CN111172131A

CN111172131A - 玉米cipk42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用

Info

Publication number: CN111172131A
Application number: CN202010077011.5A
Authority: CN
Inventors: 陈勋基; 黄全生; 李晓荣; 李娟�; 郝晓燕; 陈果; 李建平; 常晓春; 高升旗; 足木热木·吐尔逊
Original assignee: Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Nuclear Technology Biotechnology (xinjiang Uygur Autonomous Region Biotechnology Research Center)
Current assignee: Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Nuclear Technology Biotechnology (xinjiang Uygur Autonomous Region Biotechnology Research Center)
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-01-23
Also published as: CN111172131B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了玉米CIPK42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用。本发明发现玉米ZmCIPK42基因能够正调控植物耐盐性，通过提高ZmCIPK42基因的表达量，能够有效提高植物的耐盐性。本发明构建了ZmCIPK42过量表达的转基因玉米及拟南芥植株，通过与非转基因的野生型相比，转基因植株的耐盐性和生长量能显著提高。ZmCIPK42基因的耐盐功能的发现为培育耐盐植物品种提供了新的基因靶点和资源，对植物的耐盐分子机制的研究具有重要意义，为研究植物应答盐胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定一定的理论基础。

Description

玉米CIPK42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种玉米CIPK42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用。

背景技术

为了适应生长过程中的环境变化，植物会遇到一系列生物和非生物胁迫因素，例如干旱，盐碱和病原体感染。这些环境胁迫大部分与钙信号有关。钙离子(Ca²⁺)是细胞中的第二信使，几乎参与了所有非生物和生物胁迫的信号转导。Ca²⁺依赖的信号通路参与植物发育和环境响应的许多方面。研究表明，在受到环境因子的刺激后，细胞编码的转运蛋白在时间和空间上感知这些信号，并将这些信号传递到下游基因。植物细胞具有一系列的钙传感器蛋白，它们可以感知Ca²⁺并传递胁迫信号，然后调节其靶蛋白，从而进一步调控下游的抗逆反应。类钙调神经素B亚基蛋白(CBL)家族蛋白氨基酸序列与动物中钙调神经素调节B亚基以及神经细胞的钙感受器高度同源。Ca²⁺传感器中的这些非催化性Ca²⁺信号通过与CBL相互作用的蛋白激酶(CIPK)发生物理相互作用并激活它们的活性，从而激活下游一系列基因的表达。

虽然到目前为止，通过基因组数据的分析已经发现在拟南芥上有10个CBL基因，26个CIPK基因，在水稻上有10个CBL基因，30个CIPK基因，但也只有个别的基因的功能得以研究，对于不同CBL，CIPK基因所调控的不同的信号途径也仅限于初步的了解。当植物受到高盐胁迫时，引起胞内Ca²⁺浓度升高，SOS3首先感受到Ca²⁺所传导的胁迫信号，然后特异性地激活SOS2，SOS2进一步作用于Na⁺/H⁺反转运子(即SOS1)，SOS1将胞内多余的Na⁺转运到胞外，达到抵抗Na⁺对植物细胞的毒害作用。这一调控通路是在目前的抗逆研究领域中研究的比较清楚的调控途径。2003美国Luan Sheng教授研究组对拟南芥的CIPK家族成员之一AtCIPK3基因的功能进行了研究，发现CIPK3基因在3-7天的幼苗期有较高的表达，在成株期表达量很低，有趣的是，AtCIPK3基因在ABA、冷害、高盐、干旱、机械伤害等诱导下有高水平的表达。但是AtCIPK3的突变体在各种逆境的胁迫下，并没有明显的表型的变化。Chikano等(2001)研究发现另外一个拟南芥CIPK家族成员之一AtSR2(即AtCIPK14)参与到糖的调控途径中，AtCIPK14的突变体对葡萄糖(Glc)非常敏感，但是对各种渗透胁迫却没有任何反应，暗示着AtCIPK14可能特异性地参与在糖的调控体系中。郭岩等研究团队分析了拟南芥pks5(cipk11)突变体根中净质子流量的变化情况，发现野生型内的H⁺外流远远高于突变体，pks5突变体植株把质子排出胞外因而能够忍耐外部更高的pH。由此说明植物CIPK基因家族参与了不同非生物胁迫的调控，不同调控通路之间存在共性也存在特异性，预示着它们对非生物逆境胁迫调控的复杂变化。

