CN111184726A - β-内酰胺类化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及β‑内酰胺类化合物的应用，具体涉及β‑内酰胺类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用，还涉及β‑内酰胺类化合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。本发明通过底物‑酶结合实验，免疫印迹，细胞酶活性检测，划痕实验，Transwell实验研究发现头孢哌酮通过抑制HDAC6的活性，从而对恶性肿瘤转移具有显著的抑制作用。因此，以头孢哌酮为代表的β‑内酰胺类化合物能够用于制备抗肿瘤转移药物，在预防和抑制恶性肿瘤术后转移具有很好的应用前景。

Description

β-内酰胺类化合物的应用

技术领域

本发明属于已知药物的新用途领域，涉及β-内酰胺类化合物的应用，具体涉及β-内酰胺类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用，还涉及β-内酰胺类化合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

随着肿瘤发病率和死亡率的持续走高，恶性肿瘤已经成为严重威胁人们健康的头号杀手。肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，大多数癌症患者并非死于原发性癌而是死于转移性癌。侵袭与转移能力是癌细胞区别于正常细胞的最基本的特征，也是导致患者术后肿瘤复发、病情恶化而最终死亡的病理基础。

肿瘤转移大致可分为4个阶段：a.原发病灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长；b.肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭基底膜，进而转移到血管、淋巴道；c.部分肿瘤细胞在转移过程中，通过自身特异性黏附和免疫逃逸而存活，随血流或淋巴流转移到机体其它器官；d.转移的肿瘤细胞与靶器官的血管壁发生粘附并外渗到远端组织，肿瘤细胞大量增殖并迅速产生新的血管，从而形成新的转移灶，可再次转移到机体其它器官。近年来，抗肿瘤转移药物的研究主要针对肿瘤转移的各个环节，并且在基础和临床等领域获得了不同程度的进展和突破。

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)是一种通过影响多种细胞内蛋白质，调节基因表达、细胞分化及生存的酶。大量研究发现，在正常状态下，组蛋白的乙酰化和去乙酰化处于动态平衡；而在病理状态下，这种平衡会被打破，例如：在多种肿瘤细胞中HDACs 均过表达，HDACs的过表达导致组蛋白赖氨酸残基上的乙酰化水平降低，体内乙酰化水平失衡，从而抑制了肿瘤相关基因的转录过程，最终造成细胞分裂不受控制。组蛋白乙酰化水平的改变与肿瘤的发生和发展密切相关，这使得HDACs成为了重要的抗肿瘤靶点，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)成为开发新型抗肿瘤药物的突破口。组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)是HDACs家族中最具特色的一员，它拥有多种组蛋白以外的蛋白底物，可特异性催化：α-微管蛋白(α-tubulin)、热休克蛋白90(heat shockprotein，Hsp90) 和皮质肌动蛋白等，并能调控细胞内的多种生命进程，如细胞粘附、细胞运动和细胞凋亡。 HDAC6的过度表达会导致微管蛋白处于低乙酰化水平，并促进趋化性细胞运动；相反，抑制 HDAC6导致微管蛋白超乙酰化，微管动力学降低及黏着斑过度聚积，进而抑制纤维原细胞运动。抑制HDAC6能从多方面抑制肿瘤细胞的侵袭与转移，因此，特异性HDAC6抑制剂成为了研究的热点。

以头孢哌酮为代表的β-内酰胺类化合物(Cefoperazone sodium)为第三代头孢菌素，对大肠埃希菌、克雷白菌属、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌有良好抗菌作用。用于各种敏感菌所致的呼吸道、泌尿道、腹膜、胸膜、皮肤和软组织、骨和关节、五官等部位的感染，还可用于败血症和脑膜炎等。头孢哌酮钠的不良反应发生率约在5％左右，主要表现为：过敏反应、皮疹皮痒、腹痛、腹泻、伪膜性肠炎及菌群失调二重感染等。到目前为止，未见β-内酰胺类化合物通过抑制HDAC6的活性，从而抑制恶性肿瘤细胞转移的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对抑制恶性肿瘤术后转移药物的不足，提供了一种β-内酰胺类化合物的新用途。

本发明通过如下技术方案实现：

β-内酰胺类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。

β-内酰胺类化合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

所述的β-内酰胺类化合物的基本结构为：以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为母核连接不同侧链的一类化合物。

进一步地，所述的β-内酰胺类化合物为头孢哌酮、头孢呋辛、头孢孟多、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢地尼、头孢地嗪、头孢三秦、头孢克洛、头孢氨苄、头孢拉定、头孢匹罗中的一种或几种。

