CN111178173A - 一种目标菌落生长特征识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种目标菌落生长特征识别方法。活动轮廓检测算法适用类圆粒目标分割，但复杂性较高且对粘连菌落分割效果不佳。本发明如下：1、图像采集；2、灰度处理；3、进行二值化处理。4、去除图像中的培养皿边缘以外的部分。5、形态学处理。6、对图像进行轮廓检测、轮廓分割、椭圆拟合和椭圆筛选。7、获取培养皿中各个菌落的数量、大小、颜色信息。本发明依靠计算机视觉的被识别图像处理方法，并结合统计学的算法，从培养皿复杂的菌落分布中将每个菌落的面积大小、颜色特征和边缘特征提取出来，能够得到非常精确的菌落总数量和菌落实际位置，从而方便了使用者统计菌落信息，减少了使用者的操作负担。

Description

一种目标菌落生长特征识别方法
技术领域
本发明属于菌落识别技术领域，具体涉及一种目标菌落生长特征识别方法。
背景技术
在生物研究领域中，培养皿中形成菌落的数量及大小等是抗生素筛选、细菌鉴定及相关测试的重要指标。如何精确测定目标菌落生长信息来观察菌落动态变化是有待解决的重要难题，而人工对菌落计数及大小测定是非常艰苦且易出错的过程，往往还需要计算机相关软件进行辅助标记，耗时且费力。在培养皿中形成的菌落单位往往不仅仅是独立的，可能会有多个粘连在一起，这更增加了菌落信息测定的困难度。
随着图像处理与计算机视觉的广泛应用，已经有许多学者将其应用到微生物研究中，包括有菌落识别、菌落计数和定位等领域。在菌落计数领域中，较为成熟的方法有基于距离变换的分水岭分割法，基于深度学习的被识别图像分割方法和活动轮廓检测算法等(张力新，基于改进水平集的菌落被识别图像智能计数算法[J].天津大学学报，2019,52(1):84-89)。其中较为传统的基于距离变换的分水岭分割方法对较少的粘连菌落和规则形状的分割效果较好，但对于粘连菌落严重的情况效果不佳，容易产生过分割于与欠分割的问题，满足不了精确分割的要求；基于深度学习的被识别图像分割方法分割效果较好，能够满足大多数实验要求，但是该方法需要的训练数据较多难以大量采集；活动轮廓检测算法适用类圆粒目标分割，但复杂性较高且对粘连菌落分割效果不佳。这些方法实现计数或定位还需采用其他遍历方法进行处理，并且获取每个菌落的详细信息较为困难。
近几年有许多学者提出基于几何学进行拟合的方法对粘连菌落进行处理，相比于分水岭等方法对粘连区域的分割效果更佳，但是鲁棒性较差，只能针对椭圆或者针对圆进行拟合，这样分割效果虽然不错，但需要提前设定好椭圆或圆的信息，且对粘连菌落分割存在一定的随机性，不能按照目标菌落自身具备的长短轴比例进行分割，故不具备广泛适用性(San-Ding Luo,Zheng Zou,Guang-Ya Tian,An Automatic Colonies Counting Basedon Piecewise Circle Fitting[J].Journal of Information Hiding and MultimediaSignal Processing,2017,8(3):660-669)。在很多菌落图像处理中，往往忽视了对存在较少菌落的培养皿进行二值化处理的问题，由于图像中背景点较多直接采用全局阈值二值化会错误地将菌落与背景混淆，而采用自适应阈值二值化会使得菌落边缘粗化，不适用对存在较密集菌落的培养皿进行二值化处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种目标菌落生长特征识别方法。
本发明的步骤如下：
步骤1、用摄像机在纯黑色背景下对装有菌落的培养皿进行图像采集，得到彩色被识别图像。
步骤2、对彩色被识别图像进行灰度化和双边滤波处理，得到灰度值被识别图像。
步骤3、根据灰度值被识别图像的大小进行自适应分割，并进行二值化处理。
3-1.设定图像分割块大小n×n；n的表达式如式(2)所示：
Figure BDA0002318422740000021
式(2)中，L为灰度值被识别图像的像素行数，
Figure BDA0002318422740000022
为
Figure BDA0002318422740000023
向上取整所得值。
3-2.将被识别图像分割为多张n×n大小的子图像。
3-3.对分割后的每幅子图像进行全局阈值处理。
3-4.将经过全局阈值处理的各幅子图像按照顺序进行拼接，即得到二值被识别图像。
步骤4：检测二值被识别图像中的培养皿边缘，并将培养皿的边缘及该边缘以外的部分置为0。
步骤5：对步骤4处理后的二值被识别图像进行形态学处理。
步骤6：对步骤5处理后的二值被识别图像进行轮廓检测、轮廓分割、椭圆拟合和椭圆筛选。具体过程如下：
6-1.将步骤5处理后的二值被识别图像中八邻域内至少有一个黑色像素点的像素点标记为边缘像素点。在一张初始为黑色的图像上，将与二值被识别图像中各边缘像素点相对应的像素点置为白色，得到只含有菌落边缘的轮廓特征图像。
