CN111093623A - 药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其用途 - Google Patents

药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111093623A
CN111093623A CN201780094129.5A CN201780094129A CN111093623A CN 111093623 A CN111093623 A CN 111093623A CN 201780094129 A CN201780094129 A CN 201780094129A CN 111093623 A CN111093623 A CN 111093623A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
peptide
pharmaceutical composition
therapeutic agent
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780094129.5A
Other languages
English (en)
Inventor
L·萨玛特
R·拉贾戈帕兰
A·沙玛
V·卡里亚普鲁马
G·韦尔
M·斯坦福
A·彭威尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immune Vaccine Technology Co
Original Assignee
Immune Vaccine Technology Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immune Vaccine Technology Co filed Critical Immune Vaccine Technology Co
Publication of CN111093623A publication Critical patent/CN111093623A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/07—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开涉及通过使用平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒来制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的方法。本申请还提供稳定的无水药物组合物，其包括具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构、至少一种治疗剂、和疏水载体；以及与之相关的治疗方法、用途和试剂盒，如例如用于诱导抗体和/或CTL免疫响应。

Description

药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其 用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年7月10日提交的美国临时专利申请号62/530,498的权益和优先权，其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本申请涉及用于制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂(dried preparation)的方法、用于制备药物组合物的方法、以及稳定的无水药物组合物，该药物组合物包含具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构、至少一种治疗剂和疏水载体。
背景技术
在药学领域，治疗剂的有效递送通常呈现困难和挑战，特别是在被设计以增强治疗剂功效的新兴递送平台的复杂性方面。对于这些采用独特组分的专用递送平台，出现了常规药物组合物所不存在的新障碍。利用无水疏水载体的递送平台无疑是这种情况。
治疗剂的各种特性使得其在这种递送平台中的掺入是耗时且费力的技术，特别是当必须将多种不同的治疗剂一起配制在单一组合物中时。例如，由于许多治疗剂的高度亲水性或疏水性，涉及在水性溶液和疏水性溶液中进行制备的相继阶段的制造过程为制备药物级制剂带来了独有的障碍。此外，将治疗剂封装在脂质体递送载体中意味着通常需要大小挤出步骤以有效地进行无菌过滤程序从而获得药物级组合物。然而，这些挤出步骤可导致治疗剂从溶液中析出，因此缺乏再现性和/或药学用途可接受的组合物。
