CN111116719A - 乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学免疫学和感染病学领域，特别涉及189种乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用，所述抗原表位肽分别是由HLA‑A0201、HLA‑A1101、HLA‑A2402、HLA‑A0207、HLA‑A3101、HLA‑A0206、HLA‑A3303、HLA‑A3001、HLA‑A0203、HLA‑A1102、HLA‑A0301、HLA‑A2601、HLA‑A0101分子限制性的抗原肽，可以特异性地与细胞毒性胸腺依赖性淋巴细胞结合，刺激后者活化、增殖和分化，从而发挥抗乙型肝炎病毒的免疫效应作用；这些抗原肽可以用来制备乙型肝炎病毒感染的治疗性和预防性疫苗，也可以用来制备检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒型胸腺依赖性淋巴细胞的检测试剂，在乙型肝炎的预防、治疗和诊断中有着潜在的应用价值。

Description

乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其 应用

技术领域

本发明属于医学免疫学和感染病学领域，特别涉及189种乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖 性淋巴细胞抗原表位肽及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是最常见感染性疾病之一，严重危及人类 的健康。世界卫生组织2015年7月统计数据显示，预计全球1/3的人口感染过HBV，约2.48亿HBV携带者，后期可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌。每年约78万HBV感染的 患者因疾病进展为肝硬化、肝衰竭或是肝癌而导致死亡。

HBV基因组由不完全双链环状DNA组成，长的为负链，含3020-3320个碱基，短的 为正链，含1700-2800个碱基。包括四个开放阅读框(ORF)，分别称为C、X、P和S编 码区。C区由pre-C和C基因组成，分别由不同的起始密码子调控，在相同的终止密码子 处结束，pre-C和C基因共同编码pre-C蛋白，Pre-C蛋白再经过切割加工后形成e抗原 (HBeAg)。C基因编码病毒的衣壳蛋白，即HBcAg。S区由S基因、PreS1和PreS2基因 组成，由3个不同的起始密码子启动翻译，在同一个终止密码子处终止翻译，分别编码表 面抗原(HBsAg)蛋白、PreS1蛋白和PreS2蛋白。P区基因编码的HBV的聚合酶蛋白 (HBpol)。X区的基因编码X蛋白(HBx)，包含154个氨基酸，是最小的一个开放阅读 框。

细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)是介导适应性免疫应答的核心细胞，在 抗感染、抗肿瘤以及超敏反应和自身免疫病的发生中起着至关重要的作用，其细胞膜上的 T细胞受体(T cell receptor,TCR)能够特异性识别并结合抗原递呈细胞表面MHCI类分子 与抗原肽的复合物，即MHC/抗原肽复合体分子。CTL表位是指与MHC I类分子结合的抗 原肽，是抗原分子中能被TCR特异性识别的线性片段或空间构象性结构，是引起免疫应答 反应的基本抗原单位，在CTL活化过程中扮演着关键角色。

MHC系统指主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)，是脊椎动 物基因组中一组紧密连锁的基因群，编码表达MHC I类和II类蛋白分子。HLA(human leukocyte antigen)是人类的MHC系统，是人体最复杂的基因群，在人群中具有高度多态性。HLA在抗原识别、抗原呈递等机体免疫过程中发挥重要作用，是影响人体免疫反应的主要 因素。HLA I类分子主要负责将内源性HBV抗原呈递给CD8⁺ CTL，活化的CTLs通过分 泌穿孔素和颗粒酶等使病毒感染的肝细胞凋亡，同时分泌特定的细胞因子抑制HBV的复制。因此，动态监测HBV抗原特异性CD8⁺T细胞的数量和功能可以准确反映乙肝感染者 针对HBV的特异性免疫功能状态。由于不同人的HLA分子型别不同，其对HBV不同抗 原的加工、处理和提呈能力也不相同，从而引起不同程度的HBV抗原特异性免疫应答反应。 根据乙肝患者不同的HLA分子型别，选择其所提呈的HBV特异性抗原肽，动态监测该 HBV抗原肽特异性的CD8⁺T细胞的数量和功能，对HBV感染者的疾病进程监测、诊断与 治疗方案的制定、疗效观察和预后转归的判断等都有重要意义，是实现乙肝精准医学治疗 的重要技术手段。同时，利用这些HLA-A分子高亲和力结合的HBV特异性抗原肽，还可 以制备多肽疫苗或基因疫苗，预防和治疗HBV感染。

