CN113902713A - 一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法。采集图像并预处理和菌落图像获取；进行第一次二值化处理获得二值化图像，再距离变换处理和拉伸处理获得距离图像，对距离图像进行第二次二值化处理和闭包处理，得到菌落二值图像；使用基于凹点匹配的多菌落分割方法得到分割后的菌落图像，再轮廓检测获得标记图像，对标记图像进行轮廓特征分析滤除非菌落体的标记；利用标记图像对菌落图像做分水岭变换计数获得菌落数量。本发明增加凹点匹配方法，优化多菌落体的分割结果，提高多个菌落相互连接时计数的准确性，同时不影响计数速度，解决了菌落数量多、分布密集时计数速度慢且计数准确性不高的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域的一种菌落图像计数方法，具体涉及一种适用于密集菌落群的菌落计数方法。
背景技术
菌落检测在生物医学、食品、污水处理等领域具有重要意义，是生物制药、食品检测、微生物学研究等操作过程中最常见的技术手段。其中菌落计数是检测过程中的一项关键技术。
标准的人工计数方法是平板菌落计数法。该方法的先将待测样本进行适当稀释，在适宜温度下培养一段时间后，通过肉眼观察计数。手工计数方法漫长且费力，对于高密集度的菌落而言，人类视觉能力无法进行高效精准的计数任务。同时，手工计数方法仅保存统计数据，原始数据结果无法保存，不利于后期的数据分析以及二次检测，无法实现检测的准确性及数据化管理。
为克服传统手工计数方法的局限，通过数字图像处理技术，研究实现菌落数量的自动检测。通过算法优化，提高计数效率和准确性，并且能够对数据样本进行保存，便于后续处理分析。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明基于图像分割算法提出了一种适用于密集菌落群的菌落计数方法，以解决现有菌落计数方法由于无法准确分割多菌落体(多个菌落粘连在一起)，将菌落群体作为单菌落体进行计数，导致菌落计数结果不准确的问题。
本发明所采用的技术方案是：
步骤1、采集图像并预处理和菌落图像获取：采集菌落置于培养皿中的完整俯视图图像，然后降低图像的噪声，并同时识别获取图像中培养皿区域，对培养皿区域进行前景与背景的对比度增强处理，获得删除背景后的菌落图像；
步骤2、将删除背景后的菌落图像进行第一次二值化处理获得包含菌落轮廓信息的二值化图像，对二值化图像进行距离变换处理和拉伸处理，获得具有显著菌落特征的距离图像，随后对距离图像进行第二次二值化处理和闭包处理，得到包含多个单连通域区域的菌落二值图像；
步骤3、菌落二值图像中单连通区域代表了菌落，包含单菌落体、多菌落体和非菌落体，对菌落二值图像使用基于凹点匹配的多菌落分割方法得到分割后的菌落图像，再对图像进行轮廓检测获得包含所有菌落闭合轮廓的标记图像，同时通过对标记图像进行轮廓特征分析滤除非菌落体的标记；
步骤4、利用步骤3获得的标记图像对步骤1获得删除背景后的菌落图像做分水岭变换，完成菌落图像的最终区域分割结果，对最终区域分割结果进行区域计数获得菌落图像中的菌落数量。
所述步骤1中，降低图像的噪声具体是对采集的图像做高斯滤波和中值滤波，做降噪处理滤除图像中夹杂的椒盐噪声和高斯滤波。
所述步骤1中，还包括：
S11、基于培养皿固有形状特征通过圆检测获取培养皿的边界圆作为培养皿区域，；
S12、在培养皿区域内通过直方图均衡处理增强图像整体的对比度；
S13、在完成直方图均衡优化后，获取各种灰度值对应的像素的数量占图像中总像素数量的比例，根据比例的大小来判断像素是否为背景像素，判断式如下，
其中，Npix代表每一个灰度值在图像中的数量，Sd代表培养皿区域的面积，T为灰度比例阈值，具体实施设置其为0.7；
若满足上述判断式，则该灰度值对应的像素为背景像素；否则为前景像素；
S14、最后将所有背景像素的灰度值置0，由此对培养皿区域进行前景与背景的对比度增强处理，获得删除背景后的菌落图像。
