CN111148532A - 疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗感染性疾病的疫苗，以及制备或递送这种疫苗的方法。特别地，用于预防或治疗疾病的疫苗以如下剂量使用：通过肠胃外途径，在不含佐剂的情况下少于0.03μg抗原，和含佐剂的情况下少于0.003μg抗原；以及通过粘膜途径，在不含佐剂的情况下少于1μg抗原和/或1.6×10⁷PFU当量，和在含佐剂的情况下少于0.04μg抗原和/或1.6×10⁷PFU当量。

Description

疫苗组合物

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗感染性疾病的疫苗，以及制备或递送这种疫苗的方法。

背景技术

感染性疾病

感染性疾病可以说是对健康的最大威胁。世界卫生组织(WHO)将流感和结核(TB)列为当前世界卫生面临的两个最大的传染威胁，因为它们都是空气传播的病原体。其他威胁包括新发传染病，如中东呼吸综合征病毒(MERS)，它也是通过空气途径传播的。在动物中，一种严重的病原体是牛的口蹄疫病毒(FMDV)。这又是一种通过空气传播途径从一个个体传播到另一个个体的病原体，传播距离可能长达几英里。

感染性疾病预防史上的主要发展包括疫苗和抗生素。1796年，Edward Jenner证明了疫苗接种的有效性，为未来的疫苗接种方案奠定了科学基础。除了抗生素之外，接种疫苗可能比任何其他医疗干预措施挽救了更多的生命。1928年，Alexander Fleming从霉菌特异青霉菌(Penicillium notatum)中分离出青霉素，这最终导致了用于治疗细菌感染的抗生素的开发。然而，抗生素的有效性因细菌中抗生素耐药性的增加而降低。显然，抗生素对细菌感染有有益的影响，但并不直接影响对抗生素不敏感的病毒引起的感染。第三个重要发展是公共卫生和卫生措施，如清洁水、洗手和使用手帕，这些措施防止了感染性疾病的传播并挽救了无数生命。

尽管治疗和预防都减少了由传染原引起的危害，但显然，如果可能的话，最好首先预防感染而不是治疗它。基本上有两种保护人们免受感染的方法:干扰传播途径和减少易感人群。对于地方性感染以及流行病和大流行来说也是如此。

全球化对病原体的传播和易感人群的可及性都有影响。国际旅行意味着病原体可以更容易地在世界各地传播。这也使易感人群的数量增加。因此，任何新的感染性疾病，例如由动物病原体(例如，MERS、SARS、禽流感、埃博拉、HIV等)突变引起的感染性疾病，都有机会传播到易感个体，并在人群中长期维持。幸运的是，随着时间的推移，病原体通常变得不那么严重，因为它们选择了更容易传播的变异体，而不是那些快速杀死宿主的变异体。

感染的其他健康影响

感染，无论是急性的还是慢性的，都会引起对健康有一系列的影响的炎症。例如，炎症被认为是从心血管疾病到痴呆症的衰老的许多方面的原因。感染也是老年疾病(包括糖尿病和慢性阻塞性肺疾病)恶化的关键原因。流感疫苗是“处理”患有这些疾病的人的最具成本效益的方法之一(例如，Hovden,A.-O.,Cox,R.J.,和Haaheim,L.R.,2007,Int JCOPD 2,229-240；Centers for Disease Control and Prevention:“People at HighRisk of Developing Flu–Related Complications”,和“Adults With ChronicConditions:Get Vaccinated”)。

疫苗

由于Jenner对牛痘/牛痘苗毒在保护人免受天花感染的有效性的证明，1979年，WHO领导的运动最终消除了天花这一野生病原体。天花连同牛瘟、脊髓灰质炎病毒2型，以及可能地脊髓灰质炎病毒3型，仍然是迄今为止唯一通过接种疫苗消除的感染。在目前可用的疫苗中值得注意的是抗流感疫苗。在美国，季节性流感每年导致大约3000人死亡。在好的年份，即当疫苗与当前流行的流感病毒株的抗原性相匹配时，接种疫苗将症状性甲型流感感染降低60％，从而对接种者降低60％的住院率和死亡率(Centers for Disease Controland Prevention:“Vaccine Effectiveness-How Well Does the Flu Vaccine Work？”,和“CDC Presents Updated Estimates of Flu Vaccine Effectiveness for the 2014-2015Season)。

发明内容

发明概述

本发明基于这样的实验发现，即，低剂量(“小剂量(mini dose)”)的疫苗提供了针对随后暴露于活的传染性病原体的免疫保护。提供免疫保护的剂量比以前用于注射接种疫苗或气雾剂/粘膜疫苗的剂量更低且明显更低。500PFU的剂量提供了免疫保护，即，令人惊讶的是，少于10⁷PFU的剂量对例如流感有效。提供保护并不需要佐剂。

因此，本文提供了一种用于预防或治疗感染的疫苗，其中剂量为“小剂量”或低剂量，通常低于或显著低于在提交本申请时基于公共知识的已知的或预测的有效剂量。例如，少于用于鼻内免疫法的剂量的一半，或少于用于肌肉内免疫法的剂量的十分之一，或少于用于肌肉内免疫法的剂量的百分之一。通常，剂量少于0.03μg抗原，例如少于0.003μg抗原和/或少于10⁷PFU的当量，少于1×10⁷PFU或少于1.6×10⁷PFU的当量，并且通常在没有佐剂的情况下递送。疫苗可以粘膜递送，例如到消化道，鼻内递送(i.n.)，经肺内途径(i.pul.)，到生殖道、到泌尿道或到眼睛。疫苗可以被递送到呼吸道或呼吸系统。疫苗可以经肺内途径(i.pul.)递送到肺部。

在本发明的一些实施方案中，可以递送重复的剂量。在一些实施方案中，可以使用完全灭活的病原体。可以通过i.pul.递送两剂、三剂或更多剂。

此外，疫苗可以使用保护性呼吸装置在原位制备，该装置可以灭活空气中的病原体。本发明的低剂量允许在日常情况下使用保护性呼吸装置来对空气传播的感染进行保护和免疫。

因此，本发明涉及通过使用疫苗来预防或治疗疾病，其中疫苗的剂量是“小剂量”。例如，疫苗的施用剂量可少于0.04μg，或相当于1.6×10⁷PFU的剂量。当疫苗通过肠胃外途径施用时，在没有佐剂的情况下，疫苗的剂量可以少于0.03μg。当疫苗通过肠胃外途径施用时，在有佐剂的情况下，疫苗的剂量可以少于0.003μg抗原。当疫苗通过粘膜途径施用并且无佐剂时，剂量可以少于1μg抗原和/或1.6×10⁷PFU的当量。当疫苗通过粘膜途径施用并且有佐剂时，剂量可以少于0.04μg抗原和/或1.6×10⁷PFU的当量。因此，在一些实施方案中，疫苗包含佐剂或与佐剂一起递送。在其他实施方案中，疫苗不包含佐剂或不与佐剂共同施用。

在这些实施方案的任何一个中，剂量可以少于0.003μg和/或少于10⁷PFU的当量。在这些实施方案的任何一个中，剂量可以少于0.001μg和/或少于5×10⁶PFU的当量。在这些实施方案的任何一个中，剂量可以少于0.0003μg和/或少于10⁶PFU的当量。

优选地，所述剂量是有效剂量。所述剂量可以大于3×10^-8μg和/或大于10PFU的当量。所述方法可以在个体中预防或治疗感染性疾病，其中所述方法包括给个体施用有效量的疫苗，其中所述有效量少于3×10^-2μg抗原和/或10⁷PFU的当量。

要治疗或预防的疾病可以是呼吸道感染和/或空气传播感染，因此所述疫苗可以抵抗呼吸道感染和/或空气传播感染。所述疾病可能是流感、结核、MERS、SARS、鼻病毒、麻疹、埃博拉、衣原体肺炎、呼吸道合胞病毒、肺炎球菌或FMDV。在典型的实施方案中，所述疾病是流感。所述疫苗可以是病毒疫苗或细菌疫苗。所述疫苗可用于治疗异源(相关)和/或异源(不相关)病原体。

在这些实施方案中的任何一个中，疫苗可以被施用到肺部。在这些实施方案的任何一个中，疫苗可以作为气雾剂和/或包含气雾剂来递送。在这些实施方案的任何一个中，疫苗可以是灭活疫苗。

在这些实施方案的任何一个中，疫苗可以是预制的疫苗制剂，或者可以在原位制备。当疫苗在原位制备时，可以使用便携式装置和/或空气消毒装置在原位制备。例如，待治疗的受试者可以是保护装置的佩戴者和/或在保护装置的佩戴者的环境中。

在一些实施方案中，待治疗的受试者已经通过暴露于相同或相似的病原体而被致敏(prime)，和/或已经接种了相同或相似病原体的疫苗。

疫苗可以被递送1次或多次。疫苗可以以初始的致敏剂量，随后加强免疫或多次加强免疫的方式被递送。疫苗可以3次或更多次被递送给受试者。

在如本文所述的特定实施方案中，有效量的灭活的、通常为合成的、重组的、杀死的或无复制能力的疫苗以少于10⁶PFU当量(灭活的)或少于0.001μg的剂量通过气雾剂递送至肺部3次或更多次。

在一些实施方案中，剂量在10PFU当量(灭活的)和10⁷PFU当量(灭活的)之间，疫苗以气雾剂的形式通过肺内施用来递送，疫苗递送超过2次，并且疫苗是使用便携式装置在原位制备的和/或疫苗是预制的疫苗制剂。

疫苗可以与雾化器组合提供。可将包含细菌或病毒的组合物与诸如保护性装置的装置组合提供，所述保护性装置包括与面罩流体连通的消毒腔室，其中该消毒腔室被设置成在从该室排出流体之前对室中包含细菌或病毒的流体进行消毒和/或灭菌，并且其中疫苗的剂量少于0.03μg或少于0.003μg和/或少于10⁷PFU的当量或少于1.6×10⁷PFU的当量。例如，腔室可以被设置成在组合物从腔室排放到面罩中之前灭活腔室中的病毒，使得该装置将少于0.003μg和/或少于1.6×10⁷PFU当量的灭活病毒剂量递送到面罩中。