但是，目前已明确的被各种HLA分子所提呈并能刺激机体引起T细胞应答反应的HBV 抗原肽仍然很少，从而限制了对携带不同HLA等位基因的乙肝患者开展特异性T细胞检测，也限制了HBV特异性T细胞在乙肝发生发展中的作用研究，更限制了基于HLA基因 个体差异性及其提呈的HBV抗原肽差异性的个性化检测和精准免疫治疗。

发明内容

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴 细胞抗原表位肽及其应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽，其氨基酸序列为如下所示表位肽 序列中的任一种：

由上述的表格可看出，上述序列分别为乙肝病毒e抗原HBeAg、表面抗原HBsAg、聚合酶蛋白HBpol或X蛋白(HBx)的抗原肽序列，上述序列分别与HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、A0206、A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子呈 高亲和力结合，在抗原提呈细胞表面组成MHC/抗原肽复合体分子，与抗原肽特异性CD8⁺ T细胞克隆结合，刺激其活化、增殖和分化，发挥抗乙型肝炎病毒的免疫效应作用。

所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备乙型肝炎多肽 疫苗或基因疫苗：多肽疫苗制备：按照本发明的抗原表位肽序列人工合成一种或多种抗原肽， 与佐剂混合制成可溶性制剂，或者由生物纳米材料装载制成纳米多肽疫苗，注入乙肝病毒感 染者或乙型肝炎患者体内，激发患者乙肝病毒抗原特异性T细胞活化、增殖，并增强其杀瘤 细胞活性，从而制备成乙肝多肽疫苗。基因疫苗制备：按照本分明的多肽序列，构建一种多 肽或多种多肽的重组DNA基因片段、重组质粒或者重组病毒载体，注入乙肝病毒感染者或 乙型肝炎患者体内，使该重组基因在体内表达一种或多种多肽，激发乙肝病毒抗原特异性T 细胞活化、增殖，并增强其杀病毒感染细胞的活性，从而制备成乙肝基因疫苗。

所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备检测乙型肝 炎病毒抗原特异性T细胞的检测制剂或试剂盒：按照本发明的抗原表位肽序列，人工合成 一种或多种抗原肽，在酶联免疫斑点法、胞内细胞因子荧光染色法和酶联免疫吸附试验中， 作为抗原制剂，与患者外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，刺激乙肝病毒抗原特异性T 细胞活化、增殖和分泌细胞因子，进而通过其他组合试剂检测该细胞因子的合成量，从而 反应特异性T细胞的数量和反应活性；也可以利用这些多肽通过基因工程技术和蛋白工程 技术制备人类白细胞抗原与多肽的复合体(peptide-HLAcomplex)及其多聚体，再进一步 制备成荧光素标记的制剂，用流式细胞分析法检测患者外周血PBMC细胞群中乙肝病毒抗 原特异性T细胞的数量。相关试剂盒则是指由上述制剂与不同检测方法中常用的其他试剂 组装而成的乙肝病毒抗原特异性T细胞检测试剂盒。

所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备治疗乙型肝 炎的药物：将上述基于本发明抗原表位肽序列的多肽疫苗或基因疫苗与其他免疫治疗制剂 或化学治疗制剂组合，制备成治疗乙肝的临床药物。

本发明利用六种在线表位预测数据库虚拟预测HLA-A分子限制性的HBV特异性抗原 表位肽序列，获得一组能分别与HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、A0206、A0207、 A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子呈高亲和力结合的HBV特 异性抗原表位肽序列，然后通过ELISPOT功能性实验验证了其免疫原性，为制备HBV感 染的治疗和预防性疫苗以及研制HBV抗原特异性T细胞检测试剂等提供了特异性抗原肽。