所述S12直方图均衡的步骤包括：
S12.1、对图像各通道像素值分别统计，获得各通道的图像直方图；
S12.2、对各直方图的灰度进行拉伸，使各直方图的灰度范围均匀分布在全部灰度范围0-255内；例如直方图中所有像素统计获得的灰度范围为10-100，则处理将10-100范围拉伸到0-255范围。
所述步骤2中，第一次二值化采用OTSU阈值化，自适应获取一个使得菌落图像前景和背景分开的阈值，完成对删除背景后的菌落图像的二值化处理；
第二次二值化采用固定阈值二值化处理，预先设定一个极小的阈值完成对距离图像的二值化处理，将距离图像中的浮点信息转化为易处理的二值信息以及消除距离图像中的噪声，若存在噪声像素点，则生成的距离图像中的对应位置会呈现一个极小的值。
所述步骤2中的距离变换处理具体是将二值化图像中的每个前景像素进行遍历，每个前景像素中径向向外不断扩展直到扩展到背景像素则停止并计算已扩展的像素距离作为输出距离，将所有前景像素的输出距离归一化到0-1范围内，0代表了输出距离为零，1表示输出距离为最大。
所述步骤2中的拉伸处理是将输出距离的0-1范围对应拉伸到0-255的全部灰度范围。
所述步骤2中，闭包处理是对整体图像做闭包处理，完成对二值图像中各菌落对应前景像素的内部填充，级将属于前景的单连通域区域中的背景像素删除，填充空洞。
所述步骤3中，基于凹点匹配的多菌落分割方法，具体是针对菌落二值图像中的每个单连通域区域进行以下处理：
首先，识别获取单连通域区域中的凹点：
遍历单连通域区域中的每个前景像素，在以每个前景像素为中心的n*n邻域中，若存在的前景像素的数量小于预设数量阈值，则该前景像素认为是待选凹点；否则不为待选凹点；
对所有待选凹点进行聚类，针对坐标连续的多个待选凹点，选择的n*n邻域中前景像素数量最小的待选凹点作为该类中的最终的凹点；
首先，识别获得凹点的朝向：
在以每个凹点为中心的n*n邻域中，统计所有前景像素坐标的平均坐标位置，将平均坐标位置和凹点进行连线，并加上预设的偏置角度，获得凹点的朝向；凹点的朝向具体为一个角度范围。
其次，单连通域区域中，根据每一个凹点的朝向找到与之相匹配的凹点，若两个凹点的朝向相对且具有重叠方向则形成凹点间匹配对，并将凹点间匹配对中的两个凹点作连线，并且连线的像素置0，完成多菌落体的分割。
所述步骤3中，对标记图像进行轮廓特征分析，具体是使用计算轮廓矩的方法获得轮廓的宽长比来区别菌落和非菌落：
若轮廓的宽长比小于预设宽长比阈值，则判断该轮廓为非菌落；
若轮廓的宽长比大于等于预设宽长比阈值，则判断该轮廓为菌落。
本发明通过数字图像处理技术，对目前基于分水岭算法的菌落计数框架进行改进。本发明是在分水岭算法对多菌落体进行识别、分割的基础上，增加凹点匹配方法，优化多菌落体的分割结果。通过凹点匹配方法，利用菌落连接处的凹点对图像进行分割处理，提高多个菌落相互连接时计数的准确性，同时不影响计数速度，解决了菌落数量多、分布密集时计数速度慢且计数准确性不高的问题。
本发明具有以下有益效果：
1、使用图像处理方法(预处理、特征提取和特征识别等)代替传统的人工菌落计数，保证菌落计数结果准确性的同时，解决了人工菌落计数速度慢、劳动力消耗大等问题。
2、在使用分水岭算法进行菌落计数的框架上，加入了凹点匹配的方法，在原本通过分水岭识别和分割多菌落体的基础上，优化了多菌落体的分割结果，在保证算法运行速度快的同时，进一步优化了菌落计数算法，提高了针对存在多菌落体情况的菌落计数的准确性。
附图说明
图1为菌落计数的算法流程图；
图2为采集到典型菌落样本图像；
图3为删除背景后的菌落图像；
图4为距离变换的结果图；
图5为距离图像归一化后未进行闭包处理的结果图；
图6为距离图像归一化后并进行闭包处理后的结果图；
图7为凹点匹配并分割后的结果图；
图8为分水岭算法分割结果示意图；
图9为菌落的识别结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的解释说明。
