的时候未表现出抑制作用。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，F3-2和F3-3组合形成的引物组中无辅助突变碱基，其与引物与实施例1相同，即：
CYP2C19*2-F3-W:CACTATCATTGATTATTTCCCG；
CYP2C19*2-F3-M:CACTATCATTGATTATTTCCCA；
CYP2C19*3-F3-W:GATTGTAAGCACCCCCTGG；
CYP2C19*3-F3-M:GATTGTAAGCACCCCCTGA；
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图20所示。可以看出，没有辅助突变碱基的引物完全不能区分野生型和突变型；当辅助突变碱基与待测位点相邻时，野生型引物仅扩增野生型模板，突变型引物仅扩增突变型模板，可以显著区分野生型和突变型。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，F3-2和F3-3组合形成的引物组中辅助突变碱基的位置为：
CYP2C19*2-F3-W:CACTATCATTGATTATTTCDCG；
CYP2C19*2-F3-M:CACTATCATTGATTATTTCDCA；
CYP2C19*3-F3-W:GATTGTAAGCACCCCCTGG；
CYP2C19*3-F3-M:GATTGTAAGCACCCCCTGA；
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图21所示。可以看出，当辅助突变碱基与待测位点相隔1-2个碱基的时候，野生型引物对突变型模板的扩增效率降低了100～1000倍，但体现在时间间隔上仅有5～10min，不利于区分两种基因型。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>一种辅助突变引物的设计方法及其应用
<160>
<210> 1
<211> 22
<212> CYP2C19*2-F3-W-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cactatcattgattatttccdg-3'
<210> 2
<211> 22
<212> CYP2C19*2-F3-M-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cactatcattgattatttccda-3'
<210> 3
<211> 23
<212> CYP2C19*2-B3-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gtaaacacaaaactagtcaatga-3'
<210> 4
<211> 46
<212> CYP2C19*2-FIP-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-catcgattcttggtgttcttttccataacaaattacttaaaaacct-3'
<210> 5
<211> 43
<212> CYP2C19*2-BIP-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cctcgggactttattgattgctcgcaagcagtcacataactaa-3'
<210> 6
<211> 23
<212> CYP2C19*2-LF-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-tctccaaaatatcactttccata-3'
<210> 7
<211> 23
<212> CYP2C19*2-LB-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ggagaaggtaaaatgttaacaaa-3'
<210> 8
<211> 19
<212> CYP2C19*3-F3-W-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gattgtaagcacccccthg-3'
<210> 9
<211> 19
<212> CYP2C19*3-F3-M-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gattgtaagcaccccctha-3'
<210> 10
<211> 23
<212> CYP2C19*3-B3-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-catttcctgtgcataaaataaag-3'
<210> 11
<211> 46
<212> CYP2C19*3-FIP-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-atatagaattttggatttcccagaaccaggtaaggccaagtttttt-3'
<210> 12
<211> 44
<212> CYP2C19*3-BIP-1
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gaccaagccctgaagtacattttgccatcttttccagatattca-3'
<210> 13
<211> 21
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<213> DNA
<220>
<400>
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<211> 19
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<213> DNA
<220>
<400>
5'-cagtcttgcctagacagcc-3'
<210> 15
<211> 23
<212> CYP2C19*2-F3-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ctcaaatcttgtataatcagaga-3'
<210> 16
<211> 23
<212> CYP2C19*2-B3-W-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-taagtaatttgttatgggttcdc-3'
<210> 17
<211> 23
<212> CYP2C19*2-B3-M-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-taagtaatttgttatgggttcdt-3'
<210> 18
<211> 47
<212> CYP2C19*2-FIP-2
<220>
<400>
5'-gccaagctctggttgtaatttaactacacatgtacaataaaaatttc-3'
<210> 19
<211> 49
<212> CYP2C19*2-BIP-2
<220>
<400>
5'-gtatctatacctttattaaatgctttcaatgatagtgggaaaattattg-3'
<210> 20
<211> 29
<212> CYP2C19*2-LF-2
<220>
<400>
5'-tataaatataaataaaatatattgtatat-3'
<210> 21
<211> 21
<212> CYP2C19*2-LB-2
<220>
<400>
5'-taataaattattgttttctcttagat-3'
<210> 22