1.选择乙肝病毒e抗原(HBeAg，包括HBcAg的序列)、表面抗原(HBsAg)、聚合 酶蛋白(HBpol)和X蛋白(HBx)氨基酸序列为靶向序列；

2.选择预测结果获得研究者公认的、具有较高准确性的、常用的六种表位预测数据库： SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、NETMHC和EPIJEN预测上述两种HLA-A分子 限制性的HBV特异性抗原表位肽序列；

3.根据一定的预测标准，对六个在线表位预测网站的预测结果进行整合分析，获得六 个网站预测结果较一致的候选抗原肽序列。

4.通过IFN-γELISPOT细胞功能性实验验证HBV抗原表位肽的免疫原性。

本发明为乙肝病毒e抗原(HBeAg，包括HBcAg的序列)、表面抗原(HBsAg)、聚合 酶蛋白(HBpol)和X蛋白(HBx)中能分别与HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、A0206、 A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子呈高亲和力结合并 且具有免疫原性的抗原肽序列；还涉及到以上述抗原肽为基础的乙型肝炎多肽疫苗、基因 疫苗、乙型肝炎的治疗与预防方法，以及以上述抗原肽为基础的检测乙型肝炎病毒抗原特 异性T细胞的试剂和方法。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

经在线虚拟预测和功能性实验验证获得的HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、A0206、 A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子限制性的HBV特异 性抗原表位肽以前没有被报道过。这些HLA-A分子以前也没有被报道有限制性的HBV抗 原肽。因此这些新的抗原表位肽序列将为研制针对乙型肝炎治疗性和预防性多肽疫苗和基 因疫苗、设计检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的试剂和方法等提供所需的关键抗原组 分，即抗原表位肽序列；同时这些抗原表位肽也为针对这些特定HLA-A等位基因的乙型肝 炎患者进行个体化检测和精准医疗提供了关键的抗原组分。

附图说明

图1为HLA-A0201分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A0201分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图2为HLA-A1101分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A1101分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图3为HLA-A2402分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A2402分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图4为HLA-A3101分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A3101分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图5为HLA-A0206分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A0206分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图6为HLA-A0207分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A0207分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图7为HLA-A3303分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A3303分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图8为HLA-A3001分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A3001分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图9为HLA-A0203分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A0203分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统 计图；

图10为HLA-A1102分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴 定HLA-A1102分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点 图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N) 统计图；

图11为HLA-A0301分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴 定HLA-A0301分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点 图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N) 统计图；

图12为HLA-A0101分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴 定HLA-A0101分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点 图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N) 统计图；

图13为HLA-A2601分子限制的HBV抗原T细胞表位肽；(A)IFN-γELISPOT方法鉴 定HLA-A2601分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点 图；(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图；(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N) 统计图；

图14为实施例1中待鉴定表位肽免疫原性验证的实验技术路线图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、A0206、A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子限制性HBV特异性抗原肽，序列通过以下步骤筛选 和鉴定：

1、在线虚拟预测两种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的优势T细胞表位肽

选取4种HBV蛋白：表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg，包括HBcAg的序列)、DNA多 聚酶(HBpol)和X蛋白(HBx)，通过UniProt全球蛋白资源数据库检索获得其氨基酸序列， 选择了中国感染最多的HBV C型HBV蛋白序列；再通过SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、 NETMHC、EPIJEN等六种常用的表位肽预测数据库对HLA-A0201、A1101、A2402、A3101、 A0206、A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601分子限制的针对上 述每种HBV蛋白的T细胞表位肽进行虚拟预测，其中SVMHC数据库包括MHCPEP model和 SYFEPITHI model两种预测算法；IEDB数据库包括了ANN、SMM和ARB三种方法，本实验选 择其中具有更好统计学意义的ANN和SMM方法。这些表位肽预测数据库网站见表1。

HLA I类分子的抗原结合凹槽两端封闭，接纳的抗原肽长度为8-11个氨基酸残基，其中以 9和10个氨基酸最为常见，因此，本实验分别选择9和10个氨基酸长度的多肽作为研究对象。 分别将每种HBV蛋白的氨基酸序列输入到预测数据库网站的相应氨基酸序列输入框，再分别 选择表位肽的长度为9和10个氨基酸，然后选择特定的HLA-A分子，对HBV抗原的T细胞表位 肽进行在线虚拟预测。