这些挑战在需要配制具有多种不同治疗剂的药物组合物时混合起来，如在个性化(personalized)癌症疫苗的情况下。
个性化癌症疫苗可以基于患者特异性新抗原来设计，患者特异性新抗原是通过改变氨基酸编码序列的突变(非同义体细胞突变)而产生的肿瘤特异性抗原。最近，借助测序技术，鉴定个体肿瘤基因组(外显子组)的蛋白质编码部分内存在的突变并从而预测潜在的新抗原已成为可能。然而，基于新抗原的个性化癌症疫苗通常必须在数周内配制以促进免疫接种后的有效免疫响应。时间安排(timing)是至关重要的，并且呈现很大的障碍。首先选择潜力新抗原然后在该群体中选择具有适于配制稳定组合物的特性的肽所涉及的时间就使得该领域的进展困难，在最好的情况下。
为提供适合的治疗，目前正在临床试验中探索的新抗原疫苗在多种制剂中递送了10-30种独特的肽。尽管这种方法减少了选择最适合的新抗原的时间，但在制剂稳定性和/或免疫原性、成本和患者依从性方面仍然存在重大问题。理想地，可以以单一稳定的制剂递送抗原，并且无需费时劳动选择具有等电点、稳定性、溶解度(例如共溶解度)和/或免疫原性相关的特定一组特征的抗原。但是实际上，对于每种肽抗原基于其独特属性而确定一种完美的配制方法是一个费力费时的过程。
因此，仍然需要一种稳健并且时间敏感的制造方法以在稳定并且免疫学有效的药物组合物中配制治疗剂。还仍需要包含多种治疗剂的稳定和有效的药物组合物。
发明内容
在一种实施方式中，本公开涉及制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒(lipid vesicle particles)；(b)将脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂混合以形成混合物；(c)干燥步骤(b)中形成的混合物以形成包含脂质和治疗剂的干燥制剂。
在一种实施方式中，本公开涉及一种制备药物组合物的方法，该方法包括将通过本文所述的方法获得的干燥制剂溶解在疏水载体中。
在一种实施方式中，本公开涉及通过本文公开的方法制备的药物组合物。
在一种实施方式中，本公开涉及稳定的无水药物组合物，其包含具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构、至少一种治疗剂和疏水载体。
在一种实施方式中，本公开涉及稳定的无水的药物组合物，其包含具有单层组装体的一种或多种脂质基结构、五种或更多种不同的肽新抗原、和疏水载体，其中所述肽新抗原不是基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征预选的。
在一种实施方式中，本公开涉及在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的方法，其包括向对象给予如本文所述的药物组合物。
在一种实施方式中，本公开涉及如本文所述的药物组合物用于在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的用途。
在一种实施方式中，本公开涉及用于制备用于诱导抗体和/或CTL免疫响应的药物组合物的试剂盒，该试剂盒包括：包含通过本文所述的方法制备的干燥制剂的容器；以及包含疏水载体的容器。
通过结合附图阅读以下描述，本发明的其它方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
附图说明
附图构成本说明书一部分，仅作为实例示例本发明实施方式：
图1是使用100mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲剂制备的干燥脂质/治疗剂制剂(左图)和在溶解后由其获得的药物组合物(右图)的照片。
图2是使用50mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲剂制备的干燥脂质/治疗剂制剂(左图)和在溶解后由其获得的药物组合物(右图)的照片。
图3是使用50mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲剂制备的另一种干燥脂质/治疗剂制剂(左图)和在溶解后由其获得的药物组合物(右图)的照片。
图4描绘了干燥脂质/治疗剂制剂和在溶解后由其获得的药物组合物的照片。图(A)：大小设定的(sized)脂质囊泡颗粒和rPA抗原，图(B)：大小设定的脂质囊泡颗粒和HIV抗原，图(C)：大小设定的脂质囊泡颗粒和存活蛋白(survivin)抗原，图(D)：大小设定的脂质囊泡颗粒和RSV抗原，图(E)：非大小设定的(non-sized)脂质囊泡颗粒和rPA抗原，图(F)：非大小设定的脂质囊泡颗粒和HIV抗原，图(G)：非大小设定的脂质囊泡颗粒和存活蛋白抗原，图(H)：非大小设定的脂质囊泡颗粒和RSV抗原。