<211> 26
<212> CYP2C19*3-F3-2
<220>
<400>
5'-ctaatgtttactcatattttaaaatt-3'
<210> 23
<211> 20
<212> CYP2C19*3-B3-W-2
<220>
<400>
5'-aacttggccttacctggavc-3'
<210> 24
<211> 29
<212> CYP2C19*3-B3-M-2
<220>
<400>
5'-aacttggccttacctggavt-3'
<210> 25
<211> 42
<212> CYP2C19*3-FIP-2
<220>
<400>
5'-gagcagatcacattgcagggaccaatcatttagcttcaccct-3'
<210> 26
<211> 45
<212> CYP2C19*3-BIP-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cgtttcgattataaagatcagcaaggtgcttacaatcctgatgtt-3'
<210> 27
<211> 19
<212> CYP2C19*3-LF-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cagcccaggatgaaagtgg-3'
<210> 28
<211> 24
<212> CYP2C19*3-LB-2
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cttaacttgatggaaaaattgaat-3'
<210> 29
<211> 24
<212> CYP2C19*2-F3-3
<213> DNA
<220>
<400>
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<210> 30
<211> 22
<212> CYP2C19*2-B3-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cagtcacataactaagcttttg-3'
<210> 31
<211> 46
<212> CYP2C19*2-FIP-W-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ctttctccaaaatatcactttccacactatcattgattatttccdg-3'
<210> 32
<211> 46
<212> CYP2C19*2-FIP-M-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ctttctccaaaatatcactttccacactatcattgattatttccda-3'
<210> 33
<211> 43
<212> CYP2C19*2-BIP-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-acaccaagaatcgatggacatcaccttctccattttgatcagg-3'
<210> 34
<211> 24
<212> CYP2C19*2-LF-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gcaaggtttttaagtaatttgtta-3'
<210> 35
<211> 21
<212> CYP2C19*2-LB-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ctcgggactttattgattgct-3'
<210> 36
<211> 24
<212> CYP2C19*3-F3-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gatggaaaaattgaatgaaaacat-3'
<210> 37
<211> 23
<212> CYP2C19*3-B3-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cctgtgcataaaataaagaactt-3'
<210> 38
<211> 43
<212> CYP2C19*3-FIP-W-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ttcccagaaaaaaagactgtaagtgattgtaagcacccccthg-3'
<210> 39
<211> 43
<212> CYP2C19*3-FIP-M-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ttcccagaaaaaaagactgtaagtgattgtaagcaccccctha-3'
<210> 40
<211> 44
<212> CYP2C19*3-BIP-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gaccaagccctgaagtacatttccatcttttccagatattcacc-3'
<210> 41
<211> 21
<212> CYP2C19*3-LF-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ggaagcaaaaaacttggcctt-3'
<210> 42
<211> 20
<212> CYP2C19*3-LB-3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-ctacagtcttgcctagacag-3'
<210> 43
<211> 23
<212> CYP2C19*2-F3-4
<220>
<400>
5'-gagaattactacacatgtacaat-3'
<210> 44
<211> 23
<212> CYP2C19*2-B3-4
<220>
<400>
5'-ctccaaaatatcactttccataa-3'
<210> 45
<211> 47
<212> CYP2C19*2-FIP-4
<220>
<400>
5'-ggtatagatacaatatgccaagcttccccatcaagatatacaatata-3'
<210> 46
<211> 50
<212> CYP2C19*2-BIP-W-4
<220>
<400>
5'-tttaataaattattgttttctcttagataagtaatttgttatgggttcdc-3'
<210> 47
<211> 50
<212> CYP2C19*2-BIP-M-4
<220>
<400>
5'-tttaataaattattgttttctcttagataagtaatttgttatgggttcdt-3'
<210> 48
<211> 26
<212> CYP2C19*2-LF-4
<220>
<400>
5'-ggttgtaatttaaaactataaatata-3'
<210> 49
<211> 23
<212> CYP2C19*2-LB-4
<220>
<400>
5'-gcaataattttcccactatcatt-3'
<210> 50
<211> 20
<212> CYP2C19*3-F3-4
<220>
<400>
5'-ttcaccctgtgatcccactt-3'
<210> 51
<211> 21
<212> CYP2C19*3-B3-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gtaagtggtttctcaggaagc-3'
<210> 52
<211> 42