表1表位肽预测数据库网站

针对每种HLA-A分子和每种HBV蛋白，将不同数据库预测出的9肽和10肽分别按评分从 高到低进行排列，再从中选择至少满足两种以上预测方法评分标准的表位肽作为候选表位肽。 每种HLA-A分子，针对每种HBV蛋白，再从候选表位肽中选出评分最高(亲和力最高)的1-4 种多肽作为待鉴定表位肽。

2、分离HBV慢性感染患者外周血PBMC

取室温保存的新鲜抗凝全血，用无菌PBS适当稀释；将1倍原血体积的人淋巴细胞分离 液(达科为生物，深圳)加入15mL离心管；将稀释后的血液缓缓平铺于分离液上，室温离 心20min，2500rpm；吸取单个核细胞(PBMCs)层，离心洗涤2次；用无血清培养基(达 科为生物，深圳)重悬，细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁶/mL备用。

3、用IFN-γELISPOT法鉴定HBV抗原T细胞表位肽的免疫原性

技术路线如图14所示：

首先筛选出对混合肽组有阳性反应的HBV慢性感染者：将每种HLA-A分子限制的针对 4种HBV蛋白的待鉴定表位肽混合为一组，每组8-9种表位肽；取预包被抗人IFN-γ抗体的 ELISPOT板(达科为生物，深圳)，用无血清培养基(200μL/well)活化8min，每孔加入HBV慢性感染者PBMC悬液(100μL/well)；然后在检测孔中补加每种HLA-A分子限制的混合肽，混合肽中单种多肽为30μg/mL，在阳性对照孔补加PHA(2.5μg/mL)，在阴性对照孔补加与 检测孔相同浓度的DMSO多肽溶解液；置37℃，5％CO₂培养箱孵育20-22h；按照人IFN-γELISPOT试剂盒说明书裂解并洗去细胞；每孔加入生物素标记的抗人IFN-γ抗体工作液(100μL/well)，于37℃孵育1h；洗板后加入酶联亲和素工作液(100μL/well)，继续于37℃孵育1h；洗板后加入现配的AEC显色液(100μL/well)，室温避光显色20min；用去离子 水洗板4-5次以终止显色；将ELISPOT板避光放置，晾干后送深圳达科为生物技术公司自动 化扫描计数斑点。若阴性孔斑点数为0-5时，检测孔-阴性对照孔斑点数≧5判定为CTL反应 阳性；若阴性对照孔斑点数≧5时，检测孔≧2倍阴性孔斑点数判定为CTL反应阳性。

鉴定单种表位肽的免疫原性：重新收集对混合肽有CTL阳性反应的HBV慢性感染者外 周血PBMC，加入上述ELISPOT板中，每个检测孔中补加阳性混合肽中的单种HBV多肽 (30μg/mL)，同上设置阳性对照孔和阴性对照孔，置37℃，5％CO₂培养箱孵育20-22h，同 上做ELISPOT检测。CTL反应阳性孔即表示该孔内的待鉴定表位肽具有免疫原性。

HLA-A限制性的确定：对每位HBV感染者进行HLA-A等位基因分型，结合该表位肽的虚拟亲和力，初步确定其被哪种HLA-A分子所限制和提呈。从HBV感染者中分别选取这13 种HLA-A等位基因的纯合子感染者，取其PBMC，与上述所有已被验证具有免疫原性的且该HLA-A分子限制的表位肽，重新进行ELISPOT检测，进一步确定每种表位肽的HLA-A分子 限制性。

4、HLA-A等位基因分型

选择在表位肽鉴定实验中呈CTL阳性反应的HBV慢性感染者，取200μL抗凝血，利用人全血基因组DNA提取试剂盒(天根生物，北京)提取基因组DNA；采用HLA-A位点特 异性引物A1和A3进行PCR，扩增A位点的外显子2、内含子2、外显子3以及部分内含子 l和3的DNA序列，产物大小为985bp。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s；62℃ 退火15s；72℃延伸90s；35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 大小，并送上海桑尼生物科技公司进行纯化和双向测序。PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技 公司，见表2。

