CN111166789A - 夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用 - Google Patents

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夏伯候
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Abstract

本发明实施例提供了夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用，该应用为制备治疗肝损伤的药品提供了新的途径。夏枯草花提物能提高氟化钠所致大鼠肝脏氧化应激模型的抗氧化能力，显著降低血清中脂质氧化(MDA)水平，显著提高总超氧化物歧化酶(SOD)，总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)和过氧化氢酶(CAT)蛋白含量，具有较好的保护作用。同时，给药后使得氟化钠所致大鼠肝脏氧化应激模型肝脏中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)活性降低，总胆红素(TB)含量减少，减轻细胞内抗氧化物及其代谢物的异常，进一步减轻了肝毒性和氧化应激。

Description

夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用
技术领域
本发明属于肝药制备技术领域，具体涉及夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用。
背景技术
夏枯草(Prunella Vulgaris L)为多年生草本植物，茎直立具四棱，单叶对生，花冠唇形，二强雄蕊，心皮2个，4个小坚果，花期4～6月，果期7～10月。夏枯草应用历史悠久，一般是在夏季采取半干燥果入药，体轻质脆，微有清香气，味淡。迄今为止，从中分离得到的化合物主要为三萜及其皂苷、酚酸、甾醇及其苷、黄酮、有机酸、挥发油及糖类等。传统医学理论认为夏枯草味苦、辛，性寒，具有清火、明目、消肿、散结等功效，常用于治疗目赤肿痛，目珠夜痛，头痛眩晕，瘰疬，瘿瘤，乳痈，乳癖，乳房胀痛等。现代药理学研究显示夏枯草属植物具有抗病毒、抗菌、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降压和降糖等作用。
现有技术中，夏枯草主要以全草或全草提取物的形式用于制备治疗甲状腺疾病、心血管疾病和抗肿瘤的药品。CN106421633B公开了一种治疗桥本氏甲状腺炎的药物组合物及其制备方法，该药物组合物是由夏枯草、柴胡、郁金、穿山龙、浙贝母、玄参、山慈菇、黄芪、乌梅等组成，采用常规制药工艺制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂或丸剂，具有疏肝解郁、化痰祛瘀、软坚散结之功效，适用于桥本氏甲状腺炎及甲状腺结节患者。临床研究表明，该药物组合物可以降低炎性浸润，减少甲状腺滤泡破坏。CN107213251B公开了一种预防和/或治疗心脑血管疾病的中药组合物及其制备方法，该中药组合物含有夏枯草、黄芩、槐米、当归、、丹参、地龙、钩藤、决明子、煅烧珍珠母、煅烧磁石和三七等，可用于防治冠心病以及出血性中风疾病。CN101461842B公开了一种夏枯草抗肿瘤有效部位的提取方法及其提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用，该发明的技术方案确定的夏枯草有效部位体外实验可明显抑制Raji细胞、Jurkat细胞、K562细胞和435S细胞的增殖，体内实验对荷T淋巴瘤EL-4细胞小鼠具有抑瘤效应，并可延长其生存期，抗肿瘤作用肯定，毒性低。
现有技术表明，夏枯草主要以全草的形式被加以利用，夏枯草花作为非药用部位，暂未对其药用价值进行开发。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用。
根据本发明第一方面实施例的夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用，所述应用为制备治疗肝损伤的药品提供了新的途径。
夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用。
肝脏是人体内最大的消化腺，是药物代谢、转化的主要脏器，也是机体代谢、免疫的重要器官。常见的肝病有肝炎、肝硬化、肝脓肿、原发性肝癌等，而氧化应激是肝病发生的主要生理基础。
肝脏中含有丰富的线粒体，是反应性氧化产物(Reactive Oxidative Species，简称ROS)产生的重要场所，当机体受到外界因素的损伤时，体内产生大量的ROS及其代谢的产物，含量过载则使机体产生氧化应激状态，从而导致肝损伤。
目前临床上常以酒精、氟化钠、四氯化碳(CCl4)和卡介苗加脂多糖(LPS)等诱导小鼠产生肝损伤，其中酒精灌胃造模方法其病理改变与酒精、药物和病毒性肝炎的肝损伤机制相似，是筛选保肝药物的经典模型。
夏枯草非药用时期花提物能提高氟化钠所致大鼠肝脏氧化应激模型的抗氧化能力，显著降低血清中脂质氧化(MDA)水平，显著提高总超氧化物歧化酶(SOD)，总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)和过氧化氢酶(CAT)蛋白含量，具有较好的保护作用。同时，给药后使得氟化钠所致大鼠肝脏氧化应激模型肝脏中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)活性降低，总胆红素(TB)含量减少，减轻细胞内抗氧化物及其代谢物的异常，进一步减轻肝毒性和氧化应激。