发明详述

疗法和预防

本发明涉及预防和治疗感染性疾病的方法，以及用于这种方法的疫苗组合物和装置。其中本文所描述的方法和用途应理解为它们涉及治疗/预防方法、用于治疗/预防方法的产品和/或产品在制造用于治疗/预防的药物中的用途。

一般而言，疫苗是一种对特定疾病提供免疫(例如激活获得性免疫)的制剂。疫苗通常包含类似于致病病原体的剂，例如能够触发识别该病原体的免疫应答的剂。疫苗可包含弱化、灭活或杀死形式的病原体。疫苗可以包含一种或多种、存在于病原体中或病原体上的蛋白质或其他分子。通常，疫苗诱导受试者的免疫系统应答，允许受试者对与病原体的任何未来的接触产生免疫应答。

本发明的疫苗可用于通过疗法进行治疗的方法中。例如，本发明的疫苗可以作为主要的预防性剂施用于处于被病原体感染或暴露于抗原的风险的受试者，或者可以作为次要剂用于治疗已经被感染的受试者。

用于根据本发明用途的疫苗能够在其施用的受试者中诱导保护性免疫应答。可以针对任何不期望的感染因子或合适的抗原(例如存在于病原体上或病原体中的抗原)诱导免疫应答。因此，疫苗可以是针对病原体的疫苗(例如针对病毒、细菌、真菌、其他原核或真核细胞或生物体的疫苗)，或者是针对可用于靶向任何此类病原体的任何蛋白质、糖蛋白或其他分子或结构的疫苗。例如，就流感病毒而言，疫苗可以针对血凝素(HA)——一种在流感病毒表面发现的糖蛋白。疫苗可以针对单一抗原，也可以针对多种抗原，例如来自单一病原体的两种或更多种抗原，或者来自两种或更多种病原体的两种或更多种抗原。

通常，本文所述的疫苗用于治疗方法，例如通过疗法或预防来预防或治疗疾病(特别是感染性疾病)的治疗方法。通常，所述疾病是由病原体引起的，例如细菌或病毒感染。所述感染可能是由空气传播的病原体引起的。通常，所述感染是呼吸道感染。通常，所述感染是由空气传播的病毒引起的，更通常是由RNA病毒引起的，更通常是由负链RNA病毒引起的，更通常是由正粘病毒(orthomyxovirus)引起的，更通常是由流感病毒引起的，更通常是由甲型流感病毒引起的。感染可由流感病毒(如甲型流感、乙型流感或丙型流感)引起。通常，病毒来自乳头多瘤空泡病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒和/或嗜肝DNA病毒家族。更通常，病毒来自微小核糖核酸病毒、星状病毒、披膜病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、逆转录病毒、弹状病毒、丝状病毒、呼肠孤病毒和/或双RNA病毒家族。更通常，病毒来自正粘病毒、副粘病毒和/或冠状病毒家族；这三个家族都是相似的包膜RNA病毒，副粘病毒和冠状病毒略大于正粘病毒。

感染可以是呼吸道感染，例如流感、副流感、MERS、SARS、鼻病毒或呼吸道合胞病毒。

感染可以是大流行性(pandemic)感染，如大流行性流感、MERS、SARS或其他类似感染。通常，疫苗针对的是新发病原体和/或没有常规疫苗或其他可用疫苗的病原体。

因此，用颗粒数量和/或感染单位(灭活的)来表示的疫苗剂量应该提供与流感病毒(一种正粘病毒)相似的免疫效果。正粘病毒和副粘病毒都是负链RNA病毒。

当感染是细菌感染时，通常，所述细菌来自分枝杆菌或支原体家族。

通常，所述疫苗是针对流感、肺结核、MERS、SARS、埃博拉、肺炎球菌或FMDV的。通常，所述疫苗是针对麻疹、副流感、呼吸道合胞病毒和/或鼻病毒的。通常，所述疫苗是针对流感、鼻病毒或呼吸道合胞病毒的。

本发明的疫苗也可用于抵抗其他粘膜部位的感染，例如沙门氏菌、霍乱、幽门螺杆菌、军团菌和/或HIV。

如下所述，500PFU的流感病毒剂量(相当于1.5×10^-6μg HA抗原)能有效地在雪貂中产生保护性免疫。因此，该剂量针对甲型流感产生免疫反应(见下面的实施例1)。显然，相似病毒的相似剂量将同样免疫。这包括其他甲型流感病毒、正粘病毒家族的其他成员(通常是乙型流感病毒)，特别是当它们在常规疫苗中被类似地治疗时。显然，其他病毒家族(如副粘病毒)将需要相似数量的抗原。

疫苗可以预防或治疗病原体感染。疫苗可以预防、减轻或改善一种或多种通常与病原体感染相关的症状。疫苗可以预防、减轻或改善一种或多种与病原体感染相关的或由病原体感染引起的症状或病况。例如，疫苗可以预防或治疗与感染相关的炎症，和/或与这种炎症相关的症状或病况，例如糖尿病和COPD。

通常，所述疫苗将用于治疗动物。所述动物可以是鸟，通常，所述鸟是家禽，通常，所述鸟是鸡。所述动物可以是哺乳动物，包括非人哺乳动物；更通常，所述疫苗将用于治疗人类。所述疫苗可用于医学或兽医领域。受试者可以是男性或女性，也可以是婴儿、儿童或成人。因为这些组合物中的一些中的剂是灭活的，所以它们特别适用于施用给“处于风险的个体”，如老年人、儿童、或感染的或不适的人。

待治疗的受试者对被治疗的病原体可能是免疫学幼稚的(immunologicallynaive)。通常，待治疗的受试者和/或群体通过暴露于相同或相似的病原体和/或抗原和/或通过接种疫苗而被致敏。

疫苗制剂

用于根据本发明用途的疫苗可以作为疫苗组合物提供。合适的疫苗组合物可以是能够在施用该组合物的受试者中诱导保护性免疫应答的任何组合物。可以针对任何不期望的感染因子或合适的抗原(例如存在于病原体上或病原体中的抗原)诱导免疫应答。因此，疫苗可以是针对病原体(例如针对病毒、细菌、真菌、其他原核或真核细胞或生物体)的疫苗，或者是针对可用于靶向任何此类病原体的任何蛋白质、糖蛋白或其他分子或结构的疫苗。疫苗可以靶向单一抗原，也可以靶向多种抗原，例如来自单一病原体的两种或更多种抗原，或者来自两种或更多种病原体的两种或更多种抗原。疫苗可以靶向一种或多种病原体株。

疫苗可包含一种或多种活性治疗成分，例如病毒，肽，基于蛋白质、基于细胞和/或基于核酸的产品，例如活病毒疫苗、活细菌疫苗、杀死的或灭活的病毒或细菌疫苗、编码感兴趣的抗原的载体。

疫苗可进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体和/或佐剂。一种示例性的药学上可接受的载体是生理盐水。其他生理学上可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的，并且实例被描述在例如“Remington's PharmaceuticalSciences(18^th 15版),ed.A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA”中，其通过引用并入本文。因此，本发明提供了用于粘膜或肠胃外施用的组合物，所述组合物包括溶解或悬浮在可接受载体(通常是水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等)中的上述剂。

疫苗可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、洗涤剂等。例如，疫苗可以是包含一种或多种稳定剂(例如血清白蛋白蛋白、人或牛血清白蛋白、明胶、酪蛋白、PVP或其组合或其任意组合)、填充剂(bulkingagent)(例如糖(如乳糖、蔗糖、果糖)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)或其任意组合)、缓冲剂(例如氨基酸、组氨酸、谷氨酸碱金属盐)等的组合物。

佐剂是一种与疫苗抗原联合使用时能增强对疫苗抗原的免疫应答的物质。疫苗佐剂可以提高人体的免疫应答，并且通常允许在疫苗中使用更少量的灭活病毒或细菌。当使用佐剂时，可以根据施用途径或根据待接种的特定疫苗或病原体来选择佐剂。佐剂包括明矾、AS03、GPI00100、皂苷、ISCOMATRIX、弗氏完全和不完全佐剂；细胞因子也可用作佐剂，Toll样受体激动剂也可用作佐剂。

在粘膜施用的情况下，可以使用几丁质微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等,Microbes andInfection 8:2706-2714,2006；Ozdemir等,Clinical and Experimental Allergy 36:960-968,2006；Strong等,Clinical and Experimental Allergy 32:1794-1800,2002)。适用于经粘膜途径施用的其它佐剂包括E.coli(LT)的热不稳定毒素或其突变衍生物。在灭活病毒的情况下，可以使用肠胃外佐剂，包括例如铝化合物(例如，氢氧化铝、磷酸铝或羟磷酸铝化合物)、脂质体制剂、合成佐剂，例如(例如，QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A或聚膦嗪(polyphosphazine)。

角鲨烯或基于角鲨烯的佐剂(如MF59或AS03)已用于流感疫苗。基于菊粉(一种天然植物来源的多糖)的佐剂，如Advax^TM，已用于流感疫苗。这种佐剂可用于根据本发明的疫苗，特别是针对空气传播或呼吸道病原体的疫苗，例如流感疫苗。

本发明的疫苗，无论是用于肺内递送还是用于通过本文所述的任何其它途径的递送，都可以与佐剂一起使用。本发明的疫苗组合物可以包含一种或多种佐剂。本发明的疫苗或疫苗组合物可以与一种或多种佐剂(例如本文所述的佐剂)联合施用。