优选地，所述的β-内酰胺类化合物为头孢哌酮或其药用衍生物，所述的头孢哌酮药用衍生物是头孢哌酮的药用盐或酯，更优选头孢哌酮钠。

所述的β-内酰胺类化合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。

所述的肿瘤为胰腺癌、乳腺癌、胃癌。

所述的肿瘤转移包括胰腺导管腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌等肿瘤转移诱发的疾病。

所述的胰腺导管腺癌是与药物治疗相关的胰腺癌、原发性胰腺癌、继发性胰腺癌、转移性胰腺癌、其他病因未明的胰腺癌、以及由胰腺癌诱发的疾病。

所述的三阴性乳腺癌是与药物治疗相关的乳腺癌、原发性乳腺癌、继发性乳腺癌、转移性乳腺癌、其他病因未明的乳腺癌、以及由乳腺癌诱发的疾病。

所述的胃癌是与药物治疗相关的胃癌、原发性胃癌、继发性胃癌、转移性胃癌、其他病因未明的胃癌、以及由胃癌诱发的疾病。

进一步地，所述的β-内酰胺类化合物可以制备成药物组合物，该组合物至少包括一种活性成分β-内酰胺类化合物和一种药用载体。

进一步地，所述的药物组合物，包括1～99％(质量)β-内酰胺类化合物和1～99％(质量)药用载体。

本发明所述的β-内酰胺类化合物或其药物组合物可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂，用于口服给药，以及经静脉、肌肉、直肠、皮内或皮下等方式给药。

所述的药物组合物还可以是水溶液、非水溶液或混悬液。

本发明的头孢哌酮的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，常用的每日剂量约为0.01～5000mg，优选0.1～2000mg，更优选1～1000mg。给药次数一天一次或数次。

本发明通过构建体外肿瘤转移模型，考察受试物头孢哌酮在预防和治疗恶性肿瘤细胞转移中的应用。实验结果表明，头孢哌酮或其类似物或其药物组合物能够明显抑制肿瘤细胞的转移进程，可以用于制备抗肿瘤转移药物，并且头孢哌酮作为抗菌药已经应用于临床，因此对于预防和抑制恶性肿瘤术后转移具有很好的临床应用前景。

附图说明：

图1为头孢哌酮钠对人胰腺癌PANC-1细胞内HDAC6相关底物蛋白表达的影响。

其中A图为预先用HDAC6特异性抑制剂Tubacin(5μM)、广谱HDACs抑制剂SAHA (1μM)和不同浓度头孢哌酮钠(150、300、600μM)处理的PANC-1细胞中相关蛋白表达的变化。B图为其定量结果图。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，与control组比较。

图2为头孢哌酮钠对PANC-1细胞内HDAC6活性的影响。

预先用Tubacin(5μM)和不同浓度头孢哌酮钠(150、300、600μM)处理PANC-1细胞，检测药物对细胞内HDAC6活性的影响。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001，与control组比较。

图3为头孢哌酮钠对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响。

A图为预先用150μM、300μM、600μM头孢哌酮钠、5μM Tubacin或溶媒(Control) 处理对人胰腺癌PANC-1细胞迁移能力的影响。B图为预先用150μM、300μM、600μM头孢哌酮钠、5μM Tubacin或溶媒(Control)处理对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭能力的影响。^*p＜0.05,^**p＜0.01,^***p＜0.001，与control组比较。

具体实施方式

实施例1、采用底物-酶结合实验研究头孢哌酮钠对HDAC6的抑制活性。

采用底物-酶结合实验，将不同浓度的头孢哌酮钠与HDAC6底物和酶共孵育，通过产生的荧光强度检测头孢哌酮钠对HDAC6活性的抑制作用。

用缓冲液将Ac-Lys(Ac)-AMC荧光底物稀释至80μM备用，将HDAC6酶稀释至1μg/mL备用。随后取黑色酶标板，将体积为10μL的HDAC6酶、20μL的荧光底物和20μL梯度稀释的头孢哌酮钠加入孔中混合均匀，于37℃恒温培养箱孵育2h。然后向每孔中加入50μL 终止液，37℃恒温再次孵育15min使反应终止。随后使用多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长380nm，发射波长460nm)。实验结果表明(表1)，头孢哌酮钠对HDAC6具有很强的结合抑制活性，其IC₅₀值为8.59±1.06μM。

