CN111139247B - qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 - Google Patents
qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111139247B CN111139247B CN202010051691.3A CN202010051691A CN111139247B CN 111139247 B CN111139247 B CN 111139247B CN 202010051691 A CN202010051691 A CN 202010051691A CN 111139247 B CN111139247 B CN 111139247B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- qfae6
- rice
- gene
- haplotype
- content
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 76
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 74
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 7
- KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N heptadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000002582 Oryza sativa Indica Group Species 0.000 description 3
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- BITHHVVYSMSWAG-KTKRTIGZSA-N (11Z)-icos-11-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC(O)=O BITHHVVYSMSWAG-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100126948 Arabidopsis thaliana FAE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021329 brown rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- KFEVDPWXEVUUMW-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCC1=CC=C(O)C=C1 KFEVDPWXEVUUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940108623 eicosenoic acid Drugs 0.000 description 1
- BITHHVVYSMSWAG-UHFFFAOYSA-N eicosenoic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCC(O)=O BITHHVVYSMSWAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- WCYAALZQFZMMOM-UHFFFAOYSA-N methanol;sulfuric acid Chemical compound OC.OS(O)(=O)=O WCYAALZQFZMMOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N methyl undecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及qFAE6基因在调节稻米中油脂组分含量的应用和在水稻育种中作为稻米油脂组分含量的筛选标志的应用，本发明还涉及通过对qFAE6基因进行遗传操作来调节稻米中油脂组分含量的方法，以及以qFAE6基因或其突变体作为筛选标记的水稻杂交育种方法。
Description
技术领域
本发明涉及水稻分子育种领域，更特别地，涉及qFAE6基因在调节和筛选稻米中油脂组分含量的应用。
背景技术
植物种子中脂质主要以甘油三酯的形式储存。大米中的油脂对大米的储存、食用品质和消费者的健康都非常重要，其含油率一般为2-4％。米饭的食用品质和适口性受到大米中的脂肪酸组成与含量的影响。目前，本领域中对大米的脂质合成通路知之甚少，Liu等证实了OsFAD3将亚油酸(C18:2)转化成亚麻酸(C18:2)。Zaplin等证实OsFAD2-1将油酸转化成亚油酸。一些研究者还初步鉴定了几个数量性状位点(QTL)。
但是，目前鉴定到的基因和QTL都太少，仍然无法知晓大米油脂合成的遗传和分子基础，因此需要找到影响大米中的油脂组分及含量的主效基因，用做筛选标志或遗传操作的靶点。
发明内容