6-2.对轮廓特征图像从左上角开始逐行搜索，搜索到灰度值为255且未记入链表的像素点时，以该像素点作为起始像素点；根据起始像素点建立一个链表，过程如下：
①.以起始像素点作为目标像素点，并作为起点记入链表。
②.以目标像素点的右方向为开始方向，对目标像素点的八领域进行顺时针搜索；将搜索到的第一个灰度值为255的像素点设置为路径点并记入链表。
③.若路径点的八领域内存在初始像素点或不存在灰度值为255的像素点，则链表建立完成，继续对二值被识别图像进行逐行搜索。否则，以路径点作为新的目标像素点，重复执行步骤②。
步骤6-2执行结束后，得到了轮廓特征图像上所有的连通域顺时针链表集。
6-3.分别计算m个链表内各像素点的相对角度；第i个链表上第j个像素点的相对角度a′i,j的表达式如式(6)所示。
Figure BDA0002318422740000031
式(6)中，ai,j为第i个链表上第j个像素点的偏移角度，ai,j-1为第i个链表上第j-1个像素点的偏移角度；第一个像素点的偏转角度为0；第二个像素点起，一个像素点的偏转角度指该像素点与前一个像素点的向量转动到右方向的逆时针角度；
若出现负数则将该点作为疑似凹点。若一个疑似凹点相邻的两个像素点中的任意一个像素点的相对角度为0，则将该疑似凹点标记为凹点。将链表在每个凹点处进行分割。
6-4.对所有呈环形的链表进行椭圆拟合，每个呈环形的链表均得到拟合椭圆和长短轴比例。
对长短轴比例的范围进行从小到大等距分组，将出现链表频率最高范围的中值设定为特征长短轴比例；然后根据特征长短轴比例对各个非环形的链表进行最小二乘法拟合，得到各个非环形链表的拟合椭圆的圆心坐标、长轴长度和短轴长度。
6-5.对所有拟合椭圆长轴长度绘制箱型图，将箱型图中的离群点所对应的拟合椭圆删除。
6-6.根据轮廓特征图像上各拟合椭圆的参数，在经步骤5处理后的二值被识别图像上标记出多个特征椭圆；对二值被识别图像上所有特征椭圆进行筛选，删除置信度C小于80％的特征椭圆。一个特征椭圆的置信度C的表达式如式(7)所示。
Figure BDA0002318422740000032
式(7)中，H内为该特征椭圆的轮廓上或内部的像素灰度值为255的像素点个数；H总为该特征椭圆内的像素点总数。
6-7.对所有相交的特征椭圆进行筛选；若相交的两个特征椭圆之间的重合率大于或等于85％，则将该两个特征椭圆中置信度较低的那个椭圆删除；相交的两个特征椭圆之间的重合率
Figure BDA0002318422740000041
其中，s为该两个椭圆的相交部分的像素点个数；z为该两个椭圆中较大的那个椭圆内的像素点个数。
步骤7：根据各个特征椭圆获取培养皿中各个菌落的数量、大小、颜色信息。
作为优选，所述的彩色被识别图像呈正方形。
作为优选，步骤2的具体步骤包括如下：
2-1.采用双边滤波方法对彩色被识别图像进行处理，双边滤波方法将空间域核与颜色域核叠加得到双核。用双核对被识别图像进行滤波。
2-2.对彩色被识别图像采用加权平均值法进行灰度化处理，将彩色被识别图像转为灰度值被识别图像。灰度值被识别图中第i行第j列像素点的灰度值Gray(i,j)如式(1)所示：
Gray(i,j)＝0.299×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.144×B(i,j) (1)
式(1)中，R(i,j)、G(i,j)、B(i,j)分别为彩色被识别图像中第i行第j列像素点的红色通道值、绿色通道值、蓝色通道值。
作为优选，步骤3-3中所述的全局阈值处理具体采用最大类间方差法对每幅子图像进行处理，在类间方差最大时得到背景与菌落的最佳阈值，其中阈值为T时的类间方差
Figure BDA0002318422740000044
定义如式(3)所示。
Figure BDA0002318422740000042
其中，ω0为前景点数占总像素点数的比例；μ0为各前景点的平均灰度值；ω1为背景点数占总像素点数的比例；μ1为各背景点的平均灰度值；μ为被处理的子图像的平均灰度值。前景点是灰度值大于阈值T的像素点；背景点是灰度值小于或等于阈值T的像素点。
通过对不同大小的阈值T进行迭代，得到类间方差
Figure BDA0002318422740000043
与阈值T的关系曲线；取最大的类间方差对应的阈值T作为最佳分割阈值。将大于阈值T的像素点的灰度值设置为255，小于阈值T的像素点灰度值设置为0。
作为优选，步骤4的具体操作如下：
4-1.将二值被识别图像的中所有像素值为255的像素点的坐标值(x,y)分别代入圆锥表达式如式(4)所示。
(x-a)2+(y-b)2＝r2 (4)
式(4)中，a、b、r分别为三维参数空间中的三个坐标值；二值被识别图像中的每个白色像素点的坐标值均对应三维参数空间中的一个圆锥曲面。
4-2.设定检测的最小半径r'，这里根据图像大小自适应设置检测的最小半径，r'的表达式如式(5)所示。
