CN111110829A - 一种纳米防御素凝胶支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米防御素凝胶支架及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：将[PEO]x‑[PPO]y‑[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀，然后加入纳米防御素混匀制得所述纳米防御素凝胶支架，所述纳米防御素为在人α防御素5的C末端耦联修饰十四烷酰基。本发明采用纳米防御素作为抗菌活性成分，具有广谱抗菌活性且具有良好的生物相容性。本发明纳米防御素凝胶支架具有温敏性，在低温下呈液态，在体温下呈凝胶态，易于伤口的涂布上药，具有良好的患者依从性。本发明纳米防御素凝胶支架能够促进成纤维细胞迁移，加速创伤修复。

Description

一种纳米防御素凝胶支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种纳米防御素凝胶支架及其制备方法和应用。
背景技术
各种形式的深度皮肤组织损伤，如大面积烧伤、糖尿病足溃烂等顽固性创伤以及术后创伤，已成为威胁人们生命健康的危险因素。其中，细菌感染是造成创伤病人死亡的主要原因。据悉，细菌感染所诱导的烧伤病人死亡数约占总烧伤病人死亡数的60-75％。因此，控制感染对于创伤的治疗和修复至关重要。
水凝胶以其优良的流变学特性和生物相容性而广泛应用于医用敷料，组织工程支架以及药物递送系统。温敏性水凝胶在低温下呈现液态，而在体温下呈现凝胶态，这种特殊的流变学特性能够促进水凝胶对伤口的充分且均匀的覆盖。此外，水凝胶能够吸收伤口部位渗出的脓液并维持湿润的环境从而促进创伤的修复。因此，载抗菌剂的水凝胶是创伤治疗和修复的理想敷料。目前已应用于临床的医用敷料主要是纳米银/银离子凝胶伤口敷料和普朗特液体凝胶伤口敷料等。比如，公开号为CN101564400的发明公开了一种原位制备抗菌性超分子结构水凝胶的方法。该方法包括以下操作步骤：将硝酸银晶体和聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物溶液混合搅拌，得到混合溶液；将混合溶液按照搅拌15分钟、超声分散5分钟的步骤交替进行2～4小时，得到纳米银溶胶；将纳米银溶胶与α-环糊精溶液混合搅拌，室温下静置，得到水凝胶。该水凝胶可用于制备可注射药物载体。然而，纳米银/银离子通常具有一定的毒性，不宜大量使用。
人α防御素5(Human-αDefensin 5，HD5)是一种人肠源性的阳离子抗菌肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有杀伤作用。将HD5 C端十四烷基化修饰所得到的纳米防御素(Nanodefensin，ND)在稳定性提高的同时更显著增强及拓宽了抗菌活性和抗菌谱。比如，公开号为CN110448676A的发明专利申请公开了一种人α防御素5改造肽在制备中和内毒素药物中的应用，所述人α防御素5改造肽由人α防御素5(HD5)在C末端添加氨基酸残基并修饰连接肉豆蔻酸改造获得。所述人α防御素5改造肽可以与内毒素形成纳米杂化胶束，通过中和内毒素，抑制内毒素引起的炎症因子的释放，减轻对组织脏器损伤，对于治疗脓毒症具有重要价值。
区别于纳米银，纳米防御素不仅拥有纳米药物的优良特性，而且对人体基本无毒，具有良好的生物相容性。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种纳米防御素凝胶支架及其制备方法和应用。
一种纳米防御素凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀，然后加入纳米防御素混匀制得所述纳米防御素凝胶支架，
所述纳米防御素为在人α防御素5的C末端耦联修饰十四烷酰基。
[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物一般使用化学通式表示，优选编号为F127的三嵌段共聚物。
优选的，[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物衍生物为醛基化[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物。端醛基化修饰可以与蛋白中游离的氨基形成类希夫氏碱的动态共价键的结构，从而可以在对蛋白多肽药物的缓控释中发挥一定的作用。
[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀时与水的质量体积比W/V为18～30％。[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀时采用低温溶胀法。
所述纳米防御素为在人α防御素5的第34位Lys的ε氨基上偶联十四烷酰基。
纳米防御素的浓度并没有限制，只要有一定的抗菌作用即可。优选所述纳米防御素的浓度≥12.5μg/ml。更优选的，所述纳米防御素的浓度≥25μg/ml。进一步优选的所述纳米防御素的浓度≥50μg/ml。
优选的，所述纳米防御素的平均粒径为50-200nm。实验研究发现，制备的纳米防御素的平均粒径较为固定，一般都在这个范围内。
本发明又提供了所述制备方法制备的纳米防御素凝胶支架。
本发明还提供了所述的纳米防御素凝胶支架在制备医用敷料中的应用。所述医用敷料用于皮肤感染、皮肤损伤修复或妇科疾病。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明采用纳米防御素作为抗菌活性成分，具有广谱抗菌活性且具有良好的生物相容性。
(2)本发明纳米防御素凝胶支架具有温敏性，在低温下呈液态，在体温下呈凝胶态，易于伤口的涂布上药，具有良好的患者依从性。
(3)本发明纳米防御素凝胶支架能够促进成纤维细胞迁移，加速创伤修复。
附图说明