在本发明的发明人通过研究发现，鉴定了23个与油含量和油脂组成显著相关的位点，并且通过连锁分析的验证得到了11有可能参与到了水稻中与稻米油脂代谢有关的通路的候选基因。在进一步的研究后，我们发现这些位点中，4个基因对油脂组成的自然变异贡献巨大，并且在亚群中有分化。其中之一就是qFAE6基因，我们的研究显示，qFAE6是负调控C20:1含量的主效基因。该基因的突变如果导致蛋白功能的降低或消失，使稻米中的C20:1含量升高。
基于以上研究，本发明提供了qFAE6基因在调节稻米中油脂组分含量的应用，所述qFAE6基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个优选实施方案中，所述油脂组分为C20:1、C20:0和C22:0种的一种或多种组合。
本发明还提供了一种调节稻米中油脂组分含量的方法，包括导入qFAE6基因、提高qFAE6基因表达水平、降低qFAE6基因表达水平或者突变qFAE6基因使qFAE6基因表达的蛋白功能提高、降低或消失的步骤，所述qFAE6基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
例如，如果目标稻种其他性状优良，但是稻米中C20:1含量太高，并且该稻种含有正常功能的qFAE6基因，可通过敲除或突变目标稻种中的qFAE6基因，使qFAE6基因不表达，或者表达的蛋白的3-酮酯酰基-CoA合成酶功能降低或没有3-酮酯酰基-CoA合成酶功能，即可降低C20:1含量。
反之，如果目标稻种其他性状优良，但是稻米中C20:1含量太低，并且该稻种不含有正常功能的qFAE6基因，可通过导入qFAE6基因，或突变目标稻种中的不正常的qFAE6基因使其回复突变成具有正常3-酮酯酰基-CoA合成酶功能的qFAE6基因，即可提高稻米中的C20:1含量。
本发明还提供了qFAE6基因在水稻育种中作为稻米油脂组分含量的筛选标志的应用，所述qFAE6基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种水稻杂交育种方法，包括使用qFAE6基因或其突变体作为筛选标志来选择目标基因型的步骤。
在一个优选实施方案中，所述水稻杂交育种方法包括以下步骤：
S1：鉴定亲本中的qFAE6基因及其突变状态；
S2：选择qFAE6基因或其突变体作为筛选标志；
S3：将所述筛选标志与其他优势性状聚合到一起。
例如，已有稻种的其他性状优良，但稻米中C20:1含量太高，并且含有正常功能的qFAE6基因，要想通过杂交育种的方法提高C20:1含量，可先选择qFAE6基因发生了导致3-酮酯酰基-CoA合成酶功能降低或消失的突变的亲本与该稻种进行杂交，通过将qFAE6基因突变体作为分子标志来使该突变基因与其他优势性状聚合到一起。
反之，已有稻种的其他性状优良，但稻米中C20:1含量太低，并且不含正常功能的qFAE6基因，要想通过杂交育种的方法降低稻米的C20:1含量，可先选择具有正常3-酮酯酰基-CoA合成酶功能的qFAE6基因亲本与该稻种进行杂交，通过将该正常qFAE6基因作为分子标志来使该突变基因与其他优势性状聚合到一起。
附图说明
图1为通过GC-MS检测的533种稻米品种中的10种油脂组分的百分含量；
图2为533个稻米品种中澳洲稻(Aus)、籼稻(Ind)、粳稻(Jap)的油脂相关性状的表型分布；
图3为籼稻亚群中C20:1含量关联分析的曼哈顿图(Manhattan plot)，虚线表示显著性阈值(-log10(P)＝7.06)
图4为染色体6上的显著性峰周围的区域曼哈顿图和连锁不平衡(LD)热图，箭头表示候选基因的核苷酸变异位点，垂向虚线表示峰周围的候选区；
图5为qFAE6的基因结构以及该基因的多态性；
图6为通过连锁分析鉴定qFAE6作为ZS97/MH63的重组自交(RIL)群体中C20：1含量的主效位点的QTL扫描结果的统计图；
图7为不同qFAE6单倍型的C20:1含量统计图，其中a的测试对象为获取群体中的305个籼稻品种，b的测试对象为由ZS97/MH63衍生的RIL群体。图8为野生型和敲除突变家系中的10种脂肪酸含量的统计图，*P<0.05,**P<0.01；***P<0.001。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、样品来源
本发明使用的水稻材料包括533个栽培稻品种构成的自然群体和三个自己培育的重组自交群体。自然群体用于全基因组关联分析，三个重组自交群体用于连锁分析。
其中，533个栽培稻品种包括50个澳洲稻品种(aus)、305个籼稻品种(indica)和178个粳稻品种(japonica)。
三个重组自交品种分别衍生自以下杂交系：珍汕97/明恢63(ZS97/MH63)、88B-2/HD9802S和B805D/H6S。
所有四个群体均在武汉的华中农业大学的试验田中栽植生长，在五月中旬播种，六月中旬移栽到大田，收获后的稻谷晾干后室温储藏至少三个月，然后用于实验。
2、样品处理
将稻谷脱壳成糙米，然后碾粉，过80目筛，于80℃下干燥24h，然后进行脂质提取。0.2g米粉加入10ml玻璃管中，加入4.5ml硫酸:甲醇溶液(1:19)和100μl溶于氯仿的十七烷酸标准溶液，混匀。十七烷酸标准溶液的配置为1.07g十七烷酸标样溶于10ml色谱纯氯仿。将混合物在85℃水浴中孵育2h。冷却至室温后，使用正己烷提取脂肪酸甲酯，并通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析。所有鉴定的脂肪酸含量的总和作为含油量。每个样品进行两次测试，将平均值用于后续分析。