通常，所述疫苗的使用不需要佐剂。因此，疫苗组合物可以不包含佐剂和/或可以在没有任何佐剂的情况下施用。

已经测试了剂量变化或佐剂添加的许多种情况，包括不同年龄和肥胖。例如，老年人对流感疫苗的抗体应答较低。有证据表明，在这一人群中，高剂量的流感疫苗(每株60μg的HA与每株15μg的HA比较)更有效(Wilkinson K等，2017，Vaccine35(21)2775-2780)。肥胖是一个复杂的因素，接种疫苗的肥胖动物和成人的中和抗体应答降低。基于角鲨烯的佐剂AS03或明矾增强了免疫应答，增加了中和和非中和抗体水平。然而，即使抗体水平增加，肥胖小鼠也不能抵抗流感病毒的攻击(Karlsson EA，Hertz T等，2016，MBio 7(4)e01144-16)。几项临床试验已经将佐剂应用于流感疫苗，以节省剂量。Gordon等人，2016，(Vaccine34,3780-6)在人体中发现，当与Advax佐剂一起施用时，15μg的减少剂量的季节性三价灭活流感疫苗(TIV，每株5μg)与单独的标准三价流感疫苗(45μg，每株15μg)所引发的免疫应答(通过血凝抑制试验测量)相当。Poder等人(2014，Vaccine，32，1121-9)在儿童中发现，对于用AS05佐剂化的疫苗，递送一次或两次3.75μg或1.9μg的减少剂量的HA，相比未佐剂化的疫苗，引发相当或更好的HAI抗体应答。同样地，Langley等人(2012，Pediatr Infect Dis J31(8)848-58)在儿童中发现，对于相隔21天的2个剂量，剂量为3.75μg和1.9μg的AS03佐剂化的H1N1疫苗，相比每剂量为7.5或15μg的未佐剂化的疫苗，产生相当或更好的抗体应答。除了未佐剂化的7.5μg的HA疫苗外，所有疫苗都符合欧洲监管标准。

疫苗组合物可以以固体、液体、冻干(freeze-dried)或冻干(lyophilised)形式或气雾剂形式提供。疫苗可以溶解在生理学上相容的溶液或缓冲液中，如本文所述的药学上可接受的载体。

在施用之前，可以通过本领域已知的方法提供或者制备疫苗。可以使用标准的制备和配制方法，例如在“Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版)，ed.A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA”中所述的。

疫苗通常是预先制造和准备好的，这样就可以将已知剂量的疫苗递送给个体受试者。在本申请中，这种预先制造并提供给受试者随后施用的疫苗制剂被定义为“制造的疫苗制剂”或“预制的疫苗制剂”。这种制剂可以在密封和/或灭菌的容器中提供，允许取出一剂疫苗施用于受试者。这种制剂可以在多用途容器中提供，允许取出一个或多个剂量的疫苗用于对受试者施用，例如当施用过程包括一次以上的疫苗施用，或者用于对一个或多个不同受试者施用一个或多个剂量时。

或者，如下文进一步讨论的，可以原位生产疫苗用于对受试者施用。例如，可以使用使病原体失活或杀死病原体的呼吸装置原位生产疫苗制剂，从而将失活的病原体作为疫苗制剂递送给使用者。

疫苗施用

用于本发明的疫苗可以通过任何合适的途径递送给受试者。“施用(administration)”或“施用(administering)”或“递送”是指给予受试者(例如人)一定剂量的本发明疫苗组合物的方法，其中施用途径是，例如，鼻内、肺内、局部、全身、吸入、口服、静脉内、皮下、血管内、动脉内、腹膜内、心室内、鼻腔或肌内。通常，组合物通过肺内途径(例如，通过气雾剂吸入)、肠胃外(例如，通过肌内、皮下或静脉注射)、或通过口服摄入、或通过局部应用来施用。

优选的施用途径可以根据各种因素而变化，例如，药物组合物的成分以及潜在的或实际的发病部位。疫苗通常通过注射来递送。这可以例如通过肠胃外途径，例如皮下(s.c.)、肌内(i.m.)或真皮内途径。本发明还考虑了通过粘膜途径施用疫苗，例如通过鼻内递送、口服或肺内递送。例如，麻疹减毒活疫苗已经被递送到肺部：肺内递送(专利申请WO2007/000308，Vaccine nebulisers，Cutts F等)。可以使用粘膜施用途径，例如肺内施用。当疫苗用于治疗或预防呼吸和/或空气传播的感染时，可以使用粘膜施用途径，例如肺内施用。因此，疫苗可以递送到肺部，即肺内免疫接种(i.pul.免疫接种)。i.pul.免疫接种可以气雾剂的形式递送。

递送到肺部和肺内施用通常包括递送到下肺，不仅是气管内和支气管内递送，而且通常递送到细支气管，并且更通常递送到肺泡。

所述疫苗通常用于治疗。通常，所述疫苗用于预防或治疗感染或感染性疾病。通常，所述疫苗通过肠胃外途径(例如i.m.、s.c.、皮肤内和/或通过贴剂)和/或经粘膜途径(例如i.n.、i.pul.)施用。更通常，所述疫苗通过粘膜途径递送。更通常，所述疫苗通过肺部、i.pul.途径递送。当剂量通过贴剂和/或与佐剂组合施用时，剂量通常少于0.003μg抗原。当疫苗的剂量在没有佐剂的情况下递送到肺部时，剂量通常少于0.03μg抗原。

通常，所述疫苗用于治疗，并且所述疫苗以少于10⁷PFU(灭活的)或少于0.01μg的剂量通过气雾剂递送至肺部3次或更多次。此外，通常递送有效量的疫苗。

疫苗剂量

如本文所述，本发明还提供了包含预防有效量或治疗有效量的一种或多种疫苗的组合物。含有有效量疫苗的组合物可用于预防性和/或治疗性治疗。在预防性应用中，本发明的疫苗可以以足以延迟、减少或预防临床或亚临床疾病发作的量施用于受试者(例如，人)。在治疗性应用中，疫苗以足以治愈或至少部分中止病况及其并发症的症状的量施用于已经患有疾病(如病原体感染)的患者(如人)。

足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”。本领域技术人员基于他们的知识和本文的教导可以容易地确定合适的剂量和方案。对于这种用途的有效量可能取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和一般状态。

出于本申请的目的，使用疫苗的“小剂量”的概念。这是一种少于或大大少于先前已知的或预测的通过特定途径在该物种中对该微生物有效的疫苗剂量。特别地，当通过肺内途径递送时，未知的或预测提供保护性免疫的剂量是小剂量，并且是本发明的一个实施方案。

本文描述的剂量可以指疫苗组合物中活性成分的量，例如病毒疫苗中病毒的量。本文描述的剂量可以指疫苗组合物中递送给受试者的抗原总量，例如递送给受试者的疫苗抗原的量。例如，当疫苗是包含HA抗原的流感疫苗时，本文描述的剂量可以指疫苗组合物中HA抗原的量或递送给受试者的HA抗原的量。

当疫苗剂量以μg抗原提及时，通常，这是病原体的总抗原，更通常，这是特定抗原的量，通常，该特定抗原是病原体的表面抗原，通常，该表面抗原结合靶细胞上的受体，通常，该抗原是血凝素分子，通常，该血凝素是流感血凝素(HA)抗原，通常，该HA是甲型流感HA抗原。

对于流感，以前建议的疫苗的典型剂量为每株至少15μg血凝素(HA)抗原(WHO技术报告系列号927,2005，流感疫苗(灭活的)生产和控制建议，第121页，第A5.3节血凝素含量，“至少15μg”)。对于流感，15μg HA相当于大约5×10³个血凝单位(HAU)。对于活病毒的良好制备，例如鸡蛋生长的PR8流感病毒，1HAU可能相当于大约10⁵-10⁶个噬斑形成单位(PFU)，因此15μg可以大约相当于5×10⁸-5×10⁹PFU。

Yam等人(2015，Front Immunol 6，207e)并未着眼于免疫保护，但他们将HAI滴度视为i.m.(肌肉内)免疫接种后替代的保护标记。他们显示，在没有佐剂的情况下，在小鼠肌肉内递送重复剂量(x2)的HA抗原，在0.03μg HA抗原处产生HAI滴度，但每剂量不低于0.03μg。在有佐剂的情况下，在0.003μg HA抗原处产生HAI滴度，但每剂量不低于0.003μg。

因此，根据Yam等人的研究，剂量低于或显著低于(已知的或)预测的有效剂量，即用于本发明的剂量(包括用于通过无佐剂i.m.途径(肠胃外途径)递送本发明的HA抗原或另一种疫苗的剂量)通常是少于0.03μg或少于0.01μg，或少于0.003μg，少于0.001μg，或少于0.0003μg的剂量。类似地，在有佐剂的情况下，剂量低于或明显低于(已知的或)预测的有效剂量，即用于本发明的剂量(包括用于通过具有佐剂的i.m.途径递送HA抗原的剂量)通常是少于0.003μg、少于0.001μg或少于0.0003μg或少于0.00003μg的剂量。

因此，本发明的疫苗(例如旨在预防或治疗呼吸道感染或空气传播感染的疫苗(例如流感疫苗))可以以少于0.003μg或少于0.0003μg或少于0.00003μg的剂量施用。该剂量可以是例如0.000001μg至0.003μg、0.00001μg至0.0003μg、0.0000001μg至0.003μg、或0.0003μg至0.0001μg的疫苗抗原。这种剂量可以在有佐剂或没有佐剂的情况下施用。这种剂量可以通过本文所述的任何途径施用，包括如Yam等人所述的i.m.途径和本文更详细描述的i.pul.途径。疫苗可以以单次施用或两次或更多次施用的方式提供给受试者。疫苗的任何一次施用可以是本文所述的量，例如，疫苗的第一剂量可以包含这样的量。或者，跨多个剂量提供的疫苗总量可以是本文所述的量。

Lui等人(2012,PLoS ONE 7(12)e52135)发现，1μg剂量的HA抗原在没有佐剂的情况下通过i.n.或i.pul.途径递送×2，在保护免受攻击方面无效，但是相同剂量的i.m.途径确实提供了免疫保护。在有佐剂的情况下，1μg HA抗原通过i.n.和i.pul.途径递送×2是有效的。值得注意的是，在粘膜表面(鼻腔和肺部冲洗)，感染部位的抗体与免疫保护无关。

尽管Edwards(WO 2008/025095)没有考虑保护，但他们将HAI滴度视为绵羊中潜在的替代的保护标记。他们发现，在没有佐剂的情况下，以0.04μg HA抗原的剂量，3个剂量的HA抗原i.pul.递送未能产生HAI活性。在有佐剂的情况下，以0.04μg HA抗原获得HAI滴度，但每剂量不少于0.04μg。

