CN111141715A - 基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置及方法，测定装置包括聚合物薄膜层、金属薄膜层、玻璃基底层、物镜、成像透镜、正交狭缝、图像传感器，沿光轴依次摆放，其中，正交狭缝位于图像传感器前方并紧贴图像传感器，通过转动正交狭缝，可以完成不同转动角度下的荧光采集。依据采集的荧光，计算不同像素位置处的强度关系，以及正交狭缝所转的角度，完成荧光分子三维取向的测定。本发明结构简单，使用方便，易于扩展，能够实现仰角测量和方位角测量，测量角度全。

Description

基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置及方法

技术领域

本发明涉及光学芯片以及分子检测领域，尤其涉及一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置及方法。

背景技术

在显微成像及其应用中，单分子荧光技术已经成为一种越来越重要的手段，为纳米尺度的研究开辟了新的道路。特别是在分子生物学中，因为荧光分子可以作为所在环境光物理性质的探针，对局部物理和化学性质完成表征，在显微领域及分子生物学领域中十分重要。其可以很好的用于标记染料大分子的结构和旋转动力学检测，并且有助于阐明多种生物过程。而单个分子的各种光物理参数取决于分子吸收或发射偶极矩的取向，包括激发态寿命、发射强度和分子间的能量转移率等等。因此荧光分子的三维取向的测定也有着广泛的应用前景。

如今，已经有多种方法来确定荧光分子的取向。科研人员将荧光分子都视作发射电偶极子后测定所对应偶极矩的二维投影或全三维方向，其中包括像差成像、偏振倏逝场激发成像、离焦记录成像等等。大多选择用一个径向偏振光环形激发焦点处的荧光分子，通过记录分子在场分布不均匀的强聚焦光束中的激发率来完成其取向的三维测定。有方法基于重新分配收集到的荧光，检测不同立体角下的荧光分配而确定荧光分子取向。最近，利用空间光调制器并基于波前设计发射光的方法也被用于确定荧光分子的方向。同时，大多上述技术也被成功地用来确定纳米小结构在复杂电磁环境中的行为特征。然而，现有的荧光分子三维取向主要存在的问题为：(1)操作复杂，利用离焦原理或者波前设计需要额外的光学器件和匹配器材，甚至包括对应软件，具体安装测算步骤多，工序繁琐不易完成。(2)设备成本高，空间光调制器、生成非均匀光场所需的光学器材价格昂贵，维护成本高。并且设备一旦安置好，所设计光路不易用于其他应用。(3)速度慢，泄漏辐射谱方法利用表面等离激元的激发重新分配收集到的荧光，从而确定金属近界面处的分子取向，但却需要通过旋转并移动光电倍增管等探测设备，从而以机械扫描的方式完成全角度测量，扫描误差大。(4)应用受局限，常用的离焦方法，在分子靠近金属结构附近不再适用，偏振激化方法在选择简单光场照明时候有着诸多限制，而泄漏辐射谱方法难以表征常见水环境下以及距界面较远的分子。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置及方法，方便快捷，无需复杂光学设备，同时可以扩展至现有光学显微镜的应用中。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，所述装置包括沿光轴依次设置的聚合物薄膜层、金属薄膜层、玻璃基底层、物镜、成像透镜、正交狭缝和图像传感器，所述正交狭缝紧贴于所述图像传感器感光面，光轴与正交狭缝所在平面垂直，所述正交狭缝能够绕光轴方向转动，置于聚合物薄膜层中的荧光分子被激光辐照后发出荧光，荧光经过金属薄膜层和玻璃基底层后被物镜收集，再经过成像透镜和正交狭缝后在图像传感器完成信号采集。

进一步地，所述成像透镜和正交狭缝之间间隔预定距离以满足成像关系，使得物镜的傅里叶面信息被记录于图像传感器中。

进一步地，所述物镜入射端紧贴于玻璃基底层表面。

进一步地，所述聚合物薄膜层厚度可变，能够支持不同波长的荧光分子的传输模式。

进一步地，所述正交狭缝包括挡板，所述挡板上开设有相互正交的两条狭缝，挡板用于挡住非狭缝透过区域的所有光。

进一步地，所述正交狭缝还包括紧贴挡板设置的带通滤波片，其覆盖在所述狭缝透光区域上，用于滤去激发光并透过荧光。

进一步地，所述正交狭缝两条狭缝的初始位置分别与x、y轴平行，z轴与光轴方向一致，正交狭缝可绕z轴方向自由旋转。

根据上述所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置的测定方法，包括以下步骤：

步骤一：所述聚合物薄膜层中的荧光分子被激光照射后发出荧光，其受到聚合物薄膜层、金属薄膜层、玻璃基底层的调制，荧光以一定的方向沿光轴方向出射，经过金属薄膜层和玻璃基底层后，由物镜和成像透镜收集并成像后，荧光经过正交狭缝被图像传感器记录；