本发明的实施例及其实施过程如下：
如图1所示，其中说明了本发明提出的菌落计数算法流程图。首先通过Opencv库函数读取预先采集的菌落图像，本实施例典型的样本图像如图2所示，该图像为BGR三通道图像(图像格式为PNG)，其分辨率为1536*1520。在读取图像后对源图像做高斯滤波和中值滤波，采用3*3的卷积核作为高斯滤波和中值滤波的卷积核。考虑到培养皿始终具有圆形轮廓特征，基于霍夫圆检测算法，检测出图像中的所有圆形，计算每个圆形的半径，其中半径最大的圆即为培养皿的边界，通过该圆形区域，找到培养皿位置，对培养皿外的区域像素全部置零，同时获得培养皿区域的位置与其面积，作为后续计算需要的参数。
使用直方图均衡方法对培养皿区域进行前景(菌落)和背景(培养皿)的对比度增强，然后根据判断式找出所有的背景元素所代表的像素，将其置零，得到删除背景的菌落图像如图3所示。
对删除背景的图像做OSTU阈值化处理，并将阈值化后的二值图像进行距离变换，获得可以代表菌落目标点(像素值为255)和背景(像素值为0)的距离信息，以灰度图进行呈现。距离变换的结果如图4所示，随后通过归一化和二值化处理得到包含每一个菌落区域的二值图像，往往由于菌落的生长方式略有区别，导致二值图像中的菌落区域可能存在非单连通区域的情况(即区域内存在孔洞)，如图5所示。在图5中，右下角的方形区域是对图中部分区域的放大示意图，可以看到在该放大区域中用红色椭圆标识的0像素即为孔洞，这些存在的孔洞可能会对后续的处理产生影响。通过闭包算法完成对单连通区域的判断并对其进行填充，填充结果如图6所示。
进一步通过凹点检测与凹点匹配，对每一对匹配的凹点所构成的连线进行背景色填充，完成多菌落区域的分割，分割结果如图7所示。在图7中，可以清晰的看到在该典型样本图像中，多菌落体被分割为独立的个体。在这之后，先进行轮廓检测与轮廓分析，计算每一个轮廓面积，长宽比以及形状特征，形状特征主要是通过计算单独轮廓的面积与其最小外接椭圆的面积比，通过该比值以及其他条件(轮廓面积、长宽比等)来判断该轮廓是否为菌落轮廓，若不是，则删除该区域。结合完成轮廓分析后的标记图，使用分水岭算法对源图像进行区域分割，分水岭变换后的结果示意图如图8所示。最后对区域分割后的图像完成菌落的计数与定位，完成对菌落图像的识别与计数，识别结果示意图如图9所示。在图9中可以看到，本发明所创新的分水岭算法与凹点匹配算法的结合对菌落的识别效果较好，并且对存在粘连情况的菌落也可以准确识别并正确计数。
Claims (10)
1.一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：方法具体包括以下几个步骤：
步骤1、采集图像并预处理和菌落图像获取：采集菌落置于培养皿中的完整俯视图图像，然后降低图像的噪声，并同时识别获取图像中培养皿区域，对培养皿区域进行前景与背景的对比度增强处理，获得删除背景后的菌落图像；
步骤2、将删除背景后的菌落图像进行第一次二值化处理获得包含菌落轮廓信息的二值化图像，对二值化图像进行距离变换处理和拉伸处理，获得具有显著菌落特征的距离图像，随后对距离图像进行第二次二值化处理和闭包处理，得到包含多个单连通域区域的菌落二值图像；
步骤3、对菌落二值图像使用基于凹点匹配的多菌落分割方法得到分割后的菌落图像，再对图像进行轮廓检测获得包含所有菌落闭合轮廓的标记图像，同时通过对标记图像进行轮廓特征分析滤除非菌落体的标记；
步骤4、利用步骤3获得的标记图像对步骤1获得删除背景后的菌落图像做分水岭变换，完成菌落图像的最终区域分割结果，对最终区域分割结果进行区域计数获得菌落图像中的菌落数量。
2.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤1中，降低图像的噪声具体是对采集的图像做高斯滤波和中值滤波，做降噪处理滤除图像中夹杂的椒盐噪声和高斯滤波。