Figure BDA0002318422740000051
4-3.将r'赋值给r。
4-4.将限定为固定值的r代入圆锥表达式中，使得各圆锥表达式分别对应三维参数空间上的圆。各个圆均在高度坐标为r的截面上。
4-5.根据各个圆的直径和圆心位置，确定当前的r所对应的最大共点圆数量。最大共点圆数量指各个圆的交点中，经过最多圆的那个交点所对应的圆的数量。
4-6.若r<L/2，则将r增大1，并重复执行步骤4-5；否则，取各次执行步骤4-5所得的最大共点圆数量的最大值所对应的r值作为培养皿半径，该最大共点圆数量所对应的交点坐标为二值被识别图像中的培养皿圆心坐标。
4-7.对二值被识别图像所有像素进行遍历，将培养皿以外的所有像素点的灰度值均置为0。
作为优选，步骤5中所述的形态学处理具体为：先进行3次闭运算，再进行3次开运算。开运算是指进行一次腐蚀操作后再进行一次膨胀操作。闭运算是指进行一次膨胀操作后再进行一次腐蚀操作。膨胀和腐蚀所用的结构元素均为2×2的矩形。
作为优选，步骤7具体如下：
7-1.根据二值被识别图像上各特征椭圆的参数，在步骤1得到的彩色被识别图像上对应的位置添加各个目标椭圆。
7-2.根据各目标椭圆的圆心位置和长短轴长度，计算各目标椭圆对应的菌落的中心位置、面积和各阶颜色矩并进行数据库存储。在第i个目标椭圆上，三通道的一阶矩μi,x计算关系式如式(8)所示；三通道的二阶矩
Figure BDA0002318422740000052
计算关系式如式(9)所示；三通道的三阶矩
Figure BDA0002318422740000053
计算关系式如式(10)所示；
Figure BDA0002318422740000054
Figure BDA0002318422740000061
Figure BDA0002318422740000062
式(8)、(9)、(10)中，x表示彩色模式中的通道，分别为R通道、G通道和B通道。pi,j,x为彩色模式的被识别图像上第i个目标椭圆内的第j个像素点的x通道值。Ni为第i个目标椭圆内的像素总个数。
作为优选，每隔1小时重复执行一次步骤1至7；从而得到各菌落在不同时间段的生长信息。根据每个菌落在不同时间段的信息，计算出该菌落的生长速度、颜色变化，统计出整体菌落的生长特征。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明依靠计算机视觉的被识别图像处理方法，并结合统计学的算法，从培养皿复杂的菌落分布中将每个菌落的面积大小、颜色特征和边缘特征提取出来，能够得到非常精确的菌落总数量和菌落实际位置，从而方便了使用者统计菌落信息，减少了使用者的操作负担。
2、本发明能够自适应分割被识别图像并对子图像进行全局阈值Otsu二值化使得该方法具有更广的适用性，当被识别图像中菌落数量较少时也可以完好的二值化。若菌落数量较少时直接对整幅被识别图像进行全局阈值则会使得一些菌落被误识为背景，降低了计数准确度。而对被识别图像采用局部自适应阈值二值化的方法会使得菌落边缘变粗，不利于分割粘连菌落。
3、本发明提供了一种较好的二值被识别图像边缘提取算法，根据二值被识别图像的边缘性质，即边缘点在四方向上一定至少存在一个方向为黑白交替的情况，从而能够得到非常完整的边界被识别图像。并且提供了一种边界链表获取算法，根据八邻域方向获得顺时针链表，且根据由每个方向的偏转角度得到的相对偏移角度的符号能够判断链表的走向，从而将凹点识别出来，便于后续的拟合。
4、本发明提供了一种单菌落学习机制，为了更精确的分割粘连区域，先对所有单个菌落边缘进行拟合，统计其拟合椭圆的长短轴信息，得出最佳的长短轴比例作为后续拟合的长短轴比例，再对所有菌落进行拟合，这样不仅可以减少初始条件设定的困难，且可以非常好的估计出每个粘连菌落的具体个数，以及每个菌落的具体位置。
5、本发明通过对同固体培养基的不同时间下的信息采集，可以得到该培养皿中每个菌落不同时间段的面积大小、颜色矩参数等信息，将这些信息导出到数据库中，可以观察菌落的生长速度，或者对比不同菌落的生长参数。例如利用生长特征对比不加药物的菌落和加不同浓度药物剂量的菌落的生长状态，对初始培养条件相同的菌落在不同环境下的生长情况做定量对比，并将透明度指标引入定量分析中对其进行数值量化，从数值上比较透明度差异，这对食安领域中的细菌抑制性培养检测及定量分析具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的实施步骤框图；
图2为本发明中菌落分割的实施步骤框图；
图3为本发明中被识别图像灰度化后后的示意图；
图4为本发明中被识别图像Otsu全局阈值二值化后的示意图；
图5为本发明中被识别图像去除培养皿及其外部背景后的示意图；
图6为本发明中形态学开闭后的示意图；
图7为本发明中提取菌落边缘后的示意图；
图8为本发明中对菌落进行拟合椭圆后的示意图；
图9为本发明的验证中对照组与实验组中菌落生长曲线对比图；
图10为本发明的验证中对照组与实验组菌落灰度被识别图像素值分布图；