目前，大部分功能基因由于其结构的同源性，划分为同一家族和不同分支，同源基因之间可以进行相互比较，进行功能推测。但是研究也发现相似性很高的基因之间其功能也不尽相同，Chen Xifeng等人在2011年对玉米中38个CIPK(1-38)基因进化和非生物胁迫下表达量分析发现玉米CIPK 19、20、24和31在盐胁迫处理后表达量呈现上升趋势，但是到目前还未见到这些基因在提高耐盐性的报道。我们在研究玉米CIPK24基因功能时发现，ZmCIPK24受到盐胁迫诱导，在拟南芥中过表达ZmCIPK24，在盐胁迫条件下与对照相比转基因植株耐盐性并没有明显提升。朱健康等人对拟南芥CIPK11进行基因功分析，研究结果表明，拟南芥CIPK11基因突变后，对碱的耐受性降低，但是过表达CIPK11却并不能提高其耐碱反应(Anja T.Fuglsang，2007)。由此说明在CIPK基因家族中受到盐胁迫诱导表达量的基因，在其过表达后却不一定能提升植株的耐盐碱性。

对于农作物基因功能研究主要通过精细定位、突变体和基因过量表达进行功能验证，先前这方面的研究工作大部分是在模式植物拟南芥上进行的。有些农作物功能基因在拟南芥中可以提高其抗逆性，但是转化农作物后，其抗逆性并没有明显提升。另外，由于玉米转化还存在周期长、转化效率不高的问题，所以在玉米中能够提高其抗逆性的功能基因还比较少。大量研究表明CIPK基因家族是有选择地来调控植物在各种胁迫下的调控途径，这也使得确定基因的功能并不容易。本发明是在前期研究基础上的深入探索，通过在拟南芥和玉米中过量表达CIPK42，发现其耐盐性明显提高，这一发现为培育耐盐植物品种提供了新的基因靶点和资源，对提高农作物耐盐性具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米CIPK42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用。

本发明通过筛选玉米EMS突变体库(http://www.elabcaas.cn/memd/)，发现一个ZmCIPK42基因的提前终止突变体(802bp处C变为T)。在盐胁迫条件下，突变体幼苗与B73对照相比变得非常敏感，故推测ZmCIPK42可能与玉米耐受盐胁迫相关。于是，本发明进一步通过构建ZmCIPK42过表达载体，先转化模式植物拟南芥进行功能测试，盐胁迫下表型分析表明ZmCIPK42能够提高拟南芥耐盐性和鲜重。由此进一步在玉米自交系中过表达ZmCIPK42，在幼苗期盐胁迫处理试验中发现，过表达ZmCIPK42的玉米植株比对照植株耐盐性和鲜重明显提高，由此进一步提出了该基因在提高植物耐盐性和/或生长性能中的应用。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物耐盐性和/或生长性能中的应用。

具体地，耐盐性可表现为耐NaCl胁迫的性能。

第二方面，本发明提供玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育耐盐性和/或生长性能提高的转基因植物中的应用。

第三方面，本发明提供玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐盐种质资源改良中的应用。

第四方面，本发明提供玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高盐胁迫环境下植物存活率中的应用。

本发明中，所述玉米CIPK42蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为玉米CIPK42蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的玉米CIPK42蛋白的突变体。

本发明中，所述玉米CIPK42蛋白的cDNA具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明的玉米CIPK42蛋白的cDNA全长1323个碱基，含一个完整的开放阅读框架，为序列表中的SEQ ID NO.1，命名为ZmCIPK42。基因中的激酶结构域为自第304个至第535个，共232个碱基。本发明的玉米CIPK42蛋白由440个氨基酸残基组成，为序列表中的SEQ IDNO.2。本发明CIPK42基因编码的蛋白通过调控下游相关基因参与植物耐盐碱过程。本发明的ZmCIPK42使通过基因调控来参与植物耐盐过程成为可能，对于培育高产耐盐的转基因农作物具有重要意义。