图5描绘了干燥脂质/治疗剂制剂和在溶解后由其获得的药物组合物的照片。图(A)：DOPC/胆固醇大小设定的脂质囊泡颗粒和存活蛋白抗原，图(B)：DOPC/胆固醇大小设定的脂质囊泡颗粒和RSV抗原，图(C)：单独DOPC大小设定的脂质囊泡颗粒和存活蛋白抗原，图(D)：单独DOPC大小设定的脂质囊泡和RSV抗原。
图6是在密封在无菌袋中之前装载在用于冻干的托盘中的大小设定的脂质囊泡颗粒/抗原混合物的无菌填充小瓶的照片。
图7是在准备冻干时装载到两个无菌袋中并密封的图6的无菌填充小瓶的照片。
图8是在用于冻干的Virtis台式冷冻干燥机中的图7的双无菌袋小瓶的照片。
图9是冻干后的塞在Virtis台式冷冻干燥机中的图7的双无菌袋小瓶的照片。
图10是通过无菌袋技术冻干后的五个小瓶以及在溶解后由其获得的药物组合物的一个小瓶的照片。药物组合物是澄清溶液。
图11是使用50mM，pH 6.0的乙酸钠缓冲剂制备的干燥脂质/治疗剂制剂(左图和中图)和在溶解后由其获得的药物组合物(右图)的照片。
图12是显示14种新抗原和A16L T辅助表位的标准样品的HPLC色谱图。
图13是显示冻干前14种新抗原和A16LT辅助表位的HPLC色谱图。
图14是显示冻干后(T＝0)即刻14种新抗原和A16L T辅助表位的HPLC色谱图。
图15是显示冻干后1个月(T＝1M)14种新抗原和A16L T辅助表位的HPLC色谱图。
图16是显示冻干后3个月(T＝3M)14种新抗原和A16LT辅助表位的HPLC色谱图。
图17示例了用在本发明的油基组合物中或在水性制剂中制备的14种不同的新抗原免疫接种的C57BL/6NCrl小鼠的IFN-γELISPOT响应。通过在IFN-γELISPOT板中用同系树突状细胞刺激脾细胞，该同系树突状细胞负载或不负载无关肽或各个体新抗原(Mut17、20、22、24、25、28、29A、29B、30、36、44、45、48、50)，在疫苗接种后八天测量免疫响应。结果显示为平均响应±SEM。统计学分析通过双因素方差分析(2-way ANOVA)进行，Bonferroni事后检验(post test)比较对每种肽的组响应。*p<0.01，*p<0.001。
图18描绘了Montanide ISA 51VG样品的小角度X射线散射(SAXS)图谱。
图19描绘了批次#4c(存活蛋白)样品的SAXS图谱。还显示了批次#4c样品在27.3cm探测器距离处的对距离分布函数(pair distance distribution function)。
图20描述了批次#4a(rPA)样品的SAXS图谱。还显示了批次#4a样品在27.3cm探测器距离处的对距离分布函数。
图21描绘了在MS80油载体中利用DOPC/胆固醇或S100卵磷脂的大小设定的脂质囊泡颗粒制备的药物组合物的照片。图(A)：DOPC/胆固醇大小设定的脂质囊泡颗粒和rPA抗原；图(B)：DOPC/胆固醇大小设定的脂质囊泡颗粒和RSV抗原；图(C)：S100卵磷脂大小设定的脂质囊泡颗粒和RSV抗原；图(D)：S100卵磷脂大小设定的脂质囊泡颗粒和存活蛋白抗原；图(E)：S100卵磷脂大小设定的脂质囊泡颗粒和疟疾抗原；图(F)：S100卵磷脂/胆固醇(10：1w/w)大小设定的脂质囊泡颗粒和HIV抗原。全部均产生澄清溶液。对于使用S100卵磷脂的组合物，溶液的颜色为浅黄色，因为S100材料是黄色的。
图22是使用DOPC/胆固醇的大小设定的脂质囊泡颗粒和小分子治疗剂环磷酰胺制备的干燥脂质/治疗剂制剂的照片(左图)；以及溶解后由其获得的药物组合物(右图)。干燥的制剂具有良好的外观，在于其干燥，白色且不塌陷。由其获得的组合物是澄清至微浑浊的溶液。
具体实施方式
本发明涉及制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的有利方法，以及由此制备的药物组合物。本公开的方法避免了费时的处理步骤，并允许快速生产包含多种治疗剂的药物组合物，这被认为是特别有用的，例如在涉及肽抗原(例如患者特异性新抗原)的个性化癌症疫苗的情况下。
制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法
在一种实施方式中，本发明涉及制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒；(b)将脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂混合以形成混合物；(c)干燥步骤(b)中形成的混合物以形成包含脂质和治疗剂的干燥制剂。方法步骤将以此特定顺序进行，但是方法可以包括其它步骤，如但不限于本文所述的那些步骤。