图11为本发明的验证中对照组与实验组在彩色三通道下的三阶颜色矩分布图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
一种目标菌落生长特征识别方法，适用于椭圆形或准圆形菌落的精确信息测定，例如对乳酸菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌进行信息测定。
如图1所示，本方法的具体步骤如下：
步骤1、用摄像机在纯黑色背景下对装有菌落的培养皿进行被识别图像采集，将无压缩的彩色被识别图像传输到计算机上。彩色被识别图像呈正方形。
步骤2、如图3所示，对彩色被识别图像进行灰度化和高斯滤波处理，为后续操作做准备。步骤2的具体步骤包括如下：
2-1.采用双边滤波方法对彩色被识别图像进行处理，双边滤波方法将空间域核与颜色域核叠加得到双核。用双核对被识别图像进行滤波。双边滤波方法在保留边缘的同时，可以很好地抑制平坦区域被识别图像的噪声。
2-2.在对菌落颜色进行分析前，需要先确定每个菌落的位置并计数，而这些操作并不关心菌落颜色，甚至颜色还会产生负面影响。因此，对彩色被识别图像采用加权平均值法进行灰度化处理，将原来的彩色被识别图像转为灰度值被识别图像。灰度值被识别图中第i行第j列像素点的灰度值Gray(i,j)如式(1)所示：
Gray(i,j)＝0.299×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.144×B(i,j) (1)
式(1)中，R(i,j)、G(i,j)、B(i,j)分别为彩色被识别图像中第i行第j列像素点的红色通道值、绿色通道值、蓝色通道值。0.299、0.587和0.144为固定参数。计算可得到每个像素点的灰度值，从而将彩色被识别图像转为灰度被识别图像。
步骤3、如图4所示，根据灰度化处理后的被识别图像的大小自适应对被识别图像进行分割。具体为：若被识别图像的像素行数在0～800，则将被识别图像按照16×16的正方形进行分割；若被识别图像的像素行数大于801～1600，则将被识别图像按照32×32进行分割，以此类推。对分割后的每幅被识别子图像进行全局阈值处理，再将处理后的被识别子图像拼接起来。其中步骤3的详细步骤如下：
3-1.设定图像分割块大小n×n；n的表达式如式(2)所示：
Figure BDA0002318422740000081
式(2)中，这里的L为被识别图像的像素行数，
Figure BDA0002318422740000082
为
Figure BDA0002318422740000083
向上取整所得值。
3-2.将被识别图像分割为多个n×n大小的子图像，对于被识别图像边缘剩余的长度小于n或宽度小于n的部分单独分割。
3-3.对分割后的每幅子图像进行全局阈值处理。具体使用最大类间方差法(即Otsu算法)对每幅子图像进行处理，在类间方差最大时得到背景与菌落的最佳阈值，其中阈值为T时的类间方差
Figure BDA0002318422740000084
定义如式(3)所示。
Figure BDA0002318422740000085
其中，ω0为前景点数占总像素点数(即n×n)的比例；μ0为各前景点的平均灰度值；ω1为背景点数占总像素点数的比例；μ1为各背景点的平均灰度值；μ为被处理的子图像的平均灰度值。前景点是灰度值大于阈值T的像素点；背景点是灰度值小于或等于阈值T的像素点。
通过对不同大小的阈值T的迭代尝试，得到类间方差
Figure BDA0002318422740000091
与阈值T的关系曲线；取最大的类间方差对应的阈值T作为最佳分割阈值。将大于阈值T的像素点的灰度值设置为255，小于阈值T的像素点灰度值设置为0，从而将被处理的子图像二值化。
3-4.将经过全局阈值处理的各个子图像按照顺序进行拼接，即得到二值被识别图像。
步骤4：如图5所示，步骤3处理得到的二值被识别图像需要进行Hough变换去除培养皿边缘及外部的所有像素。根据自适应设定的圆半径范围通过Hough变换检测二值被识别图像中的圆作为培养皿的边缘。然后根据Hough返回的圆心和半径将二值被识别图像中培养皿的边缘及该边缘以外的部分去除(即置为0)。具体的过程如下：
4-1.将二值被识别图像的中所有像素值为255(白色)的像素点的坐标值(x,y)分别代入圆锥表达式如式(4)所示。x表示像素点的行序号；y表示像素点的列序号。二值被识别图像的坐标系中左上点为坐标原点，下方向为x轴方向，右方向为y轴方向。
(x-a)2+(y-b)2＝r2 (4)
式(4)中，a、b、r分别为三维参数空间中的三个坐标值；二值被识别图像中的每个白色像素点的坐标值均对应三维参数空间中的一个圆锥。
4-2.设定检测的最小半径r'，这里根据图像大小自适应设置检测的最小半径，r'的表达式如式(5)所示。
Figure BDA0002318422740000092
4-3.将r'赋值给r。
