CN111100130B - 4-氨基吡咯并嘧啶衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及4‑氨基吡咯并嘧啶衍生物及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。该类化合物能够显著抑制RIPK1激酶的活力，而且选择性较高，安全性良好，是一种RIPK1激酶相关疾病的潜在治疗药物。TNFα诱导的SIRS模型和小鼠黑色素瘤肺转移模型实验证明，本发明化合物能够在体内发挥抑制RIPK1激酶的作用，具有显著的抗炎和抗肿瘤转移活性。本发明为综合治疗肿瘤转移提供了一种新的策略和手段。

Description

4-氨基吡咯并嘧啶衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及4-氨基吡咯并嘧啶衍生物及其制备方法和用途，属于医药领域。

背景技术

近年来，随着医疗条件的不断改善，虽然外科手术及辅助治疗能够快速有效的解决原发性肿瘤的问题，但是肿瘤转移依然是一大医学难题。原因在于肿瘤转移机制复杂和恶性肿瘤转移的耐药性出现。超过90％的恶性肿瘤死亡率均由肿瘤转移而非原发性肿瘤引起。因此，如何通过直接或间接的方式抑制肿瘤转移便成为治疗恶性肿瘤的重点和难点之一。

有研究表明(参见：Nature,536,215-218)，肿瘤细胞表面的淀粉样前体蛋白(APP，amyloid precursor protein)可与血管内皮细胞表面的死亡受体6(DR6,death receptor6)相互作用，并引起血管内皮细胞的程序性坏死，从而使得血管内皮屏障破坏，引起血液中的肿瘤细胞透过内皮屏障转移到新的器官或组织。

程序性坏死(Necroptosis)是具有坏死样特征且可引起炎症反应的一种细胞死亡方式，机体过度或不恰当的Necroptosis会导致很多疾病的发生，如：肾/脑/视网膜等器官的缺血再灌注损伤、心肌梗死、脑卒中、牛皮癣、风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎和肿瘤的转移等。目前，已经发现RIPK1的激酶对程序性坏死起着关键性的调节作用，因此，RIPK1有望成为上述相关疾病的潜在治疗靶标。RIPK1属于RIP家族的成员之一，其含有一个死亡结构域(death domain，DD)和一个caspase募集域(caspase recruitment domain，CARD)，可以形成蛋白复合物起始新的信号通路，RIP3与RIP1相互作用调控细胞程序性死亡。研究表明，RIPK1介导的细胞程序性死亡与恶性肿瘤、神经退行性疾病、肿瘤转移及银屑病等多种疾病相关。

发明内容

本发明的目的在于提供4-氨基吡咯并嘧啶衍生物及其制备方法和用途。

本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁～R₅中至少一个为卤素取代的烷氧基，其余独立选自H、卤素、烷基或烷氧基；

R₆～R₈独立选自H、卤素、烷基、烷氧基或卤素取代的烷氧基。

进一步地，所述的化合物满足以下至少一项：

R₁～R₅中至少一个为卤素取代的C1～C6烷氧基，其余独立选自H、卤素、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基；

优选地，R₁～R₅中至少一个为氟取代的C1～C6烷氧基；

优选地，R₁～R₅中至少一个为三氟甲氧基；

优选地，R₁～R₅中仅一个为三氟甲氧基；

进一步优选地，R₂为三氟甲氧基，R₁、R₃、R₄、R₅均为H。

进一步地，所述的化合物满足以下至少一项：

R₆～R₈独立选自H、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或卤素取代的C1～C6烷氧基；

优选地，R₆、R₇、R₈均为H。

进一步地，所述化合物为：

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：

a、原料3与原料6在钯催化剂作用下偶联，得到中间体7：

其中，R₁₁为保护基团，X为卤素；

优选地，R₁₁选自叔丁氧羰基、苄氧羰基或芴甲氧羰基；

优选地，X为碘；

b、中间体7脱除保护基团R₁₁，得到中间体8：

c、中间体8与原料9发生酰胺化反应，即得式Ⅰ化合物：

其中，Y选自羟基或卤素；优选地，Y选自羟基或氯。

进一步地，所述的制备方法满足以下至少一项：

步骤a所述钯催化剂为三(二亚苄基丙酮)二钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、四(三苯基膦)钯中一种或两种以上；