步骤二：读取记录于图像传感器的探测信息，并旋转正交狭缝；

步骤三：重复步骤二，直到两个狭缝方向记录的亮斑数目不一致，记录下此时正交狭缝所旋转过的角度，所述角度即为荧光分子的方位角。

进一步地，还包括步骤四：固定步骤三中的狭缝方向，将亮斑少的狭缝中的亮斑强度值与正交狭缝中对应位置的亮斑强度值相除得到比值，所述比值为荧光分子面外分量占所用荧光分子的比值，根据所述比值得到荧光分子的仰角。

进一步地，所述正交狭缝的旋转角度范围设定为0°至180°

本发明通过结构特征来调制荧光辐射，将荧光分子所发出的荧光直接编码在所发射的空间分布，并通过物镜傅里叶面的强度分布来记录不同的发射模式，再利用一个可以旋转的正交狭缝选择荧光强度数据，根据分子的发射模式唯一地快速重建荧光分子的仰角和方位角，即三维取向。

本发明与现有技术相比，其显著优点在于：

(1)本发明结构简单，测量速度快，仅需额外的狭缝装置，解决了常规扫描探测既要旋转又要移动探测设备速度慢以及定位精度不准确的问题，同时旋转狭缝可以整装拆卸，不影响其他光路；

(2)本发明的测量精确度可控，利用显微物镜完成微区成像，可对独立的荧光分子实现筛选；

(3)本发明的测量方法能够实现三维角度全方位测量，三维角度测量包括仰角测量和方位角测量，测量角度全；

(4)本发明采用的测量装置的所有元件与常用显微光路一样，额外元件仅仅是可以旋转的正交狭缝，价格便宜，便于维护，成本低廉；

(5)本发明的测量装置可以直接扩展用于传统显微光路，成像的同时鉴别分子取向，便于观测生物、化学进程，扩展性好；

(6)本发明测量装置中所用的正交狭缝，透光部分使用了带通滤波片，有效的过滤激发光和杂散波长，过滤效果好、复用率高；

(7)本发明中所用聚合物薄膜，可以通过改变厚度支持不同波长的荧光分子的传输模式，完成分子取向的测定。

附图说明

图1为本发明基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置示意图。

图2为正交狭缝示意图。

图3为荧光分子仰角、方位角的示意图。

图4为正交狭缝转到不同角度时候探测结果图。

图5为图4中虚线框区域放大图。

图6为正交狭缝转角度与荧光方位角一致时候探测结果图。

图7为荧光分子面外分量所辐射荧光强度占荧光分子总共辐射荧光强度的比值与荧光分子仰角的关系图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，需要理解的是，所添加的x、y、z坐标系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。

如图1所示，一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，所述装置包括聚合物薄膜层1、金属薄膜层2、玻璃基底层3、物镜4、成像透镜5、正交狭缝6、CCD图像传感器7，所述聚合物薄膜层1、金属薄膜层2、玻璃基底层3、油浸物镜4、成像透镜5、正交狭缝6、图像传感器7沿光轴依次设置。置于聚合物薄膜层1中的荧光分子在被激光辐照后，荧光分子发出荧光，其经过金属薄膜层2和玻璃基底层3后被物镜4收集，经过成像透镜5在图像传感器7完成信号采集。转动正交狭缝6，可以完成采集不同转动角度下的信号采集。依据采集的信号，计算不同像素位置处的强度关系，以及正交狭缝所转的角度，完成荧光分子三维取向的测定。所述正交狭缝6紧贴于所述CCD图像传感器7感光面，且可以绕着光轴转动，这里所述光轴沿着z轴方向，正交狭缝6正面示意图如图2。当正交狭缝6旋转时候，可以在图像传感器7上记录不同的探测数据，如图3。正交狭缝的初始位置与x、y轴一致，图中所述转角为正交狭缝6绕z轴所旋转过的角度。分析对应的数据并记录所旋转正交狭缝6的角度，完成荧光分子仰角及方位角的测定，即荧光分子三维取向的测定。所述仰角为荧光分子的电偶极矩方向与x-y面的夹角。荧光分子的电偶极矩在x-y面内投影为荧光分子的面内分量，在z轴上的投影为荧光分子的面外分量。所述方位角为荧光分子的面内分量与x轴的夹角，如图3所示。