<212> CYP2C19*3-FIP-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-gctgatctttataatcgaaacgtttcctgggctgtgctccct-3'
<210> 53
<211> 45
<212> CYP2C19*3-BIP-W-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cttaacttgatggaaaaattgaatgaacttggccttacctggavc-3'
<210> 54
<211> 45
<212> CYP2C19*3-BIP-M-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-cttaacttgatggaaaaattgaatgaacttggccttacctggavt-3'
<210> 55
<211> 22
<212> CYP2C19*3-LF-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-tggaaaataatggagcagatca-3'
<210> 56
<211> 21
<212> CYP2C19*3-LB-4
<213> DNA
<220>
<400>
5'-aacatcaggattgtaagcacc-3'
<210> 57
<211> 620
<212> CYP2C19*2-G
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AGATGCTTTTATACTATCAAAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATCTTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTTGCGTATTTGTGATTCATTGACTAGTTTTGTGTTTACTACGGATGTTTAACAGGTCAAGGAGTAATGCTTGAGAAGCATATTTAAGTTTTTATTGTATGCATGAATATCCAGTAAGCATCATAGAAAATGTAAAATTAAATTGTTAAATAAT-3'
<210> 58
<211> 620
<212> CYP2C19*2-A
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AGATGCTTTTATACTATCAAAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATCTTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTTGCGTATTTGTGATTCATTGACTAGTTTTGTGTTTACTACGGATGTTTAACAGGTCAAGGAGTAATGCTTGAGAAGCATATTTAAGTTTTTATTGTATGCATGAATATCCAGTAAGCATCATAGAAAATGTAAAATTAAATTGTTAAATAAT-3'
<210> 59
<211> 621
<212> CYP2C19*3-G
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AAAGTGATGTGTTGATTTTATGCATGCCAAACTCTTTTTTGCTTTTAAGGGAATTCATAGGTAAGATATTACTTAAAATTTCTAAACTATTATTATCTGTTAACAAATATGAAGTGTTTTATATCTAATGTTTACTCATATTTTAAAATTGTTTCCAATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACATTTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCATGGGGTGAATATCTGGAAAAGATGGCAAAGTTCTTTATTTTATGCACAGGAAATGAATATCCCAATATAGATCAGGCTTCTAAGCCCATTAGCTCCCTGATCAGTGTTTTTTCCACTAAACTCCAAAGCCCTGTTTCTATAAAGTACTTTGGTGACAGCCCCAAAGCGT-3'
<210> 60
<211> 621
<212> CYP2C19*3-A
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AAAGTGATGTGTTGATTTTATGCATGCCAAACTCTTTTTTGCTTTTAAGGGAATTCATAGGTAAGATATTACTTAAAATTTCTAAACTATTATTATCTGTTAACAAATATGAAGTGTTTTATATCTAATGTTTACTCATATTTTAAAATTGTTTCCAATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGAATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACATTTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCATGGGGTGAATATCTGGAAAAGATGGCAAAGTTCTTTATTTTATGCACAGGAAATGAATATCCCAATATAGATCAGGCTTCTAAGCCCATTAGCTCCCTGATCAGTGTTTTTTCCACTAAACTCCAAAGCCCTGTTTCTATAAAGTACTTTGGTGACAGCCCCAAAGCGT-3'

Claims (8)

1.一种辅助突变引物的设计方法，其特征在于，包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；
所述的辅助突变引物为F3、B3、FIP或BIP中的任意一条；突变的碱基为A、T、C和G四种碱基中除自身以外的其他三种碱基的任意一种。
2.一种采用权利要求1所述的方法设计得到的引物组，其特征在于，采用该方法用于设计CYP2C19*2和CYP2C19*3基因检测的引物组，所述的引物组为如下组合中的任一种：
F3-2和F3-3组合、F3-2和B3-3组合、F3-2和FIP-3组合、F3-2和BIP-3组合、B3-2和F3-3组合、B3-2和B3-3组合、B3-2和FIP-3组合、B3-2和BIP-3组合、FIP-2和F3-3组合、FIP-2和B3-3组合、FIP-2和FIP-3组合、FIP-2和BIP-3组合、BIP-2和F3-3组合、BIP-2和B3-3组合、BIP-2和FIP-3组合、BIP-2和BIP-3组合；
所述的F3-2包括A-CYP2C19*2-F3-W、A-CYP2C19*2-F3-M、A-CYP2C19*2-B3、A-CYP2C19*2-FIP、A-CYP2C19*2-BIP、A-CYP2C19*2-LF和A-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
A-CYP2C19*2-F3-W:5’-CACTATCATTGATTATTTCCDG-3’；
A-CYP2C19*2-F3-M:5’-CACTATCATTGATTATTTCCDA-3’；
A-CYP2C19*2-B3:5’-GTAAACACAAAACTAGTCAATGA-3’；
A-CYP2C19*2-FIP:5’-CATCGATTCTTGGTGTTCTTTTCCATAACAAATTACTTAAAAACCT-3’；
A-CYP2C19*2-BIP:5’-CCTCGGGACTTTATTGATTGCTCGCAAGCAGTCACATAACTAA-3’；