本发明中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

本发明提供含有所述玉米CIPK42蛋白的编码基因的克隆载体或各类表达载体。本发明还提供含有所述载体的宿主细胞、含有所述玉米CIPK42蛋白的编码基因的转化植物细胞、转基因植物或转基因植物的繁殖材料。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；优选拟南芥、高粱、小米或玉米。更优选为玉米。

第五方面，本发明提供一种用于抑制上述cDNA在植物内表达的DNA，所述DNA为以下任一种：

(1)编码与上述cDNA或其转录产物互补的反义RNA的DNA；或

(2)编码具有激酶活性的RNA的DNA，所述活性为丝氨酸、苏氨酸磷酸化激酶信号传导上述cDNA转录产物所编码的蛋白活性；或

(3)编码一种通过共抑制作用抑制上述cDNA表达RNA的DNA，所述DNA与包含SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的DNA具有大于70％的同源性。

第六方面，本发明提供一种改变植物耐盐性和/或生长性能的方法，其为通过转基因、诱导基因变异、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对玉米CIPK42基因的表达。

优选地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含所述玉米CIPK42基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

具体地，作为本发明的一种实施方式，所述耐盐胁迫和/或生长性能提高的转基因拟南芥、玉米的构建方法包含如下步骤：

1、依据目的基因的序列，设计引物，从玉米cDNA中扩增ZmCIPK42基因序列，与克隆载体pGEM-T连接，经过测序确定所获得的序列与目的片段一致。

2、以pGEM-ZmCIPK42为入门载体，pCAMBIA3301为表达载体，进行重组反应，然后转化DH5α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，将单克隆送测序，测序正确的克隆命名为pCAMBIA3301-ZmCIPK42。

3、将制备的载体转化农杆菌LB4404和Gv3101菌株。

4、利用农杆菌LB4404介导的玉米幼胚转化法获得纯合的转化阳性苗株系；利用农杆菌Gv3101介导的花序浸染法转化拟南芥获得过表达ZmCIPK42基因的拟南芥转基因株系。

5、以PPT筛选出耐盐碱的转基因拟南芥、玉米株系。

本发明的有益效果至少在于：本发明发现玉米ZmCIPK42基因能够正调控植物耐盐性，通过提高ZmCIPK42基因的表达量，能够有效提高植物的耐盐性。本发明构建了ZmCIPK42过表达转基因拟南芥、玉米植株，与野生型相比，转基因植株的耐盐性和生长性能显著提高。ZmCIPK42基因的耐盐功能的发现为培育耐盐植物品种提供了新的基因靶点和资源，对植物的耐盐分子机制的研究具有重要意义，为研究植物应答盐胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定一定的理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1的植物表达载体构建示意图；

图2为本发明实施例4的过表达ZmCIPK42基因的拟南芥株系目的基因的PCR检测及Westernblot检测结果；

其中，图2A为PCR检测结果，M：Marker；+：正对照(以ZmCIPK42超表达载体为PCR模板)；-：负对照(以野生型受体植株哥伦比亚型DNA为PCR模板)；1-11：ZmCIPK42不同转基因株系目的基因扩增结果；图2B为Westernblot检测结果，M：Marker；1-11：ZmCIPK42不同转基因株系蛋白抗体检测结果，-：非转基因植株抗体检测结果；

图3为本发明实施例5的转基因拟南芥与野生型植株在含有不同浓度NaCl的培养基上生长情况比较结果；

其中，图3A为35S::ZmCIPK42转基因拟南芥植株与野生型植株的生长情况照片；图3B为35S::ZmCIPK42转基因拟南芥植株与野生型植株的根长比较结果图；图3C为35S::ZmCIPK42转基因拟南芥植株与野生型植株的鲜重比较结果图；图3B和图3C中数值结果为平均值±标准差(n＝3)；双星号表示P≤0.01水平，与野生型有极显著性差异，单星号表示P≤0.05水平，有显著性差异；

图4为本发明实施例6的过表达ZmCIPK42基因的玉米株系目的基因的PCR检测及Westernblot检测结果；

其中，图4A为PCR检测结果，M：Marker；+：正对照(以ZmCIPK42超表达载体为PCR模板)；-：负对照(以受体植株B104材料DNA为PCR模板)；1-11：ZmCIPK42不同转基因株系目的基因扩增结果；图4B为Westernblot检测结果，1-11：ZmCIPK42不同转基因株系蛋白抗体检测结果，-：非转基因植株(B104)抗体检测结果；