其中，物镜优选为油浸物镜，图像传感器优选为CCD图像传感器。

进一步地，所述荧光分子为罗丹明B,荧光分子三维取向的测定包括测定荧光分子的方位角和仰角。

进一步地，所述成像透镜5、正交狭缝6之间距离满足成像关系，使得物镜4傅里叶面信息可以被记录于图像传感器7。

进一步地，所述物镜4紧贴于玻璃基底层3，优选地，两者中间使用物镜匹配油连接。

进一步地，所述物镜4数值孔径为1.42。

进一步地，聚合物薄膜厚度可变，以支持不同波长的荧光分子的传输模式。

进一步地，所述辐照激光的波长为532nm，待测光学芯片荧光分子可以被此波段激光激发。

进一步地，所述的金属薄膜层2厚度为40nm至50nm。

进一步地，所述的聚合物薄膜层1厚度不少于400nm，例如为410nm。

进一步地，所述正交狭缝6含有带通滤波片8和挡板9，且所述的正交狭缝6可以绕光轴方向自由旋转，其双缝初始位置分别与x、y轴平行，带通滤波片8处可以滤去激发光并透过波长为580nm的荧光，挡板9挡住非狭缝透过区域的所有光。

根据上述基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定方法，包括以下步骤：

步骤一：聚合物薄膜层1中的荧光分子被激光照射后发出荧光，其受到聚合物薄膜层1、金属薄膜层2、玻璃基底层3三层结构的调制，以一定的方向耦合向z轴正方向出射。由物镜4和成像透镜5收集并成像后，荧光经过正交狭缝6被图像传感器7记录；

步骤二：读取记录于图像传感器7的信息，并旋转正交狭缝6。图4为每隔15度所记录的结果，观测记录大部分狭缝中的亮斑数为3。

步骤三：重复步骤二，记录两个狭缝方向记录的亮斑数目，直到数目不一致，记录下此时正交狭缝6所旋转过的角度，此时为60度。如图5所示，在狭缝旋转约60度的时候，其中一个狭缝的亮斑数变为二，在其余角度时候亮斑数目皆为三。另一个狭缝的亮斑数一直是三。所以荧光分子的方位角即60度。

步骤四：如图6，固定步骤三中的狭缝方向，记录亮斑少的狭缝(对应虚线框位置)中的亮斑强度值0.0084与正交位置的狭缝(对应虚线圈位置)中对应位置(正交狭缝中对应位置指的是亮斑距离狭缝中心距离一致，对应虚线圈中三个亮斑中的第二个亮斑)的亮斑强度值0.0045，后者与前者的比值结果0.53即为荧光分子面外分量占所用荧光分子的比值，根据图7，确定荧光分子的仰角约为30°，从而完成荧光分子三维取向的测定。

进一步地，所述正交狭缝6的旋转角度范围优选设定为0°至180°。

本发明技术方案的相关原理为：

荧光分子在匹配激光的辐照下，会产生荧光，由于波导结构的约束，荧光会被耦合成不同的模式并向一侧基底辐射。当荧光分子的取向(仰角，方位角)变化时，其耦合结果也会变化，随之改变辐射的角度和强度。因此我们收集辐射出的荧光即可一一对应的计算出荧光分子的取向。当辐射出的荧光被由油浸物镜收集，可以通过成像透镜将有效信息记录在CCD图像传感器上。而位于像面上的CCD图像传感器所记录下的横电模和横磁模是相互垂直的。当横电模在一个方向处于极大值时候，其在与其垂直的方向上处于极小值。同样横磁模在一个方向处于极小值时候，其在与其垂直的方向上处于极大值。因此可以利用正交狭缝筛选出两种所有模式来记录，在CCD图像传感器表现为一个个离散的亮斑，如图4所示。

为了测定荧光分子的三维取向，也就是荧光分子的方向，可以通过测算荧光分子的仰角以及方位角来得到。一般地，设定光轴沿z轴方向，薄膜法线方向与其一致。荧光分子与x、y轴构成的平面间的夹角，也就是与z轴的余角，通常定义为仰角。将荧光分子的电偶极矩分别投影到坐标系里，分别为处于x、y轴构成的平面里的面内分量与沿着z轴的面外分量。面外分量所发出的荧光强度与荧光分子所有发出的荧光强度的比值，决定了仰角的大小。可以利用时域有限差分法计算偶极子处于不同角度时候的远场辐射图，从而确定不同模式间的比值关系，再进一步拟合得到仰角与比值间的一一对应关系。如图7所示，当面外分量所发出的荧光强度与荧光分子所有发出的荧光强度相等时候，荧光分子的仰角为90°，也就是荧光分子的取向是沿着z轴的。当面外分量所发出的荧光强度为0而与荧光分子所有发出的荧光强度无法比拟时候，荧光分子的仰角为0°，也就是荧光分子的取向是沿着在x、y轴构成的平面内的。为进一步判别荧光分子在x、y轴构成的平面内的取向。通常定义处于x、y轴构成的平面内的荧光分子的面内分量与x轴的夹角为方位角。当方位角和仰角都确定后，也就完成了荧光分子三维取向的测定。