3.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤1中，还包括：
S11、基于培养皿固有形状特征通过圆检测获取培养皿的边界圆作为培养皿区域，；
S12、在培养皿区域内通过直方图均衡处理增强图像整体的对比度；
S13、在完成直方图均衡优化后，获取各种灰度值对应的像素的数量占图像中总像素数量的比例，根据比例的大小来判断像素是否为背景像素，判断式如下，
其中，Npix代表每一个灰度值在图像中的数量，Sd代表培养皿区域的面积，T为灰度比例阈值；
若满足上述判断式，则该灰度值对应的像素为背景像素；否则为前景像素；
S14、最后将所有背景像素的灰度值置0，获得删除背景后的菌落图像。
4.如权利要求3所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述S12直方图均衡的步骤包括：
S12.1、对图像各通道像素值分别统计，获得各通道的图像直方图；
S12.2、对各直方图的灰度进行拉伸，使各直方图的灰度范围均匀分布在全部灰度范围0-255内。
5.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤2中，第一次二值化采用OTSU阈值化，自适应获取一个使得菌落图像前景和背景分开的阈值，完成对删除背景后的菌落图像的二值化处理；
第二次二值化采用固定阈值二值化处理，预先设定一个极小的阈值完成对距离图像的二值化处理，将距离图像中的浮点信息转化为易处理的二值信息以及消除距离图像中的噪声。
6.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤2中的距离变换处理具体是将二值化图像中的每个前景像素进行遍历，每个前景像素中径向向外不断扩展直到扩展到背景像素则停止并计算已扩展的像素距离作为输出距离，将所有前景像素的输出距离归一化到0-1范围内。
7.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤2中的拉伸处理是将输出距离的0-1范围对应拉伸到0-255的全部灰度范围。
8.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤2中，闭包处理是对整体图像做闭包处理，完成对二值图像中各菌落对应前景像素的内部填充，级将属于前景的单连通域区域中的背景像素删除。
9.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤3中，基于凹点匹配的多菌落分割方法，具体是针对菌落二值图像中的每个单连通域区域进行以下处理：
首先，识别获取单连通域区域中的凹点：
遍历单连通域区域中的每个前景像素，在以每个前景像素为中心的n*n邻域中，若存在的前景像素的数量小于预设数量阈值，则该前景像素认为是待选凹点；否则不为待选凹点；
对所有待选凹点进行聚类，针对坐标连续的多个待选凹点，选择的n*n邻域中前景像素数量最小的待选凹点作为最终的凹点；
首先，识别获得凹点的朝向：
在以每个凹点为中心的n*n邻域中，统计所有前景像素坐标的平均坐标位置，将平均坐标位置和凹点进行连线，并加上预设的偏置角度，获得凹点的朝向；
其次，单连通域区域中，根据每一个凹点的朝向找到与之相匹配的凹点，若两个凹点的朝向相对且具有重叠方向则形成凹点间匹配对，并将凹点间匹配对中的两个凹点作连线，并且连线的像素置0，完成多菌落体的分割。
10.如权利要求1所述一种基于图像分割算法的多菌落体计数方法，其特征在于：所述步骤3中，对标记图像进行轮廓特征分析，具体是使用计算轮廓矩的方法获得轮廓的宽长比来区别菌落和非菌落：
若轮廓的宽长比小于预设宽长比阈值，则判断该轮廓为非菌落；
若轮廓的宽长比大于等于预设宽长比阈值，则判断该轮廓为菌落。
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