图5为本发明实施例7的转基因玉米与受体植株在含有NaCl的培养基上生长情况比较结果；

其中，图5A为35S::ZmCIPK42转基因玉米植株与野生型植株的生长情况照片(图5A的左上与左下图代表对照组，右上与右下图代表盐胁迫处理组)；图5B为35S::ZmCIPK42转基因玉米植株与野生型植株的根长比较结果图；图5C为35S::ZmCIPK42转基因玉米植株与野生型植株的鲜重比较结果图；图5B和图5C中数值结果为平均值±标准差(n＝3)；双星号表示P≤0.01水平，与野生型有极显著性差异，单星号表示P≤0.05水平，有显著性差异；

图6为本发明实施例8的玉米CIPK42基因的突变体与野生型植株抗逆性比较结果；

其中，图6A为突变体(ZmCIPK42)与同一背景B73自交系(WT)在土壤中进行耐盐表型比较，图6A的左图是正常生长条件下(对照组)结果，右图是用250mM的盐水处理后的生长情况；图6B为ZmCIPK42和WT(自交系B73)水培后用盐水处理的表型，图6B的左图是正常生长条件下结果，右图是用250mM的盐水处理后的生长情况；图6C为水培后盐胁迫下ZmCIPK42和WT植株的根长比较结果图；图6D为水培后盐胁迫下ZmCIPK42和WT植株的鲜重比较结果图；图6C和图6D中数值结果为平均值±标准差(n＝3)；双星号表示P≤0.01水平，与野生型有极显著性差异，单星号表示P≤0.05水平，有显著性差异。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1含有CIPK42蛋白激酶基因的表达载体的构建

1、依据已知目的基因的序列，设计引物，从玉米B73自交系cDNA扩增ZmCIPK42基因序列，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。

2、将回收的片段与pGEM-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性单克隆，送测序，经过序列比对，获得与原序列一致的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，将其命名为pGEM-ZmCIPK42。

3、以pGEM-ZmCIPK42为入门载体，以pCAMBIA3301质粒为表达载体，经过重组反应，获得重组载体pCAMBIA3301-ZmCIPK42。

表达载体构建示意图参见图1。

实施例2含有CIPK42蛋白激酶基因的转化拟南芥与筛选

1、将实施例1中构建好的ZmCIPK42超表达载体转入农杆菌Gv3101。

2、用沾花浸染(floral dipping)的方法转化拟南芥野生型。

3、将转化后得到的T₀代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长约两周后，用0.5‰的PPT(phosphinothricin)喷洒T₀代拟南芥筛选转化植株。

4、由于所用的转化超表达载体pCAMBIA3301带有抗PPT(phosphinothricin)的Bar基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以在喷施PPT(phosphinothricin)后大部分未转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。转化植株按照不同株系分别收获T₁代种子。

5、收获各转基因株系T₂代种子后，用0.5％的NaClO对种子进行消毒处理。然后点种于含有0.5‰的PPT(phosphinothricin)的MS培养基平板中(每个转基因株系需要约45粒种子)，以野生型为负对照。

6、春化三天后置于22摄氏度光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在含0.5‰的PPT(phosphinothricin)的MS培养基中无法存活；T₂代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无PPT(phosphinothricin)抗性的种子出现；只有T₂代为纯合体转基因株系的种子能全部在含PPT的MS培养基中存活。由此，筛选出含有ZmCIPK42基因的转化拟南芥。

实施例3含有CIPK42蛋白激酶基因的转化玉米与筛选

1、植物受体材料的准备：玉米自交系B104授粉后10～13天，取玉米幼穗在超净工作台上剥去苞叶，取出幼胚。将幼胚盾片朝上，接种于1/2MS培养基上，每培养皿中接种20～40个幼胚，28℃暗培养2～3周后，即可诱导出愈伤组织。