图1为纳米防御素凝胶支架的设计和制备工艺流程示意图。
图2为端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物的合成路线图。
图3为纳米防御素凝胶支架的流变学特性表征图。A：纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，18％)；B：纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，20％)；C：纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，22％)；D：纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)；E：空白水凝胶(25％)；F：纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，30％)。
图4为纳米防御素的形态学表征结果图，其中A和B分别为放大44000×倍和62000×倍下图。
图5为纳米防御素的粒径分布图。
图6为空白水凝胶及本发明纳米防御素凝胶支架的扫描电镜三维微结构表征图，其中A为Blank hydrogel，B为ND-based hydrogel。
图7为[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物和端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物的红外光谱表征图谱。其中，图A为的[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z红外光谱图；图B为端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的红外光谱图。
图8为纳米防御素凝胶支架的抗菌活性结果图，其中纵坐标为存活率的对数值。其中图A为空白凝胶支架；图B为纳米防御素凝胶支架(12.5μg/ml，25％)；图C为纳米防御素凝胶支架(25μg/ml，25％)；图D为纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)。
图9为纳米防御素及HD5促进小鼠成纤维细胞3T3迁移实验结果图。
图10为纳米防御素凝胶支架促进Bal/C小鼠背部创伤修复的实验结果图，其中图A为非治疗组；图B为空白凝胶支架治疗组；图C为纳米防御素凝胶支架(25μg/ml，25％)治疗组；图D为纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)治疗组；图E为纳米防御素凝胶支架(端醛基化修饰，50μg/ml，25％)，图F为市售制剂
Figure BDA0002333805770000031
治疗组。
具体实施方式
[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物(商品名：
Figure BDA0002333805770000032
F-127)：来源Sigma公司，货号P2443。
纳米防御素：由美国马里兰大学陆伍元教授实验室合成。
HD5：由美国马里兰大学陆伍元实验室合成。
6-8周雄性Bal/C小鼠：上海斯莱克实验动物有限公司。
实施例1人α防御素5(HD5)的合成
采用叔丁氧羰基(Boc)固相多肽合成法在Applied Biosystems 433A多肽合成仪中进行HD5的合成。首先将2.2mmol Boc氨基酸加入到DMF中活化3min，而后缓慢加入到0.25mmol PAM树脂中偶联10min。整个合成过程中使用TFA(100％)除去N-Boc基团，使用DMF和DCM作为间歇洗涤剂。待肽链在BOC树脂上组装完毕之后，0℃加入无水HF孵育1h除去保护基团，而后加入到冷乙醚中沉淀。然后，采用一步复性使得HD5肽链形成三对关键的二硫键，在粗肽体系中加入3mM还原型谷胱甘肽和3mM氧化型谷胱甘肽及不同浓度的GuHCl。同时迅速加入NaHCO3调节最终pH至8.3。最后过夜孵育形成二硫键。最终用逆相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化然后冻干即得HD5产品粉末。
实施例2纳米防御素(ND)的合成
按实施例1所述方法进行肽链的组装合成，肽链组装完成之后，用含20％哌啶的DMF溶液将N端赖氨酸残基上的Fmoc保护基团洗脱，而后在Applied Biosystems 433A多肽合成仪中将十四烷酸(肉豆蔻酸)按如实施例1所述相同的偶联策略偶联到赖氨酸的ε-氨基上。在0.25mg/ml的肽链粗品中加入25％N,N-dimethylformamide、2M尿素、50mM Tris/HCl以及3mM还原型谷胱甘肽和3mM氧化型谷胱甘肽，同时迅速加入NaHCO3调节最终pH至8.3，过夜孵育自然氧化形成三对二硫键。最终用逆相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化然后冻干即得ND产品粉末。
实施例3纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照18％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，18％)。
实施例4纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照20％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，20％)。
实施例5纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照22％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，22％)。