在下面的实施例1中，仅500PFU的流感产生了免疫保护(约0.000064μg)。因此，在i.pul.途径(粘膜途径)中，少于Lui和Edwards所述的剂量是有效的。例如，对于本发明的疫苗，例如本文所述的流感疫苗，在没有佐剂的情况下，通常剂量少于1μg、少于0.1μg、少于0.04μg、少于0.01μg和/或少于0.001μg抗原。在有佐剂的情况下，通常剂量少于0.04μg，或少于0.008μg，或少于0.004μg，或少于0.001μg，或少于0.0004μg抗原，如流感病毒HA抗原。

因此，本发明的疫苗(例如用于预防或治疗呼吸道感染或空气传播感染的疫苗(例如流感疫苗))可以以少于0.001μg或少于0.0004μg的剂量施用。这种剂量可以在有佐剂或没有佐剂的情况下施用。当剂量在没有佐剂的情况下施用时，可以使用更高的剂量，例如少于0.04μg、少于0.01μg和/或少于0.001μg抗原的剂量。当剂量在有佐剂的情况下施用时，可以提供更低的剂量，例如少于0.001μg，或少于0.0004μg抗原，或少于0.00007μg，或少于0.00004μg，或少于0.000004μg抗原。这种剂量可以通过本文所述的任何途径施用，包括Lui和Edwards所述的i.pul.途径。疫苗可以以单次施用或两次或更多次施用的方式提供给受试者。疫苗的任何一次施用可以是本文所述的量，例如，疫苗的第一剂量可以包含这样的量。或者，跨多个剂量提供的疫苗总量可以是本文所述的量。

通常疫苗剂量少于3×10^-2、3×10^-3、3×10^-4、10^-4、7×10^-5、6.4×10^-5、3×10^-5、3×10^-6、3×10^-7μg抗原。通常，疫苗剂量大于或等于3×10^-8μg、3×10^-7、15×10^-7或3×10^-6μg。疫苗剂量可以大于或等于10^-8、10^-7、10^-6μg抗原。疫苗剂量可以大于或等于1.28×10^-7、1.28×10^-6、1.28×10^-5或6.4×10^-5μg抗原。剂量可以在本文所述的任何这些下限至任何所述上限的范围之内。

Fernando等人(2010年，PlosONE 5(4)e10266)研究了在小鼠中使用皮肤贴片(Nanopatch^TM)递送季节性三价疫苗。他们发现，通过这种途径递送的34ng(0.034μg)HA抗原对小鼠适应的PR8病毒攻击提供了有效的保护。

下面的实施例1显示抗原的更低水平是有效的(当递送三次时)。因此，通过皮肤贴片途径可以使用少于34ng、通常少于10ng、通常少于6.5ng、通常少于1ng、通常少于0.1ng、通常少于0.01ng的剂量。

Furuya等人(2010，J Gen Virol 91，1450-1460)研究了灭活病毒的鼻内递送。他们发现，如通过体重减轻所测量的，如果病毒用γ射线灭活，1.6×10⁷PFU(灭活)的单剂量能有效保护免受攻击，但如果病毒用UV或福尔马林灭活，则类似剂量的效果较差。基于HAU，三剂量福尔马林灭活病毒产生的“总剂量当量”相当于一剂量的γ辐射灭活病毒，这产生与γ辐射灭活病毒相似的保护作用。

下面的实施例1显示了远低于1.6×10⁷PFU的水平是有效的：基于体重减轻，3剂量的500PFU提供了针对流感攻击的显著保护。因此，本发明的疫苗(例如用于预防或治疗呼吸道感染的疫苗(例如流感疫苗))可以以少于1.6×10⁷PFU、少于10⁷PFU、少于5×10⁶PFU、少于10⁶PFU、通常少于10⁵、通常少于10⁴PFU、通常少于5×10³PFU、通常少于10³PFU等的剂量施用。通常，疫苗剂量少于10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、5×10²和/或10²PFU或CFU，或少于10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、5×10²和/或10²PFU或CFU的当量的HA抗原。通常剂量大于1PFU，大于10PFU，大于50PFU，大于100PFU，大于200PFU，大于300PFU，大于400PFU或大于或等于500PFU。通常，疫苗剂量大于或等于10个感染单位(IU)、100个IU、500个IU或1000个IU。

剂量可以是例如1至1.6×10⁷PFU、10至1,000,000PFU、50至100,000PFU、100至25,000PFU或200至1000PFU。剂量可以是大约500PFU、500PFU±100PFU或500PFU±50PFU。这种剂量可以在有佐剂或没有佐剂的情况下施用。这种剂量可以通过本文所述的任何途径施用，包括Liu和Edwards所述的i.pul.途径。当在空气中i.pul.施用的情况下，可以以少于1000PFU/升空气、少于500PFU/升空气、少于300PFU/升空气或少于250PFU/升空气的剂量提供。疫苗可以以单次施用或两次或更多次施用的方式提供给受试者。疫苗的任何一次施用可以是本文所述的量，例如，疫苗的第一剂量可以包含这样的量。或者，跨多个剂量提供的疫苗总量可以是本文所述的量。

在实施例1中，假设1个RNA拷贝＝1个病毒颗粒，颗粒与PFU比率为1543；该值可能在不同的制剂之间不同。Furuya没有报告每个PFU的颗粒数量，但是根据实施例1中的比率，1.6×10⁷PFU的剂量约为2.47×10¹⁰个流感病毒颗粒，远高于实施例1中使用的7.7×10⁵个病毒颗粒的值。因此，使用该起效的实施例，通常少于2.47×10¹⁰个病毒颗粒、少于10¹⁰个病毒颗粒、少于10⁹个病毒颗粒、少于10⁸个病毒颗粒、少于10⁷个病毒颗粒、少于10⁶个病毒颗粒、少于7.7×10⁵个病毒颗粒等的病毒(通常流感病毒)的剂量可以用于本发明。例如，本发明的病毒疫苗的合适剂量可包含10³至10¹⁰个病毒颗粒、10⁴至10⁸个病毒颗粒或10⁵至10⁷个病毒颗粒。这种剂量可以在有佐剂或没有佐剂的情况下施用。这种剂量可以通过本文所述的任何途径施用，包括i.pul.途径。疫苗可以以单次施用或两次或更多次施用的方式提供给受试者。疫苗的任何一次施用可以包含本文所述的一定量的病毒颗粒，例如，疫苗的第一剂量可以包含这样一定量的病毒颗粒。或者，跨多个剂量提供的疫苗总量可以包含本文所述的一定量的病毒颗粒。类似地，这涉及以PFU(灭活前)或以HA抗原的μg数测量的灭活全病毒疫苗。

总而言之，基于上述出版物，“小剂量”可以是，通过肠胃外途径，无佐剂时少于0.03μg，有佐剂时少于0.003μg抗原，以及通过粘膜途径，无佐剂时少于或等于1μg抗原和/或少于1.6×10⁷PFU当量，有佐剂时少于0.04μg抗原和/或少于1.6×10⁷PFU当量。

通常，所述剂量是“小剂量”。通常，所述剂量是有效剂量。

有效剂量是针对感染和/或疾病提供免疫保护的剂量，例如减少体重减轻和/或其他临床症状。医学专家可以根据病原体和/或疾病确定合适的临床症状。例如，对于许多呼吸道感染，如流感，临床症状可能包括体重减轻、打喷嚏、鼻塞、流鼻涕和食欲不振。可以评估的临床终点包括住院治疗、症状的出现、疾病或症状的持续、疾病或症状的严重程度以及死亡。有效剂量可以是在递送3次(或更多次)情况下有效的量。

使用疫苗制剂的优点包括节约疫苗。也就是说，所需的疫苗制剂量要低得多。换句话说，对于同样数量的疫苗，可以治疗更多的人，可以给予更多的剂量。这样做的好处包括：在出现新的疾病或大流行的情况下，有利于更快地获得疫苗，降低成本，减少实践或物流问题，如储存(特别是在需要温度控制储存的情况下)和运输。后者被WHO认为对发展中国家很重要，在这些国家，温控储存可能受到不可靠电源的限制或影响。疫苗的递送在该领域中也是实用的，例如不需要锋利的针头。同样，通过向粘膜表面递送，在感染的传播部位产生粘膜免疫，其可能比例如肌肉内免疫产生的免疫更有效和更具保护性(例如Furuya等人，2010)。

很明显，当有效的实施例是以每剂量的HA抗原的μg数表示时，这很容易适用于其他流感病毒。类似地，当以μg来表示抗原的量时，它显然适用于其他病毒的疫苗。此外，抗原的μg适用于包括细菌在内的其他病原体的疫苗。基于每剂量μg抗原的计算可用于转换成病毒或其他病原体颗粒的数量。

当病毒的大小与流感病毒相似时，可以很容易地应用基于病毒颗粒数的剂量，例如正粘病毒、副粘病毒和冠状病毒。

“x PFU的当量”用来指x PFU流感的当量。例如，用于相似大小的病毒的相同数量的PFU，或者此数量的PFU已经以某种方式(例如通过UV、福尔马林或β-丙内酯)被灭活。如果PFU与颗粒数量和/或颗粒尺寸的比率不同，则可能需要进行适当的计算/调整。“当量”是指将等量的抗原递送到甲型流感中，通常以μg、PFU和/或颗粒数进行多方面的计量，但是当以PFU和/或颗粒数进行计量时，通常是指从整个病原体中获得的疫苗，通常没有从病原体颗粒中显著纯化任何特定的抗原。上述以PFU举证的任何剂量都可以是待注射疫苗的剂量，或者可以是当量PFU。

灭活疫苗和活疫苗

本发明的疫苗可包含活病原体(例如活病毒)或减毒病原体。本发明的疫苗可以包含灭活的病原体，例如灭活或杀死的病毒。

尽管大多数疫苗由无生命的物质组成，但也有一些由减毒活细菌或病毒组成。通常减毒疫苗包括活病原体，如活病毒，它们是在降低或破坏其毒性的条件下培养的。因为这些活的减毒微生物可以在宿主体内复制，并且抗原是在体内制造的，所以在宿主体内的实际剂量大于物理递送的剂量。减毒活病毒是通过注射以外的途径递送的。例如，减毒流感活疫苗(LAIV；例如，Flumist^tm或Fluenz^tm)可以以每株10⁷个半数组织培养感染剂量(TC ID50)递送至鼻腔(鼻内免疫)。