2、菌株的保存方法：用接种环挑取构建好的ZmCIPK42农杆菌LB4404(将实施例1中构建好的ZmCIPK42超表达载体转入农杆菌LB4404中获得ZmCIPK42农杆菌LB4404)的单菌落划线于添加相应抗生素的YEP固体培养基上，挑取继代2天后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEP培养基中，以200rpm进行振荡培养，在28℃黑暗条件下培养16-20h后，将菌液置于离心管中，在5000rpm下离心5min并收集菌体，将收集的菌体用LS-inf液体培养基进行洗涤，以去除残余的YEP培养基，最后将农杆菌悬浮于MS-inf中备用。

3、感染和共培养：将步骤2中获得的备用农杆菌加入到LS-inf液体培养基中，稀释到OD值为0.5，将幼胚或愈伤用MS-inf洗一次，再浸入菌液，用振荡器振荡30秒，并放置5分种，观察幼胚无明显的伤口，取出用灭菌滤纸吸干，放到LS-AS培养基上，在25℃黑暗共培养3天，并设对照。

4、转化体的筛选、继代：把共培养后的幼胚和愈伤移入加有相应抗生素的筛选培养基MSD，先在含5mg/L草铵膦低选择压下培养2周，再经过2～3轮10mg/L草铵膦高压选择，每轮3周。每次继代注意淘汰呈褐色和水渍化的愈伤组织，并把生长正常的愈伤组织用镊子夹碎，分开选择培养。然后将选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基MSZ上，培养条件为28℃，每日3000Lx光强光照12小时，3周即可出现胚状体。

5、转化植株再生：将胚状体转入到1/2MSZ培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日光照3000Lx光强光照12小时。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗分移植到罐头瓶中，并在室内培养2周。将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3)的小花盆中，当玉米又长出2～3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。由此，获得含有ZmCIPK42基因的转化玉米。

实施例4含有玉米CIPK42蛋白激酶基因的拟南芥转基因植株核酸PCR及蛋白分析

以提取的拟南芥阳性植株(实施例2中筛选获得的拟南芥株系1-11)的总DNA为模板，用ZmCIPK42基因引物(F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)进行PCR扩增，阳性植株能够扩增出1.32kb的条带，而假阳性植株则无PCR产物。野生型植株不能扩增出目的条带。

取拟南芥阳性植株叶片(实施例2中筛选获得的拟南芥株系1-11)，加入蛋白提取缓冲液，离心后吸取上清，获得粗提蛋白液。按照Bradford方法定量，然后，加入上样缓冲液煮沸5min。制备蛋白质SDS-PAGE胶，恒压电泳。电泳结束后，用电转移方法将蛋白转移至PVDF膜上。取出PVDF膜，封闭过夜。分别用一抗和二抗孵育。用化学发光法检测并以扫描仪检测目的条带。转基因植株均能检测到目的蛋白，对照植株无法检测到蛋白。具体检测结果参见图2。其中，图2A为PCR检测结果，图2B为Westernblot检测结果。

实施例5含有玉米CIPK42蛋白激酶基因的转基因拟南芥植株与野生型植株抗逆性比较

选取实施例2中获得的拟南芥转基因株系中的OE-1、OE-3、OE-4进行抗逆性试验。将ZmCIPK42转基因株系与野生型株系(WT)点播在MS培养基的平板上，4摄氏度春化3天后置于置于22℃，16小时光/8小时暗的培养箱中，5天后将幼苗分组转至含有0mM、125mM、150mM的NaCl的MS平板上，置于22℃，16小时光/8小时黑暗的培养箱中，10天后观察表型并进行分析。

