CN111187768B - 水牛奶中微生物总dna提取试剂盒及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA提取技术领域，特别涉及一种水牛奶中微生物总DNA的提取试剂盒及提取方法，本申请的试剂盒是针对采用现有技术的提取方法提取水牛奶微生物总DNA会存在浓度、纯度低、乳脂、蛋白含量高，导致提取到的DNA不利于后续扩增、测序等技术缺陷设计的，采用该试剂盒能方便、快捷的从水牛奶的鲜奶中提取微生物总DNA，同时利用该试剂盒采用本发明的提取方法提取DNA能有效去除水牛奶中的乳脂、乳蛋白质，提高DNA纯度，方便快捷的进行下一步的分子生物学研究。
Description
【技术领域】
本发明涉及DNA提取技术领域，特别涉及水牛奶中微生物总DNA提取试剂盒及其提取方法和应用。
【背景技术】
在分子生物学实验中，提取DNA是一项最基础也是最常用的技术，从牛奶中提取微生物总DNA有很多种方法而且，方法也较为成熟，但是，目前多是研究如何从黑白花牛奶中提取DNA，关于水牛奶中微生物总DNA提取的方法研究很少，申请人在实际工作中发现，目前用于提取黑白花奶牛的提取方法并不能很好的提取到水牛奶中的微生物总DNA，在做基因测序研究时，相应的基因测序公司也并不能从水牛奶微生物中提取到合适浓度和高质量的DNA(OD260/OD280在1.8-2.0之间)，这是因为，水牛奶与黑白花牛奶不同，乳脂和蛋白均是其它牛奶的几倍，如果直接按照现有的黑白花奶牛中微生物总DNA提取方法提取水牛奶微生物总DNA会存在丰度低，乳脂、蛋白含量高，导致不能有效提取水牛奶DNA的缺陷，而水牛奶做为广西特有的农副产品，对其微生物总DNA的提取研究是必不可少的一环，为此，有必要针对水牛奶乳脂和蛋白含量高的特点，探索出一种适合水牛奶微生物总DNA的提取方法，该方法能提高水牛奶中微生物总DNA的提取效率和丰度，减少杂带、杂质。
【发明内容】
本发明的目的是提供水牛奶中微生物总DNA提取试剂盒及其提取方法和应用，该方法能有效去除水牛奶中的乳脂和蛋白，提高水牛奶的微生物总DNA提取效率，减少杂质。
一种鲜水牛奶微生物总DNA的提取试剂盒，所述试剂盒包括：EDTA缓冲液、PBS缓冲液、蔗糖缓冲液、RNase、75％乙醇、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和溶液E；
所述EDTA缓冲溶液的浓度为500mM，pH8.0；
所述蔗糖缓冲液中蔗糖的质量浓度终浓度为12％，Tris-HCl终浓度为25mM，pH8.0；
所述溶液A为苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液；
所述溶液B为蔗糖缓冲液、变溶菌素和溶菌酶的混合液。
所述溶液C为SDS、EDTA、蛋白酶K和蔗糖缓冲液的混合液；SDS的质量浓度终浓度为10％、EDTA的终浓度为250mM pH 8.0；蛋白酶K的终浓度为20mg/mL；
所述溶液D为蔗糖缓冲液和NaCl溶液的混合液；
所述溶液E为冰异丙醇和糖原的混合液。
进一步的，所述溶液B的蔗糖缓冲液为400μL；变溶菌酶为4U，溶菌酶为1600μg。
进一步的，所述溶液C的SDS的质量浓度终浓度为10％、EDTA的终浓度为250mMpH8.0；蛋白酶K的终浓度为20mg/mL。
进一步的，所述溶液D的蔗糖缓冲液为65μL；NaCl为135μL，浓度为5M。
进一步的，所述溶液E的冰异丙醇为700μL，温度为-20℃；糖原为20μg。
进一步的，所述RNase的浓度为10mg/mL。
本发明还包括一种应用所述提取试剂盒提取鲜奶DNA的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将鲜奶样本与EDTA溶液混合，在6500×g，4℃条件下离心30min，放入-20℃条件下冰冻10min；
(2)步骤(1)冰冻后去除上层固体和悬浮液，加入PBS至5mL；