3、GC-MS分析结果
GC-MS分析结果如图1所示，鉴定出的10种脂肪酸中，软脂酸(C16:0)、油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)占总脂肪酸含量的90％以上。我们在研究中发现了大量油脂相关性状存在广泛的变异，从C18:2含量的1.5倍差异到肉豆蔻酸(C14:0)含量的7.4倍差异。总脂肪酸含量介于22.99-40.96mg/g的范围。
其中，澳洲稻(aus)中的C16:0含量最高，其次是籼稻(Ind)和粳稻(Jap)，C18:1和C18:2的含量则相反(图2)。
4、关联分析和连锁分析
全基因组关联研究(GWAS)：分别对籼稻、粳稻和所有样品实施GWAS。在每个分析组中，仅选择次要位点频率(MAF)＞5％、缺失率＜15％的SNP进行关联分析。
连锁分析：对三个RIL群体——ZS97/MH63(96个株系)、88B-2/HD9802S(108个株系)和B805D/H6S(135个株系)——进行连锁分析。这些株系均通过二代测序，然后将50bp双末端读序比对到水稻参考基因组。其中比对质量≥40的序列和平均质量≥10的碱基用于鉴定SNP。通过使用MPR算法来推断亲本株系的基因型，构建遗传Bin图谱，用于鉴定QTL。
根据以上工作，我们最终获得了520万个高质量SNP，用于评估群体结构和亲缘关系，并在其中鉴定了23个显著的关联位点。在23个位点中，我们发现了qFAE6是与C20:0(花生酸)、C20:1(二十碳一烯酸)和C22:0(二十二烷酸)的含量相关的主效基因座(图3)。
如图4所示，qFAE6位于6号染色体的长臂上，我们基于点配对连锁不平衡(LD)相关系数(r2＜6)评估了23.60-23.70Mb(98kb)区域内的序列，最终确定该QTL对应的候选基因为LOC_Os06g39750(序列为SEQ ID NO:1)，编码一种3-酮酯酰基-CoA合成酶，其在拟南芥中的同源基因为FAE1，参与长链脂肪酸的生物合成。
LOC_Os06g39750中有7个SNP位点和1个插入/缺失位点，作为非同义突变。其中4个突变位点与表型关联，并且形成了A和B两种单倍型(图5)，这四个位点分别为第7位的A-T，第28位的9bp插入/缺失位点、第366位的C-A和第559位的A-G。ZS97和MH63具有不同的单倍型，针对ZS97/MH63杂交系衍生的RIL群体的QTL分析证实了qFAE6对C20:0,C20:1和C22:0含量的影响(图6和表1)。
表1油脂相关性状的表型分析
根据突变位点，我们将qFAE6划分为单倍型A(SEQ ID NO:1)和单倍型B(SEQ IDNO:2)。在305个籼稻品种中，单倍型A系与单倍型B系相比，具有显著更低的C20:1含量，在ZS97/MH63杂交衍生群体中，单倍型A的株系C20:1含量也显著低于具有单倍型B的株系(图7)。
5、转基因分析
为了进一步确定qFAE6的功能，我们利用CRISPR-cas9系统敲除了ZS97中的qFAE6。在制备CRISPR/Cas9敲除构建体上，我们仔细地检查了基因编码区，设计了带有C末端NGG的23bp靶点。确定靶点后，我们将20bp靶点插入中间载体pER8-Cas9-U6或pER8-Cas9-U3，并克隆至pCXUN-Cas9，得到敲除载体，命名为KO-FAE6。将敲除构建体导入大肠杆菌strainTrans 5α感受态细胞中进行测序，验证正确后，导入根瘤农杆菌Agrobacteriumtumefaciens strain EHA105，然后分别转入ZS97。获得转基因植株后，通过测序验证敲除系的基因型。
与野生型相比，ZS97敲除系KO-q FAE6的C20:0、C20:1、C20:2和C22:0含量显著降低(图8)。证明该位点可用于调节大米中的脂肪酸组成。
综合上面的实验可知，qFAE6是C20:0、C20:1、C20:2和C22:0含量的正调控主效基因。该基因的突变如果导致蛋白功能的降低或消失，使稻米中使C20:0、C20:1、C20:2和C22:0降低。
本领域技术人员在阅读本申请披露的内容后可知，只需要将该基因导入、敲除、敲降或突变成相关功能降低或无相关功能，即可达到调节稻米中C20:0、C20:1和C22:0含量的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
湖北双水双绿生物科技有限公司
<120> qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1560
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atggagacct cggcggcggc ggcgcccaat ggcggcgcgg cggcggcgga gcagcagcag 60
cggcgtcggc tgccggactt ccagcagtcg gtgaggctca agtacgtgaa gctggggtac 120
cactacctca tctcccacgg catgtacctg ctgctgtcgc cgctgatggc gctggtggcc 180
gtgcagctct ccaccgtgtc cccgggcgac atcgccgacc tgtgggagca gctccgcttc 240
