CN111118154A - Linc01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用 - Google Patents

Linc01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用，LINC01272的序列如SEQ ID No：1所示。本发明提供了一种肿瘤检测试剂盒，其包括检测LINC01272表达量的试剂；一种肿瘤检测芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的探针，探针包括与SEQ ID NO.1互补的核苷酸序列。本发明还提供了用于治疗肿瘤的药物，包括LINC01272的抑制剂。LINC01272在癌细胞中上调表达，LINC01272用以开发肿瘤检测试剂盒或芯片，可判定检测的组织是否为恶性组织。抑制LINC01272的表达能够有效抑制癌细胞的增殖和侵袭，施用LINC01272表达抑制剂可治疗肿瘤。

Description

LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用。
背景技术
在人类基因组中，约有93％的DNA序列可以被转录成RNA，但是其中仅不到2％的核酸序列被用于编码蛋白质，其余的转录产物均为不编码蛋白质的非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)。非编码RNA广泛存在于各种生物中，其中长度在200-100000nt之间的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)及其亚型基因间长链非编码RNA(long intergenicnon-coding RNA,lincRNA)是近几年来发现的一类具有生物学功能的非编码RNA。已有的研究表明，lncRNA可以以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控及转录后调控，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。同时，lncRNA具有组织或细胞特异性表达、特定的亚细胞定位、局部高度保守的序列元件及特殊的空间二级结构，能以RNA的形式参与机体重要的生物学功能，包括与蛋白质相互作用、形成内源性siRNA、调控mRNA剪切、转录调节等。
尽管已经报道一些lncRNA的生物学功能，但仍有许多作用和功能机制尚不明确。因此，深入理解lncRNA涉及的复杂基因调控网络，有利于为肿瘤的诊断和治疗提供新的策略。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测肿瘤的诊断试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种用于治疗肿瘤的药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现：LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用。
所述的LINC01272的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。
所述的肿瘤优选为胰腺癌和口腔鳞状细胞癌。
所述的检测试剂为芯片和试剂盒中的一种。
一种肿瘤检测试剂盒，包括检测上述LINC01272表达量的试剂。
所述的肿瘤优选为胰腺癌和口腔鳞状细胞癌。
所述的检测LINC01272表达量的试剂为RT-PCR试剂、Northern检测试剂和RNA检测探针中的一种。
所述的RT-PCR试剂包括扩增LINC01272编码基因及其内参的引物、扩增靶miRNA497及其内参的引物、荧光定量PCR反应体系。
所述的LINC01272编码基因的引物序列如SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示。
所述的LINC01272编码基因的内参引物为GAPDH，序列如SEQ ID No：4和SEQ IDNo：5所示。
所述的靶miRNA497的引物序列如SEQ ID No：6所示。
所述的靶miRNA 497的内参引物为snRNA U6，序列如SEQ ID No：7所示。
一种肿瘤检测芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的探针。
所述的肿瘤优选为胰腺癌和口腔鳞状细胞癌。
所述的探针包括与SEQ ID NO.1互补的核苷酸序列。
所述的固相载体包括可采用基因芯片领域的各种常用材料，包括但不限于尼龙膜、硅片等。
一种用于治疗肿瘤的药物，包括上述LINC01272的抑制剂。
所述的肿瘤优选为胰腺癌和口腔鳞状细胞癌。
所述的LINC01272的抑制剂为LINC01272的反义核酸、siRNA、miRNA和shRNA中的一种。
所述的siRNA的序列如SEQ ID No：8～SEQ ID No：10所示。
所述的治疗肿瘤的药物还含有药学上可接受的载体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明发明人发现LINC01272在癌细胞中上调表达，LINC01272可用以开发肿瘤检测试剂盒或芯片，以判定检测的组织是否为恶性组织。
2.本发明发明人发现抑制LINC01272的表达能够有效抑制癌细胞的增殖和侵袭，施用LINC01272表达抑制剂可治疗肿瘤。
附图说明
图1为实施例1中，LINC01272在7株肿瘤细胞和人胰腺上皮细胞中的表达结果图。
图2为实施例2中，RT-PCR检测LINC01272敲减效果图；其中，A为BxPC-3细胞LINC01272敲减效果图；B为AsPC-1细胞LINC01272敲减效果图。
图3为实施例2中，敲减LINC01272对细胞生长的影响结果图；其中，A为BxPC-3细胞和AsPC-1细胞敲减LINC01272后的细胞形态图；B为BxPC-3细胞和AsPC-1细胞敲除LINC01272后的细胞生长数目统计图。
图4为实施例2中，敲减LINC01272对肿瘤细胞侵袭的影响结果图，其中，A为BxPC-3细胞和AsPC-1细胞敲减LINC01272后的侵袭细胞形态图；B为BxPC-3细胞敲减LINC01272后的侵袭细胞数目统计图；C为AsPC-1细胞敲减LINC01272后的侵袭细胞数目统计图。
图5为实施例3中，敲减LINC01272后BxPC-3和AsPC-1中细胞靶向miRNA miR-497表达结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1LINC01272在肿瘤细胞中的表达检测
用于实验的细胞株是hTERT-HPNE(人胰腺导管上皮细胞)、hFF(人包皮成纤维细胞)、A375(人恶性黑色素瘤细胞)、U2-OS(人骨肉瘤细胞)、CAL27(人口腔鳞状细胞癌细胞)、U118MG(人胶质瘤细胞)、BxPC-3(人胰腺癌细胞)、AsPC-1(人胰腺癌细胞)，其中，hTETR-HPNE购自华拓生物科技有限公司，hFF是分离自人包皮的成纤维原代细胞，其他细胞购自中科院细胞库。
对这8株细胞的LINC01272含量进行检测，步骤如下：
(1)提取细胞RNA
将对数生长期的细胞用预冷的1×PBS清洗3次，加入1mL Trizol充分裂解细胞，加入200μL氯仿，剧烈震荡，静止5min，4℃、12000rpm离心15min，吸取上清水相，加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，静置15min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，再加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心5min，弃上清，自然晾干5min，加入适量10-30μL的无酶水，得到细胞的RNA。
(2)采用Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒(TOYOBO公司)将步骤(1)获得的RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche公司)进行RT-PCR反应。
用于检测编码LINC01272的DNA的引物序列如下：
F1：5’-TCCTGTTCCCATTGCTGGAC-3’；
R1：5’-GTCCTGGCCTTGCCACTTT-3’。
用于检测GAPDH(内参)的引物序列如下：
F2：5’-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3’；
R2：5’-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3’。