(3)向步骤(2)中加入6mL的所述溶液A，震荡15S，冰浴20min，每隔5min上下摇匀2下；在12000r/min条件下离心10min；取上层再加入6mL的所述溶液A重复上述振荡冰浴、离心操作；
(4)取步骤(3)第2次离心后的上清液2mL加入离心管再离心获取沉淀，向沉淀中加入2μL的RNase(10mg/mL)，37℃培养30min；
(5)用1mL的蔗糖缓冲液冲洗步骤(4)中的反应物，离心去沉淀悬浮于400μL的溶液B中，37℃下培养1-2h；
(6)向步骤(5)的反应液中加入溶液C在60℃条件下培养1h；之后加入溶液D；
(7)向步骤(6)的反应液中加入700μL的溶液A，上下摇匀；在18000×g、4℃条件下离心15min提取上清；重复3加入溶液A、离心提取3次；
(8)提取步骤(7)的上清液加入溶液E在-20℃条件下沉淀过夜；
(9)将步骤(8)的反应液在18000×g条件下离心30min获取沉淀，用70％乙醇清洗两次；风干得到DNA。
本发明具有以下有益效果：
本发明的试剂盒是针对水牛奶设计的，采用该试剂盒能方便、快捷的从水牛奶的鲜奶中提取微生物总DNA，同时利用该试剂盒采用本发明的提取方法提取DNA能有效去除水牛奶中的蛋白质，提高DNA纯度，能方便快捷的进行下一步的分子生物学研究。
【附图说明】
图1为本发明采用实施例的方法提取到的水牛奶DNA扩增图，图中Marker为：DL2000，从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；其中，1-9泳道为利用实施例2的方法获得DNA为模板扩增后电泳条带，10-12为对照组2获得DNA为模板扩增后电泳条带；13-15为对照组1获得DNA为模板扩增后电泳条带。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
现以正常育龄且健康的水牛产出的水牛奶为例，非限定实施例叙述如下：
实施例1：
本实施例的鲜奶DNA提取试剂盒包括：EDTA缓冲液、PBS缓冲液、蔗糖缓冲液、RNase、75％乙醇、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和溶液E；
其中，EDTA缓冲溶液的浓度为500mM，pH8.0；
蔗糖缓冲液中蔗糖的质量浓度终浓度为12％，Tris-HCl终浓度为25mM，pH8.0；
溶液A为苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液；
溶液B为蔗糖缓冲液、变溶菌素和溶菌酶的混合液。
溶液C为SDS、EDTA、蛋白酶K和蔗糖缓冲液的混合液；SDS的质量浓度终浓度为10％、EDTA的终浓度为250mM pH 8.0；蛋白酶K的终浓度为20mg/mL；
溶液D为蔗糖缓冲液和NaCl溶液的混合液；
溶液E为冰异丙醇和糖原的混合液。
溶液B的配置浓度为：蔗糖缓冲液400μL，变溶菌浓度为4U；溶菌酶为1600μg。
溶液D的配置浓度为：蔗糖缓冲液65μL；135μl 5M的NaCl。
溶液E的配置浓度为：冰异丙醇700μL，温度为-20℃；糖原20μg。
溶液配制：
上述溶液中部分溶液配置方法如下：
500mM EDTA：100mL蒸馏水中加入46.525g EDTANa.2H2O，用NaOH调节pH至8.5后，定容至250mL。
蔗糖缓冲液：12g蔗糖、0.3028gTris，添加80mL蒸馏水溶解用HCl调节pH至8.0，定容至100mL。
10％SDS：10g SDS溶解至60mL蒸馏水，定容至100mL。
5M NaCl：29.25g溶于60mL蒸馏水，定容至100mL。
需要购买的药品及药品厂商如下：
变溶菌素(Sigma，Oakville，ON，Canada)；
溶菌酶(sigma)；
蛋白酶K(20mg/mL，Sigma)；
蛋白酶K配制标准：20mg/mL蛋白酶K配制标准(proteinase K)：将200mg的蛋白酶K加入到9.5mL水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，不要涡旋混合，加水定容到10mL，然后分装成小份贮存于-20℃；