疫苗可以是灭活疫苗。通常，疫苗是通常(UV或福尔马林，或类似的)灭活病毒的直接疫苗组合物，不需要专门的摄取技术或复杂的递送系统(例如微囊)。疫苗可以是灭活的整个病原体，并且可以包含完整的病原体和/或片段。疫苗可包含病毒颗粒或等效的病毒亚单位、分裂病毒体、重组蛋白、合成肽或其他抗原制剂中。疫苗可以包含无复制能力的载体，例如腺病毒。然而，通常疫苗是死的疫苗。通常所述疫苗不是减毒活疫苗。

本发明的疫苗可以是不能产生感染的疫苗。所述疫苗可以是这样的疫苗，其不是减毒活疫苗和/或不是有复制能力的载体疫苗和/或不是无复制能力的载体疫苗。

当疫苗按照本文所述方法的一部分在原位生产时，一些可生存的病原体可能作为污染物被递送。在这样的实施方案中，通常所述方法将对递送给受试者的流体(例如通过装置递送给受试者的流体)中的至少90％、95％、99％、99.9％或99.99％的病原体进行杀菌或去活。可生存的或活的病原体的量通常不超过递送给受试者的病原体总量的10％、不超过5％、不超过1％、不超过0.5％、不超过0.1％、不超过0.01％或不超过0.001％。

整个病原体可以被温和地灭活。通常，疫苗将被β-丙内酯、紫外线(UV)、福尔马林和/或γ射线灭活。如果用UV灭活，那么通常用少于10,000Jm^-2 UV灭活，更通常少于1,000Jm^-2，更通常少于或等于600Jm^-2来灭活它。通常，紫外线的量少于200Jm^-2，通常为5-200Jm^-2，和/或通常大于200Jm^-2。

灭活疫苗可以保留抗原特性，这使得用该疫苗治疗的受试者获得针对该疫苗的免疫应答。然而，病原体的一种或多种其他特性被去除或降低。例如，与等量未灭活的病原体相比，灭活疫苗可包含传染性降低或繁殖能力降低的病原体。通常，病原体的活性(例如其传染性或繁殖能力)降低至灭活前病原体或野生型病原体活性的90％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低、2％或更低、1％或更低、0.5％或更低、0.1％或更低、0.01％或更低、0.001％或更低或0.0001％或更低。病原体可按照本文所述方法的一部分被灭活，例如在递送给受试者之前通过使用灭活病原体的装置。病原体可以以灭活的形式提供，以用于根据本发明的用途。病毒或其他病原体可通过γ射线照射、UV、福尔马林和/或β-丙内酯或其他方式灭活。

气雾剂

通常，所述疫苗会被递送到肺部。通常，所述疫苗将以气雾剂的形式和/或作为气雾剂被递送。

在实际应用中，不同尺寸的气雾剂颗粒表现不同：要成为一种真正的气雾剂，其中颗粒不沉降，要求颗粒尺寸小于10μm。在实际应用中，颗粒直径为10μm或更小的气雾剂可以递送到肺部。颗粒尺寸大于10μm的气雾剂可递送至鼻腔通道(鼻腔内递送或免疫)，而非肺部。如果颗粒尺寸明显是直径小于10μm，则颗粒被递送到肺部的信心得到提高。

通常，疫苗(抗原和/或灭活病原体)是直径小于10μm、或小于5μm、或小于3μm或小于1μm的颗粒。更通常，气雾剂将具有直径小于或等于10μm的平均颗粒尺寸，更通常直径小于或等于6μm，更通常直径小于或等于3μm，更通常直径为3μm±3μm，更通常计数中值空气动力学直径为0.1-2.5μm，和/或质量中值空气动力学直径为0.2-5.0μm，更通常计数中值空气动力学直径为大约0.72-0.78μm，和/或质量中值空气动力学直径为1.3-1.5μm。通常，颗粒的计数中值空气动力学直径小于5μm，或小于3μm，或小于1μm，和/或质量中值空气动力学直径小于5μm，或小于3μm，或小于1μm。这些颗粒尺寸通常用于疫苗要递送到肺部时，即，i.pul施用(例如通过吸入)。

通常，疫苗将包含颗粒尺寸≤10μm的气雾剂，通常施用到肺部，通常剂量为3×10^-8至3×10^-4μg和/或10至10⁶IU；通常，该剂量将被递送3次或更多次。

预制备和原位疫苗生产

如本文所述的疫苗可以预先制造和制备，以便可以将已知剂量递送给受试者。在本申请中，这种预先制造并提供给受试者随后施用的疫苗制剂被定义为“制造的疫苗制剂”或“预制的疫苗制剂”。

通常，本发明中使用的疫苗是预制疫苗制剂。通常，本发明的预制疫苗不能产生感染。

这种预制疫苗制剂可以与如下所述的装置组合，例如喷雾器。然后，这种组合可以产生用于治疗(通常治疗或预防感染性疾病)的气雾化疫苗。

在本发明的另一个实施方案中，疫苗可以按照本发明方法的一部分原位生产。例如，可以使用装置制备合适的疫苗组合物并将该组合物递送给受试者。在一些实施方案中，本发明的方法包括灭活活病原体，以便生产本发明的灭活疫苗组合物。通常，在递送给受试者之前，这种方法灭活或灭菌至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％或至少99.99％的活病原体。

用于本发明的装置

可以使用装置将疫苗递送给受试者。在一些实施方案中，疫苗按照本发明方法的一部分在原位制备。

在一些实施方案中，所述装置是能够向受试者的呼吸系统递送空气或其他流体的装置。所述装置可以递送空气或其他流体给受试者吸入或呼出。

所述装置可以是呼吸装置，例如将空气或其他流体直接递送到受试者的呼吸系统的装置，例如递送到受试者的口腔或鼻腔、呼吸道或肺部中。这种装置的例子包括呼吸机(ventilator)和面罩。所述装置可以包括放置在受试者鼻子和嘴上的面罩。所述装置可以包括气管造口管或鼻插管。

所述装置可以包括用于将疫苗递送给受试者的构件，例如，用于将预定剂量的疫苗递送给受试者的构件。在一些实施方案中，所述装置包括喷雾器。所述装置可允许将疫苗递送给受试者，例如由受试者通过该装置呼吸含有疫苗的空气。

所述装置可以是处理将由受试者呼吸的空气的装置。例如，所述装置可以是空气处理装置或设备，例如空调系统或通风系统(例如房间或建筑物通风系统)。所述装置可以是空气消毒装置。所述装置可以原位生产疫苗，并在受试者要呼吸的空气中提供疫苗。

先前，发明人已经描述了一种针对空气传播病原体提供个人保护的创新装置(WO2008/120005)，其通过引用并入本文。它不用过滤器，而是用UV灯照灭活空气传播的病原体，从而克服了渗漏、磨损和堵塞的问题。关于此的另一个重要方面是灭活的病原体可以被递送给使用者，可能会使使用者免疫。

现已认识到，低剂量的病原体可用于免疫使用者。通过灭活空气中的微生物来生产疫苗在本文中被描述为“原位制造”的疫苗。基于咳嗽时产生的小滴的数量(5x10⁵,Lindsley WG等人,2012,J Occup Environ Hyg 9(7)443-449,Quantity and sizedistribution of cough-generated aerosol particles produced by influenzapatients during and after illness)，如果吸入这种气雾剂，使用所述装置所接受的剂量可能会很大，尤其是如果每个小滴都含有一定数量的病原体的话。然而，空气中病原体的数量更普遍地比这低得多(Yang W.,Elankumaran S.和Marr L.C.,2011,J R Socinterface 8,1176-1184)。因此，认为所述装置不能在常规环境中用于免疫。

由于疫苗通常含有15μg抗原(见上文)，因此认为所述装置只能在空气中的病原体水平足以递送类似量的情况下用于免疫接种。可以假定所述装置不能在常规环境中用于免疫接种。

然而，发明人研究了如果将所述装置用于较常规的环境中，是否可能以可能遇到的非常低的剂量进行免疫接种。这在下面的实施例1中有描述。

根据本发明，呼吸装置(例如在WO2008/120005中描述的装置)，可以用于向使用者递送疫苗，从而实现保护效果。

在一些实施方案中，所述装置在将病原体递送给受试者之前，使进入该装置的一些或所有病原体失活。如上所述，从该装置向受试者的输出因此可以是或可以包括灭活的病原体，例如灭活的病毒。所述装置可用于灭活特异性引入该装置的病原体，例如从活性病原体原位产生灭活疫苗。所述装置可用于灭活周围空气中的病原体，例如通过灭活使用者通过该装置呼吸的病原体，从而减少到达受试者的周围空气中的活性病原体。在递送给受试者之前，所述装置可以灭活所有相关病原体，或者可以基本上灭活所有病原体。所述装置可以允许一些活性病原体到达受试者，例如高达1％、高达2％、高达5％或高达10％的周围空气中的活病原体或进入该装置的活病原体。在本发明的一些实施方案中，疫苗因此可以通过灭活在空气中的活微生物而原位生产。一种用于原位产生疫苗的典型装置包括腔室(空气被接收到该腔室中)，来自该腔室中的UV源的UV(其使空气中的病原体灭活，允许排出的空气包含灭活的病原体)；通常，该腔室与面罩流体连通，并且通常，所述装置是便携式的。通常，消毒空气从腔室递送到面罩，保护面罩的佩戴者。可选地或另外地，空气可以从面罩被接收到腔室中，允许保护空气的接收者免受佩戴者呼出的病原体的影响。因此，提供了上述空气消毒装置和由该装置原位生产的疫苗的组合。通常所述疫苗是吸入的。通常所述疫苗被递送到肺部。

当使用UV原位灭活病原体时，递送到空气和/或病原体的UV量包括少于10,000Jm^-2，更通常少于1,000Jm^-2，更通常为600±300Jm^-2，通常少于600Jm^-2，通常大于200Jm^-2，和/或通常为5-200Jm^-2。