测试结果见图3。从结果中可以看出，转基因株系与野生型株系的生长在盐胁迫下受到明显抑制，NaCl对幼苗根长也有明显抑制作用。相对野生型而言，野生型在高盐胁迫下叶子萎蔫发黄程度严重，转基因植株叶片可以正常生长(参见图3A)，根系也相比野生型更长，正常条件下，野生型和转基因植株根长分别为8.81cm、8.57cm、8.63cm、8.70cm，没有显著差异；在125mM盐处理条件下，野生型根长仅为3.25cm，转基因植株根长分别为6.33cm、5.95cm、6.23cm，转基因与非转基因植株之间存在极显著差异。在150mM盐处理条件下，野生型根长仅为2.61cm，转基因植株根长分别为4.91cm、5.08cm、5.13cm，转基因与非转基因植株之间存在极显著差异(参见图3B)，从鲜重结果可以看出转基因植株鲜重大于野生型(参见图3C)，正常条件下，野生型和转基因株系鲜重在0.076g以上，差异不显著；受到125mM盐胁迫处理后，非转基因株系根长仅为0.033g，转基因株系分别为0.054g、0.056g和0.051g，过表达ZmCIPK42植株与野生型之间存在显著差异，同样在150mM盐胁迫处理条件下，野生型植株大部分白化弱小，野生型植株的鲜重仅为转基因株系的一半，为显著差异。由此说明在盐胁迫条件下，CIPK42在拟南芥中的过表达，促使其生理耐盐性显著提高。

实施例6含有玉米CIPK42蛋白激酶基因的玉米转基因植株核酸PCR及蛋白分析

以提取的玉米阳性植株(实施例3中筛选获得的玉米株系1-11)的总DNA为模板，用ZmCIPK42基因正向引物和表达载体整合区末端反向引物(F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)进行PCR扩增，阳性植株能够扩增出1.32kb的条带，而假阳性植株则无PCR产物。野生型植株不能扩增出目的条带。

取玉米阳性植株叶片(实施例3中筛选获得的玉米株系1-11)，加入蛋白提取缓冲液，离心后吸取上清，获得粗提蛋白液。按照Bradford方法定量，然后，加入上样缓冲液煮沸5min。制备蛋白质SDS-PAGE胶，恒压电泳。电泳结束后，用电转移方法将蛋白转移至PVDF膜上。取出PVDF膜，封闭过夜。分别用一抗和二抗孵育。用化学发光法检测并以扫描仪检测目的条带。转基因植株均能检测到目的蛋白，对照植株无法检测到蛋白。具体检测结果参见图4。其中，图4A为PCR检测结果，图4B为Westernblot检测结果。

实施例7过表达玉米CIPK42蛋白激酶基因的转基因玉米植株与野生型植株抗逆性比较

选取3个T₃代纯合的过表达ZmCIPK42的转基因玉米株系(35S::ZmCIPK42，实施例3中获得的11个玉米转基因株系中的OE-3、OE-7、OE-12)种子，将它们和受体B104(野生型玉米)种子用0.5％的NaClO消毒10分钟，用灭菌蒸馏水冲洗5次。在发芽纸上发芽，48小时后，将萌发整齐的种子，播种于含有蛭石和草炭土(1:1)的小花盆中，培养箱内28℃，16h光照/8h暗培养，幼苗培养10天后，浇灌250mM NaCl溶液(对照组不含有NaCl)，每隔5天浇灌1次，每次处理后确保花盆底部不积水。待幼苗培养至21天时，观察植株耐盐情况。观察表型及测试结果见图5。幼苗在盐处理5天后的野生型幼苗开始出现萎蔫，野生型和转基因植株的生长活力存在显著差异(参见图5A)。

与对照组相比，盐胁迫处理后的材料均受到不同程度影响，盐胁迫处理后对照植株的根长和鲜重只有正常培养条件的一半。转基因植株盐胁迫处理后根长和鲜重有所下降，但是不明显。通过比较转基因植株和受体植株表型发现，盐胁迫条件下过表达ZmCIPK42基因的植株表现出明显的优势。盐胁迫处理后受体(野生型，WT)植株生长受到明显抑制作用，而转基因株系OE-3、OE-7、OE-12表现出明显的耐盐表型，转基因植株与对照植株(野生型，非转基因植株)相比，非转基因植株叶片发黄，出现严重的萎蔫。转基因植株的根长远大于野生型(参见图5B)。NaCl处理下转基因植株鲜重与野生型植株有显著差异(参见图5C)，转基因植株生长性能更好，其根长可以达到25cm，而非转基因对照根长只有18cm；转基因植株受到胁迫后鲜重为4.5g以上，而非转基因对照植株仅为2.2g，转基因植株与对照植株存在显著差异。说明转基因植株比野生植株具有更强的耐性，这些结果表明过表达ZmCIPK42转基因株系的生长具有耐盐性调控的特异性。