如本文所用，术语“脂质囊泡颗粒”可以与“脂质囊泡”互换使用。脂质囊泡颗粒是指具有通过连续包封脂质层与外部环境隔离的内部环境的复合物或结构。在本公开的环境(reverse micelle)中，表述“包封脂质层”可以表示单层脂质膜(例如在胶团(micelle)或反胶团上发现)、双层脂质膜(例如在脂质体上发现)或由单和/或双层脂质膜形成的任何多层膜。包封脂质层通常在其整个圆周上是单层、双层或多层，但是考虑其它构象可以是可能的，使得该层其圆周上具有不同的构型。脂质囊泡颗粒可以在其内部环境中包含其它囊泡结构(即，其可以是多囊的)。
术语“脂质囊泡颗粒”包括多种不同类型的结构，包括但不限于胶团、反胶团、单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体，只要满足本文所述的颗粒大小限制(即平均颗粒大小≤120nm和PDI≤0.1)。
取决于归属于脂质纳米颗粒的定义，本公开的脂质囊泡颗粒可以与脂质纳米颗粒同义。然而，在本领域中关于术语“脂质纳米颗粒”的含义存在差异观点。一种观点是脂质纳米颗粒是指由脂质膜形成的任何纳米大小的颗粒(即，具有在1纳米至1000纳米之间的直径)。另一观点是，纳米颗粒材料的大小阈值限制在1纳米至100纳米之间。此后者定义不包括本公开所涵盖的脂质囊泡大小(例如，脂质囊泡颗粒大小>100nm)，并且在此程度上与本公开中使用的术语“脂质囊泡颗粒”不一致。
脂质囊泡颗粒可以呈现各种不同的形状，并且该形状可以在任何给定时间(例如，在干燥后)改变。通常，脂质囊泡颗粒是球形或基本上球形的结构。“基本上球形”是指脂质囊泡接近球形，但可以不是完美球形。脂质囊泡颗粒的其它形状包括但不限于椭圆形、长方椭圆形(oblong)、正方形、矩形、三角形、长方体、新月形、菱形、圆柱体或半球形状。可以形成任何规则或不规则形状。此外，如果单个脂质囊泡颗粒是多囊的，则其可以包括不同的形状。例如，外部囊泡形状可以是长方椭圆形或矩形的，而内部囊泡形状可以是球形的。
脂质囊泡颗粒由单层脂质膜、双层脂质膜和/或多层脂质膜形成。脂质膜主要由脂质构成和形成，但也可以包含其它组分。例如但非限制，脂质膜可包括稳定化分子以帮助维持脂质囊泡颗粒的大小和/或形状。可以使用本领域已知的任何稳定化分子，只要其不负面影响脂质囊泡颗粒用于本公开方法的能力。
术语“脂质”在本领域中具有其通用含义，在于其是可溶于非极性溶剂但总体上不溶于极性溶剂(例如水)的任何有机物质或化合物。脂质是各种各样的化合物，包括但不限于脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素、甘油单酸酯、甘油二酸酯、甘油三酸酯和磷脂。对于本文的脂质囊泡颗粒，可以使用任何脂质，只要其是成膜脂质。“成膜脂质”是指该脂质单独或与其它脂质和/或稳定化分子一起能够形成脂质囊泡颗粒的脂质膜。脂质囊泡颗粒可包含单一类型的脂质或两种或更多种不同类型的脂质。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的一种或多种脂质为两亲脂质，意味着其同时具有亲水和疏水(亲脂)特性。
尽管可以使用如上定义的任何脂质，但是特别适合的脂质可以包括具有至少一个包含至少4个碳并且一般约4至28个碳的脂肪酸链的那些。脂肪酸链可以包含任何数量的饱和和/或不饱和键。脂质可以是天然脂质或合成脂质。脂质的非限制性实例可包括磷脂、鞘脂、鞘磷脂、脑苷脂(cerobrocides)、神经节苷脂、醚脂质、固醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)和其它聚合物改性的脂质。合成脂质可包括但不限于以下脂肪酸成分：月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基、油酰基、亚油酰基、芥酰基或这些脂肪酸的组合。
在一种实施方式中，脂质是磷脂或磷脂混合物。广义地限定，“磷脂”是在水解时产生磷酸、醇、脂肪酸和含氮碱的一组脂质化合物的成员。
可以使用的磷脂包括但不限于例如具有选自磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸胆碱(DOPC；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和磷酸肌醇的至少一种头基(headgroup)的那些。在一种实施方式中，磷脂可以是磷脂酰胆碱或包含磷脂酰胆碱的脂质混合物。在一种实施方式中，脂质可以是DOPC(Lipoid GmbH，德国)或Lipoid S100卵磷脂。在一些实施方式中，可以使用DOPC和未酯化胆固醇的混合物。在其它实施方式中，可以使用脂质S100卵磷脂和未酯化胆固醇的混合物。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒包含合成脂质。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒包含合成的DOPC。在另一实施方式中，脂质囊泡颗粒包含合成的DOPC和胆固醇。