步骤a向反应体系中加入膦配体；

优选地，所述膦配体为四氟硼酸三叔丁基膦、三环己基磷中一种或两种；

步骤a向反应体系中加入碱；

优选地，所述碱为磷酸钾、碳酸钾、碳酸铯中一种或两种以上；

步骤a中原料3：原料6：钯催化剂：膦配体：碱的摩尔配比为10：12：2：1：25；

步骤a的反应溶剂选自1，4-二氧六环、水、甲苯中一种或两种以上；

优选地，所述反应溶剂为1，4-二氧六环：水体积比为5：1的混合物；

步骤a于保护气氛下反应；

优选地，所述保护气氛为氮气；

步骤a反应温度为90～105度；

优选地，步骤a反应温度为95度；

步骤b用盐酸乙醇脱除保护基团；

步骤b中中间体7：盐酸乙醇的配比为(7.5～12.5):1，m/v；

优选地，步骤b中中间体7：盐酸乙醇的配比为10:1，m/v；

步骤b的反应溶剂为1，4-二氧六环、乙醇中一种或两种；

步骤b于常温反应；

步骤c取中间体8和原料9，在缩合剂和碱存在下进行酰胺化反应；

优选地，所述缩合剂为HATU、HOBT中一种或两种；

优选地，所述碱为三乙胺、DIEA中一种或两种；

步骤c中中间体8：原料9的摩尔配比为1:1.5；

步骤c反应溶剂为四氢呋喃、DMF中一种或两种；

步骤c反应温度为60～70度；

优选地，步骤c反应温度为65度。

进一步地，当X为碘时，所述原料3由下述方法制备得到：

d、化合物1经碘代得到化合物2：

e、化合物2与卤代乙烷发生取代反应，得到原料3：

进一步地，所述的制备方法满足以下至少一项：

步骤d采用N-碘代丁二酰亚胺为碘源；

步骤d向反应体系中加入碱；

优选地，所述碱为氢氧化钾；

步骤d中化合物1：N-碘代丁二酰亚胺的摩尔配比为1：1；

步骤d的反应溶剂为二氯甲烷；

步骤d于保护气氛下反应；

优选地，所述保护气氛为氮气；

步骤d于常温反应；

步骤e所述卤代乙烷为碘乙烷；

步骤e向反应体系中加入碱；

优选地，所述碱为碳酸铯；

步骤e中化合物2：碘乙烷的摩尔配比为1：2；

步骤e的反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；

步骤e于保护气氛下反应；

优选地，所述保护气氛为氮气；

步骤e反应温度为80～85度；

优选地，步骤e反应温度为80度。

进一步地，当R₁₁为叔丁氧羰基时，所述原料6由下述方法制备得到：f、化合物4与二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物5：

其中，Z为卤素；优选地，Z为溴；

g、化合物5在钯催化剂作用下与联硼酸频那醇酯反应，得到中间体6：

进一步地，所述的制备方法满足以下至少一项：

步骤f向反应体系中加入碱；

优选地，所述碱选自N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶中一种或两种以上；

步骤f中化合物4：二碳酸二叔丁酯：(N，N-二异丙基乙胺+4-二甲氨基吡啶)的摩尔配比为3：2：1；

步骤f的反应溶剂为乙腈；

步骤f反应温度为80度；

步骤g所述钯催化剂为[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物；

步骤g向反应体系中加入碱；

优选地，所述碱为醋酸钾；

步骤g中化合物5：联硼酸频那醇酯：钯催化剂：碱的摩尔配比为7：20：1：16；

步骤g的反应溶剂为二氧六环；

步骤g于保护气氛下反应；

优选地，所述保护气氛为氮气；

步骤g反应温度为90～95度；

优选地，步骤g反应温度为95度。

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途。

进一步地，所述肿瘤为黑色素瘤。

进一步地，所述药物是抑制黑色素瘤肺转移的药物。

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备RIPK1激酶抑制剂类药物中的用途。

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制细胞程序性坏死的药物中的用途。

进一步地，所述药物是抑制结肠癌细胞、淋巴癌细胞、成纤维细胞或单核巨噬细胞程序性坏死的药物。

本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗和/或预防全身性炎症反应综合征的药物。

本发明提供了药物组合物，它是以所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

术语定义：

本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C₁～C₆烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、正戊基(C₅)、3-戊基(C₅)、戊基(C₅)、新戊基(C₅)、3-甲基-2-丁基(C₅)、叔戊基(C₅)和正己基(C₆)。除非另外指明，否则烷基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。在一些实施方案中，所述C₁～C₆烷基是被卤素(氟、氯、溴、碘)取代的C₁～C₆烷基。在C₁～C₆烷基被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。

术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是上文所定义的烷基。C₁～C₆烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。除非另外指明，否则烷氧基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，R是被卤基(氟、氯、溴、碘)取代的烷基。所述C₁～C₆烷氧基在R被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明的某些实施方式中，包括了同位素标记的化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入本发明化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即²H,³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的本发明化合物以及该化合物的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明提供了结构新颖的4-氨基吡咯并嘧啶类化合物，该类化合物能够显著抑制RIPK1激酶的活力，而且选择性较高，安全性良好，是一种RIPK1激酶相关疾病的潜在治疗药物。细胞实验表明，本发明化合物对于TNFa+Smac mimetic+Z-VAD-FMK诱导细胞发生的程序性坏死(诱导后细胞坏死完全依赖于RIPK1酶活性)具有显著的抑制作用。此外，TNFα诱导的SIRS模型和小鼠黑色素瘤肺转移模型实验进一步证明，本发明化合物能够在体内发挥抑制RIPK1激酶的作用，具有显著的抗炎和抗肿瘤转移活性。本发明为综合治疗肿瘤转移提供了一种新的策略和手段。

附图说明

图1为本发明化合物36b的激酶选择性谱图；

图2为实施例4中细胞生存率曲线图；

图3为实施例5中HT29细胞双染实验图；

图4为实施例5中L929细胞双染实验图；

图5为实施例6中免疫共沉淀图；

图6为实施例7中本发明化合物36b对RIPK1信号通路作用机制的Western Blot图；

图7为本发明化合物36b对TNFα诱导的SIRS模型的作用结果图；

图8为本发明化合物36b对小鼠黑色素瘤肺转移模型的作用结果图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1 本发明化合物36b的制备

I二氯甲烷，N-碘代丁二酰亚胺，氢氧化钾，常温，12小时，90％；

ii N，N-二甲基甲酰胺,碘乙烷,碳酸铯，80度，12小时,50％；

iii乙腈，N,N-二异丙基乙胺，4-二甲氨基吡啶，二碳酸二叔丁酯，80度，3小时，90％；

iv无水二氧六环,[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，醋酸钾，联硼酸频那醇酯，95度，24小时,60％；

v 1,4-二氧六环/水＝5：1，[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物，三环己基磷，碳酸铯,95度,18小时,58％；

vi 1,4-二氧六环，盐酸乙醇，常温，4小时，59％；

vii N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二异丙基乙胺，间氧三氟甲基苯乙酸，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，65度，12小时，51％。

具体操作步骤包括：

5-碘-7-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-胺(中间体2)的制备

将2.6克4-氨基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶、4.5克N-碘代丁二酰亚胺、1.2克氢氧化钾溶于100毫升二氯甲烷，氮气保护，常温反应12小时后，将反应液浓缩，于浓缩液中加硫代硫酸钠水溶液，常温搅拌30分钟后，抽滤、滤饼干燥后为偏灰色固体，为中间体2，产率为90％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.01(s,1H),8.08(s,1H),7.38(s,1H),6.61(s,2H)。

5-碘-7-乙基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-胺(中间体3)的制备

将1克中间体2，700毫克碘乙烷和1.8克碳酸铯溶于20毫升N，N-二甲基甲酰胺，80度氮气保护下反应12小时，乙酸乙酯：石油醚＝2:1展开剂监控反应，反应完毕，直接将反应液浓缩、拌样、柱层析。乙酸乙酯：石油醚＝1:1洗脱液纯化出中间体3，为白色固体，产率为50％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.09(s,1H),7.49(s,1H),6.57(s,2H),4.14(s,2H),1.98(s,2H),1.31(s,3H)。

N-BOC-5-溴吲哚啉(中间体5)的制备

将5克5-溴二氢吲哚(4)、7.5克二碳酸二叔丁酯、4克N，N-二异丙基乙胺和1.5克4-二甲氨基吡啶溶于150毫升乙腈，80度反应3小时，石油醚:乙酸乙酯＝5:1展开剂监控反应，产物点极性变小。反应完后浓缩反应液，于浓缩液中加水常温搅拌、抽滤，滤饼用乙醇洗涤得白色滤饼为中间体5，产率为90％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.58(s,1H),7.37(d,J＝1.0Hz,1H),7.30(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),3.90(t,J＝8.8Hz,3H),3.06(t,J＝8.7Hz,2H),1.50(s,9H)。

N-叔丁氧羰基-5-吲唑频那醇硼酸酯(中间体6)的制备

将10克中间体5、6.7克醋酸钾、12克联硼酸频那醇酯和2.8克[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物溶于200毫升无水二氧六环，用氮气将反应体系置换三次后，置于95度反应24小时，石油醚：乙酸乙酯＝20：1展开剂监控反应，反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，选用石油醚：乙酸乙酯＝80：1洗脱液纯化出中间体6。为白色固体。产率为60％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.74-7.55(m,1H),7.48(d,J＝6.7Hz,2H),3.90(t,J＝8.7Hz,2H),3.05(t,J＝8.7Hz,2H),1.50(s,10H),1.27(s,13H)。

叔丁基5-(4-氨基-7-甲基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基)吲哚-1羧酸酯(中间体7)的制备

将400毫克中间体3、580毫克中间体6、133毫克三(二亚苄基丙酮)二钯、41毫克四氟硼酸三叔丁基膦和780毫克磷酸钾溶于100毫升1，4-二氧六环/水＝5：1(体积比)的混合液中，将反应体系用氮气置换三次后置于95度反应18小时，乙酸乙酯：石油醚＝3：1展开剂监控反应，与原料极性相比，产物点极性增大，TLC监控反应完毕，将反应液浓缩、拌样、柱层析，选用乙酸乙酯：石油醚＝3:1洗脱液纯化出中间体7，为偏白色固体。产率为58％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.24(s,1H),7.80(s,1H),7.47(s,1H),7.42(d,J＝8.3Hz,1H),3.97(t,J＝8.7Hz,2H),3.93(s,3H),1.53(s,9H)。

1-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-5-基)吲哚-1-基)-2-(3-(三氟甲氧基)苯基)乙酮(化合物36b)的制备

将25毫克中间体7溶于50毫升1，4-二氧六环，常温下加入2毫升盐酸乙醇，常温搅拌4小时，乙酸乙酯：石油醚＝1：1展开剂监控反应，TLC监控反应完毕后，浓缩反应液，加入饱和碳酸钠水溶液与二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤、除去硫酸镁，将滤液减压浓缩得偏橙色油状物，未进一步纯化，直接投下一步反应，将油状物用10毫升四氢呋喃溶解，加入40毫克HATU,20微升三乙胺，35毫克间氧三氟甲基苯乙酸，65度加热反应12小时，乙酸乙酯：石油醚＝3：1展开剂监控反应，反应完毕，将反应液浓缩，并用二氯甲烷和饱和碳酸钠水溶液对浓缩液萃取，将二氯甲烷萃取液用无水硫酸镁干燥、过滤除去硫酸镁，将干燥后的滤液浓缩后用20厘米×20厘米的制备板纯化，选用展开剂的极性为乙酸乙酯：石油醚＝3：1，化合物36b的颜色为淡黄白色。产率为51％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.33(d,J＝8.2Hz,1H),8.28(s,1H),7.40(t,J＝7.9Hz,1H),7.31-7.28(m,3H),7.19-7.15(m,2H),7.00(s,1H),5.89(s,2H),4.29(q,J＝7.3Hz,2H),4.17(t,J＝8.4Hz,2H),3.86(s,2H),3.27(t,J＝8.4Hz,2H),1.50(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ168.96,157.67,151.94,150.26,148.71,142.21,138.48,133.29,130.44,129.49,127.60,125.39,123.03,122.72,119.47,116.65,115.53,100.42,48.32,41.70,39.12,27.96,15.95.HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺:482.1797。

实施例2 本发明化合物36b的体外激酶实验

体外激酶试验采用Eurofins公司提供的Kinase Profiler服务完成。实验方法如下：将待测小分子化合物36b(0.001-10μM)、待测蛋白激酶与包含底物、10mM醋酸镁和[γ-³³P-ATP]的缓冲液共同孵育，通过加入Mg\ATPmix以开始反应，在室温下孵育一段时间后，向缓冲液中加入3％的磷酸盐溶液以终止反应。随后定量吸取10μL反应混合液滴在P30滤纸上，并用75mM的磷酸盐溶液清洗3次，再用甲醇清洗一次，将P30滤纸晾干后加入闪烁液进行闪烁计数。化合物36b的抑制活性用半数抑制浓度IC₅₀来表示，IC₅₀值由各浓度梯度对应的抑制率拟合得到。

首先将化合物36b在浓度为10μM的条件下对Eurofins公司现有的396种激酶进行单浓度抑制率的测试，针对具有较高抑制活性的激酶进行IC₅₀测试，结果(试验由Eurofins公司测试并提供活性数据)如下表1、表2所示：

表1 化合物36b对396种激酶的单浓度抑制活性

表2 化合物36b对部分激酶的半数抑制浓度

可以看出，化合物36b对表2中所列激酶有较高的抑制作用。为更具体地描述化合物36b的激酶选择性，根据表1和表2的数据绘制了化合物36b的选择性图谱，(绘制流程及操作参考http://bcb.med.usherbrooke.ca/kinomerenderLig.php)，如图1所示。其中，灰色斑点表示IC50值大于10微摩的激酶(无明显抑制作用)，红色圆形斑点表示有明显抑制作用的激酶，其中，红色斑点的半径越大，说明对激酶的抑制作用越高，反之越小。由表1、表2和图1可以看出化合物36b对Src家族(包括yes\lyn\fyn\lck\blk\fgr\hck等)和MAP4K3家族具有较强的抑制作用，对Flt4、TrkB、TrkC的抑制作用都小于或等于10纳摩，具有一定的激酶选择性。

实施例3 本发明化合物36b与RIP家族激酶的体外亲和力测试

化合物36b对RIP家族的体外激酶亲和力分析测试送至DiscoveRx公司，由KINOMEscan服务完成。KINOMEscan^TM实验主要包括：1.DNA标记的激酶；2.可与激酶结合的诱饵分子；3.待测化合物。KINOMEscan^TM的磁珠上连有诱饵分子，这种分子能与激酶的活性位点结合。如果待测化合物也能与激酶结合，就会与诱饵发生竞争。或者待测化合物不能直接与激酶活性位点结合，但能使激酶的活性位点发生改变，也能减少磁珠上结合的激酶量。而激酶上连接的有DNA，可通过qPCR的方法来定量反映磁珠上激酶数量的变化情况。利用这一体系可以检测激酶与待测化合物的结合情况。结果见下表：

表3 化合物36b与RIPKs家族蛋白半数结合浓度

由表3可知，化合物36b与RIPK1激酶的半数结合浓度为4.4nM，同时，针对RIPKs家族其他成员的选择性至少在1600倍以上，说明化合物36b对RIPK1激酶有较高的选择性。

实施例4 本发明化合物36b抑制程序性坏死的作用

1)实验材料

DMEM培养基购自Gibco公司，MEM培养基购自Hyclone公司，青、链霉素购自Hyclone公司，TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic、Z-VAD-FMK购自Selleck公司，CCK8购自Medchem Express公司。

2)实验方法

HT29、J774A.1细胞采用DMEM+10％FBS+青/链霉素培养基培养，L929细胞采用MEM/EBSS+10％FBS+青/链霉素培养基培养，U937细胞采用RPMI-1640+10％FBS+青/链霉素培养基培养。实验时，收集处于对数生长期的待测细胞，以每孔特定数目(贴壁细胞一般为8×10³cells/well)接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜。次日，用培养基稀释待测化合物到相应浓度并加入到96孔板相应孔中，每个样品3-5个复孔，同时设置溶剂对照组和只含培养基的空白对照组，将加药后的细胞用TNFα/Smac mimetic/Z-VAD-FMK联合诱导24h，再每孔加入10μl CCK8溶液，并在细胞培养箱中孵育1-3h，随后用酶标仪在495nm波长下检测吸光度，并根据以下公式计算细胞生存率：细胞生存率＝[(X-C₀)/(C-C₀)]×100％，其中，C、C₀和X分别代表溶剂对照组、空白对照组和药物处理组的平均吸光度值。最后，使用GraphpadPrism 5.0软件拟合细胞生存率曲线并计算出待测化合物抑制细胞程序性坏死的EC₅₀值。

3)实验结果

为了测试本发明化合物36b抑制细胞程序性坏死的水平，在HT29细胞、U937细胞、L929细胞和J774A.1细胞的程序性坏死模型中加入不同浓度的化合物36b，并通过各个药物浓度下细胞的生存率数据计算出对应的EC50值。

结果由图2所示，化合物36b抑制HT29细胞(结肠癌细胞)、U937细胞(淋巴癌细胞)、L929细胞(成纤维细胞)和J774A.1细胞(单核巨噬细胞)程序性坏死模型的EC50值分别为1.202nM、11.55nM、0.999nM和0.517nM。以上实验结果表明，本发明化合物36b能够保护HT29细胞免受TSZ诱导的坏死样凋亡。

实施例5 CytoCalceinTM Violet 450/7-AAD双染实验

1)实验材料

TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic、Z-VAD-FMK购自Selleck公司，CytoCalceinTM-Violet 450染料购自AAT Bioquest公司，7-AAD染料购自天津三箭科技有限公司。

2)实验方法

将HT29细胞和L929细胞以每孔4万的密度接种于24孔板中，过夜细胞贴壁后，将待测化合物加入对应孔中，同时将加药后的细胞用TNFα/Smac mimetic/Z-VAD-FMK联合诱导24h。诱导结束后，小心吸出上清，无需PBS或生理盐水冲洗，直接加入binding buffer。并在避光条件下按说明书推荐的稀释比例加入CytoCalceinTM-Violet 450染料和7-AAD染料。避光反应30min至1h后，置于荧光显微镜下观察并拍照。CytoCalceinTM-Violet450染料(蓝色荧光)用于标记健康细胞，7-AAD(红色荧光)用于标记坏死细胞。

3)实验结果

为了更为形象地表述化合物36b对程序性坏死细胞模型的抑制作用，用CytoCalcein^TM-Violet 450和7-AAD这两种染料对细胞进行了染色。CytoCalcein^TM-Violet450染色为阳性细胞是健康而具有活力的细胞，而7-AAD是一种无法透过细胞膜的细胞核染料，只有细胞膜结构破坏的坏死细胞才能被染上。

结果如图3和图4所示，在HT29和L929这两种细胞中，T(S)Z的诱导可以显著减少CytoCalcein^TM-Violet450阳性(蓝色荧光)的细胞，同时7-AAD阳性(红色荧光)的细胞大量产生(因为细胞坏死后失去膜结构不能贴壁，而染色前需吸掉上清加入bindingbuffer，所以实际坏死的细胞应该高于7-AAD阳性的细胞数目)。而化合物36b在10nM的浓度几乎可以完全抑制T(S)Z诱导的坏死，1nM的浓度可以部分抑制，与计算出的EC₅₀值相符合。

实施例6 免疫共沉淀实验

1)实验材料

DMSO购自Sigma公司，TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic、Z-VAD-FMK购自Selleck公司，NP40裂解液购自碧云天生物技术研究所，Protein A/G琼脂糖珠购自Roche公司。

2)实验方法

免疫共沉淀样品的制备：将细胞传代培养成若干皿，更换新鲜培养基后第二天向培养基中加入化合物36b溶液，对照组加入等量100％DMSO。将加药后的细胞用TNFα/Smacmimetic/Z-VAD-FMK联合诱导6h。此后，吸尽上清，用预冷的PBS或生理盐水洗三次，再加入适当体积的NP40裂解液(含1％cocktail和1％PMSF蛋白酶抑制剂)立即置于冰上平放裂解30min以上，30min后将细胞裂解液用刮刀刮下转移至1.5ml的EP管中，随后将离心管置于低温高速离心机中离心(12000x g，20min)以除去细胞碎片。再用BCA法进行蛋白定量，并用蛋白标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度，再通过计算将各组蛋白样品浓度调平。此时，将蛋白溶液分为两部分，一份(少)直接加入蛋白上样缓冲液置于100℃干式恒温器中保持10min，使蛋白变性。这一份作为input样品。另一份蛋白溶液(多)作为IP样品加入一定体积的目的抗体和相同量的对照抗体IgG，置于4℃旋转孵育过夜，并于次日加入50μl用PBS重悬的50％ProteinA/G琼脂糖珠再继续孵育4-6小时。孵育完成后将各样品置于4℃离心(2500rpm，3min)，弃掉上清，保留抗体-蛋白复合物，再用NP40裂解液重悬、离心清洗3次后，向其中加入用NP40裂解液配制好的2x蛋白上样缓冲液重悬，置于100℃干式恒温器中保持10min以上，使蛋白与琼脂珠和抗体分离并变性，后，高速离心，取上清。处理好的蛋白样品直接电泳或分装后保存于-20℃备用。蛋白样品避免反复冻融。

3)实验结果

为了检测化合物36b在细胞内对程序性坏死信号通路的抑制情况，采用以上方法检测了TSZ诱导下坏死小体necrosome的形成。

如图5所示，在HT29和L929这两种细胞中，RIPK1和RIPK3在TSZ的诱导下形成复合物，但化合物36b对上述复合物的形成有显著的抑制作用。

实施例7 本发明化合物36b对RIPK1信号通路的作用机制

1)实验材料

TNFα购自Peprotech公司，Smac mimetic、Z-VAD-FMK购自Selleck公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，PMSF蛋白酶抑制剂购自Sigma公司，十二烷基磺酸钠SDS，甘氨酸，丙烯酰胺，三羟甲基氨基甲烷Tris，过硫酸铵APS，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺TEMED，羧甲基纤维素钠均购自Sigma公司。

2)实验方法

细胞总蛋白的提取：在细胞上清中加入相应浓度的化合物36b或空白溶剂处理细胞并用TNFα/Smac mimetic/Z-VAD-FMK联合诱导一定时间后，弃尽上清，用预冷的PBS或生理盐水洗三次，再加入适当体积的RIPA裂解液(含1％cocktail和1％PMSF蛋白酶抑制剂)立即置于冰上平放裂解15min，15min后将细胞裂解液用刮刀刮下转移至1.5ml的EP管中，用超声破碎仪破碎细胞。随后将离心管置于低温高速离心机中离心(12000rpm，15min)以除去细胞碎片。再用BCA法进行蛋白定量，并用蛋白标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度，再通过计算将各组蛋白样品浓度调平，加入5x蛋白上样缓冲液后置于100℃干式恒温器中保持10min。随后直接上样电泳或分装后或分装后保存于-20℃备用。蛋白样品避免反复冻融。

蛋白样品制备好后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶制胶配方如表4所示，一般采用10％的分离胶进行分离。电泳分离后，用槽式湿转法将蛋白充分转移至PVDF膜上，然后将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉(脱脂奶粉用TBS/T配制)中室温封闭2h以上，按照所需蛋白的分子量取得含相应蛋白的PVDF膜带，按抗体说明书推荐的稀释比例稀释一抗并在4℃孵育蛋白条带过夜。次日，取出各条带，用TBS/T缓冲液漂洗(5min，3次)后加入1:5000稀释的HRP标记的二抗，在37℃下摇动孵育1h，随后用TBS/T洗脱除去过量抗体，在PVDF膜上均匀滴加HRP底物后，置于快速凝胶成像系统中显影并拍照。

表4 SDS-PAGE中分离胶和浓缩胶配方

3)实验结果

结果见图6。可以看出，化合物36b通过抑制RIPK1的自身磷酸化，影响了它下游RIPK3和MLKL的磷酸化，且这种抑制活性具有浓度依赖效应，与细胞水平的保护活性一致，说明化合物36b通过阻断程序性坏死信号通路发挥抑制程序性坏死的作用。

实施例8 本发明化合物36b对TNFα诱导的SIRS模型的作用

1)实验材料

TNFα购自Peprotech公司，0.C.T组织固定液购自SAKURA公司。

2)实验方法

TNFα的造模剂量为500μg/ml，用无菌生理盐水配制，通过尾静脉注射方式造模。小鼠的体温通过红外电动体温枪来检测。溶剂为0.1％CMC-Na，给药方式为腹腔注射，化合物36b的给药剂量为20mg/kg，造模前腹腔给药。前12小时每2小时记录一次体温并记录小鼠的生存情况，12h后每12小时记录一次。用Graphpad Prism 5.0软件拟合生存期曲线。

TNFα注射6h后，将部分小鼠处死，并取心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏浸泡于中性福尔马林溶液中处理24-48h待用。将浸泡于中性福尔马林溶液中的组织取出转移至包埋盒中，并置于流动自来水中冲洗2-3h，随后浸泡于75％的酒精中。次日，取出包埋盒并将其依次放入下列溶剂中进行酒精固定脱水：85％酒精，1h/次，2次；95％酒精，1h/次，2次；100％酒精，1h/次，3次；二甲苯，1h/次，2次。随后，将脱水后的组织依次置于65℃的旧蜡、二蜡和新蜡中处理，每次0.5h。最后进行石蜡包埋，保存备用。将蜡块以5μm的厚度连续切片，并将切片置于烤箱中65℃-70℃烘烤1-2h，然后将其依次放入下列溶剂中进行梯度酒精水化以脱蜡：二甲苯，10min/次，2次；100％、95％、80％、75％酒精，各2min；蒸馏水，5min/次，2次。然后滴加苏木精和伊红染色，染色一定时间后冲洗掉多余的染料，自然风干后加中性树胶封片。

3)实验结果

为了验证化合物36b是否在体内也具有抗RIPK1和抑制程序性坏死的活性，本实验选择了经典炎症模型SIRS。全身性炎症反应综合征(Systemic Inflammatory ResponseSyndrome，SIRS)是由于感染或非感染因素作用于机体，引起机体失控而自我破坏的全身炎症反应。危重病人常因机体代偿性抗炎反应能力降低及代谢功能紊乱，易引发SIRS。而TNFα诱导的SIRS疾病模型在长期的研究中被证明与RIPK1依赖的细胞凋亡与程序性坏死病高度相关。

本实验建立了TNFα诱导的SIRS小鼠模型，以评价本发明化合物的体内活性。TNFα的造模剂量为500μg/ml，用无菌生理盐水配制，通过尾静脉注射方式进入小鼠体内。因为测小鼠的直肠温度会对小鼠造成机械性损伤，可能对实验结果产生干扰，故采用红外电动体温枪来测量小鼠的体温，同时观察生存情况。化合物36b的给药剂量为20mg/kg，造模前给药一次。模型组给予对应溶剂对照。

实验结果如图7所示，SIRS模型组小鼠在被注射TNFα后短时间内产生体温持续下降，活动减少等症状，在数小时内开始死亡，并在24h内全部死亡。而给药化合物36b的组别在TNFα注射后的12h内体温相对正常，小鼠的活力明显优于模型组，且在前12小时内没有死亡小鼠出现，整体死亡率与模型组相比显著降低。为了观察小鼠器官的病理变化，在TNFα注射6h后处死部分小鼠，取其心脏、肝、脾、肺、肾做病理切片。根据HE染色的结果显示，TNFα的诱导主要导致小鼠的肝脏和肾脏发生严重的损伤，而给药化合物36b之后小鼠肝和肾脏的损伤都得到很大程度的保护。

以上实验结果说明，化合物36b通过在体内抑制RIPK1发挥了显著的抗炎作用，保护了高剂量TNFα诱导小鼠产生的死亡。

实施例9 本发明化合物36b对小鼠黑色素瘤肺转移模型的作用

1)实验材料

DMEM培养基购自Gibco公司，B16细胞购自ATCC公司。

2)实验方法

短期模型：造模前先腹腔给药化合物36b或空白溶剂。造模方法为收集对数生长期的黑色素瘤B16细胞，用不添加血清和抗生素的DMEM培养基重悬细胞，洗涤三次，并计数。将细胞重悬成5×10⁶cells/ml的悬液，并将100μL细胞悬液通过尾静脉缓慢注射到小鼠体内。6h后处死小鼠并取肺部做冰冻切片和免疫荧光，观察短期中B16细胞在肺部的转移情况。

长期模型：收集对数生长期的黑色素瘤B16细胞，用不添加血清和抗生素的DMEM培养基重悬细胞，洗涤三次，并计数。将细胞重悬成5×10⁶cells/ml的悬液，并将100μL细胞悬液通过尾静脉缓慢注射到小鼠体内。细胞注射1天后，将小鼠随机分成2组：溶剂对照组、化合物36b(20mg/kg/d，i.p.)组。分组后于连续腹腔给药12天，处死小鼠并取肺拍照，并数肺部转移灶结节做统计图。肺部用中性福尔马林固定后做HE染色。

3)实验结果

本实验选用小鼠黑色素瘤细胞(B16)的肺转移模型来评价化合物36b的体内抗肿瘤转移效果。

结果如图8所示，在高浓度B16细胞通过尾静脉注射入小鼠体内的6h后，通过冷冻切片与免疫荧光染色的方法，发现小鼠肺部毛细血管网明显可见有黑色素瘤细胞的侵入(CD31⁺的绿色荧光细胞为小鼠血管内皮细胞，DAPI阳性的蓝色荧光细胞为黑色素瘤B16细胞)，说明大量的肿瘤细胞可以短时间内开始破坏小鼠肺部的血管内皮屏障；而在造模前给药化合物36b的小鼠与模型组相比，肺部的黑色素瘤B16细胞显著减少。在长期的转移模型中，化合物36b以20mg/kg的剂量每天给药1次。12天后，小鼠被处死取肺部观察并拍照，然后被包埋切片做HE染色。结果显示模型组小鼠的肺部被肉眼可见的大量黑色素瘤转移灶侵占，化合物36b给药组的小鼠与模型组相比，肺部黑色素瘤转移灶显著减少，仅有少量的可见转移灶。HE染色也显示出同样的结果。

以上实验结果表明，本发明化合物36b具有减少黑色素瘤细胞肺转移的作用。

Claims (56)

1.所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征是：所述化合物为：

2.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

a、原料3与原料6在钯催化剂作用下偶联，得到中间体7：

其中，R₁₁为保护基团，X为卤素；

b、中间体7脱除保护基团R₁₁，得到中间体8：

c、中间体8与原料9发生酰胺化反应，即得式Ⅰ化合物：

其中，Y选自羟基或卤素。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是：R₁₁选自叔丁氧羰基、苄氧羰基或芴甲氧羰基；X为碘；Y选自羟基或氯。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：满足以下至少一项：

步骤a所述钯催化剂为三(二亚苄基丙酮)二钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、四(三苯基膦)钯中一种或两种以上；

步骤b的反应溶剂为1，4-二氧六环、乙醇中一种或两种；

步骤b于常温反应；

步骤c中中间体8：原料9的摩尔配比为1:1.5；

步骤c反应溶剂为四氢呋喃、DMF中一种或两种。

5.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤a向反应体系中加入膦配体；步骤a向反应体系中加入碱；步骤a中原料3：原料6：钯催化剂：膦配体：碱的摩尔配比为10:12:2:1:25。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤a，所述膦配体为四氟硼酸三叔丁基膦、三环己基磷中一种或两种。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤a，所述碱为磷酸钾、碳酸钾、碳酸铯中一种或两种以上。

8.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤a的反应溶剂选自1，4-二氧六环、水、甲苯中一种或两种以上。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是：步骤a，所述反应溶剂为1，4-二氧六环：水体积比为5：1的混合物。

10.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤a于保护气氛下反应。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征是：步骤a，所述保护气氛为氮气。

12.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤a反应温度为90～105度。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征是：步骤a反应温度为95度。

14.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤b用盐酸乙醇脱除保护基团；步骤b中中间体7：盐酸乙醇的配比为(7.5～12.5):1，m/v。

15.如权利要求14所述的制备方法，其特征是：步骤b中中间体7：盐酸乙醇的配比为10:1，m/v。

16.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤c取中间体8和原料9，在缩合剂和碱存在下进行酰胺化反应。

17.如权利要求16所述的制备方法，其特征是：步骤c，所述缩合剂为HATU、HOBT中一种或两种；步骤c，所述碱为三乙胺、DIEA中一种或两种。

18.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是：步骤c反应温度为60～70度。

19.如权利要求18所述的制备方法，其特征是：步骤c反应温度为65度。

20.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：当X为碘时，所述原料3由下述方法制备得到：

d、化合物1经碘代得到化合物2：

e、化合物2与卤代乙烷发生取代反应，得到原料3：

21.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：满足以下至少一项：

步骤d的反应溶剂为二氯甲烷；

步骤d于常温反应；

步骤e的反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。

22.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤d采用N-碘代丁二酰亚胺为碘源；步骤d中化合物1：N-碘代丁二酰亚胺的摩尔配比为1：1。

23.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤d向反应体系中加入碱。

24.如权利要求23所述的制备方法，其特征是：步骤d，所述碱为氢氧化钾。

25.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤d于保护气氛下反应。

26.如权利要求25所述的制备方法，其特征是：步骤d，所述保护气氛为氮气。

27.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤e所述卤代乙烷为碘乙烷；步骤e中化合物2：碘乙烷的摩尔配比为1：2。

28.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤e向反应体系中加入碱。

29.如权利要求28所述的制备方法，其特征是：步骤e，所述碱为碳酸铯。

30.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤e于保护气氛下反应。

31.如权利要求30所述的制备方法，其特征是：步骤e，所述保护气氛为氮气。

32.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：步骤e反应温度为80～85度。

33.如权利要求32所述的制备方法，其特征是：步骤e反应温度为80度。

34.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：当R₁₁为叔丁氧羰基时，所述原料6由下述方法制备得到：

f、化合物4与二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物5：

其中，Z为卤素；

g、化合物5在钯催化剂作用下与联硼酸频那醇酯反应，得到中间体6：

35.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：Z为溴。

36.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：满足以下至少一项：

步骤f的反应溶剂为乙腈；

步骤f反应温度为80度；

步骤g所述钯催化剂为[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物；

步骤g的反应溶剂为二氧六环。

37.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：步骤f向反应体系中加入碱。

38.如权利要求37所述的制备方法，其特征是：步骤f，所述碱选自N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶中一种或两种以上。

39.如权利要求38所述的制备方法，其特征是：步骤f中化合物4：二碳酸二叔丁酯：(N，N-二异丙基乙胺+4-二甲氨基吡啶)的摩尔配比为3：2：1。

40.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：步骤g向反应体系中加入碱。

41.如权利要求40所述的制备方法，其特征是：步骤g，所述碱为醋酸钾。

42.如权利要求40所述的制备方法，其特征是：步骤g中化合物5：联硼酸频那醇酯：钯催化剂：碱的摩尔配比为7：20：1：16。

43.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：步骤g于保护气氛下反应。

44.如权利要求43所述的制备方法，其特征是：步骤g，所述保护气氛为氮气。

45.如权利要求34所述的制备方法，其特征是：步骤g反应温度为90～95度。

46.如权利要求45所述的制备方法，其特征是：步骤g反应温度为95度。

47.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。

48.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途。

49.如权利要求47或48所述的用途，其特征是：所述肿瘤为黑色素瘤。

50.如权利要求48所述的用途，其特征是：所述药物是抑制黑色素瘤肺转移的药物。

51.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备RIPK1激酶抑制剂类药物中的用途。

52.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制细胞程序性坏死的药物中的用途。

53.如权利要求52所述的用途，其特征是：所述药物是抑制结肠癌细胞、淋巴癌细胞、成纤维细胞或单核巨噬细胞程序性坏死的药物。

54.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的用途。

55.如权利要求54所述的用途，其特征是：所述药物是治疗和/或预防全身性炎症反应综合征的药物。

56.药物组合物，其特征是：它是以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

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