4-4.将限定为固定值的r代入圆锥表达式中，使得各圆锥表达式分别对应三维参数空间上的圆。各个圆均在高度坐标为r的截面上。
4-5.根据各个圆的直径和圆心位置，确定当前的r所对应的最大共点圆数量。最大共点圆数量指各个圆的交点中，经过最多圆的那个交点所对应的圆的数量。假设高度坐标为r的截面上至多只有三个点交于同一点，则最大共点圆数量为3。
4-6.若r<L/2，则将r增大1，并重复执行步骤4-5；否则，取各次执行步骤4-5所得的最大共点圆数量的最大值所对应的r值作为培养皿半径，该最大共点圆数量所对应的交点坐标(x轴、y轴坐标)为二值被识别图像中的培养皿圆心坐标。
4-7.对二值被识别图像所有像素进行遍历，将培养皿(步骤4-6所得的圆)以外的所有像素点的灰度值均置为0。这可以较为明显的提高后续计数算法的准确性，使算法更专注于培养皿中的菌落区域。
步骤5：如图6所示，对步骤4处理后的二值被识别图像进行形态学处理，即对二值被识别图像重复交替地进行开运算和闭运算来减少较小的连通域或噪声点，并使边缘平滑。开运算是指进行一次腐蚀操作后再进行一次膨胀操作。闭运算是指进行一次膨胀操作后再进行一次腐蚀操作。通过交替进行开运算、闭运算可以去除较小的噪声点，也使得边界更加平滑。这里采用的结构元素为2×2的矩形，先进行3次闭运算，再进行3次开运算。最后得到形态学处理后的被识别图像。
步骤6：如图2、6和8所示，对步骤5处理后的二值被识别图像进行边缘处理，得到轮廓特征图像。再获取轮廓特征图像中所有连通域的顺时针链表，并计算各链表内每个像素点的相对角度，筛选出凹点；将具有凹点的链表从凹点处分割，形成多个独立的链表。对未被分割的链表进行最小二乘法椭圆拟合，统计出最佳长短轴比例；然后再根据最佳长短轴比例对所有经过分割的链表进行最小二乘法拟合，得到拟合椭圆，并根据条件筛选出符合条件的拟合椭圆。其中步骤6的具体步骤如下：
6-1.对步骤5所得的被识别图像，通过边缘条件检测得到菌落边缘。边缘条件为：菌落边缘上的像素点的八邻域内至少有一个黑色像素点。依据该条件，将二值被识别图像中八邻域内至少有一个黑色像素点的像素点标记为边缘像素点。在一张初始为黑色的新建图像上，将与二值被识别图像中各边缘像素点相对应的像素点置为白色，得到只含有菌落边缘的轮廓特征图像。
6-2.根据步骤6-1所得的轮廓特征图像，获取各个轮廓(菌落或粘连菌落群体)的边缘链表。对轮廓特征图像从左上角开始逐行搜索，搜索到灰度值为255且未记入链表的像素点时，以该像素点作为起始像素点；根据起始像素点建立一个链表，过程如下：
①.以起始像素点作为目标像素点，并作为起点记入链表。
②.以目标像素点的右方向为开始方向，对目标像素点的八领域进行顺时针搜索；将搜索到的第一个灰度值为255的像素点设置为路径点并记入链表。
③.若路径点的八领域内存在初始像素点或不存在灰度值为255的像素点，则链表建立完成，继续对二值被识别图像进行逐行搜索。否则，以路径点作为新的目标像素点，重复执行步骤②。
步骤6-2执行结束后，得到了轮廓特征图像上所有的连通域顺时针链表集G{g1,g2,...,gi,...gm}，其中gi为第i个链表，i＝1,2,...,m，m为链表的个数(连通域的数量)。
6-3.对于八邻域方向按照45°的间隔进行定义。分别计算m个链表内各像素点的相对角度；第i个链表上第j个像素点的相对角度a′i,j的表达式如式(6)所示。
Figure BDA0002318422740000111
式(6)中，ai,j为第i个链表上第j个像素点的偏移角度，ai,j-1为第i个链表上第j-1个像素点的偏移角度；第一个像素点的偏转角度为0；第二个像素点起，一个像素点的偏转角度指该像素点与前一个像素点的连线转动到右方向的逆时针角度(即该像素点指向前一个像素点的向量以该像素点为转动中心转动偏转角度后，所得向量朝向正右方)；具体参见表1。表1中的X坐标偏移量为本像素点相对于前一像素点的行号增加量，Y坐标偏移量为本像素点相对于前一像素点的列号增加量。举例来说，一个像素点位于前一个像素点的左下角，X坐标偏移量为1，Y坐标偏移量为-1，则该像素点的偏转角度为135°。
表1 顺时针链码定义
Figure BDA0002318422740000112
对每个链表循环计算相对角度可以得到每个链表的相对角度数组g′i{a′i,1,a′i,2,...,a′i,k,...,a′i,t}，其中a'i,k为第i个链表的第k个相对角度，t为链表内像素点的总数。
由于链表的顺序方向是顺时针，故相对角度一般为大于或等于0的数。若出现负数则将该点作为疑似凹点。若一个疑似凹点相邻的两个像素点中的任意一个像素点的相对角度为0，则将该疑似凹点标记为凹点。将链表在每个凹点处进行分割，分割后的每个链表成为独立的链表进行后续拟合。
通过该步骤可以得到新的链表组合G'{g'1,g'2,...,g'i,...g'm'}，其中g'i为第i个新链表，m'为经过分割后链表的个数。