A-CYP2C19*2-LF:5’-TCTCCAAAATATCACTTTCCATA-3’；
A-CYP2C19*2-LB:5’-GGAGAAGGTAAAATGTTAACAAA-3’；
A-CYP2C19*2-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，A-CYP2C19*2-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的F3-3包括A-CYP2C19*3-F3-W、A-CYP2C19*3-F3-M、A-CYP2C19*3-B3、A-CYP2C19*3-FIP、A-CYP2C19*3-BIP、A-CYP2C19*3-LF、A-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
A-CYP2C19*3-F3-W:5’-GATTGTAAGCACCCCCTHG-3’；
A-CYP2C19*3-F3-M:5’-GATTGTAAGCACCCCCTHA-3’；
A-CYP2C19*3-B3:5’-CATTTCCTGTGCATAAAATAAAG-3’；
A-CYP2C19*3-FIP:5’-ATATAGAATTTTGGATTTCCCAGAACCAGGTAAGGCCAAGTTTTTT-3’；
A-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTTGCCATCTTTTCCAGATATTCA-3’；
A-CYP2C19*3-LF:5’-AGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3’；
A-CYP2C19*3-LB:5’-CAGTCTTGCCTAGACAGCC-3’；
A-CYP2C19*3-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，A-CYP2C19*3-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；
所述的B3-2包括B-CYP2C19*2-F3、B-CYP2C19*2-B3-W、B-CYP2C19*2-B3-M、B-CYP2C19*2-FIP、B-CYP2C19*2-BIP、B-CYP2C19*2-LF和B-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
B-CYP2C19*2-F3：5’-CTCAAATCTTGTATAATCAGAGA-3’；
B-CYP2C19*2-B3-W：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTCDC-3’；
B-CYP2C19*2-B3-M：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTCDT-3’；
B-CYP2C19*2-FIP:5’-GCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAACTACACATGTACAATAAAAATTTC-3’；
B-CYP2C19*2-BIP:5’-GTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTCAATGATAGTGGGAAAATTATTG-3’；
B-CYP2C19*2-LF：5’-TATAAATATAAATAAAATATATTGTATAT-3’；
B-CYP2C19*2-LB：5’-TAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGAT-3’；
B-CYP2C19*2-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，B-CYP2C19*2-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、T、G中的任意一个碱基；
所述的B3-3包括B-CYP2C19*3-F3、B-CYP2C19*3-B3-W、B-CYP2C19*3-B3-M、B-CYP2C19*3-FIP、B-CYP2C19*3-BIP、B-CYP2C19*3-LF、B-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
B-CYP2C19*3-F3:5’-CTAATGTTTACTCATATTTTAAAATT-3’；
B-CYP2C19*3-B3-W:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAVC-3’；
B-CYP2C19*3-B3-M:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAVT-3’；
B-CYP2C19*3-FIP:5’-GAGCAGATCACATTGCAGGGACCAATCATTTAGCTTCACCCT-3’；
B-CYP2C19*3-BIP:5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAAGGTGCTTACAATCCTGATGTT-3’；
B-CYP2C19*3-LF:5’-CAGCCCAGGATGAAAGTGG-3’；
B-CYP2C19*3-LB:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAAT-3’；
B-CYP2C19*3-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，B-CYP2C19*3-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基；
所述的FIP-2包括C-CYP2C19*2-F3、C-CYP2C19*2-B3、C-CYP2C19*2-FIP-W、C-CYP2C19*2-FIP-M、C-CYP2C19*2-BIP、C-CYP2C19*2-LF和C-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
C-CYP2C19*2-F3:5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAAT-3’；
C-CYP2C19*2-B3:5’-CAGTCACATAACTAAGCTTTTG-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-W:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCATTGATTATTTCCDG-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-M:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCATTGATTATTTCCDA-3’；
C-CYP2C19*2-BIP:5’-ACACCAAGAATCGATGGACATCACCTTCTCCATTTTGATCAGG-3’；
C-CYP2C19*2-LF:5’-GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTA-3’；
C-CYP2C19*2-LB:5’-CTCGGGACTTTATTGATTGCT-3’；