通常，待治疗的受试者佩戴所述装置和/或处于佩戴用于原位产生疫苗的所述装置的人的环境中。

疫苗通常是预先确定的。这就是疫苗用于抵御的疾病是已知的，并且疫苗被选择用于该疾病。诸如细菌或病毒之类的活生物体可被递送到腔室的入口，例如作为气雾剂，然后在腔室内用UV处理。它们可以作为生物体的培养物或作为分离或纯化的生物体提供。

通常，所述装置用于吸入(inhaling)(吸入(breathing in))处理过的空气时所接受的剂量明显低于先前确定的、已知的或预测的针对该病原体的疫苗的有效剂量的情况，以及疫苗被或可能被递送到肺部的情况。

如上所述，来自Furuya(2010)的数据表明，对于灭活的全病原体(在本例中为流感)，包括用UV灭活的病原体，当递送到呼吸道(i.n.)进行免疫时，需要至少1.6×10⁷PFU。如果颗粒与PFU的比率类似于下面实施例1中的比率，这相当于约2μg HA抗原。这与Lui(2012)的研究结果一致，他发现，在没有佐剂的情况下，以1μg HA抗原i.pul.免疫接种×2无效。

Yang等人(2011，参见上文)，在医疗保健中心、日托中心和飞机上对IAV进行了测量。平均水平是51PFUm^-3，高达119PFU^-3。基于20m³d^-1的成人呼吸速率，这相当于43,342和1026PFU的1,8和24小时的暴露期间的剂量(高达99,791和2374PFU)。

Blachere等人(2009，Clin Infect Dis 48，438-440)发现，在医院急诊科，800-27,500PFUm^-3的范围，在1小时、8小时和24小时的暴露期间，剂量分别为667-23,000、5333-183,000和16,000-550,000PFU。

在下面的实施例1中，500PFU(制剂每PFU有1543个颗粒，因此这是7.7x 10⁵个颗粒，或约6.4x 10^-5μg)产生免疫保护。

因此，根据本发明，现在已经认识到，所述疫苗可以原位制造，和/或可以使用保护装置，在包括健康护理中心、日托中心和飞机上的环境中，以及在其他环境中，可以将有效剂量递送给处理的空气的接受者，并且其中剂量少于或远少于先前认为达到免疫效果所需的剂量，例如少于1.6×10⁷PFU，例如大约500PFU。所述装置可由感染风险增加的受试者使用，例如在呼吸感染或空气传播感染风险增加的环境中的受试者。本文所述的装置可用于灭活空气中的病原体，并向受试者提供基本上不含活性病原体或所述病原体量减少的空气，所述空气含有由该装置产生的灭活病原体。例如，处于已知或预期包括空气传播病原体(例如空气中的呼吸道感染性病原体)的环境中的受试者，可以使用这种装置来减少他们对活病原体的暴露，并获得针对病原体的保护性或治疗性效果。

这些环境通常包括室内区域(例如学校、医院、手术室、家庭、护理院、剧院、电影院、健身中心、健身房和商店)，以及交通工具(例如飞机、公共汽车、长途汽车、火车、出租车、汽车、船和缆车)。

因此，本发明提供了一种预防或治疗由空气传播的感染性因子引起的感染的方法，该方法包括灭活空气中的感染性因子，并将包含灭活的感染性因子的空气提供给受试者。灭活可以通过本文所述的任何方法来实现，例如通过用UV或福尔马林处理包含感染性因子的空气。通常，在该方法中施用给受试者的因子剂量是如上所述的剂量。通常，施用给受试者的灭活因子的剂量是如上所述的剂量。通常，包含灭活因子的空气通过i.pul.施用(例如通过吸入)施用到受试者的肺部。通常，空气传播的感染性因子是呼吸道病原体，例如上述呼吸道病毒，例如正粘病毒，通常是流感病毒，例如甲型流感。

原位生产的疫苗和/或预制疫苗制剂可以按一次、一次以上、两次以上、三次、三次以上递送；这些次可以是在同一天、不同的日子、相隔一天以上、相隔一周以上、相隔9天或10天、相隔至少9天、相隔不到一年、或相隔其他时间。

各次递送或免疫接种可以在一段时间内进行，例如在10分钟、1小时、2小时、3小时或10小时内，并且可以包括多次呼吸。

本发明关于疫苗的原位生产的优点包括一系列条目。首先，它改变了先前描述的装置和相关装置的使用，允许它们在日常情况下用于产生保护性免疫。这使得它们更加实用。这种装置的一个主要优点是，这种免疫可以与个人防护装备能力相结合。当空气中存在多种病原体时，它们还可以针对多株或多种病原体进行保护和免疫。

第二，在大流行的情况下，比已制成的疫苗制剂更快获得免疫接种。其他优势包括在未知感染的情况下可用。它可以用于没有疫苗或疫苗数量有限的情况。它可能用于季节性感染。它可以用于未免疫的人们。它可以用于老年人，或其他常规疫苗可能不适合或效力较低的人群。它可用于增强免疫力，特别是对那些现有免疫(包括因先前感染和/或接种疫苗而产生的免疫)无效、效果不佳或不完全有效的人。它可以用来初次免疫，以便将来加强免疫。

Furuya等人(2010，J Gen Virol 91，1450-1460)报道，UV处理和福尔马林灭活流感病毒比γ射线照射更能降低病毒的血凝活性(血凝活性降低9倍，而γ射线照射降低3倍)。先前的研究发现，UV和福尔马林并没有显著降低血凝活性(Goldstein M.A.和TaurasoN.M.,1970,Effect of formalin,β-propriolactone,merthiolate,and ultravioletlight upon influenza virus infectivity,chicken cell agglutination andantigenicity,Applied Microbiology 19,290-294)。当用于鼻内免疫小鼠时，UV和福尔马林灭活的病毒不如γ射线照射的病毒有效。然而，如果反复给予福尔马林灭活的病毒，使得累积剂量在血凝单位方面等于γ辐射的病毒，那么它是有效的(Furuya等，第1451页，最后三行)。用于免疫的剂量是1.6×10⁷PFU的低剂量(即1.6×10⁷PFU已被灭活且不再具有传染性)。

因此，现有技术教导了对于死的疫苗，(a)需要大于约1.6×10⁷PFU或当量的疫苗剂量(尤其如果是UV或福尔马林灭活的话)，和(b)UV和福尔马林灭活的微生物比γ辐射灭活的微生物效果差或无效。

预暴露、致敏和加强

获得性免疫的一个众所周知的特征是，在初次暴露于抗原导致初次免疫应答后，进一步暴露于致敏抗原可导致通常更强的二次免疫应答。这些免疫分别被称为致敏和加强免疫。进一步暴露于抗原将导致免疫应答的进一步增强。疫苗接种可能由一次或多次免疫接种组成。如果有一次以上的免疫接种，可以称之为初次剂量，然后是一次或多次加强剂量(加强剂)。为了使致敏和加强有效，很明显，所有剂量的抗原都必须相同。

因此，疫苗可以单剂量施用。或者，施用可以包括第一(致敏)剂量，随后是一个或多个(加强)剂量。例如，初次施用之后可以进行一次或多次进一步的施用。在一些实施方案中，以每小时、每天、每周或每月的间隔给予进一步的施用。存在于本发明组合物中的剂的总有效量可以以单剂量的形式施用于受试者，或者以丸剂的形式或者通过在相对短的时间内输注，或者可以使用分次治疗方案施用，其中多剂量在更加延长的时间段内(例如，每4-6、8-12、14-16或18-24小时施用一剂量，或者每2-4天、1-2周、每月施用一剂量)施用。当施用一剂量或多剂量时，每剂量可以在一段时间内施用，例如在10分钟、1小时、2小时、3小时或10小时内施用，并且可以包括多次呼吸。

疫苗可以被重复递送；它可能被递送两次。疫苗可以被递送三次。疫苗可被递送三次或更多次。疫苗可以被递送三次以上。在i.pul.递送的情况下，可以使用少于3×10⁷、少于10⁷、少于10⁶、少于10⁵、少于10⁴、少于10³或少于10²IU(灭活的)的剂量。同样，可以使用少于10^-3、少于10^-4、少于10^-5、少于10^-6或少于10^-7μg抗原的剂量。

如实施例中所示，以所述水平递送单剂量将刺激免疫系统，并有助于免疫保护。以此水平递送单剂量将不同程度地引发和/或增强免疫应答。通常，疫苗将用于引发和/或增强，这可以是同源和/或异源(相关和/或不相关)引发和/或增强。为了提供更好的免疫保护，即更好地防止临床症状，可能需要多剂量，通常为3剂量。如果病原体和/或正在使用的抗原免疫原性差，例如如果已知特定病原体免疫原性差，则可以通过不同程度地增加施用剂量(包括佐剂)和/或使用基于已知有效剂量(例如通过i.m.施用已知有效剂量的10⁴分之1)的剂量来获得改善的应答。另一种方法是使用高于此处指定范围的剂量。

异源效应

在某些情况下，针对一种抗原的致敏可以导致在随后暴露于第二种抗原时针对另一种抗原的免疫应答增强，或者针对不同病原体的某种保护。如果致敏抗原和加强抗原之间存在某种免疫交叉反应，这种情况可能会发生。例如，人们已经注意到，用一种流感毒株致敏可能导致对另一种流感毒株的保护。这通常是在两个菌株密切相关的情况下。还已经注意到，至少在某些物种中，通过粘膜途径(i.n.或肺内，i.pul.途径)致敏比肠胃外施用在产生这种针对不同菌株的保护方面更有效(Takada A.等，2003，Vaccine 21(23)3212-3218；Perrone L.A.等，2009，J Virology 83(11)5726-5734)。这种交叉保护称为异源保护，在这种情况下针对的是相关病原体。致敏的机制可以包括例如在T细胞水平的交叉反应，其中致敏产生针对共有抗原表位的T细胞，所述抗原表位反过来支持针对攻击病原体的抗体应答。