实施例8玉米CIPK42基因的突变体与野生型植株抗逆性比较

通过查询玉米EMS突变体库，我们发现一个玉米ZmCIPK42基因突变体，该突变体在编码区的802碱基处发生C-T的突变，从而导致编码的蛋白提前终止。本实施例对该玉米CIPK42基因突变体与野生型植株抗逆性进行了测试，观察表型及测试结果见图6。

在正常条件下，幼苗期ZmCIPK42突变体与正常对照(B73植株，WT)表型没有明显的差异，而在250mM氯化钠处理10天以后，突变体植株呈现矮小，叶片枯萎的表型(参见图6A-土壤培育方式、图6B-水培方式)。水培后盐胁迫处理下突变体植株的根长与对照植株相比存在极显著差异(参见图6C)。正常条件下，对照植株的鲜重与突变体没有明显差异，而在水培后盐胁迫处理下，突变体植株鲜重为2.61g，对照植株为3.27g，两者之间存在显著差异(参见图6D)，由以上结果推测，玉米ZmCIPK42基因可能在玉米耐盐过程中起重要作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新疆农业科学院核技术生物技术研究所（新疆维吾尔自治区生物技术研究中心）

<120> 玉米CIPK42蛋白及其编码基因在调控植物耐受盐胁迫中的应用

<130> KHP201110087.0

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacacca gagggaagac tttgacggag cggtacgaga tggggaagct gctggggaaa 60

ggcgcgttcg ggaaggtgca ctatgcaagg gacctcgagt ccaaccaggg tgttgctatc 120

aagatcatgg acaaggacag ggtgctcaag gccgggctct cagagcaggt aaagcgtgag 180

atcacgacta tgcggctggt ggaacacaaa aacatcgttc gtctccatga ggtcatggcg 240

acgcggaaca agatctacat catcatggag tatgccaaag ggggtgagct catggacaag 300

cttaagagga gcggcaggct cacggaggct gacgcacaca gatacttcga gcagctcatc 360

gatgcactgg atcactgcca caaccgaggc gtgtaccacc gggacttgaa gcctgagaac 420

ctactgttgg atgagaatgg ggacctcaag gtgtctgact ttggacttag cgcgttttca 480

gagtcgagga ggacagatgg gctgctccat acggtctgtg ggacaccgat atatatagct 540

ccagaggtga tcatgaagac aggctatgat ggtgcaaaat cagacatctg gtcttgtggt 600

gtcgtcctgt ttgttcttgc tgctggctac ctccctttcc agggcccaaa cttgatggag 660

atttatcgga agatacatga tagagatttc acgtgcccaa gtaggttttc acacaaactc 720

aagaggctgc tatacaagat cctgaacccc aaccccagca tgagaccttc aattcaggag 780

ataaaagagt ctacctggtt ccgaaaaggt cctagggaga ttagtgcagt gaacgagaaa 840

gttcttagcg agaatgccac caccacaaat gctgccccag tgcttgcttc taggcacaag 900

gagattgctc acgaagatat gaagtccttg gttgccacaa acctcaatgc ctttgaaatc 960

atcgcgttat cagcagggtt ggacctgtct ggtctgttta tcaaggagtg caggaaggag 1020

acaagattca cttcagataa gcctgcgttg gccatcatct caaagcttga agacatcgca 1080

aaagcactga atctcaggat aaggaagaag gacaacaaca ttgtcagcat tgaagggagg 1140

aaggaggggg gcaatggtgt ccttcagttt gacatgcaga tctttgagat cacaccatcc 1200

tgccatctcg ttcagatgaa acaaacaagt ggtgatctac ttgagtacca aaaactattg 1260

gaagagggca tccgaccagg gttaaaggat gttgtctcgg cctggcatgg agatgatctg 1320

tag 1323

<210> 2

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Thr Arg Gly Lys Thr Leu Thr Glu Arg Tyr Glu Met Gly Lys

1 5 10 15

Leu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Gly Lys Val His Tyr Ala Arg Asp Leu

20 25 30

Glu Ser Asn Gln Gly Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asp Arg Val