表1.头孢哌酮钠对HDAC6的抑制活性

^a.数据为三次独立实验的平均±SD。

实施例2、头孢哌酮钠对人胰腺癌PANC-1细胞内HDAC6相关底物蛋白表达的影响。

广谱HDAC抑制剂可诱导组蛋白和非组蛋白底物的过度乙酰化，例如组蛋白H3(histone H3)和α-微管蛋白(α-tubulin)，而HDAC6的去乙酰化酶活性主要集中在非组蛋白底物上，选择性HDAC6抑制剂能显著催化α-tubulin的过度乙酰化，而不能催化histone H3的过度乙酰化。将PANC-1细胞用头孢哌酮钠(150、300、600μM)、Tubacin(5μM)和SAHA(1μM)预处理48h，提取总蛋白检测相关蛋白表达水平。如图1所示，HDAC6特异性抑制剂Tubacin、广谱HDAC抑制剂SAHA和头孢哌酮钠均可诱导Ac-α-tubulin表达的增加，但是只有广谱HDAC抑制剂SAHA可诱导histone H3的过度乙酰化。此外，头孢哌酮钠以剂量依赖性方式诱导Ac-α-tubulin表达的增加。这些数据表明，头孢哌酮钠是HDAC6的特异性抑制剂，可以选择性地抑制细胞环境中的HDAC6。

实施例3、头孢哌酮钠对PANC-1细胞内HDAC6活性的影响。

PANC-1细胞用头孢哌酮钠(150、300、600μM)、Tubacin(5μM)或溶媒(Control) 处理48h，随后加入细胞裂解液，收集裂解细胞，4℃离心取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。将蛋白稀释为统一浓度后，取出黑色酶标板，将蛋白与HDAC6荧光底物在37℃共孵育30min。然后每孔加入10μL显影剂，37℃孵育10min使其产生荧光，使用多功能酶标仪检测荧光强度(激发波长380nm，发射波长490nm)。实验结果表明(图2)，头孢哌酮钠以剂量依赖性的方式抑制PANC-1细胞内HDAC6的活性。

实施例4、头孢哌酮钠对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响。

将PANC-1细胞用不同浓度的头孢哌酮钠(150、300和600μM)或5μM Tubacin预处理，通过划痕实验和Transwell实验研究头孢哌酮钠对人胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。如图 3A所示，头孢哌酮钠以剂量依赖性的方式显著抑制PANC-1细胞的迁移能力。Transwell实验结果表明(图3B)，与对照组相比，经头孢哌酮钠处理的PANC-1细胞穿过基底膜侵袭入下室的细胞数量明显减少。与划痕实验结果一致，头孢哌酮钠以剂量依赖性的方式抑制PANC-1 细胞的侵袭能力。以上实验结果表明，头孢哌酮钠通过抑制细胞内HDAC6的活性，从而显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此，临床上市药物头孢哌酮钠对于抑制恶性肿瘤术后转移具有重要的应用价值。

Claims (10)

1.β-内酰胺类化合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

2.β-内酰胺类化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。

3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-内酰胺类化合物的基本结构为：以7-氨基头孢烷酸为母核连接不同侧链的一类化合物。

4.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-内酰胺类化合物为头孢哌酮、头孢呋辛、头孢孟多、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢地尼、头孢地嗪、头孢三秦、头孢克洛、头孢氨苄、头孢拉定、头孢匹罗中的一种或几种。

5.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为上皮癌，优选胰腺癌、乳腺癌、胃癌。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤转移包括胰腺导管腺癌、三阴性乳腺癌、胃癌等肿瘤转移诱发的疾病。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的胰腺导管腺癌是与药物治疗相关的胰腺癌、原发性胰腺癌、继发性胰腺癌、转移性胰腺癌、其他病因未明的胰腺癌、以及由胰腺癌诱发的疾病；所述的三阴性乳腺癌疾病是与药物治疗相关的乳腺癌、原发性乳腺癌、继发性乳腺癌、转移性乳腺癌、其他病因未明的乳腺癌、以及由乳腺癌诱发的疾病；所述的胃癌是与药物治疗相关的胃癌、原发性胃癌、继发性胃癌、转移性胃癌、其他病因未明的胃癌、以及由胃癌诱发的疾病。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的头孢哌酮是头孢哌酮或其药用衍生物，头孢哌酮药用衍生物优选头孢哌酮的药用盐或酯。

9.如权利要求1-8任何一项所述的应用，其特征在于，所述的β-内酰胺类化合物和药学上可接受的载体组成药物组合物。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物为水溶液、非水溶液或混悬液，或制备成片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂，用于口服、静脉、肌肉、直肠、皮内或皮下给药。

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