当使用胆固醇时，可以使用任何足以稳定化脂质膜中的脂质的量的胆固醇。在一种实施方式中，可以以相当于磷脂重量的约10％的量使用胆固醇(例如，以10∶1w/w的DOPC：胆固醇比)。胆固醇可以稳定化磷脂囊泡颗粒的形成。如果使用胆固醇以外的化合物，本领域技术人员可以容易地确定所需的量。
在一种实施方式中，本文公开的组合物包含约120mg/ml的DOPC和约12mg/ml的胆固醇。
另一种常见的磷脂是鞘磷脂。鞘磷脂含有鞘氨醇，一种具有长不饱和烃链的氨基醇。脂肪酰基侧链通过酰胺键与鞘氨醇的氨基连接，形成神经酰胺。鞘氨醇的羟基被酯化为磷酸胆碱。像磷酸甘油酯一样，鞘磷脂是两亲性的。
卵磷脂，也可以被使用，是天然磷脂混合物，通常源自鸡蛋、羊毛、大豆和其它植物来源。
这些和其它磷脂全部都可用于实施本发明。磷脂可以例如购自Avantil lipids(Alabastar，AL，USA)、Lipoid LLC(Newark，NJ，USA)和Lipoid GmbH(德国)等各种供应商。
脂质囊泡颗粒是封闭的囊泡结构。其通常为球形形状，但是其它形状和构型可以被形成并且不被排除。脂质囊泡颗粒的示例性实施方式包括但不限于单层囊泡结构(例如，胶团)和双层囊泡结构(例如，单层或多层囊泡)或其各种组合。
“单层”是指脂质不形成双层，而是存留在一层中，其中疏水部分朝向一侧而亲水部分朝向相反侧。“双层”是指脂质形成两层片材，一般各层的疏水部分内部朝向双层的中心，而亲水部分朝向外部。然而，相反的构型也是可能的。术语“多层”意为包括单层和双层结构的任何组合。采用的形式可以取决于所使用的具体脂质。而且，在本文的方法中使用的形式将取决于本公开的方法的大小限制，即，平均颗粒大小≤120nm和PDI≤0.1。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒是双层囊泡结构，如例如脂质体。脂质体是完全封闭的脂质双层膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单个双层膜)、多层囊泡(以多层膜为特征，其中每个双层可以或可以不通过水层与下一层隔离)或多囊囊泡(在囊泡中具有一个或多个囊泡)。脂质体的一般讨论可以在Gregoriadis 1990；和Frezard，1999中找到。
因此，在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒是脂质体。在一种实施方式中，脂质体是单层的、多层的、多囊的或其混合物。在一种实施方式中，脂质体的平均颗粒大小为≥80nm。因此，在一种实施方式中，本文公开的方法中使用的脂质体的平均颗粒大小在80nm至120nm的范围内，并且PDI≤0.1。
本文公开的方法需要使用平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒。
如本文所用，“平均值”是指给定群体中脂质囊泡颗粒的颗粒大小的算术平均值。其是平均值的同义词。因此，“平均颗粒大小”意图指代群体中各脂质囊泡颗粒直径的总和除以该群体中的脂质囊泡颗粒总数(例如，在具有颗粒大小为95nm、98nm、102nm和99nm的4个脂质囊泡颗粒的群体中，平均颗粒大小为(95+98+102+99)/4＝98.5nm)。然而，技术人员将理解，脂质囊泡颗粒可以不是完美球形的，因此给定囊泡颗粒的“颗粒大小”可以不是其直径的精确度量。而是，可以通过本领域中已知的其它方式来限定颗粒大小，包括例如：面积相等的球的直径或接触颗粒的相反侧的平行切线之间的最大垂直距离(Feret统计学直径)。
有多种技术、仪器和服务可利用以测量脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小，如电子显微术(透射TEM或扫描SEM)、原子力显微术(AFM)、傅立叶变换红外光谱法(FTIR)、X射线光电子光谱法(XPS)、粉末X射线衍射(XRD)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、核磁共振(NMR)和动态光散射(DLS)。DLS是一种用于测量亚微米大小范围内的颗粒大小的成熟技术，测量小于1nm的颗粒大小的可用技术(LS Instruments，CH；MalvernInstruments，UK)。