结果如图1所示，7种肿瘤细胞中LINC01272的表达量均比人胰腺导管上皮细胞高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明LINC01272在肿瘤细胞中表达上调。
实施例2LINC01272在肿瘤细胞功能的影响研究
(1)建立LINC01272敲低细胞系
将LINC01272 siRNA1、LINC01272 siRNA2、LINC01272 siRNA3及NC siRNA(广州锐博生物)用lip2000(ThermoFisher)转入BxPC-3和AsPC-1细胞，培养48小时。用RT-PCR的方法检测两种细胞中LINC01272的表达水平，从而检测LINC01272的敲除效率。具体操作如下：取对数生长期的细胞用预冷的1×PBS清洗3次后，加入1mL Trizol充分裂解细胞，加入200μL氯仿，剧烈震荡，静止5min，4℃、12000rpm离心15min，吸取上清水相，加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，再加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心5min，弃上清，自然晾干5min，加入10-30μL的无酶水，得到细胞的RNA。然后采用ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒(TOYOBO公司)将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche公司)进行RT-PCR反应。用于检测GAPDH(内参)和编码LINC01272的DNA的引物序列如实施例1所示。
结果如图2所示，胰腺癌细胞BxPC-1和AsPC-1中，LINC01272的表达水平显著下降，该结果表明LINC01272敲除效果明显。
(2)LINC01272对肿瘤细胞生长的影响
将LINC01272 siRNA1、LINC01272 siRNA2、LINC01272 siRNA3及NC siRNA(广州锐博生物)用lip2000(ThermoFisher)转入BxPC-3和AsPC-1细胞，培养48小时后，用细胞计数法检测两种细胞的生长情况。
结果如图3所示，与NC siRNA组相比，LINC01272 siRNA感染的BxPC-3和AsPC-1细胞的数量显著减少(p<0.05)，表明下调LINC01272的表达可抑制肿瘤细胞的生长。
(3)LINC01272对肿瘤细胞侵袭的影响
将LINC01272 siRNA1、LINC01272 siRNA2、LINC01272 siRNA3及NC siRNA用lip2000转入BxPC-3和AsPC-1细胞，培养24小时后，用浓度为0.25％(v/v)的胰酶(Trypsin-EDTA)消化细胞2min，取105个细胞接种在transwell小室中，上室加入200μL含2％(v/v)胎牛血清的培养基(BxPC-1的培养基为DMEM，AsPC-1的培养基为RPMI1640)，下室加入500μL完全培养基，48h后取出小室，用棉签擦拭小室内粘附的细胞，用甲醇固定10min，加入结晶紫染色10min，计算小室中细胞数量。
结果如图4所示，LINC01272 siRNA组比NC siRNA组穿膜细胞数量显著下降(P<0.05)，证明了敲低LINC01272可抑制肿瘤细胞的侵袭能力。提示LINC01272的表达与肿瘤细胞的侵袭能力有关。
实施例3敲减LINC01272的细胞中miR-497的表达上调
LINC01272的靶向miRNA为miR-497。将LINC01272 siRNA1、LINC01272 siRNA2、LINC01272 siRNA3及NC siRNA(广州锐博生物)用lip2000(ThermoFisher)转入BxPC-3和AsPC-1细胞，培养48小时后，用RT-PCR的方法检测两种细胞中miR-497的表达水平，从而检测miR-497的差异表达。具体操作如下：取对数生长期的细胞用预冷的1×PBS清洗3次后，加入1mL Trizol充分裂解细胞，加入200μL氯仿，剧烈震荡，静止5min，4℃、12000rpm离心15min，吸取上清水相，加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，再加入1mL预冷的75％(v/v)乙醇，4℃、12000rpm离心5min，弃上清，自然晾干5min，加入10-30μL的无酶水，得到细胞的RNA。然后使用miDETECT A track miRNA qRT-PCR Starter Kit(锐博生物)将RNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模板用FastStart Universal SYBR GreenMaster(ROX)试剂盒(Roche公司)进行RT-PCR反应。
用于检测snRNA U6内参的引物序列如下：
5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’。
用于检测miR-497的引物序列如下：
5’-CAGCAGCACACTGTGGTTTGT-3’。
结果如图5所示，LINC01272 siRNA组中miR-497的表达量显著上调(P<0.05)，提示LINC01272靶向miR-497调控胰腺癌细胞的增殖和侵袭。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南协同创新研究院
<120> LINC01272在制备肿瘤检测试剂和治疗药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272的cDNA序列
<400> 1
atgaagctac ttgccaaggt cacgcagcac agtcacatcc tactgaacat catcctgttc 60
tctgggtgga atgtcaccat cgcccaggtg gggatttttg tgtgttttgt tcactgctgt 120
acacccagcc cccagcacag cgcctgtcca ggacaagtgc ccagtaaaca cttgggaagc 180
aatgcaagcg tcctcccagc agctcctgca aacagacccc cgacccaagc ccttccttct 240
gcctccactg ccaccactgc tgctcatctc tgctggcaca gaagtctctt ccctggtctt 300
ccagaaatcc cctctccaca ctcagccaga gggagctatt aa 342
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272编码基因的引物F1
<400> 2
tcctgttccc attgctggac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272编码基因的引物R1
<400> 3
gtcctggcct tgccacttt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272编码基因的内参引物F2
<400> 4
caaattccat ggcaccgtca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272编码基因的内参引物R2
<400> 5
tgatgaccct tttggctccc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶miRNA 497的引物
<400> 6
cagcagcaca ctgtggtttg t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶miRNA 497的内参引物snRNA U6
<400> 7
cgcttcggca gcacatatac 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272 siRNA1
<400> 8
gcagcacagt cacatccta 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272 siRNA2
<400> 9
gctggcacag aagtctctt 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LINC01272 siRNA3
<400> 10
ggagaataaa ccctcggat 19