糖原(glycogen，Roche Diagnostic)；
RNase(康为世纪生物科技有限公司)。
实施例2：
利用实施例1的提取试剂盒来提取水牛鲜奶的DNA，其中，提取方法为：
样品采集：进行人工挤奶，挤奶时弃去前10mL；
(1)将上述鲜奶样本与EDTA溶液混合，在6500×g，4℃条件下离心30min，放入-20℃条件下冰冻10min；
(2)步骤(1)冰冻后去除上层固体和悬浮液，加入PBS至5mL；
(3)向步骤(2)中加入6mL的所述溶液A，震荡15S，冰浴20min，每隔5min上下摇匀2下；在12000r/min条件下离心10min；取上层再加入6mL的所述溶液A重复上述振荡冰浴、离心操作；
(4)取步骤(3)第2次离心后的上清液2ml加入离心管再离心获取沉淀，向沉淀中加入2μL的RNase，37℃培养30min；
(5)用1mL的蔗糖缓冲液冲洗步骤(4)中的反应物，离心去沉淀悬浮于400μL的溶液B中，37℃下培养1h(优选为1h，培养时间在1-2h范围内均可达到本申请的效果)；
(6)向步骤(5)的反应液中加入溶液C在60℃条件下培养1h；之后加入溶液D；
(7)向步骤(6)的反应液中加入700μL的溶液A，上下摇匀；在18000×g、4℃条件下离心15min提取上清；重复3加入溶液A、离心提取3次；
(8)提取步骤(7)的上清液加入溶液E在-20℃条件下沉淀过夜；
(9)将步骤(8)的反应液在18000×g条件下离心30min获取沉淀，用70％乙醇清洗两次；风干得到DNA。
DNA提取效率的验证：
向上述实施例2制备得到的DNA加入50μL无菌水，70℃水浴5min采用NanoDrop法测定DNA浓度；
对照组1方法，其他参数与实施例2相同，不同在于，步骤(4)中不加入“2μL的RNase(10mg/mL)，37℃培养30min”，并增加步骤10即：
(1)将水牛鲜奶样本与EDTA溶液混合，在6500×g，4℃条件下离心30min，放入-20℃条件下冰冻10min；
(2)步骤(1)冰冻后去除上层固体和悬浮液，加入PBS至5mL；
(3)向步骤(2)中加入6mL的所述溶液A，震荡15S，冰浴20min，每隔5min上下摇匀2下；在12000r/min条件下离心10min；取上层再加入6mL的所述溶液A重复上述振荡冰浴、离心操作；
(4)取步骤(3)第2次离心后的上清液2mL加入离心管再离心获取沉淀；
(5)用1mL的蔗糖缓冲液冲洗步骤(4)中的反应物，离心去沉淀悬浮于400μL的溶液B中，37℃下培养1h；
(6)向步骤(5)的反应液中加入溶液C在60℃条件下培养1h；之后加入溶液D；
(7)向步骤(6)的反应液中加入700μL的溶液A，上下摇匀；在18000×g、4℃条件下离心15min提取上清；重复3加入溶液A、离心提取3次；
(8)提取步骤(7)的上清液加入溶液E在-20℃条件下沉淀过夜；
(9)将步骤(8)的反应液在18000×g条件下离心30min获取沉淀，用70％乙醇清洗两次；风干得到DNA。
(10)加入50μL无菌水，2μl RNase(10mg/mL)，37℃培养30min。
对照组2：采用文献报道的CTAB法制备DNA做为对照；
实施例2和对照组1-2均采用NanoDrop法测定DNA浓度；测定结果如表1：
表1
Nanodro浓度表示：用Nanodrop分光光度计测得的核酸浓度。
OD260/OD280表示在260nm和280nm处的紫外光吸收比值，用于检测提取DNA的纯度，合适比值在1.8-2.0之间，＜1.8说明有蛋白质污染，＞2.0说明有RNA污染。
从上表可见，本申请实施例2的OD260/OD280均在1.8-2.0之间；而对照组1-2的方法有数值低于1.8，证明，采用对照组2和对照组1的方法提取水牛奶中总微生物的DNA有蛋白污染。
PCR检测：