而荧光分子的面外分量在波导结构中只能被耦合成横磁模，荧光分子面内分量则可以在波导结构中被耦合成横磁模和横电模。荧光分子面内分量所发出的荧光在其对应的方向上可以最大程度的耦合成横磁模，因而CCD传感器上记录的横磁模的最强值对应着荧光分子面内分量的方向，也就是荧光分子的方位角。由于所记录的横磁模与横电模是垂直的，在此方向上横电模的强度为0。因此利用一个正交的狭缝，我们可以在CCD图像传感器中找到横电模强度为0的位置，从而判断荧光分子的方位角，如图5中第二行中间图，此时横电模强度为0，所以CCD上显示的亮斑数比别的角度要少。同时结合正交的狭缝，可以记录在方位角正交方向上的横磁模强度，由于荧光分子面内分量在此方向上耦合成横磁模的强度为0，其全部由荧光分子的面外分量所耦合而成。所以将方位角正交方向上的横磁模强度与方位角方向上的横磁模强度相除，则可以计算面外分量占所用荧光分子的比值，从而确定荧光分子的仰角。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述装置包括沿光轴依次设置的聚合物薄膜层(1)、金属薄膜层(2)、玻璃基底层(3)、物镜(4)、成像透镜(5)、正交狭缝(6)和图像传感器(7)，所述正交狭缝(6)紧贴于所述图像传感器(7)感光面，光轴与正交狭缝(6)所在平面垂直，所述正交狭缝(6)能够绕光轴方向转动，置于聚合物薄膜层(1)中的荧光分子被激光辐照后发出荧光，荧光经过金属薄膜层(2)和玻璃基底层(3)后被物镜(4)收集，再经过成像透镜(5)和正交狭缝(6)后在图像传感器(7)完成信号采集。

2.根据权利要求1所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述成像透镜(5)和正交狭缝(6)之间间隔预定距离以满足成像关系，使得物镜(4)的傅里叶面信息被记录于图像传感器(7)中。

3.根据权利要求1所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述物镜(4)入射端紧贴于玻璃基底层(3)表面。

4.根据权利要求1所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述聚合物薄膜层(1)厚度可变，能够支持不同波长的荧光分子的传输模式。

5.根据权利要求1所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述正交狭缝(6)包括挡板(9)，所述挡板(9)上开设有相互正交的两条狭缝，挡板(9)用于挡住非狭缝透过区域的所有光。

6.根据权利要求5所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述正交狭缝(6)还包括紧贴挡板(9)设置的带通滤波片(8)，其覆盖在所述狭缝透光区域上，用于滤去激发光并透过荧光。

7.根据权利要求5或6所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置，其特征在于，所述正交狭缝(6)两条狭缝的初始位置分别与x、y轴平行，z轴与光轴方向一致，正交狭缝(6)可绕z轴方向自由旋转。

8.根据权利要求1-7任一项所述的基于旋转正交狭缝的荧光分子三维取向的测定装置的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：所述聚合物薄膜层(1)中的荧光分子被激光照射后发出荧光，其受到聚合物薄膜层(1)、金属薄膜层(2)、玻璃基底层(3)的调制，荧光以一定的方向沿光轴方向出射，经过金属薄膜层(2)和玻璃基底层(3)后，由物镜(4)和成像透镜(5)收集并成像后，荧光经过正交狭缝(6)被图像传感器(7)记录；

步骤二：读取记录于图像传感器(7)的探测信息，并旋转正交狭缝(6)；

步骤三：重复步骤二，直到两个狭缝方向记录的亮斑数目不一致，记录下此时正交狭缝(6)所旋转过的角度，所述角度即为荧光分子的方位角。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，还包括步骤四：固定步骤三中的狭缝方向，将亮斑少的狭缝中的亮斑强度值与正交狭缝中对应位置的亮斑强度值相除得到比值，所述比值为荧光分子面外分量占所用荧光分子的比值，根据所述比值得到荧光分子的仰角。

10.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述正交狭缝(6)的旋转角度范围设定为0°至180°。

Images