在现实世界情况中，个体很可能曾经暴露于与感染性威胁相关的病原体。例如，大多数人已经感染了流感，和/或接种了流感疫苗。有证据表明，这种先前的暴露可能会增强未来对相似但不同流感毒株的免疫。这一原则甚至可能适用于新出现的感染，如MERS和SARS(两者都是冠状病毒，冠状病毒是常见的感染)以及流感大流行。

异源效应(不相关的病原体)

在某些情况下，针对一种病原体的免疫导致针对无关病原体的免疫保护(Goodridge HS等，2016，harnessing the beneficial heterologous effects ofvaccination,Nature Reviews Immunology 16,392-400)。这被称为异源(不相关)病原体。

HAI滴度通常被用作替代的免疫保护标记，尽管如上(Karlsson，2016)所述，并不一定存在相关性，尤其是在使用佐剂的情况下。

有趣的是，在一些模型系统中，即使标准的保护性免疫对重复低剂量攻击也几乎没有作用(Song等,2015,Repeated low-dose influenza virus infection causessevere disease in mice:a model for vaccine evaluation,J Virol 89(15)7841-51)。

一个实施方案是用于治疗或预防感染性疾病的疫苗，其中疫苗的剂量少于0.03μg和/或少于10⁷CFU或PFU当量。

另一个实施方案是疫苗，其中剂量少于0.003μg和/或少于10⁶CFU或PFU。在另一个实施方案中，疫苗剂量少于0.0003μg和/或少于10⁵CFU或PFU当量。

疫苗可用于治疗异源病原体(相关的)和/或异源病原体(不相关的)。

个人防护装备

为了防护空气传播的物质，有大量的面罩可供使用。这些装置通常是根据通过过滤器的空气来起作用的。然而，人们普遍认为，基于过滤器的装置保护个人免受感染的有效性是有限的。主要问题与过滤器的作用有关。过滤器会导致压力下降。压力下降导致面罩在密封处泄漏，使得佩戴者仍然暴露于进入面罩周围的空气中的病原体。此外，这种压降阻碍了呼吸，并因此限制了该装置可以佩戴的时间长度。当过滤器被物质堵塞，因此导致压差变得更大，从而导致更多的物质泄漏到面罩中并潜在污染时，会引起进一步的问题。

根据本发明，面罩或其他个人防护装备可以是如上所述的装置(例如灭活病原体的装置)，并将灭活的病原体递送给装置的使用者或其他受试者(例如呼吸装置排出的空气的受试者)。病原体的灭活可以通过本文描述的任何方法实现，例如使用UV。这种装置可以包括或不包括过滤器。通常装置可以允许该装置的使用者吸入灭活的病原体。通常装置可以将灭活的病原体递送给使用者用于吸入，例如递送到面罩或呼吸面罩中。通常装置可以灭活装置使用者呼出的病原体。这种装置可以灭活这种病原体，并将其从该装置递送到空气中，使得其他受试者(例如与该装置的使用者接近或在同一房间或建筑物中的受试者)被递送灭活的病原体，并可以通过吸入在肺部接收灭活的病原体。

个人防护装备(PPE)和疫苗是干扰传播(PPE)和减少易感人群(接种疫苗)的主要途径。

仅参考附图通过实施例的方式进一步描述本发明:

附图说明

图1.研究示意图。向上的箭头表示鼻腔冲洗取样的天数；(S)显示血清取样的天数。天数相对于在T＝0时的H3N2致敏感染进行编号。

图2.1-4组的针对H3N2病毒的血清HAI滴度。点代表每组的几何平均滴度。

图3.针对H1N1病毒的血清HAI滴度。点代表每组的几何平均滴度。<4的滴度标绘为2，以便观察。

图4.组平均鼻腔冲洗液细胞计数。点代表每组的几何平均滴度。

图5.H1N1攻击后第56天的组几何平均鼻腔冲洗液滴度。未检测到噬斑的样品标绘为1PFU/ml。

图6.H3N2病毒攻击后体重变化。点代表组平均值。

图7.喷洒H1N1气雾剂后的体重变化。点代表组平均值。

图8.H1N1鼻腔内攻击后的体重变化。点代表组平均值。

具体实施方式

实施例1

当被流感感染时，雪貂的症状与人类流感非常相似。由于这个原因和其他原因，雪貂被认为可能是人类流感的最佳动物模型。因此，雪貂被用来测试使用非常低剂量的流感的免疫。使用福尔马林杀死的病毒形式的已制成的疫苗制剂和通过如专利申请WO2008/120005中所述的UV消毒装置的活病毒形式的原位疫苗。动物在第0天预先感染了H3N2病毒(甲型流感/珀斯/16/09)，以模拟大多数人已经感染了一种或多种流感毒株和/或接种了季节性流感疫苗的天然情况。免疫接种和攻击的病毒是H1N1病毒(甲型流感/加利福尼亚/04/09)。

整体实验设计

在T＝0时，所有雪貂都通过感染i.n.递送的100PFU H3N2病毒而被致敏。28天后，雪貂被分成4组进行气雾剂喷洒:

组	气雾剂病毒	气雾剂喷洒的日期
			1	H1N1(未处理的)	仅T+28天
2	H1N1(UV-灭活的)	T+28,38,47天
			3	H1N1(福尔马林灭活的)	T+28,38,47天
4	空白对照(PBS)	仅T+28天

表1研究组。

H1N1(未处理的)动物暴露于通过消毒装置但UV灯关闭的H1N1病毒。因此，这些动物暴露在活病毒中。

H1N1(UV灭活的)动物暴露于通过消毒装置但UV灯打开的H1N1病毒(递送剂量为600Jm^-2UV)。因此，动物暴露于UV灭活的病毒。

H1N1(福尔马林灭活的)动物暴露于通过消毒装置但UV灯关闭且已经用福尔马林灭活的H1N1病毒。因此，动物暴露于福尔马林灭活的病毒。

空白对照(PBS)动物暴露于通过消毒装置(在关灯的情况下)的PBS中。因此，这些动物是未免疫的对照组，没有暴露于病毒。

所有气雾剂免疫接种剂量为500PFU，通过气雾剂递送至肺部。喷雾器递送的颗粒的计数中值空气动力学直径为0.72-0.78μm，质量中值空气动力学直径为1.3-1.5μm。

在第T+56天，所有雪貂i.n.接受低剂量(100PFU)的H1N1病毒攻击。

雪貂的气雾剂感染

按照第4、3、2、1组的顺序，使用连接到6喷嘴Collison喷雾器的消毒装置，对每组进行两次5分钟的喷洒，每次喷洒3只雪貂。在T+38和T+47天，只喷洒第2组和第3组。

之前在英国公共卫生部(PHE)波顿进行的一项使用Collison喷雾器和Henderson仪器的研究表明，空气消毒装置(UV灯关闭)的存在对H1N1病毒的喷洒因子没有可测量的影响。使用已知的平均喷洒因子1.53×10^-6，以及平均重量(在T+26天测量)为0.9066kg的雪貂，计算出需要1.88×10⁵PFU/ml的喷雾器浓度来给每只雪貂提供500PFU的施用剂量。对于福尔马林固定的病毒，基于HAU为单位的回收率，使用稀释物，并且起始材料的测量的PFU/HAU比率为7.8×10⁴PFU/HAU。因此，在第28、38和47天，免疫剂量为500PFU病毒。

结果

用H3N2病毒使雪貂致敏

在T＝0时，所有组中的雪貂被鼻内感染100PFU H3N2病毒。病毒接种物的反滴定给出了375PFU/ml的滴度，其在500PFU/ml的目标滴度的2倍之内。所有雪貂的成功感染通过T+4天的鼻腔冲洗液细胞计数的增加(见图4)和T+28天的血凝抑制(HAI)滴度的增加(图2)得到证实。对于鼻腔冲洗液细胞计数上升最低的6只雪貂，对鼻腔冲洗液进行了噬斑试验，并确认所有6只雪貂都在积极清除病毒。

血清HAI滴度

在滴定之前，用3体积的受体破坏酶(RDE)处理所有血清，以除去任何非特异性血凝抑制剂。使用鸡红细胞，针对H3N2(A/珀斯/16/09)和H1N1(A/加利福尼亚/07/09,与A/加利福尼亚/04/09在抗原上无法区别)病毒，滴定来自T＝-3(预先取血)、T+28和T+70天的血清。此外，针对H1N1病毒，滴定在T+38、T+47和T+56天提取的血清。

在T＝-3天时对两种病毒的所有滴度都≤8，因此被认为是血清阴性。所有雪貂到T+28天均显示血清转化为H3N2而不是H1N1病毒(滴度≥320)。H3N2滴度保持在高水平(≥160)，直到T+70天研究结束(图2)。

只有第1组在T+28天喷洒气雾剂后的10天，血清转化为H1N1病毒。第2、3和4组在T+56天鼻内H1N1攻击后的14天，血清转化为H1N1病毒(图3)。

鼻腔冲洗液HAI滴度

在T+38天和T+56天获取的鼻腔冲洗液通过HAI滴定，无需事先进行RDE处理，从2倍稀释开始。两天的所有滴度都≤2。由于这些天被认为是最有可能出现粘膜免疫应答的日子，其他日子的鼻腔冲洗液没有被滴定。

鼻腔冲洗液细胞计数

病毒感染后几天，鼻腔冲洗液中的活细胞数通常从≤10⁵个细胞/ml上升到10⁶-10⁷个细胞/ml。这种上升是针对感染的先天免疫应答的结果。

在T+4天所有组的计数上升，代表对在T＝0天的H3N2感染的免疫应答(图4)。然后，细胞计数下降到在T+28天的气雾剂感染前的基线水平。气雾剂喷洒后，只有第1组在3-5天后细胞计数上升，表明UV处理的和福尔马林处理的病毒不能引发雪貂感染。第2-4组显示，在T+56天的H1N1病毒攻击后的3-7天，细胞计数上升，而第1组没有显示上升。

通过噬斑试验滴定气雾剂喷洒的病毒

为了估计雾化病毒的呈递剂量，剩余的喷雾器液体和收集的冲击器(impinger)液体通过噬斑试验进行滴定。由于福尔马林固定的病毒和在UV照射下通过流感气雾剂消毒装置(IASD)的病毒预计不会显示出感染性，因此提取喷雾器和冲击器液体样品中的RNA，并通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCT)进行滴定。