C-CYP2C19*2-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，C-CYP2C19*2-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的FIP-3包括C-CYP2C19*3-F3、C-CYP2C19*3-B3、C-CYP2C19*3-FIP-W、C-CYP2C19*3-FIP-M、C-CYP2C19*3-BIP、C-CYP2C19*3-LF和C-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
C-CYP2C19*3-F3:5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACAT-3’；
C-CYP2C19*3-B3:5’-CCTGTGCATAAAATAAAGAACTT-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-W:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAAGCACCCCCTHG-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-M:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAAGCACCCCCTHA-3’；
C-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTCCATCTTTTCCAGATATTCACC-3’；
C-CYP2C19*3-LF:5’-GGAAGCAAAAAACTTGGCCTT-3’；
C-CYP2C19*3-LB:5’-CTACAGTCTTGCCTAGACAG-3’；
C-CYP2C19*3-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，C-CYP2C19*3-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；
所述的BIP-2包括D-CYP2C19*2-F3、D-CYP2C19*2-B3、D-CYP2C19*2-FIP、D-CYP2C19*2-BIP-W、D-CYP2C19*2-BIP-M、D-CYP2C19*2-LF和D-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：
D-CYP2C19*2-F3:5’-GAGAATTACTACACATGTACAAT-3’；
D-CYP2C19*2-B3:5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAA-3’；
D-CYP2C19*2-FIP:5’-GGTATAGATACAATATGCCAAGCTTCCCCATCAAGATATACAATATA-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-W:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAATTTGTTATGGGTTCDC-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-M:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAATTTGTTATGGGTTCDT-3’；
D-CYP2C19*2-LF:5’-GGTTGTAATTTAAAACTATAAATATA-3’；
D-CYP2C19*2-LB:5’-GCAATAATTTTCCCACTATCATT-3’；
D-CYP2C19*2-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，D-CYP2C19*2-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；
所述的BIP-3包括D-CYP2C19*3-F3、D-CYP2C19*3-B3、D-CYP2C19*3-FIP、D-CYP2C19*3-BIP-W、D-CYP2C19*3-BIP-M、D-CYP2C19*3-LF和D-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：
D-CYP2C19*3-F3：5’-TTCACCCTGTGATCCCACTT-3’；
D-CYP2C19*3-B3：5’-GTAAGTGGTTTCTCAGGAAGC-3’；
D-CYP2C19*3-FIP:5’-GCTGATCTTTATAATCGAAACGTTTCCTGGGCTGTGCTCCCT-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-W:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGGCCTTACCTGGAVC-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-M:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGGCCTTACCTGGAVT-3’；
D-CYP2C19*3-LF：5’-TGGAAAATAATGGAGCAGATCA-3’；
D-CYP2C19*3-LB：5’-AACATCAGGATTGTAAGCACC-3’；
D-CYP2C19*3-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，D-CYP2C19*3-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基。
3.一种如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的引物组用于制备基因突变检测试剂盒的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的试剂盒，所述的试剂盒包括权利要求2所述的引物组、Bst DNA Polymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；
所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；
所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的16种引物组每一组中的F3的浓度与B3的浓度相同，为0.8～1.6μmol/L；LF和LB的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；FIP与BIP的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的Bst DNA Polymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；
所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的HNB溶液的浓度为5～10μmol/L；所述的SYBR Green I浓度为1×～5×；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10～30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml。
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