同时夏枯草花提取物能提高乙醇诱导的亚急性酒精性肝损伤小鼠模型的抗氧化能力，给药后血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平具有下降趋势，肝脏中脂质过氧化终产物(MDA)含量出现一定程度的减少，小鼠肝脏内SOD、GSH-Px、CAT活性显著上调，血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量下降。抑制小鼠肝脏内脂质过氧化反应，改善氧化应激中酶活性和炎症因子的释放，进而减轻肝损伤。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：取夏枯草花，用醇回流提取，回收醇，得浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：取夏枯草花，用甲醇回流提取，回收甲醇，得浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：取夏枯草花，用乙醇回流提取，回收乙醇，得浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
醇为低级醇，低级醇指四个C以下的醇。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：
S1：取夏枯草花粉末，用醇第一次回流提取后滤过，得到第一滤渣和第一滤液；
S2：将步骤S1得到的第一滤渣用醇第二次回流提取后滤过，得到第二滤渣和第二滤液；
S3：将步骤S2得到的第二滤渣用醇第三次回流提取后滤过，得到第三滤渣和第三滤液；
S4：合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，低温静置后离心，得到上清液；
S5：将步骤S4得到的上清液减压浓缩，得到浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：
S1：取夏枯草花粉末，用醇第一次回流提取后滤过，得到第一滤渣和第一滤液；
S2：将步骤S1得到的第一滤渣用8～12倍体积量的醇第二次回流提取后滤过，得到第二滤渣和第二滤液；
S3：将步骤S2得到的第二滤渣用6～10倍体积量的醇第三次回流提取后滤过，得到第三滤渣和第三滤液；
S4：合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，低温静置后离心，得到上清液；
S5：将步骤S4得到的上清液减压浓缩，得到浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
根据本发明的一些实施例，所述夏枯草花提取物的制备方法为：
S1：取夏枯草花粉末，用10倍量甲醇第一次回流提取后滤过，得到第一滤渣和第一滤液；
S2：将步骤S1得到的第一滤渣用10倍量甲醇第二次回流提取后滤过，得到第二滤渣和第二滤液；
S3：将步骤S2得到的第二滤渣用8倍量甲醇第三次回流提取后滤过，得到第三滤渣和第三滤液；
S4：合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，低温静置后离心，得到上清液；
S5：将步骤S4得到的上清液减压浓缩，得到浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
根据本发明的一些实施例，所述第一次回流提取的温度为80～100℃，优选90℃，时间为1～3h，优选2h。
根据本发明的一些实施例，所述第二次回流提取的温度为80～100℃，优选90℃，时间为1～3h，优选2h。
根据本发明的一些实施例，所述第三次回流提取的温度为80～100℃，优选90℃，时间为1～3h，优选2h。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，低温静置的温度为1～5℃，优选4℃。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，低温静置的时间为12～48h，优选24h。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，离心的速度为3000～5000rpm，优选4000rpm。
根据本发明的一些实施例，步骤S4中，离心的时间为5～20min，优选15min。
提取采用的醇在减压浓缩过程中被完全去除。
附图说明
图1是夏枯草花提取物预处理对氟化钠诱导大鼠肝脏SOD、GSH、CAT及MDA含量的影响图。
图2是夏枯草花提取物预处理对氟化钠诱导大鼠肝脏AST、ALT、ALP及TB含量的影响图。
图3是夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠血清转氨酶活力的影响图。
图4是夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠肝脏SOD、GSH、CAT及MDA含量的影响图。
图5是夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠肝脏中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本例提供了根据本发明第一方面实施例的夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用。
实施例2
本例提供了夏枯草花提取物的制备方法，具体为：
S1：取夏枯草花粉末，用10倍量甲醇第一次回流提取后滤过，得到第一滤渣和第一滤液；
S2：将步骤S1得到的第一滤渣用10倍量甲醇第二次回流提取后滤过，得到第二滤渣和第二滤液；
S3：将步骤S2得到的第二滤渣用8倍量甲醇第三次回流提取后滤过，得到第三滤渣和第三滤液；
S4：合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，低温静置后离心，得到上清液；
S5：将步骤S4得到的上清液减压浓缩，得到浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
上述制备方法中，第一次回流提取的温度为90℃，时间为2h。第二次回流提取的温度为90℃，时间为2h。第三次回流提取的温度为90℃，时间为2h。
步骤S4中，低温静置的温度为4℃。低温静置的时间为24h。离心的速度为4000rpm。
离心的时间为15min。
试验例1
1实验材料和过程
1.1实验动物