实施例6纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照25％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)；加入纳米防御素使体系浓度为25μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(25μg/ml，25％)；加入纳米防御素使体系浓度为25μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(12.5μg/ml，25％)。
实施例7纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照30％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀即可得纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，30％)。
实施例8端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的合成
端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物(aldehylation-[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z-aldehylation)由[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物经乙酸酐氧化反应合成得到，合成路线如图2所示，合成过程如下：称取0.4mmol[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物放于无菌平皿中，置于37℃恒温真空干燥箱中干燥6h，所得的干燥粉末溶解于20mlDMSO中，并置于50℃水浴中直至完全溶解成澄清透明的溶液，设置磁力搅拌转速为300rpm，在搅拌下缓慢逐滴加入4.0mmol乙酸酐，反应体系在室温下搅拌反应48h。30h后向反应体系中加入冷乙醚终止反应，同时将体系置于冷阱中使产物充分析出。随后进行减压抽滤，将所得产物再次溶解于二氯甲烷中，而后再加入冷乙醚并放入冷陷使产物析出，此过程重复三次以提高产物纯度。
实施例9纳米防御素凝胶支架的制备
制备工艺和制剂设计如图1所示，将端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物按照25％(w/v)在冰浴中与灭菌水混合，随后置于4℃环境中充分溶胀12h；溶胀后置于-20℃环境中5min，然后缓慢搅拌30s，冰浴超声直至三嵌段共聚物溶解形成澄清透明的溶液，加入纳米防御素使体系浓度为50μg/ml，充分混匀，端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z即可与纳米防御素中的游离氨基形成动态共价键，最终得到纳米防御素凝胶支架。
实施例10温敏性的流变学表征
实验方法：流变学特性使用安东帕智能型高级旋转流变仪MCR302进行表征。设置测定振幅为1rad，频率为0.1Hz，升温速率为2℃/min，温度扫描范围为4～50℃，50mm平行板转子，收集参数为储存模量(G’)和损耗模量(G”)。
实验结果：
空白水凝胶和纳米防御素凝胶支架(实施例3-7制备)的流变学特性如图3所示。纳米防御素凝胶支架和空白水凝胶都表现出了温度敏感性，其储存模量和损耗模量随着温度的升高而增大，表明了液态到凝胶态的相变过程，且在37℃下呈凝胶态。并且随着纳米防御素凝胶支架中[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z比例的提升，其储存模量和损耗模量也得到了增加，凝胶化转变时间和温度都降低。此外相比于含同比例[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z空白水凝胶，纳米防御素的载入并不影响的[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z流变学特性，凝胶化转变温度范围基本一致。
实施例11纳米防御素的形态学与粒径分布表征
实验方法：
吸取少量的纳米防御素样品溶液滴在透射电镜用铜网上，室温干燥，用醋酸双氧铀染色，置于透射电镜下观察纳米防御素的形态学特征；吸取100μg/ml的纳米防御素溶液100μl于微量比色皿中，用马尔文激光粒度分析仪测定纳米防御素的粒径分布。
实验结果：
如图4所示，纳米防御素确实能在水相中自组装形成超分子纳米结构，且粒径分布均匀，具有纳米药物的优良特性；如图5所示，纳米防御素的粒径大小基本分布于50-200nm之间，表明纳米防御素的粒度大小约为50-200nm。
实施例12三维微结构表征
实验方法：
将空白水凝胶([PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物加水溶胀后获得，方法同实施例6)和纳米防御素凝胶支架(实施例6制备)置于离心管中，并置于37℃恒温箱中物理交联6h，而后冻干直至完全干燥，经表面喷金处理之后，置于Nova Nano 450场发射扫描电子显微镜下分别上述两种水凝胶的横截面和纵截面的微观形态特征。
实验结果：
两种水凝胶的微观结构如图6所示。图6表明了上述两种水凝胶在37℃下能物理交联形成三维网状结构。
实施例13端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的红外光谱表征
实验方法：分别将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z和端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z粉末与溴化钾粉末充分混匀研磨(1mg样品:100mg溴化钾)进行压片，随后使用傅立叶红外光谱仪检测两种样品在800-4000cm-1的红外透射率。