Claims (10)

1.LINC01272在制备肿瘤检测试剂和/或治疗药物中的应用，其特征在于：所述的LINC01272的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为胰腺癌和口腔鳞状细胞癌。
3.一种用于检测肿瘤的诊断试剂盒，其特征在于：包括检测权利要求1所述的LINC01272表达量的试剂。
4.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤的诊断试剂盒，其特征在于：所述的检测LINC01272表达量的试剂为RT-PCR试剂、Northern检测试剂和RNA检测探针中的一种。
5.根据权利要求4所述的用于检测肿瘤的诊断试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR试剂包括扩增LINC01272编码基因及其内参的引物、扩增靶miRNA 497及其内参的引物、荧光定量PCR反应体系。
6.根据权利要求5所述的用于检测肿瘤的诊断试剂盒，其特征在于：
所述的LINC01272编码基因的引物序列如SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示；
所述的靶miRNA 497的引物序列如SEQ ID No：6所示。
7.根据权利要求5所述的用于检测肿瘤的诊断试剂盒，其特征在于：
所述的LINC01272编码基因的内参引物为GAPDH，序列如SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示；
所述的靶miRNA 497的内参引物为snRNA U6，序列如SEQ ID No：7所示。
8.一种肿瘤检测芯片，其特征在于包括固相载体和固定在固相载体上的探针；
所述的探针包括与SEQ ID NO.1互补的核苷酸序列；
所述的固相载体包括尼龙膜和硅片。
9.一种用于治疗肿瘤的药物，其特征在于包括权利要求1所述的LINC01272的抑制剂；
所述的LINC01272的抑制剂为LINC01272的反义核酸、siRNA、miRNA和shRNA中的一种。
10.根据权利要求9所述的用于治疗肿瘤的药物，其特征在于：
所述的siRNA的序列如SEQ ID No：8～SEQ ID No：10所示；
所述的治疗肿瘤的药物还含有药学上可接受的载体。
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