SPF级雄性大鼠(8-12周，200-250g)50只，购买于湖南斯莱克景达动物有限公司，实验单位使用许可证编号:SYXK(湘)2013-000。所有大鼠饲养于恒温房间(24±2℃)，湿度60±5％，自然光照，自由采食和饮水,适应性喂养一周。
1.2试剂及药物制备
总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒(碧云天S0058)、总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(碧云天S0109)、脂质氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天S0131)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒、总胆红素(TB)测定试剂盒。
夏枯草花提取物制备：取夏枯草花100g，10倍量甲醇回流提取2次，再8倍量甲醇回流提取1次合并浓缩液，减压浓缩至无醇味，蒸馏水溶解至100mL，备用。
1.3造模及给药
50只成年雄性SD大鼠，适应性喂养一周后，随机分为5组，每组10只。正常组饮食正常，连续饲养7d天。模型组给予7d天饮水(含氟化钠600ppm)作为毒素对照组。阳性药物组在给予饮水(含氟化钠600ppm)的同时，用已知的抗氧化剂维生素C(10mg/kg/d)腹腔注射7d作为阳性对照组。给药组在给予饮水(含氟化钠600ppm)的同时，用夏枯草花提取物(1.6mL/kg/d、3.2mL/kg/d)灌胃7d作为低、高剂量药物治疗组。
1.4处理
所有大鼠均用8％水合氯醛(6ml/kg，IP)麻醉，腹主动脉取血，动脉血静置离心，吸取上清得到血清。组织样本用生理盐水灌流取血，用于制备组织匀浆。
1.5组织匀浆准备
整个肝组织在10倍体积的磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH7.4，含1mM乙二胺四乙酸)中匀浆，在4℃中16000g离心30min，收集上清液用于后续研究。
1.6氧化应激指标测定
取各组肝脏匀浆上清液，按照参考试剂盒说明书操作，检测GSH-PX、SOD、CAT、MDA等指标。取各组血清，按照参考试剂盒说明书操作，检测ALT、AST、ALP、TB等指标。
1.7统计分析
所有数据以均数±标准误(mean±SD)表示，所有数据单因素方差分析和Duncan’s分析，当P＜0.05时，表明具有统计学意义。
2结果
机体的抗氧化防御系统包括各种酶系统，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽等抗氧化剂，具有清除自由基作用。谷胱甘肽在抗氧化防御活性氧等方面起着重要的作用，在氧化应激期间，谷胱甘肽被氧化形成二硫键，称为氧化谷胱甘肽。除了以硫醇为基础的抗氧化剂外，细胞防御还包括酶促抗氧化剂，如SOD、CAT等。当肝脏组织中超氧阴离子的积累过多时，肝脏组织中SOD、CAT活性下降。脂质过氧化是氧化应激的基本参数，MDA是多不饱和脂肪酸氧化链式反应的分解产物，是组织中脂质过氧化的标志。故对大鼠肝匀浆总超氧化物歧化酶(SOD)、总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、脂质氧化(MDA)及过氧化氢酶(CAT)进行含量测定，结果如图1和表1所示。由表1可知，氟化钠可使MDA水平显著上升，SOD、GSH及CAT的酶活性水平显著减低(p<0.01)，由此说明，造模成功。
表1 夏枯草花提取物预处理对氟化钠诱导大鼠肝脏SOD、GSH、CAT及MDA含量的影响(n＝10)
Figure BDA0002293490870000071
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。
经夏枯草花提取物治疗后，MDA水平出现明显降低，SOD、GSH及CAT的酶活性水平显著升高(P<0.01)。实验结果表明，夏枯草花提取物能显著提高SOD和GSH蛋白含量(p<0.05)，对SOD和GSH蛋白具有保护作用，同时，高剂量组保护作用优于低剂量组。
肝脏是人体内最大的具有代谢、解毒以及免疫等多种生理功能实质性腺体器官，肝功能指标AST、ALT、ALP、TB是评价肝功能正常的标准条件之一，当机体发生肝毒性时，其指标含量增加。如ALP和TB含量的显著增加可反应肝脏分泌和排泄功能障碍。分析夏枯草花提取物对大鼠肝功能指标AST、ALT、ALP及TB的影响，如图2和表2所示，与正常组相比，AST、ALT、ALP活性升高，TB含量升高，这说明造模成功(p<0.05)。经夏枯草花提取物干预治疗后，各项指标趋向正常，与模型组之间存在显著差异(p<0.05)，可反应给药后肝脏分泌和排泄功能均得到改善。
表2 夏枯草花提取物预处理对氟化钠诱导大鼠肝脏AST、ALT、ALP及TB含量的影响(n＝10)
Figure BDA0002293490870000081
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。
试验例2
1实验材料
1.1实验动物
SPF级雄性小鼠(8-12周，200-250g)40只，购买于湖南斯莱克景达动物有限公司，实验单位使用许可证编号:SYXK(湘)2013-000。所有大鼠饲养于恒温房间(24±2℃)，湿度60±5％，自然光照，自由采食和饮水,适应性喂养一周。
1.2试剂及药物制备
总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒(碧云天S0058)、总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(碧云天S0109)、脂质氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天S0131)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测定试剂盒、白细胞介素(IL-1β、IL-6)测定试剂盒。