实验结果：如图7所示，[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z和端醛基化修饰[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的红外吸收峰基本一致，表明两者的骨架结构基本一致，但可以看出，端醛基化[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的红外光谱在1727cm-1处有一吸收峰，为醛基中的羰基的伸缩振动吸收峰，是醛基的特征峰，而[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z的红外光谱中则没有此特征峰。上述结果定性表明，端醛基化[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z成功合成。
实施例14纳米防御素凝胶支架抗菌活性的测定
实验方法：
将MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)接种于LB固体培养基上进行培养，待细菌繁殖到一定程度后挑取单菌落置于5mL的LB液体培养基中。在摇床上以200rpm，37℃条件下培养4-6h，待培养时间到后，用PBS溶液将细菌洗涤3次。用PBS将细菌配制成2×106CFU/mL浓度，以每孔50μl菌液加于96孔板中，接着分别将50μl的空白水凝胶(制备方法同实施例6)、纳米防御素凝胶支架(12.5μg/ml，25％)、纳米防御素凝胶支架(25μg/ml，25％)和纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)(实施例6制备)分别加入到96孔板中与这些细菌中孵育2h，然后每孔加入100μl 2×LB液体培养基，将此96孔板置于酶标仪中在600nm下监测OD值，随后计算出细菌存活率，即可表征抗菌活性。
实验结果：
如图8所示，由[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物自组装形成的空白水凝胶基本不表现出抗菌活性，而本发明纳米防御素凝胶支架则具有较强的抗菌活性，并且随着水凝胶中纳米防御素含量的升高(12.5、25、50μg/ml)，MRSA的存活率能以数量级形式下降。
实施例15纳米防御素和HD5促进成纤维细胞迁移
实验方法：
将小鼠成纤维细胞3T3按4×105个/孔的细胞密度接种于12孔板中，过夜贴壁，用200μl移液枪枪头在每孔中央划出一条划痕，而后分别加入HD5和纳米防御素使体系浓度为12.5μg/ml，并加入等体积的PBS作为对照，分别在加入药物刺激后的0h，12h和24h观察划痕闭合情况。
实验结果：
结果如图9所示，纳米防御素和HD5均可促进3T3细胞迁移，且纳米防御素的效果更佳。
实施例16纳米防御素凝胶支架促进创伤修复
实验方法：
实验动物选用6-8周雄性Bal/C小鼠，实验前饲养一周以熟悉实验环境。实验前用氯胺酮麻醉小鼠，并将小鼠背部毛发脱去，用手术剪在小鼠背部剪去一块1cm×1cm的全层皮肤制造创伤模型。而后在小鼠创伤部位均匀涂上100μl1×107CFU/ml的MRSA菌液感染伤口1h。随后分别将100μl生理盐水(Control组)、Blank hydrogel、纳米防御素凝胶支架(25μg/ml，25％)、纳米防御素凝胶支架(50μg/ml，25％)，纳米防御素凝胶支架(端醛基化修饰，50μg/ml，25％)(实施例9制备)和市售制剂普朗特液体凝胶伤口敷料
Figure BDA0002333805770000081
均匀涂布到经感染后的小鼠伤口部位，随后每2天换药一次。分别观察第0、2、4天的伤口愈合情况。
实验结果：
小鼠的创伤愈合情况如图10所示，纳米防御素凝胶支架治疗组的小鼠创伤的修复愈合速度和效果明显好于控制组、空白凝胶支架治疗组和
Figure BDA0002333805770000091
治疗组。

Claims (10)

1.一种纳米防御素凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀，然后加入纳米防御素混匀制得所述纳米防御素凝胶支架，
所述纳米防御素为在人α防御素5的C末端耦联修饰十四烷酰基。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物衍生物为醛基化[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀时与水的质量体积比W/V为18～30％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，[PEO]x-[PPO]y-[PEO]z三嵌段共聚物或其衍生物在水中溶胀时采用低温溶胀法。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米防御素为在人α防御素5的第34位Lys的ε氨基上偶联十四烷酰基。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米防御素的浓度≥12.5μg/ml。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米防御素的平均粒径为50-200nm。
8.如权利要求1～7任一所述制备方法制备的纳米防御素凝胶支架。
9.如权利要求8所述的纳米防御素凝胶支架在制备医用敷料中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述医用敷料用于皮肤感染、皮肤损伤修复或妇科疾病。
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