6-4.对所有呈环形(首尾相连，即未经过分割)的链表进行椭圆拟合，每个呈环形的链表均得到一个拟合椭圆和一个长短轴比例。
以0.05为组距绘制所有链表长短轴比例的频率分布直方图，将频率最高的长短轴比例范围(0.05一组的比例所成的范围)的中值设定为特征长短轴比例；然后根据特征长短轴比例对各个非环形的链表进行最小二乘法拟合，得到各个非环形链表的拟合椭圆的圆心坐标、长轴长度和短轴长度。
6-5.对所有拟合椭圆长轴长度绘制箱型图，将箱型图中的离群点所对应的拟合椭圆删除。
6-6.根据轮廓特征图像上各拟合椭圆的参数，在经步骤5处理后的二值被识别图像上标记出多个特征椭圆；对二值被识别图像上所有特征椭圆进行筛选，删除置信度C小于80％的特征椭圆。一个特征椭圆的置信度C的表达式如式(7)所示。
Figure BDA0002318422740000121
式(7)中，H内为该特征椭圆的轮廓上或内部的像素灰度值为255的像素点个数；H总为该特征椭圆内的像素点总数。
6-7.对所有相交的特征椭圆进行筛选；若相交的两个特征椭圆之间的重合率大于或等于85％，则将该两个特征椭圆中置信度较低的那个椭圆删除；相交的两个特征椭圆之间的重合率
Figure BDA0002318422740000122
其中，s为该两个椭圆的相交部分的像素点个数；z为该两个椭圆中较大的那个椭圆内的像素点个数。
步骤7：根据特征椭圆获取所有目标菌落的数量、大小、颜色信息。步骤7具体如下：
7-1.根据二值被识别图像上各特征椭圆的参数，在步骤1得到的彩色被识别图像上对应的位置添加各个目标椭圆。
7-2.根据各目标椭圆的圆心位置和长短轴长度，计算各目标椭圆对应的菌落的中心位置、面积和各阶颜色矩并进行数据库存储。其中由于颜色特征一般分布在低阶矩中，故计算至三阶矩就可以得到主要特征。在第i个目标椭圆上，三通道的一阶矩μi,x计算关系式如式(8)所示；三通道的二阶矩
Figure BDA0002318422740000123
计算关系式如式(9)所示；三通道的三阶矩
Figure BDA0002318422740000124
计算关系式如式(10)所示；
Figure BDA0002318422740000125
Figure BDA0002318422740000131
Figure BDA0002318422740000132
式(8)、(9)、(10)中，x表示彩色模式中的通道，分别为R通道、G通道和B通道。pi,j,x为彩色模式的被识别图像上第i个目标椭圆内的第j个像素点的x通道值。Ni为第i个目标椭圆内的像素总个数。
步骤8：每隔1小时重复执行一次步骤1至7；从而得到各菌落在不同时间段的生长信息。根据每个菌落在不同时间段的信息，计算出该菌落的生长速度、颜色变化，从而统计出整体菌落的生长特征。根据每个菌落在不同时间的信息变化，绘制各菌落对应的生长曲线，以及状态变化情况。利用数据库可以分析整体菌落的生长情况，不同菌落生长情况对比，以及实验组与对照组之间的对比。
本实例在相同条件下培养了多批菌落进行对比，分别为正常生长的对照组菌落和在生长一段时间后添加抗生素的实验组菌落。细菌初始浓度为9×106CFU/ml，各组培养基为LB培养基，加药组药量为：16.6mg/ml。对于存入数据库中的面积、颜色矩等关键信息进行提取，按照间隔1小时取了18个小时的数据，并绘制了菌落生长曲线的对比图如图9所示。由于在菌落面积较小时难以检测，故采用生长到一定规模的菌落进行对比。挑选的两组菌落在培养基上出现的时间基本相同，且选择的两组菌落都为单个菌落。利用完善的数据库，可以快速建立每个菌落的生长曲线模型，由图9所示，给出了两组菌落的生长曲线区别。当添加抗生素后菌落面积增长变慢，生长速度逐渐停止。
再通过对每个菌落灰度图的像素值分布进行统计，建立了两组菌落像素值的分布曲线，由图10所示。本实例定义了透明度的量化指标，以培养皿背景灰度图的直方图定义透明度为0，而菌落透明度值则为透明度为0所在的灰阶减去菌落频率分布直方图最大值所在灰阶后的值，本例中对照组菌落透明度为-23.03±3.54，而实验组透明度为-32.78±5.61。根据结果分析，由于对照组菌落生长良好、透明度较高，峰值明显，其分布曲线偏左。而实验组菌落由于抗生素抑制作用皱缩明显，透明度较低，峰值不明显，灰度值较高，分布曲线偏右，所以灰度分布值反映的透明度指标是检测细菌生长情况的一个重要指标。同时，根据数据库中还有每个菌落颜色RGB三通道下的一阶、二阶、三阶颜色矩信息，我们提取了对加药后特征参数最明显的三阶颜色矩直方图(每组中各增加9个菌落)，如图11所示。可以看到对照组与实验组三阶矩在三个通道下，加药比不加药的细菌菌落三阶矩明显降低，因此也是一个加药后微生物信息的重要对比参数值。