aacctcctct ccgtcgtcgc ctgctccacc ctcctcgtct tcctctccac cctctacttc 300
ctcacccgcc cccgccccgt ctacctcctc gacttcgcct gctacaagcc cgacccccag 360
cgcaagtgca cccgcgagac cttcatgcgc tgctccagcc tcaccggctc cttcaccgac 420
gccaacctcg acttccagcg caagatcctc gagcgctccg gcctcggcga ggacacctac 480
ctccctcccg ccgtgctgcg cgtcccgccc aacccgtgca tggacgaggc ccgcaaggag 540
gcccgcaccg tcatgttcgg cgccattgac cagcttcttg agaagacggg tgtgaagccc 600
aaggacattg gtgtggttgt cgtcaattgc agcttgttca acccgacgcc gtcgctgtcc 660
gccatggttg tgaaccacta caagctgagg gggaatgtca tcagctacaa cctcggcggg 720
atggggtgca gtgccggctt gctgtccgtc gatctcgcca aggacttgct gcaggtgcac 780
ccaaactcgt acgcgctggt ggtcagcatg gagaacatca cgctcaattg gtactttggc 840
aacaaccggt cgatgctcgt gtcgaattgc ctgttccgga tgggcggcgc cgccatcctg 900
ctgtcgaaca ggcggtccga ccgccggagg tccaagtatg agcttgtgca caccgtgcgc 960
acgcacaagg gcgccaacga caagtgcttt ggctgtgtca cccaggagga agacgagatc 1020
ggcaagatcg gcgtgtcgct ctccaaggac ctgatggcgg tggccggaga cgcgctgaag 1080
acgaacatca ccaccctcgg gccgctcgtg ctcccgttgt cggagcagct gctcttcatg 1140
gccacattgg ttgccaagaa ggtcctcaag atgaagatca agccatacat tcccgatttc 1200
aagctggcat ttgagcattt ctgcatccat gccggtggcc gtgccgtgct ggatgagctg 1260
gagaagaact tggagttgac tgactggcac atggagccat ctaggatgac actgtaccgg 1320
tttggcaaca catcgagcag ctcactctgg tatgagctgg cgtacaccga ggcgaagggg 1380
aggatcagga agcgggacag gatctggcag attgcatttg gatctggttt caagtgcaac 1440
agcgcagtct ggaaggcgct gcaaacagtg aatccagcga aggagaagaa cccctggatg 1500
gatgagattg acaacttccc ggttgaagtt ccaaagatat caaaggttgg aaatgcatga 1560
<210> 2
<211> 1572
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
atggagtcct cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcca atggcggcgc ggcggcggcg 60
gagcagcagc agcggcgtcg gctgccggac ttccagcagt cggtgaggct caagtacgtg 120
aagctggggt accactacct catctcccac ggcatgtacc tgctgctgtc gccgctgatg 180
gcgctggtgg ccgtgcagct ctccaccgtg tccccaggcg acatcgccga cctgtgggag 240
cagctccgct tcaacctcct ctccgtcgtc gcctgctcca ccctcctcgt cttcctctcc 300
accctctact tcctcacccg cccccgcccc gtctacctcc tcgacttcgc ctgctacaag 360
cccgaacccc agcgcaagtg cacccgcgag acattcatgc gctgctccag cctcaccggc 420
tccttcaccg acgccaacct cgacttccag cgcaagatcc tcgagcgctc cggcctcggc 480
gaggacacct acctccctcc cgccgtgctg cgcgtcccgc ccaacccctg catggacgag 540
gcccgcaagg aggcccgcgc cgtcatgttc ggcgccattg accagcttct tgagaagacg 600