表2 HLA-A位点特异性的PCR扩增引物

通过Lasergene程序的Seqman软件把外显子2和外显子3的测序结果拼成一条完整的 HLA-A重叠序列(Contig)，仔细检查双向测序的碱基是否完整一致，找出杂合子的碱基并用 兼并碱基代替，例如M表示A和C，R表示A和G，W表示A和T，S表示C和G，Y表 示C和T，K表示G和T，最终确定扩增出来的HLA-A等位基因的序列片段。利用Nucleotide BLAST工具，将拼接好的HLA-A碱基序列与数据库中所有HLA-A等位基因的外显子2和外 显子3序列进行比对，直到获得完全匹配的基因组合，从而确定HLA-A的等位基因。

通过IFN-γ ELISPOT方法从612例HBV慢性感染患者中筛选出288例对HBV混合肽有 CTL阳性反应的患者。再重新收集这些患者的PBMC，用ELISPOT法进行单种表位肽免疫原性的验证，然后结合患者的HLA-A等位基因以及表位肽与这些等位基因的虚拟预测亲和力 进行综合分析。结果显示：有26种HBV表位肽(P1-P26)能刺激HLA-A*02:01阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图1)；有23种HBV表位肽(P27-P49)能刺激HLA-A*11:01 阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图2)；有25种HBV表位肽(P50-P74)能刺激 HLA-A*24:02阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图3)；有17种HBV表位肽(P36、 P54、P75-P89)能刺激HLA-A*31:01阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图4)；有15 种HBV表位肽(P9、P24-P26，P54，P90-P99)能刺激HLA-A*02:06阳性患者的PBMC呈 现CTL阳性反应(图5)；有14种HBV表位肽(P20、P100-P112)能刺激HLA-A*02:07阳 性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图6)；有16种HBV表位肽(P36、P42、P46、P48、 P79，P86、P113-P122)能刺激HLA-A*33:03阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图7)； 有16种HBV表位肽(P9、P34、P123-P136)能刺激HLA-A*30:01阳性患者的PBMC呈现 CTL阳性反应(图8)；有11种HBV表位肽(P95、P137-P146)能刺激HLA-A*02:03阳性 患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图9)；有13种HBV表位肽(P86、P117、P127、P147-P156) 能刺激HLA-A*11:02阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图10)；有13种HBV表位肽 (P78、P85、P115、P151、P153、P155、P157-P164)能刺激HLA-A*03:01阳性患者的PBMC 呈现CTL阳性反应(图11)；有16种HBV表位肽(P47、P50、P115、P158，P164-P175) 能刺激HLA-A*01:01阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图12)；有15种HBV表位肽 (P31、P176-P189)能刺激HLA-A*26:01阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图13)。 在每种HLA-A分子限制的HBV表位肽之间，免疫原性存在明显差异。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范 围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

附：

四种被用来预测抗原表位的乙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如下：

HBsAg(Q913A6)：

序列的分子类型：PRT

科学命名的生物属种：人体乙型肝炎病毒

HBeAg(Q913A8)：

序列的分子类型：PRT

科学命名的生物属种：人体乙型肝炎病毒

HBpol(Q913A7)：

序列的分子类型：PRT

科学命名的生物属种：人体乙型肝炎病毒

HBx(Q913A9)：

序列的分子类型：PRT

科学命名的生物属种：人体乙型肝炎病毒

序列表

<110> 南京大户生物科技有限公司

东南大学

<120> 乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)

<400> 1

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His His Leu Asp Pro

20 25 30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

35 40 45

Lys Asp His Trp Pro Lys Ala Asn Gln Val Arg Ala Gly Ala Phe Gly

50 55 60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Cys Ser Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

65 70 75 80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

85 90 95

Ser Asn Arg Gln Ser Gly Lys Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

100 105 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

115 120 125

Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145 150 155 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu

165 170 175

Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly

180 185 190

Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser

195 200 205

Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly

210 215 220

Gln Asn Ser Gln Ser Pro Ile Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro

225 230 235 240

Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile

245 250 255

Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu

260 265 270

Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser

275 280 285

Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly

290 295 300

Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn

305 310 315 320

Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu

325 330 335

Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro

340 345 350

Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val

355 360 365

Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser

370 375 380

Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile

385 390 395 400

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)