与现有的菌落计数及相关信息测定方法相比(陈可意，菌落计数与分类智能算法研究[D]天津：天津大学精密仪器及光电子工程学院，2014：40-67)，本发明在计数准确率拥有足够的优势，计数准确度可以达到98％，且适用椭圆与准圆形菌落的计数，鲁棒性较高。通过定位每个菌落相对培养皿的实际位置，可以将不同时间下的菌落图像信息都存储在数据库中，简化了统计与分析过程。通过对初始培养条件相同的菌落在不同环境下的同期生长情况做定量对比，并将透明度指标进行量化，对食安领域中的细菌抑制性培养检测及定量分析具有重要意义。

Claims (8)

1.一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤1、用摄像机在纯黑色背景下对装有菌落的培养皿进行图像采集，得到彩色被识别图像；
步骤2、对彩色被识别图像进行灰度化和高斯滤波处理，得到灰度值被识别图像；
步骤3、根据灰度值被识别图像的大小进行自适应分割，并进行二值化处理；
3-1.设定图像分割块大小n×n；n的表达式如式(2)所示：
Figure FDA0002318422730000011
式(2)中，L为灰度值被识别图像的像素行数，
Figure FDA0002318422730000012
为
Figure FDA0002318422730000013
向上取整所得值；
3-2.将被识别图像分割为多张n×n大小的子图像；
3-3.对分割后的每幅子图像进行全局阈值处理；
3-4.将经过全局阈值处理的各幅子图像按照顺序进行拼接，即得到二值被识别图像；
步骤4：检测二值被识别图像中的培养皿边缘，并将培养皿的边缘及该边缘以外的部分置为0；
步骤5：对步骤4处理后的二值被识别图像进行形态学处理；
步骤6：对步骤5处理后的二值被识别图像进行轮廓检测、轮廓分割、椭圆拟合和椭圆筛选；具体过程如下：
6-1.将步骤5处理后的二值被识别图像中八邻域内至少有一个黑色像素点的像素点标记为边缘像素点；在一张初始为黑色的图像上，将与二值被识别图像中各边缘像素点相对应的像素点置为白色，得到只含有菌落边缘的轮廓特征图像；
6-2.对轮廓特征图像从左上角开始逐行搜索，搜索到灰度值为255且未记入链表的像素点时，以该像素点作为起始像素点；根据起始像素点建立一个链表，过程如下：
①.以起始像素点作为目标像素点，并作为起点记入链表；
②.以目标像素点的右方向为开始方向，对目标像素点的八领域进行顺时针搜索；将搜索到的第一个灰度值为255的像素点设置为路径点并记入链表；
③.若路径点的八领域内存在初始像素点或不存在灰度值为255的像素点，则链表建立完成，继续对二值被识别图像进行逐行搜索；否则，以路径点作为新的目标像素点，重复执行步骤②；
步骤6-2执行结束后，得到了轮廓特征图像上所有的连通域顺时针链表集；
6-3.分别计算m个链表内各像素点的相对角度；第i个链表上第j个像素点的相对角度a′i,j的表达式如式(6)所示；
Figure FDA0002318422730000021
式(6)中，ai,j为第i个链表上第j个像素点的偏移角度，ai,j-1为第i个链表上第j-1个像素点的偏移角度；第一个像素点的偏转角度为0；第二个像素点起，一个像素点的偏转角度指该像素点与前一个像素点的向量转动到右方向的逆时针角度；
若出现负数则将该点作为疑似凹点；若一个疑似凹点相邻的两个像素点中的任意一个像素点的相对角度为0，则将该疑似凹点标记为凹点；将链表在每个凹点处进行分割；
6-4.对所有呈环形的链表进行椭圆拟合，每个呈环形的链表均得到拟合椭圆和长短轴比例；
对长短轴比例的范围进行从小到大等距分组，将出现链表频率最高的范围的中值设定为特征长短轴比例；然后根据特征长短轴比例对各个非环形的链表进行最小二乘法拟合，得到各个非环形链表的拟合椭圆的圆心坐标、长轴长度和短轴长度；
6-5.对所有拟合椭圆长轴长度绘制箱型图，将箱型图中的离群点所对应的拟合椭圆删除；
6-6.根据轮廓特征图像上各拟合椭圆的参数，在经步骤5处理后的二值被识别图像上标记出多个特征椭圆；对二值被识别图像上所有特征椭圆进行筛选，删除置信度C小于80％的特征椭圆；一个特征椭圆的置信度C的表达式如式(7)所示；
Figure FDA0002318422730000022
式(7)中，H内为该特征椭圆的轮廓上或内部的像素灰度值为255的像素点个数；H总为该特征椭圆内的像素点总数；
6-7.对所有相交的特征椭圆进行筛选；若相交的两个特征椭圆之间的重合率大于或等于85％，则将该两个特征椭圆中置信度较低的那个椭圆删除；相交的两个特征椭圆之间的重合率
Figure FDA0002318422730000023
其中，s为该两个椭圆的相交部分的像素点个数；z为该两个椭圆中较大的那个椭圆内的像素点个数；
步骤7：根据各个特征椭圆获取培养皿中各个菌落的数量、大小、颜色信息。
2.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：所述的彩色被识别图像呈正方形。
3.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤2的具体步骤包括如下：
2-1.采用双边滤波方法对彩色被识别图像进行处理，双边滤波方法将空间域核与颜色域核叠加得到双核；用双核对被识别图像进行滤波；