表2喷雾器和冲击器液体的噬斑试验滴度。n/c，不可计数的噬斑。以PFU/ml为单位的滴度，2次重复的均值。*一次重复的一个孔里的两个噬斑。

由于Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的技术问题，不可能获得T+28天样品的准确滴度。感染是明显的(在n/c组)，但由于单层的问题，噬斑不能被准确计数。T+38和T+47天的第2组喷雾器滴度在1.88×10⁵PFU/ml的目标滴度的2倍以内。第1组和第2组在T+28天，和第2组在T+38和T+47天，在喷雾器中使用相同病毒储液的相同稀释度。根据第1组的RT-PCR滴度计算的喷洒因子非常接近预期值，这支持已达到每只雪貂500PFU的目标呈递剂量的结论。RT-PCR还证实，在第T+28天递送的病毒剂量与在第T+38天和第T+47天递送的病毒剂量相当。福尔马林固定的病毒组3中未检测到活病毒。对于第2组，在第T+28天和第T+38天UV处理病毒后，在冲击器中未检测到感染性。对于第2组，在第T+47天在冲击器中观察到的2.5PFU/ml的低滴度(从单个孔中的2个噬斑计算)仅在冲击器的一个重复中检测到。由于第2组雪貂没有一只在第T+47和T+56天之间显示出任何感染迹象，因此认为该噬斑是污染的结果，所述污染或者是在收集冲击器液体的过程中，或者是在噬斑试验建立的过程中。

病毒滴定

滴定第1-3组在第T+31天(第一次气雾剂喷洒后的3天)的鼻洗液以确认通过气雾剂途径感染雪貂(表3)。

表3第T+31天鼻腔冲洗液的噬斑滴定。

第1组中的6只雪貂(UV灯关闭的状态下感染的)全部被感染并在清除病毒。来自第2组(UV灯照)或第3组(福尔马林固定的)的雪貂的鼻洗液中未检测到病毒。

攻击后的鼻腔冲洗液细胞计数

在H1N1于第T+56天鼻内攻击后的第1、3、5和7天，收集鼻腔洗液并滴定(图5)。

攻击后的病毒滴定

在任何时间点，第1组的鼻腔洗液中均未检测到病毒。第2-4组中的所有18只雪貂在鼻腔冲洗液中都显示出病毒，在攻击后3天达到高峰。在第T+57、T+59或T+61天，第2-4组之间的滴度没有显著差异(单向方差分析)。计算每只雪貂的曲线下面积，第2-4组之间没有显著差异(单向方差分析，p＝0.20)。

感染的临床症状

每天测量体重，T+43-55(含端值)天除外。

在T＝0天时H3N2病毒攻击导致轻微的体重减轻，每组在T+3天时显示平均体重下降(1天下降1.7％)(图6)。

感染的其他临床症状(打喷嚏、流鼻涕和/或食欲不振)在H3N2攻击后的所有组中都能观察到，大多在感染后的第5天至第11天之间。在感染后的28天内没有观察到不活动或腹泻的情况。

在T+28天第一次气雾剂喷洒后，只有第1组显示体重减轻(图7)。

只有第1组在气雾剂喷洒攻击后出现任何其他临床症状，即5次打喷嚏。在T+28天和T+42天之间，没有在任何雪貂中观察到流鼻涕、不活动、食欲不振或腹泻的情况。

在T+56天进行H1N1鼻内攻击后，在第4组(空白对照喷洒的)中观察到相对于第1组(用感染性病毒喷洒的)的显著的体重减轻(t-检验，在T+59天p<0.0001)(图8)。最大平均体重减轻约10％(第4组)与以前使用低剂量H1N1鼻内攻击的研究一致。

相对于第1组和第4组，第2组和第3组表现出中等程度的体重减轻。在T+58-66天和T+68-70天，第2组的体重显著低于第1组(t-检验，p<0.05)(14天中的12天)。第2组体重在T+57-59天和T+61-70天显著大于第4组(t-检验，p<0.05)，即14天中的13天。

为了比较T+56至70天(含端值)的各组，绘制了相对于T+56(即T+56设定为0％)的体重增加或减少，并计算了每只雪貂的曲线下面积。然后通过单尾t检验对各组进行比较：

组	2	3	4
				1	0.007	0.002	0.001
2		0.432	0.022
				3			0.024

表4各组间体重减轻的曲线下面积的比较。显示每对组之间的p值。

除了第2组和第3组之间没有显著差异(表4)外，所有组之间都显示出显著不同的体重减轻。

在T+56至T+70天内，第2、3和4组之间的打喷嚏、流鼻涕和食欲不振的观察结果似乎没有显著差异，尽管所有的似乎都大于第1组。

结论

H3N2致敏通过所有组中鼻腔冲洗液细胞计数的增加以及在T+28天观察到的高H3N2特异性HAI血清滴度来证实。在T+28天的喷洒导致第1组中所有雪貂的感染(如对于感染性病毒所预期的)，但是第2-4组中没有雪貂被感染，证实UV处理和福尔马林处理已经消除了病毒接种物的感染性。从第1组的RT-PCR滴度计算的喷洒因子非常接近预期值，证实了每只雪貂500PFU的目标呈递剂量，这得到了噬斑试验数据的支持。第1组在T+56天显示出对H1N1病毒攻击的明显保护作用：没有体重减轻，最小的临床症状，没有鼻腔冲洗液细胞计数的增加，并且在鼻腔冲洗液中没有可检测的病毒。这种保护与在T+56天观察到的高H1N1特异性血清HAI滴度相关。第2组和第3组在T+38天和T+56天的血清或鼻腔洗液中均没有可检测的HAI滴度。第2组和第3组本身未受到针对感染的保护(鼻腔冲洗液细胞增多，病毒清除在T+59天达到高峰，血清转化为H1N1)，但与对照组4相比，在减少的体重减轻方面表现出针对疾病的免疫保护。

因此，通过显著减少的临床症状(特别是显著减少的体重减轻)证明了将低剂量的(a)福尔马林灭活的H1N1病毒或(b)原位产生的UV灭活的H1N1病毒三次气雾剂递送到肺中，产生了针对感染性H1N1病毒的未来攻击或暴露的免疫保护。

在检测不到HAI滴度的水平，因此低于通常认为的有效保护所需的水平下，可以看到这种免疫保护。

本文描述的免疫保护预计适用于所有空气传播的病原体；预计它适用于所有空气传播的病毒、所有空气传播的RNA病毒、所有空气传播的负链RNA病毒、所有正粘病毒、所有流感病毒和/或甲型流感病毒。

基于500PFU的有效剂量，可以推断出相似量级或更大的剂量刺激免疫系统并且如果通过相同的途径和重复剂量施用也将是有效的。众所周知，重复免疫将增强免疫应答，因此基于这些观察，认识到对于明显低于500PFU的剂量，可能需要3次以上的免疫。显然，500PFU或类似的可以被UV或福尔马林或类似的灭活剂灭活，并且可以作为已制成的或在原位灭活的疫苗制剂被提供。

Claims (25)

1.一种用于预防或治疗疾病的疫苗，其中所述疫苗以如下剂量使用：通过肠胃外途径，在不含佐剂的情况下少于0.03μg抗原，和在含佐剂的情况下少于0.003μg抗原；以及通过粘膜途径，在不含佐剂的情况下少于1μg抗原和/或1.6×10⁷PFU当量，和在含佐剂的情况下少于0.04μg抗原和/或1.6×10⁷PFU当量。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗用于预防或治疗呼吸道感染和/或空气传播感染。

3.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗被施用至呼吸道。

4.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗被施用至肺部。

5.一种用于预防或治疗呼吸道感染或空气传播感染的方法中的疫苗，其中所述疫苗被递送至待治疗受试者的肺部，其中所述疫苗不是减毒活疫苗，并且其中所述疫苗以少于0.003μg的剂量被施用。

6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述剂量少于0.001μg。

7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述剂量少于0.0003μg。

8.一种用于预防或治疗呼吸道感染或空气传播感染的方法中的疫苗，其中所述疫苗是病毒疫苗，并且被递送到待治疗的受试者的肺部，并且其中所述疫苗以少于10³PFU的剂量被施用。

9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述感染是病毒感染。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗是或包含灭活的病毒。

11.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是针对流感、结核、MERS、SARS、鼻病毒、麻疹、埃博拉、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、肺炎双球菌或FMDV的疫苗。

12.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述感染是甲型流感。

13.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述方法包括生产所述疫苗组合物并将其施用至受试者的肺部。

14.根据权利要求13所述的疫苗，其中所述方法包括灭活导致所述疾病的感染性因子，并将灭活的因子递送至受试者的肺部。

15.根据权利要求13或14所述的疫苗，其中所述疫苗是使用便携式装置在原位制备的。

16.根据权利要求15所述的疫苗，其中所述装置由受试者在所述受试者处于所述疾病风险增加的环境中使用。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的疫苗，其中所述疾病是感染。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是预制疫苗制剂。

19.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中使用包括喷雾器的装置将所述疫苗递送至受试者。

20.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗以气雾剂和/或包含气雾剂的形式递送。

21.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗不包含佐剂或不与佐剂共同施用。

22.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中

(a)待治疗的受试者已经通过暴露于相同或相似的病原体而被致敏，和/或已经接种了相同或相似的病原体的疫苗；或者

(b)所述疫苗以初始致敏剂量，随后加强的方式被递送；或者

(c)向受试者递送所述疫苗3次或更多次。

23.喷雾器和如前述权利要求中任一项所定义的疫苗的组合。

24.包含病毒的组合物和包含与面罩流体连通的消毒腔室的装置的组合，其中所述消毒腔室被布置成在将所述组合物从消毒腔室排放到面罩中之前灭活消毒腔室中的病毒，使得所述装置将剂量少于0.003μg和/或少于1.6×10⁷PFU当量的灭活病毒递送到面罩中。

25.一种用于在个体中预防或治疗感染性疾病的方法，其中所述方法包括向个体施用有效量的疫苗，其中所述有效量少于0.003μg抗原和/或少于1.6×10⁷PFU。

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