ggtgtgaagc ccaaggacat tggtgtggtt gtcgtcaatt gcagcttgtt caacccgacg 660
ccgtcgctgt ccgccatggt tgtgaaccac tacaagctga gggggaatgt catcagctac 720
aacctcggcg ggatggggtg cagtgccggc ttgctgtccg tcgatctcgc caaggacttg 780
ctgcaggtgc acccaaactc gtacgcgctg gtggtcagca tggagaacat cacgctcaat 840
tggtactttg gcaacaaccg gtcgatgctc gtgtcgaatt gcctgttccg gatgggcggc 900
gccgccatcc tgctgtcgaa caggcggtcc gaccgccgga ggtccaagta tgagcttgtg 960
cacaccgtgc gcacgcacaa gggcgccaac gacaagtgct ttggctgtgt cacccaggag 1020
gaagacgaga tcggcaagat tggcgtgtcg ctctccaagg acctgatggc ggtggccgga 1080
gacgcgctga agacgaacat caccaccctc gggccgctcg tgctcccatt gtcggagcag 1140
ctgctcttca tggccacatt ggttgccaag aaggtcctca agatgaagat caagccatac 1200
attcccgatt tcaagctggc atttgagcat ttctgcatcc atgccggtgg ccgtgccgtg 1260
ctggatgagc tggagaagaa cttggagttg actgactggc acatggagcc atctaggatg 1320
acactgtacc ggtttggcaa cacatcgagc agctcactct ggtatgagct ggcgtacacc 1380
gaggcgaagg ggaggatcag gaagcgggac aggatctggc agattgcatt tggatctggt 1440
ttcaagtgca acagcgcagt ctggaaggcg ctgcgaacag tgaacccggc gaaggagaag 1500
aacccctgga tggatgagat tgacaacttc ccggttgaag ttccaaagat atcaaaggtt 1560
ggaaatgcat ga 1572
Claims (5)
1.一种调节稻米中油脂组分含量的方法，其特征在于，包括将生产所述稻米的稻种中的qFAE6基因单倍型A突变成qFAE6基因单倍型B，或将生产所述稻米的稻种中的qFAE6基因单倍型B突变成qFAE6基因单倍型A的步骤，所述qFAE6基因单倍型A的序列如SEQ ID NO:1所示，所述qFAE6基因单倍型B的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.qFAE6基因单倍型B和A在水稻育种中作为稻米油脂组分含量的筛选标志的应用，所述qFAE6基因单倍型B的序列如SEQ ID NO:2所示，所述qFAE6基因单倍型A的序列如SEQ IDNO:1所示。
3.一种水稻杂交育种方法，其特征在于，包括使用qFAE6基因单倍型B和A作为筛选标志来选择目标基因型的步骤，所述qFAE6基因单倍型B的序列如SEQ ID NO:2所示，所述qFAE6基因单倍型A的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述水稻杂交育种方法，其特征在于，已有稻种含有qFAE6基因单倍型B，
S1：鉴定含有qFAE6基因单倍型A的稻种作为亲本；
S2：使所述已有稻种与含有qFAE6基因单倍型A突变的亲本杂交；
S3：以所述qFAE6基因单倍型A和B作为筛选标记，将所述qFAE6基因单倍型A与所述已有稻种的优势性状聚合到一起。
5.根据权利要求3所述水稻杂交育种方法，其特征在于，已有稻种含有qFAE6基因单倍型A，
S1：鉴定含有qFAE6基因单倍型B的稻种作为亲本；
S2：使所述已有稻种与所述含有qFAE6基因单倍型B的稻种杂交；
S3：以所述qFAE6基因单倍型A和B作为筛选标记，将所述qFAE6基因单倍型B与所述已有稻种的优势性状聚合到一起。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010051691.3A CN111139247B (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010051691.3A CN111139247B (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111139247A CN111139247A (zh) | 2020-05-12 |
| CN111139247B true CN111139247B (zh) | 2022-04-08 |
Family