<400> 2

Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr

1 5 10 15

Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Arg Gly Met Asp Ile

20 25 30

Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu

35 40 45

Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Phe

50 55 60

Ala Leu His Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His

65 70 75 80

His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Val Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn

85 90 95

Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu

100 105 110

Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln

115 120 125

Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val

130 135 140

Leu Glu Tyr Leu Val Ser Val Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala

145 150 155 160

Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr

165 170 175

Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro

180 185 190

Arg Arg Arg Arg Ser Lys Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg

195 200 205

Glu Ser Gln Cys

210

<210> 3

<211> 843

<212> PRT

<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)

<400> 3

Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp

1 5 10 15

Glu Ala Gly Pro Leu Glu Asp Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly

20 25 30

Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val

35 40 45

Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro

65 70 75 80

His Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln Tyr Val

85 90 95

Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro

100 105 110

Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Leu Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly

115 120 125

Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr Phe Lys Thr

130 135 140

Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg

145 150 155 160

Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu

165 170 175

Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His

180 185 190

Gly Asp Glu Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser

195 200 205

Pro Phe Gly Pro Cys Val Arg Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg Leu Gly

210 215 220

Leu Gln Pro Gln Gln Gly Ser Leu Ala Lys Gly Lys Ser Gly Gln Ser

225 230 235 240

Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Leu Gln Ser Phe Gly

245 250 255

Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Asp Asn Gly Ala Ser Ser Thr

260 265 270

Ser Ser Cys Leu Leu Gln Ser Ala Val Arg Lys Thr Ala Tyr Ser His

275 280 285

Leu Ser Thr Phe Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu

290 295 300

His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Arg Pro Ile

305 310 315 320

Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp

325 330 335

Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys

340 345 350

Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg

355 360 365

Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala

370 375 380

Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Tyr

385 390 395 400

Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr

405 410 415

Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala

420 425 430

Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu

435 440 445

Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn

450 455 460

Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Leu Gln Asn Leu His Asp

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Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr

485 490 495

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500 505 510

Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln

515 520 525

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530 535 540

Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val

545 550 555 560

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565 570 575

Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser

580 585 590

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610 615 620

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660 665 670

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675 680 685

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690 695 700

Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val

705 710 715 720

Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala

725 730 735

Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Leu Gly Thr Asp Asn Ser Val Val

740 745 750

Leu Ala Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala

755 760 765

Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu

770 775 780

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820 825 830

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835 840

<210> 4

<211> 154

<212> PRT

<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)

<400> 4

Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu

1 5 10 15

Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly

20 25 30

Pro Leu Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala Val Pro Ala Asp

35 40 45

His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Phe Ala Arg Arg Met Glu

65 70 75 80

Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg

85 90 95

Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe

100 105 110

Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg

115 120 125

Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser

130 135 140

Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala

145 150

Claims (6)