35 40 45

Leu Lys Ala Gly Leu Ser Glu Gln Val Lys Arg Glu Ile Thr Thr Met

50 55 60

Arg Leu Val Glu His Lys Asn Ile Val Arg Leu His Glu Val Met Ala

65 70 75 80

Thr Arg Asn Lys Ile Tyr Ile Ile Met Glu Tyr Ala Lys Gly Gly Glu

85 90 95

Leu Met Asp Lys Leu Lys Arg Ser Gly Arg Leu Thr Glu Ala Asp Ala

100 105 110

His Arg Tyr Phe Glu Gln Leu Ile Asp Ala Leu Asp His Cys His Asn

115 120 125

Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Asn Gly Asp Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Phe Ser

145 150 155 160

Glu Ser Arg Arg Thr Asp Gly Leu Leu His Thr Val Cys Gly Thr Pro

165 170 175

Ile Tyr Ile Ala Pro Glu Val Ile Met Lys Thr Gly Tyr Asp Gly Ala

180 185 190

Lys Ser Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Val Leu Phe Val Leu Ala Ala

195 200 205

Gly Tyr Leu Pro Phe Gln Gly Pro Asn Leu Met Glu Ile Tyr Arg Lys

210 215 220

Ile His Asp Arg Asp Phe Thr Cys Pro Ser Arg Phe Ser His Lys Leu

225 230 235 240

Lys Arg Leu Leu Tyr Lys Ile Leu Asn Pro Asn Pro Ser Met Arg Pro

245 250 255

Ser Ile Gln Glu Ile Lys Glu Ser Thr Trp Phe Arg Lys Gly Pro Arg

260 265 270

Glu Ile Ser Ala Val Asn Glu Lys Val Leu Ser Glu Asn Ala Thr Thr

275 280 285

Thr Asn Ala Ala Pro Val Leu Ala Ser Arg His Lys Glu Ile Ala His

290 295 300

Glu Asp Met Lys Ser Leu Val Ala Thr Asn Leu Asn Ala Phe Glu Ile

305 310 315 320

Ile Ala Leu Ser Ala Gly Leu Asp Leu Ser Gly Leu Phe Ile Lys Glu

325 330 335

Cys Arg Lys Glu Thr Arg Phe Thr Ser Asp Lys Pro Ala Leu Ala Ile

340 345 350

Ile Ser Lys Leu Glu Asp Ile Ala Lys Ala Leu Asn Leu Arg Ile Arg

355 360 365

Lys Lys Asp Asn Asn Ile Val Ser Ile Glu Gly Arg Lys Glu Gly Gly

370 375 380

Asn Gly Val Leu Gln Phe Asp Met Gln Ile Phe Glu Ile Thr Pro Ser

385 390 395 400

Cys His Leu Val Gln Met Lys Gln Thr Ser Gly Asp Leu Leu Glu Tyr

405 410 415

Gln Lys Leu Leu Glu Glu Gly Ile Arg Pro Gly Leu Lys Asp Val Val

420 425 430

Ser Ala Trp His Gly Asp Asp Leu

435 440

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaacacca gagggaagac 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctacagatca tctccatgcc a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcaagctgc tctagcattc g 21

Claims

1.玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物耐盐性和/或生长性能中的应用。

2.玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育耐盐性和/或生长性能提高的转基因植物中的应用。

3.玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐盐种质资源改良中的应用。

4.玉米CIPK42蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高盐胁迫环境下植物存活率中的应用。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述玉米CIPK42蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

6.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述玉米CIPK42蛋白的cDNA具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

7.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

8.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；优选拟南芥、高粱、小米或玉米。

9.一种用于抑制根据权利要求6所述的cDNA在植物内表达的DNA，其特征在于，所述DNA为以下任一种：

(1)编码与权利要求6所述的cDNA或其转录产物互补的反义RNA的DNA；或

(2)编码具有激酶活性的RNA的DNA，所述活性为丝氨酸、苏氨酸磷酸化激酶信号传导权利要求6所述的cDNA转录产物所编码的蛋白活性；或

(3)编码一种通过共抑制作用抑制权利要求6所述的cDNA表达RNA的DNA，所述DNA与包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA具有大于70％的同源性。

10.改变植物耐盐性和/或生长性能的方法，其特征在于，通过转基因、诱导基因变异、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对玉米CIPK42基因的表达；