2-2.对彩色被识别图像采用加权平均值法进行灰度化处理，将彩色被识别图像转为灰度值被识别图像；灰度值被识别图中第i行第j列像素点的灰度值Gray(i,j)如式(1)所示：
Gray(i,j)＝0.299×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.144×B(i,j) (1)
式(1)中，R(i,j)、G(i,j)、B(i,j)分别为彩色被识别图像中第i行第j列像素点的红色通道值、绿色通道值、蓝色通道值。
4.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤3-3中所述的全局阈值处理具体采用最大类间方差法对每幅子图像进行处理，在类间方差最大时得到背景与菌落的最佳阈值，其中阈值为T时的类间方差
Figure FDA0002318422730000031
定义如式(3)所示；
Figure FDA0002318422730000032
其中，ω0为前景点数占总像素点数的比例；μ0为各前景点的平均灰度值；ω1为背景点数占总像素点数的比例；μ1为各背景点的平均灰度值；μ为被处理的子图像的平均灰度值；前景点是灰度值大于阈值T的像素点；背景点是灰度值小于或等于阈值T的像素点；
通过对不同大小的阈值T进行迭代，得到类间方差
Figure FDA0002318422730000033
与阈值T的关系曲线；取最大的类间方差对应的阈值T作为最佳分割阈值；将大于阈值T的像素点的灰度值设置为255，小于阈值T的像素点灰度值设置为0。
5.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤4的具体操作如下：
4-1.将二值被识别图像的中所有像素值为255的像素点的坐标值(x,y)分别代入圆锥表达式如式(4)所示；
(x-a)2+(y-b)2＝r2 (4)
式(4)中，a、b、r分别为三维参数空间中的三个坐标值；二值被识别图像中的每个白色像素点的坐标值均对应三维参数空间中的一个圆锥曲面；
4-2.设定检测的最小半径r'，这里根据图像大小自适应设置检测的最小半径，r'的表达式如式(5)所示；
Figure FDA0002318422730000041
4-3.将r'赋值给r；
4-4.将限定为固定值的r代入圆锥表达式中，使得各圆锥表达式分别对应三维参数空间上的圆；各个圆均在高度坐标为r的截面上；
4-5.根据各个圆的直径和圆心位置，确定当前的r所对应的最大共点圆数量；最大共点圆数量指各个圆的交点中，经过最多圆的那个交点所对应的圆的数量；
4-6.若r<L/2，则将r增大1，并重复执行步骤4-5；否则，取各次执行步骤4-5所得的最大共点圆数量的最大值所对应的r值作为培养皿半径，该最大共点圆数量所对应的交点坐标为二值被识别图像中的培养皿圆心坐标；
4-7.对二值被识别图像所有像素进行遍历，将培养皿以外的所有像素点的灰度值均置为0。
6.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤5中所述的形态学处理具体为：先进行3次闭运算，再进行3次开运算；开运算是指进行一次腐蚀操作后再进行一次膨胀操作；闭运算是指进行一次膨胀操作后再进行一次腐蚀操作；膨胀和腐蚀所用的结构元素均为2×2的矩形。
7.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：步骤7具体如下：
7-1.根据二值被识别图像上各特征椭圆的参数，在步骤1得到的彩色被识别图像上对应的位置添加各个目标椭圆；
7-2.根据各目标椭圆的圆心位置和长短轴长度，计算各目标椭圆对应的菌落的中心位置、面积和各阶颜色矩并进行数据库存储；在第i个目标椭圆上，三通道的一阶矩μi,x计算关系式如式(8)所示；三通道的二阶矩
Figure FDA0002318422730000042
计算关系式如式(9)所示；三通道的三阶矩
Figure FDA0002318422730000043
计算关系式如式(10)所示；
Figure FDA0002318422730000051
Figure FDA0002318422730000052
Figure FDA0002318422730000053
式(8)、(9)、(10)中，x表示彩色模式中的通道，分别为R通道、G通道和B通道；pi,j,x为彩色模式的被识别图像上第i个目标椭圆内的第j个像素点的x通道值；Ni为第i个目标椭圆内的像素总个数。
8.根据权利要求1所述的一种目标菌落生长特征识别方法，其特征在于：每隔1小时重复执行一次步骤1至7；从而得到各菌落在不同时间段的生长信息；根据每个菌落在不同时间段的信息，计算出该菌落的生长速度、颜色变化，统计出整体菌落的生长特征。
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