1.乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列为如下序列中的任一种：

WMMWYWGPS、LLCLIFLLV、SLYSILSPF、LVLQAGFFL、FLFILLLCL、SLDSWWTSL、GVWIRTPPA、ELVVSYVNV、ILSTLPETT、TVLEYLVSV、IISCSCPTV、HLPDRVHFA、KLIGTHNSV、LLSSNLSWL、KQYLHLYPV、FLLAQFTSA、FSSAGPCAL、VLGGCRHKL、AMSTTDLEA、CQLDPARDV、KLVCSPAPC、CVFKDWEEL；SPISSIFSR、QAGFFSLTK、PTPISPPLR、RVRGLYFPA、SVIWMMWYW、STLPETTVVR、HISCLTFGR、RGMDIDTYK、VVSYVNVNM、YVSLMLLYK、VVDFSQFSR、SVVRRAFPH、LVMGHQRMR、TVNAHGNLPK、TTDLEAYFK、SSSAVPADH、CALRFTSAR、AMSTTDLEAY、HQVLPKVLHK、RWMCLRRFII、YWGPSLYSI、IFFCLWVYI、WEWASARFSW、WFHISCLTF、LEYLVSFGVW、IRQLLWFHI、VLSFLPSDF、KYTSFPWLL、LYSSTVPCF、FYPNVTKYL、NWILRGTSF、SAGPCALRF、GPCALRFTF、TFARRMETT、GYRWMCLRR、PGYRWMCLR、MYPSCCCTK、RTPSPRRRR、CSPHHTALR、RSQSPRRRR、RLKLIMPAR、HLNPHKTKR、WGLVMGHQR、NSARSQSER、KVFVLGGCR、SSAGPCALR、LKVFVLGGCR、PLLPIFFCL、LVPFVQWFV、HQTLQDPRV、RQLLWFHIS、AILCWGELM、WILRGTSFV、ATPTGWGLV、IINRCQQYV、HQRMRGTFV、RVCCQLDPA、MMWFWGPSL、LLDYQGMLPV、SLYSILSPFL、LLVPFVQWFV、ILCWGELMNL、KLCLGWLWGM、VLEYLVSFGV、IMPARFYPNL、SLYAVSPSV、YCLSHIVNLL、RLMVFVLGGC、CQLDPARDVL、CPGYRWMCLR、FLWEWASVR、MMWYWGPSLY、SMYPSCCCTK、VWIRTPPAYR、ETTVVRRRGR、ELLAACFAR、MPLSYQHFR、FPCWWLQFR、ALRFTFARR、QVLPKVLHKR、SVRFSWLSL、CLRRFIIFL、RFSWLSLLV、RTPPAYRPPN、ASRELVVSY、KIRQLLWFH、VVRRRGRSP、RSRSGAKLI、RVHFASPLH、TTGRTSLYA、LYRPLLHLP、HKRTLGLSA、RLKVFVLGG、KVLHKRTLGL、ITSGFLGPL、FLGGTTVCL、ILSTLPETTV、LIISCSCPTV、LLAQFTSAI、FLLAQFTSAI、GLYRPLLHL、SMFPSCCCTK、LQAGFFLLTR、SSTTSTGPCR、TSCPPTCPGY、CSCPTVQASK、QAFTFSPTYK、TLWKAGILYK、SLPQSHIIQK、KTFGRKLHLY、CALRFTFARR、KFLWEWASAR、LIFLLVLLDY、WIRTPPAYR、LLYKTYGRK、TAYSHLSTFK、TVNAHQVLPK、LQDPRVRGLY、VWIRTPPAY、PSDFFPSNR、SLDVSAAFY、PTTGRTSLY、PSRGRLGLY、QSAVRKTAY、SSAGPCALRF、LGEEIRLKV、SVPNPLGFF、FTPPHGGLL、TTPAQGTSMY、ETVLEYLVSF、EVLSFLPSDF、YVNVNMGLKI、HTAELLAACF、DPSRGRLGLY、FAAPFTQCGY、HTLWKAGILY、STTDLEAYF、CSPAPCNFF、SLLVPFVQWF、FLPLLPIFFC、CLGWlWGMDI、FGVWIRTPPA、PASSNRQSGK、PIPSSWAFGK、MQWNSTTFH、CLRPVGAESR、MYPSCCCTKP、LYSILSPFLP、WFHISCLTFG、VFADATPTGW、KYTSFPWLLG、YYPEHAVNHY、LVCSPAPCNF、VCSPAPCNFF、PCALRFTFAR、ALRFTFARRM、VLGGCRHKLV、TLPSPSSSAV、GLPVCAFSSA、GVWIRTPPAY、WLWGMDIDPY、PASRELVVSY、DLEAYFKDCV、SLRGLPVCAF、AVPADHGAHL、FSSAGPCALR。

2.一种利用要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽进行单个氨基酸的去除或者更换后所得抗原表位肽。

3.一种利用权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽或权利要求2所述的抗原表位肽在制备乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗中的应用。

4.一种利用权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽或权利要求2所述的抗原表位肽在制备检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的检测制剂或试剂盒中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为酶联免疫斑点法试剂、细胞内细胞因子荧光染色法试剂、酶联免疫吸附试验试剂、人类白细胞抗原多聚体荧光染色或流式细胞分析法试剂。

6.一种利用权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽或权利要求2所述的抗原表位肽在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。

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