使用细菌通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGC-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，对16S rRNA基因进行扩增。其中，PCR反应体系如下：5×FastPfu Buffer 4μL，
2.5mM dNTPs 2μL，
上游引物(5μM)0.8μL，
下游引物(5μM)0.8μL，
FastPfu Polymerase 0.4μL，
BSA 0.2μL；补充无菌水至20μL。
PCR反应程序为
95℃3min
95℃30S，60℃30S，72℃45S，35个循环。
72℃10min
PCR的凝胶电泳图如图1所示：图中1-9均为利用实施例2的方法获得DNA为模板扩增后电泳条带，10-12为对照组2获得DNA为模板扩增后电泳条带；13-15为对照组1获得DNA为模板扩增后电泳条带。由图可见，图中的1-9的DNA条带光亮、清晰、杂带少，证明DNA纯度高。10-15相对较为模糊，而10-12的DNA条带比13-15更模糊，说明从DNA提取的浓度上来讲，实施例2＞对照组1＞对照组2，由此，本申请的提取方法能有效的提取水牛奶总微生物的DNA。
综上，本申请的试剂盒和方法能有效提高水牛奶中总微生物DNA的提取效率和纯度，是一种行之有效的水牛奶中总微生物的DNA提取试剂盒和提取方法。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (1)
1.一种提取水牛鲜奶微生物总DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将水牛鲜奶样本与EDTA溶液混合，在6500×g，4℃条件下离心30 min，放入-20℃条件下冰冻10 min；
（2）步骤（1）冰冻后去除上层固体和悬浮液，加入PBS至5 mL；
（3）向步骤（2）中加入6 mL的溶液A，震荡15 s，冰浴20 min，每隔5 min上下摇匀2下；在12000 r/min条件下离心10 min；取上层再加入6 mL的溶液A重复上述震荡冰浴、离心操作；
（4）取步骤（3）第2次离心后的上清液2 mL加入离心管再离心获取沉淀，向沉淀中加入2µL 的浓度为10mg/mL的RNase，37℃培养30 min；
（5）用1mL的蔗糖缓冲液冲洗步骤（4）中的反应物，离心取沉淀悬浮于400 µL的溶液B中，37℃下培养1-2 h；
（6）向步骤（5）的反应液中加入溶液C在60℃条件下培养1 h；之后加入溶液D；
（7）向步骤（6）的反应液中加入700 µL的溶液A，上下摇匀；在18000×g 、4℃条件下离心15 min提取上清；重复加入溶液A、离心提取3次；
（8）取步骤（7）的上清液加入溶液E在-20℃条件下沉淀过夜；
（9）将步骤（8）的反应液在18000×g条件下离心30 min获取沉淀，用70%乙醇清洗两次；风干得到DNA；
所述EDTA溶液的浓度为500 mM，pH8.0；
所述蔗糖缓冲液中蔗糖的质量浓度终浓度为12%，Tris-HCl终浓度为25 mM，pH8.0；
所述溶液A为苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液；
所述溶液B为蔗糖缓冲液、变溶菌素和溶菌酶的混合液；其中，蔗糖缓冲液为400µL，变溶菌素为4U，溶菌酶为1600µg；
所述溶液C为 SDS、EDTA、蛋白酶K和蔗糖缓冲液的混合液；其中，SDS的质量浓度终浓度为10%、EDTA的终浓度为250 mM pH 8.0；蛋白酶K的终浓度为20 mg/mL；
所述溶液D为蔗糖缓冲液和 NaCl溶液的混合液；其中，蔗糖缓冲液为65 µL；NaCl为135µL浓度为5 M；
所述溶液E为冰异丙醇和糖原的混合液；其中，冰异丙醇为700 µL，温度为-20℃；糖原为20 µg。
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