ID=70525681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010051691.3A Expired - Fee Related CN111139247B (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111139247B (zh) |
-
2020
- 2020-01-17 CN CN202010051691.3A patent/CN111139247B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Wax Crystal-Sparse Leaf1 encodes a β–ketoacyl CoA synthase involved in biosynthesis of cuticular waxes on rice leaf;Dongmei Yu等;《Planta 》;20080624;第228卷;摘要，结果部分 * |
| XM_015788720.2;NCBI;《Genbank》;20180807;第1-2页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111139247A (zh) | 2020-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties | |
| EP3978613A1 (en) | Parthenogenetic haploid induction gene dmp and application thereof | |
| CN110760608B (zh) | 一种油菜BnFAD2基因高油酸等位突变及其SNP标记引物的开发和应用 | |
| CN110305980B (zh) | 一种抗根肿病高油酸油菜的选育方法及其应用 | |
| CN113980996B (zh) | 蛋白gen1及其相关生物材料在调控玉米产量中的应用 | |
| CN114350832B (zh) | 一种外源萝卜片段特异标记及其制备方法和应用 | |
| US20140345005A1 (en) | Brassica Ogura Restorer Lines with Shortened Raphanus Fragment (SRF) | |
| CN111139247B (zh) | qFAE6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 | |
| CN115125262B (zh) | 一种水稻垩白相关基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN115851824B (zh) | 一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法以及sd1基因核心启动子和应用 | |
| CN111139246B (zh) | qPLA6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 | |
| CN110669782A (zh) | 大豆糖转运体基因GmSWEET39的应用 | |
| CN114525300A (zh) | 多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系 | |
| CN111154784A (zh) | qLIN6基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 | |
| CN114599224B (zh) | 芥菜品系nubj1207 | |
| CN114731949A (zh) | 高油酸大豆突变体及其检测方法 | |
| CN111235170A (zh) | qMYR2基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用 | |
| CN113583990A (zh) | 水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其应用 | |
| CN108707690B (zh) | 与白肋烟控制基因共分离的分子标记及其应用 | |
| US9622430B2 (en) | Solanum lycopersicum plants having non-transgenic alterations in the ACS4 gene | |
| CN115820661B (zh) | 一种玉米矮化基因及其应用 | |
| CN112852866B (zh) | 利用线粒体基因编辑系统培育植物雄性不育系的方法 | |
| CN112342227B (zh) | 水稻花药发育调控基因edt1及其应用 | |
| CN117305326B (zh) | 青花菜BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用 | |
| CN118028308A (zh) | 穗发育相关转录因子TaMYC2及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220408 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |