CN111093813A

CN111093813A - 用于处理含蛋白质悬浮液或含蛋白质溶液的方法

Info

Publication number: CN111093813A
Application number: CN201880058952.5A
Authority: CN
Inventors: L·斯密斯洛娃; J·福伊勒
Original assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Current assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: JP2020533159A; EP3681618B1; JP7218357B2; CN111093813B; EP3681618A1; US11247178B2; WO2019052989A1; US20200276540A1; DE102017216030A1

Abstract

本发明涉及一种用于处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法，例如用于浓缩或清理悬浮液或溶液中所含的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。在所述方法中，含蛋白质悬浮液或溶液借助于过滤器模块被过滤，并将保留在过滤器模块中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质借助于反冲洗流体输送出过滤器模块。

Description

用于处理含蛋白质悬浮液或含蛋白质溶液的方法

技术领域

本发明涉及一种用于处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法，所述含蛋白质悬浮液或溶液含有分散在载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。本发明还涉及该方法在浓缩和清理含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质中的用途。

背景技术

在环境和质量管理中，特别是在医疗技术中的水处理和生物流体的液体处理中，经常需要识别水系统中的分散或溶解成分，以便可以使它们可用于进一步的处理步骤和分析。为此，通常需要从高度稀释物中浓缩和清理这些成分。在这种情况下，采用过滤过程来分离和/或清理这些成分。与此相关的是，特别是在市政或临床供水系统中，需要能够识别诸如病毒、细菌或原生动物、病原体、细胞、细胞碎片、热原、内毒素或其它含蛋白质颗粒等可以以高度稀释的形式分散或溶解在水源中的微生物，并评估它们的健康风险。

从稀释的水系统中浓缩成分需要过滤掉大量的液体。在此，中空纤维膜过滤已被证明优于使用其它膜的过滤。在这方面，近年来已经开发了各种过滤过程来浓缩和清理细菌、病毒和其它含蛋白质物质。特别采用的是“切向流”和“死端(Dead End)”过滤过程。

根据“切向流”过滤，过滤是通过膜进行的，其中，待过滤的液体沿着过滤器模块内的膜表面流动。由此，液体的一部分通过过滤器模块内的膜壁到达膜壁的相反侧。液体的另一部分保留在膜壁的这一侧，并作为所谓的保留物被引导出过滤器。保留物可以再循环并再次供给过滤器，使得待过滤的液体的被膜壁阻挡的成分集中在保留物中。

特别是在中空纤维膜过滤器中采用“切向流”方法。流体例如通过中空纤维膜过滤器上的流体通路输送到中空纤维膜的管腔侧，流经中空纤维膜，并经由第二流体通路被引导出中空纤维膜，然后再循环。滤出液通过中空纤维膜的膜壁进入中空纤维膜过滤器的纤维间隙。待过滤的液体的膜渗透成分与滤出液一起被排出，使得保留在保留物中的成分同时得到净化。可以继续进行再循环，直到保留物中的成分被足够地浓缩或净化。如果打算过滤大量液体，可能会导致相对较长的循环过程。不利的结果是来自待过滤的液体的沉积物在此形成在膜表面上。这些沉积物阻碍有效过滤，在更糟糕的情况下导致堵塞膜孔，从而损害过滤并阻止待分离的成分的有效浓缩和净化。此外，在“切向流”方法中，首先将整个样本提供在样本容器中是有利的，以便可以再循环保留物和保留物中的成分的浓度。

在“死端”过滤方法中，液体被引入过滤器模块，并通过建立的压力梯度穿过膜壁。中空纤维膜过滤器通常采用“死端”方法，即经由流体通路将液体在中空纤维膜的管腔侧引入中空纤维膜过滤器中。中空纤维膜的端部在此被密封或堵塞，从而不会有流体通过中空纤维膜的端部泄漏。特别地，在中空纤维膜的另一端的第二流体通路经常被堵塞，使得所有待过滤的流体都通过膜壁，并可以作为滤出液输送出去。待过滤的液体的被膜阻挡的成分收集在过滤器中，特别是在中空纤维膜的管腔中，并且通过反冲洗在进一步的输送步骤中从过滤器中回收。因此，还可以首先在过滤器中收集样本，并将其存储以备以后使用，例如通过反冲洗进行回收。

就所需时间而言，“死端”方法优于“切向流”方法。然而，不利的是，膜往往会被堵塞。含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质容易被膜壁吸附并沉降在膜壁的表面和孔中。这种堵塞会阻碍蛋白质的有效回收，损害过滤。已知用牛血清或聚磷酸钠(NAPP)或二磷酸钠预处理中空纤维膜过滤器以消除堵塞。然而，这样的过程是不利的，因为它们是耗时的，并且过滤器可能会受到微生物的污染。还已知的是在过滤过程中使用诸如NAPP或TWEEN(吐温)80作为表面活性物质的添加剂来评估要评估的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的吸附。在此，要获得的蛋白质的加性污染被认为是不利的。此外，还可以将添加剂添加到反冲洗流体中，以实现对含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的解吸附。然而，这些添加剂也与对浓缩的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的污染有关。

US 9,446,354公开了一种在过滤过程中使用反冲洗步骤过滤生物流体的方法。在此，在“死端”过滤过程中从生物反应器获得的含蛋白质流体被浓缩。流体借助于膜式泵输送，这会引起很大的压力波动。在此，在泵循环期间进行反向过滤，从而使沉积在膜中的蛋白质被解吸附。因此，可以在过滤器中容纳更多的保留蛋白质，而不会造成过高的跨膜压力梯度使膜破裂。US 9,446,354没有描述保留的蛋白质的回收。

JP2016116465描述了一种用于回收污染较少的细胞浓缩物的方法。为了浓缩细胞悬浮液中的细胞，来自蓄存器的细胞悬浮液在“切向流”过程中通过中空纤维膜过滤器的管腔侧循环。滤出液通过膜壁渗透到滤出液区。为了净化，将冲洗流体逐渐添加到保持细胞悬浮液的蓄存器中。这个过程没有提到“死端”过滤。

现有技术中描述的方法在操作简易性和从含蛋白质悬浮液或溶液中清理和浓缩含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的速率方面需要改进。特别地，所述方法的回收率可以继续提高。因此，需要提供一种用于处理细胞悬浮液的改进方法，其解决了所描述的缺点。

发明内容

本发明的任务

因此，在本发明的第一方面，任务是提供一种处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法，该方法几乎不费力气，并且可确保含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的高回收率。

本发明的概要

在本发明的第一方面，通过一种根据权利要求1所述的用于处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法创造性地解决了该任务。权利要求2至13构成本发明的第一方面的优选实施例。

在第二方面，通过根据权利要求14所述的根据权利要求1至13的方法用于清理载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的用途，创造性地解决了该任务。

在第三方面，通过根据权利要求15所述的根据权利要求1至13的方法浓缩载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的用途，创造性地解决了该任务。

本发明的详细描述

本发明的第一方面涉及一种用于处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法，包括以下步骤：

·提供过滤器模块，所述过滤器模块具有通过至少一个多孔膜壁而被分为保留腔室和滤出液腔室的内部，其中，保留腔室具有至少一个第一流体通路和至少一个第二流体通路，并且滤出液腔室具有至少一个流体通路，

·提供含有悬浮在载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的至少一个含蛋白质悬浮液或溶液的源，其中，所述含蛋白质悬浮液或溶液的源能够通过流体管线至少连接到至保留腔室的第一流体通路，

·提供一个或多个冲洗流体的源，其中，所述一个或多个冲洗流体的源能够至少连接到至保留腔室的第一或第二流体通路和连接到至滤出液腔室的所述至少一个流体通路，

·提供至少一个泵装置，用于通过流体管线泵送含蛋白质悬浮液或溶液以及冲洗流体，

·在第一输送步骤中将含蛋白质悬浮液或溶液从所述含蛋白质悬浮液或溶液的源泵入过滤器模块的保留腔室，

·使含蛋白质悬浮液或溶液穿过膜壁而被输送到滤出液腔室，

·在适用的情况下，经由滤出液腔室的所述至少一个流体通路排出在滤出液腔室中获得的流体，

其特征在于

在第二输送步骤中，将冲洗流体从所述一个或多个冲洗流体的源泵入滤出液腔室和保留腔室，并且从保留腔室排出含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体。

该方法的优点在于，能够容易地借助于“死端”过滤来进行。所描述的方法还具有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质回收率高的特性。特别是，该方法适用于例如从饮用水中清理和浓缩细胞、病原体、病毒、热原、内毒素、微泡或其它含蛋白质颗粒或高稀释度的溶解的含蛋白质物质，以便对获取的样本进行进一步的微生物分析。

术语“蛋白质”应理解为能够作为颗粒悬浮或溶解在载体流体中并通过膜过滤被清理和浓缩的所有基于氨基酸的大分子。在这种情况下，“含蛋白质悬浮液或溶液”是指在载体流体中含有细胞、蛋白质、含蛋白质病原体、病毒、热原、内毒素或微囊的悬浮液或溶液。本文中的“载体流体”特别是指含水的液体，更特别地是水。

在本发明的方法中使用了一种具有膜的过滤器模块，膜的性质的特征在于能够保留待分析的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。蛋白质保留率与膜的选择层的孔径大小有关。例如，如果要分离病毒，可建议使用孔径小于20nm的膜。用于膜的分离性能的一个值是分子截止值，它表示为能够可靠分离的物质的分子量。截止值通常以kDa表示。过滤器的截止值是根据EN ISO 8637:2014通过测量筛分系数来确定的。过滤器模块的膜将过滤器模块的内部分成两个腔室。过滤器模块的第一腔室用于保留待过滤的含蛋白质悬浮液或溶液。含蛋白质悬浮液或溶液的载体流体可通过膜壁过滤进入过滤器模块的第二腔室。未被过滤的流体和样本仍保留在过滤器模块的第一腔室中，并被称为“保留物”。因此，本申请将第一腔室称为“保留腔室”。通过膜壁进入过滤器模块的第二腔的流体称为“滤出液”。因此，本申请将滤出液积聚在其中的过滤器模块的腔室称为“滤出液腔室”。

过滤器模块具有多个流体通路，其中，保留腔室具有至少两个流体通路，滤出液腔室具有至少一个流体通路。如本申请所定义的，“流体通路”应理解为过滤器模块上的端口，通过该端口，流体、特别是含蛋白质悬浮液或溶液或冲洗流体可以被引入过滤器模块中，例如进入保留腔室或滤出液腔室。所谓的流体通路也同样适用于从过滤器模块中排出流体、特别是滤出液或保留物。

通过含蛋白质悬浮液或溶液的源提供含蛋白质悬浮液或溶液用于过滤。在本申请的意义内，保持所述含蛋白质悬浮液或溶液供应的蓄存器可以用作含蛋白质悬浮液或溶液的“源”。然而，持续供应含蛋白质悬浮液或溶液的含蛋白质悬浮液或溶液供给也可以作为源。特别是，这也可以是指来自采样站的被含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质污染的饮用水的供给。此外，从上游过程获得和提供含蛋白质悬浮液或溶液也可以构成本申请意义内的含蛋白质悬浮液或溶液的源。

此外，本发明的方法提供了一种用于处理含蛋白质悬浮液或溶液的冲洗流体的源。冲洗流体的“源”可以是储存本发明的方法中使用的冲洗流体的蓄存器。然而，也可以将来自采样站的冲洗流体供给理解为源。特别地，可理解为源的是通过从多个构件制备和供应冲洗流体的制备单元提供冲洗流体。

冲洗流体也可以是用于置换含蛋白质悬浮液或溶液的载体流体的液体，从而清理含蛋白质颗粒或伴生物质的含蛋白质溶解物，例如存在于载体流体中的杂质。冲洗流体可以是水。特别地，冲洗流体可以包含另外的添加剂，用于防止当前蛋白质的变性以及使进一步的有害影响最小化，从而防止蛋白质的变性、吸附或碎裂。

特别地，如果生理浓度适用，冲洗流体可以包含食盐。冲洗流体还可以含有表面活性剂，例如吐温80。吐温80是聚氧乙烯山梨醇单油酸酯类化合物的一种表面活性剂。具有这种冲洗流体成分的优点是吸附的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质被特别好地解吸附。

此外，根据本发明的方法，至少一个泵装置将含蛋白质悬浮液或溶液经由流体管线从含蛋白质悬浮液或溶液的源输送到保留腔室。在本申请的意义上，“泵装置”应理解为能够通过压力变化来输送液体的任何装置。本发明的方法特别规定了使用膜泵或蠕动泵，特别是软管滚子泵，这在医疗技术领域是众所周知的。叶轮泵也可以在本发明的方法中使用。合适的泵的选择还取决于要泵送的介质，因此，对于相应的含蛋白质颗粒或含蛋白质溶解物，优选尽可能温和的泵送方法。还可以提供泵装置用于从过滤器模块排出滤出液。还可以提供泵装置将冲洗流体输送到滤出液腔室和保留腔室。特别地，可通过泵装置输送冲洗流体、含蛋白质悬浮液或溶液、保留物或反冲洗流体。替代性地，可以通过多个泵装置将冲洗流体泵入滤出液腔室和保留腔室。特别地，还可以提供多个泵装置，以便输送含蛋白质悬浮液或溶液、冲洗流体、保留物或反冲洗流体。

泵装置可以被配置成在第一输送方向上将冲洗流体和/或含蛋白质悬浮液或溶液从相应的源泵送到过滤器模块，并在第二输送方向上将保留物或反冲洗流体引导出过滤器。

本发明的方法还使得所述至少一个含蛋白质悬浮液或溶液的源能经由流体管线连接到保留腔室的至少一个第一流体通路，并且还使得含蛋白质悬浮液或溶液经由所述至少一个泵装置泵送到过滤器模块。任何适合于输送本发明的方法中提供的液体的连接系统都可以用作“流体管线”。特别地，在医疗技术、特别是透析中已知的柔性软管系统可以用作流体管线。在此上下文中，“软管系统”应理解为由管段、连接器和例如注射/抽取端口的其它功能元件或压力分析单元组成并旨在用于液体输送的设备。

还使得所述一个或多个冲洗流体的源能够经由流体管线连接到保留腔室的所述至少一个第一流体通路，并且冲洗流体能够通过至少一个泵装置被泵入过滤器模块的保留腔室。

还使得所述一个或多个冲洗流体的源能够经由流体管线连接到至滤出液腔室的所述至少一个第一流体通路，并且冲洗流体能够通过至少一个泵装置被泵入过滤器模块的滤出液腔室。

根据本发明的方法，在第一输送步骤中，含蛋白质悬浮液或溶液的源通过第一流体通路经由流体管连接到过滤器模块。将含蛋白质悬浮液或溶液在第一输送方向上从含蛋白质悬浮液或溶液的源泵入过滤器模块的保留腔室。含蛋白质悬浮液或溶液载体流体的一部分在此流入过滤器模块的滤出液腔室。含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质在此被浓缩在保留腔室中，并且如果适用，则被清理，因为载体流体的一部分经由膜壁被分离为滤出液。如果需要，可以通过泵装置将积聚在滤出液腔室中的滤出液排出滤出液腔室，并且例如将其引导到保持罐或丢弃。

在第二输送步骤中，所述一个或多个冲洗流体的源经由过滤器模块的流体管连接到滤出液腔室的所述至少一个流体通路，其中，所述一个或多个冲洗流体的源还连接到保留腔室的第一或第二流体通路。泵装置然后将冲洗流体泵入保留腔室和滤出液腔室。通过在第二输送步骤进入的冲洗流体，可以将第一输送步骤后浓缩在保留腔室中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质以浓缩、被清理的形式排出。含有在第二输送步骤中从保留腔室中排出的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的冲洗流体称为“反冲洗流体”。

在根据第一方面的另一个实施例中，该方法的特征在于在第一输送步骤中至过滤器模块的保留腔室的第二流体通路被阻塞而不被流体渗透。根据该实施方式，在第一输送步骤中，将含蛋白质悬浮液或溶解的含蛋白质物质引入过滤器模块的保留腔室。在过滤器模块的保留腔室处的第二流体通路的液密阻塞具有防止含蛋白质悬浮液或溶液从保留腔室排出的效果，使得所有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质都集中在保留腔室中。因此，含蛋白质悬浮液或溶液在第一输送步骤中按照“死端”过滤进行处理。“死端”过滤的优点是能够以更大的稀释度处理含蛋白质悬浮液或溶液。此外，与“切向流”过滤相比，处理含蛋白质悬浮液或溶液所需的时间更少。

在另一实施例中，本发明的方法的特征在于，在第一输送步骤中，经由过滤器模块上的第一流体通路，将含蛋白质悬浮液或溶液从含蛋白质悬浮液或溶液的源泵送到保留腔室，并且在第二输送步骤中，经由所述至少一个第一流体通路，将冲洗流体从所述一个或多个冲洗流体的源泵入过滤器模块的保留腔室，而且经由保留腔室上的第二流体通路排出含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体。在此，在第二输送步骤中将冲洗流体泵入保留腔室与在第一输送步骤中将含蛋白质悬浮液或溶液泵入保留腔室的输送方向相同。用反冲洗流体经由至过滤器模块的保留腔室的第二流体通路将含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质排出，也称为“前向冲洗”。前向冲洗的特征在于通过简单设计来回收保留在保留腔室中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于过滤器模块为中空纤维膜过滤器。这种中空纤维膜过滤器在现有技术中，特别是在水处理、透析和血浆分离术中是已知的。现有技术中已知的中空纤维膜过滤器相对于模块尺寸具有高的膜表面积，并且可以在待过滤的液体(在这种情况下是含蛋白质悬浮液或溶液)的高流率下操作。通常，中空纤维膜过滤器在保留腔室上有两个流体通路，在滤出液腔室上还有另外两个流体通路。这种中空纤维膜过滤器可以用于本发明的方法。在本发明的方法中使用中空纤维膜过滤器时，可阻塞相应的流体通路而不被流体渗透。根据一个实施例，这些阻塞的流体通路是例如在第一输送步骤中在保留腔室处的第二流体通路和在滤出液腔室处的两个流体通路中的一个。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，中空纤维膜的管腔侧形成保留腔室，纤维间隙形成滤出液腔室。这种结构的优点是能够简单可靠地回收含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质，特别是因为过滤器模块的内腔的容积小并且容易接近，而且没有或仅具有低的死容积。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第二输送步骤中，沿着第一输送方向将冲洗流体从所述至少一个冲洗流体的源输送到过滤器模块的滤出液腔室，并且同时沿着第一输送方向将冲洗流体从所述至少一个冲洗流体的源或另一个冲洗流体的源输送到过滤器模块的保留腔室。在第二输送步骤中将冲洗流体同时输送到保留腔室和滤出液腔室，可以更好地从膜壁上冲洗掉潜在粘附的蛋白质颗粒。从而提高了对含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的回收。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第二输送步骤中，冲洗流体以相等的流率流入保留腔室和滤出液腔室。在此，在第二输送步骤中可以通过泵装置(例如，蠕动软管滚子泵)将冲洗流体泵送到保留腔室并将冲洗流体泵送到滤出液腔室。替代性地，也可以使用膜泵将冲洗流体输送到保留腔室和滤出液腔室。此外，设置进入保留腔室和滤出液腔室的匹配的冲洗流体流率，使得能够设置冲洗流体从滤出液腔室进入保留腔室的限定的跨膜通道。冲洗流体从滤出液腔室进入保留腔室的跨膜通道在本申请的意义上称为“反过滤”。来自第一输送步骤的过滤方向在此被反转，并且支持粘附在膜壁上的蛋白质颗粒的释放，从而支持反冲洗流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的高回收。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于以交替脉冲的方式将冲洗流体输送到滤出液腔室和保留腔室。特别地，可以为此目的采用诱导输送的冲洗流体的脉动流动的泵装置。脉动泵是例如蠕动软管滚子泵或膜泵。假定当在第二输送步骤中以交替脉冲将冲洗流体泵入保留腔室和滤出液腔室时，在保持含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的保留腔室中产生湍流。进一步假定保留腔室中的湍流使附着在膜壁上或膜壁孔内的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质移动，以回收含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。从而提高了反冲洗流体中对含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的回收。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于滤出液腔室包括另一个流体通路，并且冲洗流体在第二输送步骤中经由第一和另一个流体通路沿着第一输送方向从所述一个或多个冲洗流体的源被输送到滤出液腔室。这种类型的实施方式能够进一步优化回收含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于中空纤维膜为过滤器提供小于64kDa的截止值。包含具有这个截止值的膜的过滤器模块特别适用于浓缩溶解的白蛋白。白蛋白是一种特别有营养价值的蛋白质。提供这种过滤器模块用于细胞悬浮液处理，特别是细菌悬浮液处理也可能是有利的。由于该应用的截止值非常低，在特别高的回收率下确保了可靠和良好的分离。根据EN ISO 8637:2014通过筛分系数测量来确定过滤器的截止值。因此，在本申请的上下文中，截止值应理解为对白蛋白实现0.01的筛分系数(64KDa)。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第一输送步骤中以至少200ml/min、优选至少250ml/min、优选至少300ml/min、优选至少350ml/min、优选至少400ml/min、优选至少450ml/min且小于700ml/min、优选小于650ml/min、优选小于600ml/min、优选小于550ml/min、优选在200至700ml/min之间、或在300至600ml/min之间、或在350至550ml/min之间、或在400至550ml/min之间、或在450至550ml/min之间的流率将蛋白质悬浮液输送到保留腔室。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第二输送步骤中以至少100ml/min、优选125ml/min且小于200ml/min、优选175ml/min的流率或以150ml/min的流率将冲洗流体从至少一个第一冲洗流体的源输送到滤出液腔室和将冲洗流体从所述至少一个第一冲洗流体的源或另一个冲洗流体的输送到过滤器模块的保留腔室。这种流率选择能够提供特别有利的条件，特别是当使用有效表面积为1.0至2.5m²的中空纤维过滤器时。这种过滤器在市场上特别容易获得。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第一输送步骤之前用冲洗流体冲洗过滤器模块。在该前述冲洗步骤中，清除过滤器模块的污染，否则可能会降低在第二输送步骤回收含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质过程中回收的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的结果。此外，冲洗流体使膜湿润。湿润能够使膜保留足够量的内毒素。在冲洗步骤中，无菌水通过过滤器模块上的第一流体通路被输送到保留腔室。保留腔室上的第二流体通路被相对于液体阻塞，使得进入保留腔室的无菌水穿过膜壁进入滤出液腔室，并经由流体通路被引导走滤出液腔室。可以提供用无菌水单独冲洗滤出液腔室和保留腔室，以提高过滤器模块的脱气。

在另一个实施例中，本发明的方法的特征在于，在第一输送步骤之后和第二输送步骤之前，用冲洗流体冲洗从含蛋白质悬浮液或溶液的源到过滤器模块处的至少一个第一通路的流体管线，以便将残余的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质从保留腔室中输送出流体管线。从流体管线中冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质可以提高回收。

本发明的第二方面涉及前述本发明的方法用于净化载体流体中含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的含蛋白质悬浮液或溶液的用途。所讨论的含蛋白质悬浮液或溶液可能含有不希望的杂质，阻碍了通过分析或细胞培养等方式进行进一步处理。特别地，这种杂质可以通过膜过滤在第一输送步骤中去除。在适用的情况下，可以通过相应体积的冲洗流体置换过滤后的载体流体，从而可以从反冲洗流体中以被清理的形式获得所使用的含蛋白质悬浮液或溶液的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质。

在第三方面，本发明涉及前述本发明的方法用于浓缩载体流体中含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的含蛋白质悬浮液或溶液的用途。特别令人感兴趣的是浓缩载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质，以便于进一步处理，例如分析或细胞培养。特别地，通过在第二输送步骤中用较少量的冲洗流体抵消在第一输送步骤中过滤的载体流体，可以浓缩含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质，使得含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质在反冲洗流体中比在所使用的含蛋白质液体中更高度浓缩。

附图说明

图1示出了依照根据本发明的方法的第一输送步骤在过滤器模块中过滤含蛋白质悬浮液或溶液的过滤系统。

图2示出了依照根据本发明的方法的第二输送步骤从过滤器模块反冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗系统。

图3示出了根据非本发明的方法的用于从过滤器模块反冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗系统。

图4示出了根据另一非本发明的方法的用于反冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗系统。

具体实施方式

图1中示意性示出的过滤系统1用于在本发明的方法的第一输送步骤中过滤含蛋白质悬浮液或溶液，该过滤系统1包括过滤器模块100，该过滤器模块100具有图1中未示出的保留腔室和滤出液腔室。所示的流体通路101A和101B在此形成到保留腔室和滤出液腔室的入口。所示的流体通路102A和102B形成到滤出液腔室的流体通路。在所示的图示中，滤出液腔室上的第一流体通路102A和保留腔室上的第二流体通路101B被阻挡装置B1和B2阻塞，从而不会被流体渗透。保留腔室上的第一流体通路通过流体管线154连接到泵装置140。示意性地示出了具有两个滚子的蠕动软管滚子泵作为所述泵装置。同样替代地，具有三个滚子的软管滚子泵、膜泵、齿轮泵或例如叶轮泵可用于第一输送步骤的过滤。这种泵特别适用，因为对含蛋白质悬浮液或溶液中的含蛋白质颗粒没有或仅有轻微的降级。在该图示中，用箭头F1表示泵装置140依照旋转方向D1的输送方向。泵装置140通过流体管线151连接到含蛋白质悬浮液或溶液110的源。在所示的图示中，源是存储一定体积的用于抽出的含蛋白质悬浮液或溶液液体的蓄存器。连接在过滤器模块100的滤出液腔室处的第二流体通路102B通过流体管线157连接到蓄存器160，该蓄存器160被设置用于接收在第一输送步骤产生的滤出液。

图2示出了根据本发明的方法的第二输送步骤将蛋白质颗粒反冲洗出过滤器模块的示意性反冲洗系统2。图2示出了过滤器模块100，该过滤器模块100在第一输送步骤之后连接到系统2的构件，以便通过“前向冲洗”和“反向过滤”实现对过滤器模块的反冲洗。图2示出了连接到过滤器模块100的保留腔室的第一流体通路101A和第二流体通路101B。所示的流体通路102A和102B连接到过滤器模块100的滤出液腔室，这在图中未示出。在保留腔室处的第一流体通路101A经由流体管线154连接到泵装置141。如图所示，示意图中示出了具有三个滚子的蠕动软管滚子泵作为泵装置。软管滚子泵141还通过流体管线152连接到冲洗流体的源120。储存用于进一步抽取的某一液体体积的冲洗流体的蓄存器在所示图示中用作所述源。软管滚子泵141还经由流体管线153连接到冲洗流体的另一源130。另一源同样是存储用于进一步抽取的某一液体体积的冲洗流体的蓄存器。软管滚子泵141经由流体管线155连接到与过滤器模块100的滤出液腔室连接的流体通路102A、102B。流体管线具有分支点155A，在该分支点处，供给到流体管线155中的冲洗流体被分配到流体通路102A和102B。根据所使用的软管滚子泵的旋转方向D1来实现冲洗流体从源120和130到过滤器模块100的输送方向F1。在所示的图示中，从冲洗流体的源120、130通向过滤器模块的流体管线与泵装置连接。在此，两个软管段S1和S2通过相应的流体管线152、153与冲洗流体的源120、130连接，并与软管滚子泵接合。“接合”在此是指软管滚子泵的滚子可以在蠕动输送的意义上压缩软管段S1和S2，并迫使冲洗流体朝向过滤器模块100流动。软管滚子泵141的转子142具有三个滚子143。在另一个实施例中，可以设置软管滚子泵141的软管段S1和S2以及滚子143，使得一个相应的滚子与软管段S1或S2中的一个接合，而另外两个滚子在泵操作期间基本上不与软管段接合。在该实施例中，经由流体管线154和155在保留腔室和滤出液腔室中交替产生压力脉冲，从而可以提高含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的回收。在流体通路101B处与冲洗流体一起退出的含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体经由流体管线156被收集在样本蓄存器170中。

图3示出了用于根据比较性的方法的输送步骤从过滤器模块反冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗系统3的示意图。图3示出了过滤器模块100，该过滤器模块100在第一输送步骤之后连接到系统3的构件，以便通过“前向冲洗”实现对过滤器模块的反冲洗。图3还示出第一流体通路101A和第二流体通路101B连接到过滤器模块100的保留腔室(未示出)。所描述的流体通路102A和102B连接到过滤器模块100的滤出液腔室，这在图中未示出。保留腔室上的第一流体通路101A经由流体管线154连接到泵装置140。在所示的示意图中，示出了具有两个滚子的蠕动软管滚子泵作为泵装置。泵装置还通过流体管线152连接到冲洗流体的源120。储存用于进一步抽取的某一液体体积的冲洗流体的蓄存器在所示图示中用作所述源。在此，软管滚子泵的旋转方向D1将冲洗流体沿输送方向F1从源120输送到第一流体通路101A而进入过滤器模块100的保留腔室中。连接在过滤器模块100的滤出液腔室处的流体通路102A、102B被阻挡装置B1和B3阻塞，因此不会被流体渗透。包含在流体通路101B处与冲洗流体一起退出的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体经由流体管线156被收集在样本蓄存器170中。

图4示出了用于根据比较性的方法的输送步骤从过滤器模块100反冲洗含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗系统4的示意图。图4示出了过滤器模块100，该过滤器模块100在第一输送步骤之后连接到系统4的构件，以便通过“反过滤”实现对过滤器模块的反冲洗。图4还示出第一流体通路101A和第二流体通路101B连接到过滤器模块100的未示出的保留腔室。所示的流体通路102A和102B连接到过滤器模块100的滤出液腔室，这在图中未示出。在所示的示意图中，示出了具有三个滚子的蠕动软管滚子泵作为泵装置141。此外，流体管线152和153从冲洗流体的源120通向软管段S1和S2。软管段彼此相反布置在软管滚子泵141上。在此，流体管线153和152连接到软管段S1和S2，以使得能够按照输送方向F1将冲洗流体从冲洗流体的源输送到软管滚子泵，然后进一步输送到过滤器模块。流体管线152A和153A连接到软管滚子泵141上的软管段S1和S2，并汇合成一条流体管线155。两条流体管线分别从分支点155A通向过滤器模块100的相应的第一流体通路102A和第二流体通路102B，使得冲洗流体可以被输送到过滤器模块的滤出液腔室。该系统还包括从过滤器模块的流体通路101A和101b通向样本蓄存器170的流体管线156A和156B。这样，冲洗流体可以经由反过滤从滤出液腔室穿过膜壁进入保留腔室，并可作为含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体被捕获在样本蓄存器中。

本发明参考示例的描述

示例1

通过将8升过滤后的无菌水加入含有10⁵CFU/ml大肠杆菌的40ml细菌悬浮液中制备含蛋白质悬浮液。CFU单位代表“集落形成单位”，因此可以通过已知的细胞培养方法确定活细胞的数量。依照图1的过滤系统通过用过滤后的无菌水对系统进行“死端”冲洗而准备。所用过滤器模块为德国费森尤斯医疗保健公司生产的HF80S型中空纤维膜过滤器。HF80S过滤器在肾脏替代治疗中用作透析器，对低分子物质的透过率高，对分子量为64kDa的诸如白蛋白等物质的保留率高。过滤器的截止值小于64kDa。这意味着具有诸如白蛋白或更大分子量的溶解分子、例如细菌、细胞和微囊被可靠地保留。具有纤维的内腔的过滤器的有效表面积为1.8m²。随后切换系统的阻塞装置B1、B2，使得滤出液腔室和保留腔室中的每一个都被单独冲洗，直到整个系统充满冲洗流体并且没有气穴。此后，在产生的大约2升的大肠杆菌悬浮液的初始组分中测定大肠杆菌的浓度。然后，根据图1中所示的过滤系统，依照“死端”过滤对初始组分进行过滤，并记录过滤后的大肠杆菌悬浮液体积。随后用冲洗流体冲洗通向中空纤维膜过滤器的流体管线，以便将剩余的大肠杆菌从管路中输送出来而进入过滤器的保留腔室。大肠杆菌悬浮液和冲洗流体以500ml/min的流动速率输送。

在相同的过程条件下，再用两个相同型号的HF80S型中空纤维膜过滤器过滤大肠杆菌悬浮液。这样就得到了3个中空纤维膜过滤器，它们在保留腔室中装载了大致相同数量的大肠杆菌。表1记录了初始组分的相应被过滤的体积、相应初始组分中的大肠杆菌浓度以及计算的相应中空纤维膜过滤器装载的大肠杆菌数量。

表1

中空纤维膜过滤器从过滤系统中无污染地移除，并用于集成到根据图2至图4的反冲洗系统中。

示例2

示例1下装有大肠杆菌的1号中空纤维膜过滤器被集成到根据图2的反冲洗系统中。软管滚子泵将冲洗流体泵入保留腔室和滤出液腔室的输送速率为150ml/min。由于依照反冲洗系统的软管滚子泵与两个软管段接合，因此向过滤器模块提供的冲洗流体的总容量达到300ml/min。利用具有三个滚子和两个软管段的软管泵转子，实现了保留腔室和滤出液腔室的同时反冲洗，尽管是以交替的脉动压力比进行的。然后用含有0.8％(重量)食盐和0.1％(重量)TWEE(吐温)80的溶液进行反冲洗。反冲洗本身以五个步骤进行，其中，前三个反冲洗步骤使用100ml的冲洗流体体积，而第四个反冲洗步骤使用200ml的冲洗流体体积。然后使用大约200ml的体积进行最后的冲洗步骤。含有大肠杆菌的反冲洗流体收集在样本蓄存器中。从大肠杆菌的准确体积、数量、浓度以及回收率方面对样本进行分析。表2记录了结果。

比较性示例1

示例1下装有大肠杆菌的2号中空纤维膜过滤器被集成到根据图3的反冲洗系统中。软管滚子泵将冲洗流体输送到保留腔室和滤出液腔室的输送速率为300ml/min。反冲洗溶液是0.8wt％的盐水溶液，其中吐温80为0.1％(重量)。反冲洗本身以四个步骤进行，其中前三个反冲洗步骤使用100ml的冲洗流体体积，而第四个反冲洗步骤使用200ml的冲洗流体体积。然后使用大约200ml的体积进行最后的冲洗步骤。含有大肠杆菌的反冲洗流体收集在样本蓄存器中。相应具有大约100ml和200ml体积的含有大肠杆菌的反冲洗流体的样本收集在样本蓄存器中。从大肠杆菌的准确体积、数量、浓度以及回收率方面对样本进行分析。表2记录了结果。

比较性示例2

示例1下装有大肠杆菌的3号中空纤维膜过滤器被集成到根据图4的反冲洗系统中。软管滚子泵将冲洗流体输送到保留腔室和滤出液腔室的输送速率为150ml/min。反冲洗溶液是0.8wt％的盐水溶液，其中吐温80为0.1％(重量)。由于依照反冲洗系统的软管滚子泵与两个软管段接合，因此向过滤器模块供给的冲洗流体的总容量达到300ml/min。反冲洗本身分为四个步骤，其中前三个反冲洗步骤使用100ml的冲洗流体体积，第四个反冲洗步骤使用200ml的冲洗流体体积。然后使用大约200ml的体积进行最后的冲洗步骤。含有大肠杆菌的反冲洗流体收集在样本蓄存器中。从大肠杆菌的准确体积、数量、浓度以及回收率方面对样本进行分析。表2记录了结果。

表2

结果

样本1至4和最终样本中包含的大肠杆菌总数为：

示例2：2.17×10⁶。

比较性示例1：1.8×10⁶。

比较性示例2：1.5×106。

因此确定的最终回收率为：

示例2：87％。

比较性示例1：65％。

比较性示例2：66％。

表三示出了各自回收率。

表3

依照示例1和比较性示例2的每一次反冲洗的回收率大致处于同一水平。依照示例2的每一次反冲洗的回收率则明显更高。此外，即使在仅200ml的低冲洗体积的情况下也可获得相对较高的回收率。

Claims

1.一种处理含蛋白质悬浮液或溶液的方法，包括以下步骤：

提供过滤器模块(100)，所述过滤器模块(100)具有通过至少一个多孔膜壁而被分为保留腔室和滤出液腔室的内部，其中，保留腔室具有至少一个第一流体通路(101A)和至少一个第二流体通路(101B)，并且滤出液腔室具有至少一个流体通路(102B)，

提供含有悬浮在载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的至少一个含蛋白质悬浮液或溶液的源(110)，其中，所述含蛋白质悬浮液或溶液的源能够通过流体管线(151、154)至少连接到至保留腔室的第一流体通路(101A)，

提供一个或多个冲洗流体的源(120、130)，其中，所述一个或多个冲洗流体的源(120、130)能够通过流体管线(152、153、154、155)至少连接到至保留腔室(101A、101B)的第一或第二流体通路和连接到至滤出液腔室的所述至少一个流体通路(102B)，

提供至少一个泵装置(140、141)，用于通过流体管线泵送含蛋白质悬浮液或溶液以及冲洗流体，

在第一输送步骤中将含蛋白质悬浮液或溶液从所述含蛋白质悬浮液或溶液的源(110)泵入过滤器模块(100)的保留腔室，

使含蛋白质悬浮液或溶液穿过膜壁而被输送到滤出液腔室，

在适用的情况下，经由滤出液腔室的所述至少一个流体通路(102B)排出在滤出液腔室中获得的流体，

其特征在于

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第一输送步骤中，至所述过滤器模块的保留腔室的所述至少一个第二流体通路(101B)被阻塞而不被流体渗透。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，来自所述一个或多个冲洗流体的源(120、130)的冲洗流体在所述第二输送步骤中经由所述至少一个第一流体通路(101A)被泵入过滤器模块的保留腔室，并且含有含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的反冲洗流体经由至保留腔室的第二流体通路(101B)排出。

4.根据权利要求1至3中至少一项所述的方法，其特征在于，所述过滤器模块(100)是中空纤维膜过滤器。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，中空纤维膜的管腔侧形成保留腔室，纤维间隙形成滤出液腔室。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，中空纤维膜具有小于64kDa的分子截止值。

7.根据权利要求1至6中至少一项所述的方法，其特征在于，在第二输送步骤中将冲洗流体从所述一个或多个冲洗流体的源(120、130)输送到过滤器模块的滤出液腔室的操作，

与

将冲洗流体从所述一个或多个冲洗流体的源输送到过滤器模块的保留腔室的操作同时进行。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述冲洗流体以交替脉冲输送到滤出液腔室和保留腔室。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述冲洗流体进入保留腔室和滤出液腔室的流率基本相等。

10.根据权利要求1至9中至少一项所述的方法，其特征在于，所述滤出液腔室包括另一流体通路(102A)，并且在第二输送步骤中，冲洗流体经由所述至少一个第一流体通路(102B)和所述另一流体通路(102A)从一个或多个冲洗流体的源输送到滤出液腔室。

11.根据权利要求1至10中至少一项所述的方法，其特征在于，在第二输送步骤中，冲洗流体以至少100ml/min、优选至少125ml/min且小于200ml/min、优选小于175ml/min、特别是在100ml/min与200ml/min之间、优选在125ml/min与175ml/min之间的流率从所述一个或多个冲洗流体的源(120、130)输送到过滤器模块的滤出液腔室，

和/或

在第二输送步骤中，冲洗流体以至少100ml/min、优选至少125ml/min且小于200ml/min、优选小于175ml/min、特别是在100ml/min与200ml/min之间、优选在125ml/min与175ml/min之间的流率从所述一个或多个冲洗流体的源(120、130)输送到过滤器模块的保留腔室。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，在第一输送步骤之前用冲洗流体冲洗过滤器模块(100)。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，在第一输送步骤与第二输送步骤之间用冲洗流体冲洗从含蛋白质悬浮液或溶液的源(110)到过滤器模块处的所述至少一个第一通路(101A)的流体管线(151、154)，以便将含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质从滤出液腔室中传输出流体管线。

14.一种根据权利要求1至13中至少一项所述的方法用于清理载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的用途。

15.一种根据权利要求1至13中至少一项所述的方法用于浓缩载体流体中的含蛋白质颗粒或溶解的含蛋白质物质的用途。