取夏枯草花粉末，10倍量甲醇90℃回流提取2h，滤过，滤渣加10倍量甲醇回流提取2h，滤过，滤渣再加8倍量甲醇回流提取2h，共提取3次，合并浓缩液，4℃下静置24h，离心速度4000r·min-1，时间15min，得上清液，减压浓缩至无醇味浸膏，蒸馏水溶解，备用。
1.3造模及给药
40只成年雄性SD小鼠，适应性喂养一周后，随机分为对照组、乙醇组、夏枯草花提取物低剂量组、夏枯草花提取物高剂量组，每组10只。对照组正常饮食连续饲养45d。乙醇组正常饮食连续饲养45d。第三、四组灌胃夏枯草花提取物(1.6mL/kg/d、3.2mL/kg/d)45d，每日一次。当第31d起，乙醇组和夏枯草花提取物组连续15d内灌胃乙醇(2400mg/kg)，诱导亚急性酒精性肝损伤，第45d处死小鼠，眼球取血，分离肝脏，储存于-80℃。
1.4样本处理及指标检测
血液在常温下静置5h，4℃下离心30min分离血清(3000r/min)，按试剂盒测定血清中ALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6等指标含量。整个肝组织在10倍体积的磷酸二氢钾缓冲液(100mM，pH7.4，含1mM乙二胺四乙酸)中匀浆，在4℃中16000g离心30min，收集上清液，按照参考试剂盒说明书操作，检测GSH-PX、SOD、CAT、MDA等指标。
1.5统计分析
所有数据以均数±标准误(mean±SD)表示，所有数据单因素方差分析和Duncan’s分析，当P＜0.05时，表明具有统计学意义。
2结果
从图3和表3可知，与对照组相比，模型组的ALT和AST水平显著增加(p<0.05)，表明模型组小鼠肝细胞受损，造模成功。经夏枯草花提取物干预后，ALT和AST水平具有下降趋势且有显著性差异(p<0.05)，高剂量组治疗效果优于低剂量组(p<0.05)。
表3 夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠血清转氨酶活力的影响(n＝10)
Figure BDA0002293490870000101
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。
从图4和表4可知，模型组肝脏内的MDA含量显著高于正常组(p<0.01)，这表明小鼠灌胃大量酒精后，肝脏内的脂质过氧化程度增加，经夏枯草花提取物干预后，MDA含量出现一定程度的下调(p<0.05)，这说明夏枯草花提取物能改善大量饮酒后所致的肝脏氧化应激水平增加。与正常组相比，模型组小鼠肝脏内SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低，经夏枯草花提取物治疗可做增加其活性，说明夏枯草花提取物具有抗氧化作用。
表4 夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠肝脏SOD、GSH、CAT及MDA含量的影响(n＝10)
Figure BDA0002293490870000102
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。
从图5和表5可知，模型组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均显著高于对照组(p<0.05)，经夏枯草花提取物干预后，炎症因子水平具有下降趋势且有显著性差异(p<0.05),高剂量组治疗效果优于低剂量组(p<0.05)。
表5 夏枯草花提取物预处理对乙醇诱导小鼠肝脏中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响(n＝10)
Figure BDA0002293490870000111
*：与正常组相比，p<0.05；**：与正常组相比，p<0.01；
#：与模型组相比，p<0.05；##：与模型组相比，p<0.01。

Claims (10)

1.夏枯草花提取物在制备治疗肝损伤的药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述夏枯草花提取物的制备方法为：取夏枯草花，用醇回流提取，回收醇，得浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述夏枯草花提取物的制备方法为：
S1：取夏枯草花粉末，用醇第一次回流提取后滤过，得到第一滤渣和第一滤液；
S2：将步骤S1得到的第一滤渣用8～12倍体积量的醇第二次回流提取后滤过，得到第二滤渣和第二滤液；
S3：将步骤S2得到的第二滤渣用6～10倍体积量的醇第三次回流提取后滤过，得到第三滤渣和第三滤液；
S4：合并第一滤液、第二滤液和第三滤液，低温静置后离心，得到上清液；
S5：将步骤S4得到的上清液减压浓缩，得到浸膏，所述浸膏即为夏枯草花提取物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一次回流提取的温度为80～100℃，时间为1～3h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第二次回流提取的温度为80～100℃，时间为1～3h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第三次回流提取的温度为80～100℃，时间为1～3h。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S4中，低温静置的温度为0～5℃。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S4中，低温静置的时间为12～48h。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S4中，离心的速度为3000～5000rpm。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S4中，离心的时间为5～20min。
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