在一种实施方式中，≤120的平均颗粒大小通过适于测量脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小的任何仪器和/或机器来测量，如通过上述方法。
在本文公开的方法的实施方式中，平均颗粒大小通过DLS(Malvern Instruments，UK)来确定。
在一种实施方式中，≤120的平均颗粒大小通过DLS利用Malvern Zetasizer系列仪器，如例如Zetasizer Nano S、Zetasizer APS、ZetasizerμV或Zetasizer AT机器(Malvern Instruments，英国)来测量。在一种实施方式中，使用Malvern Zetasizer NanoS机器通过DLS测量≤120的平均颗粒大小。示例性条件和系统设置可包括：
分散剂名称：0.006％NaCl
分散剂RI：1.330
粘度(cP)：0.8872
温度(℃)：25.0
使用时间(s)：60
计数速率(kcps)：200-400
测量位置(mm)：4.65
单元(池，cell)描述：可抛弃型大小测量皿
衰减因子：7
在本文的方法中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小小于或等于120纳米(即≤120nm)，多分散指数(PDI)≤0.1。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小≤115nm，更具体地还≤110nm，更具体地还≤100nm。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在50nm至120nm之间。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在80nm至120nm之间。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在约80nm至约115nm、约85nm至约115nm、约90nm至约115nm、约95nm至约115nm、约100nm至约115nm或约105nm至约115nm。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小为约80nm、约81nm、约82nm、约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm、约88nm、约89nm、约90nm、约91nm、约92nm、约93nm、约94nm、约95nm、约96nm、约97nm、约98nm、约99nm、约100nm、约101nm、约102nm、约103nm、约104nm、约105nm、约106nm、约107nm、约108nm、约109nm、约110nm、约111nm、约112nm、约113nm、约114nm、约115nm、约116nm、约117nm、约118nm或约119nm。在一种实施方式中，平均颗粒大小为120nm。
如贯穿本文所用，术语“约”是指合理地接近。例如，“约”可以表示在本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受标准偏差和/或可接受误差范围内，其将取决于该具体值如何测量。此外，当表示整数时，约可以指代整数任一侧的十进制值。当在范围环境中使用时，术语“约”涵盖范围一端的一个具体值和范围另一端的另一具体值之间的所有示例性数值，以及超出各端的合理接近的值。
关于平均颗粒大小，术语“约”用于表示±2.0nm的偏差，只要其不会引起平均颗粒大小超过120nm。同样，术语“约”是指涵盖所示平均颗粒大小的任何十进制数。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在约105nm至约115nm之间，如例如当脂质囊泡颗粒由DOPC/胆固醇(10∶1w∶w)形成时。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在约90nm至约100nm之间，如例如当脂质囊泡颗粒仅由DOPC形成时。
如本文所用，多分散指数(PDI)是脂质囊泡颗粒的大小分布的度量。在本领域中已知术语“多分散性”可以与“分散性”互换使用。可以通过确定脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小和该颗粒大小的标准偏差来计算PDI。有技术和仪器可用于测量脂质囊泡颗粒的PDI。例如，DLS是一种用于测量亚微米大小范围内的颗粒的颗粒大小和颗粒大小分布的成熟技术，测量小于1nm的颗粒大小的可用技术(LS instruments，CH；Malverninstruments，UK)。
对于完全均匀的样品，PDI为0.0。本文公开的方法需要PDI≤0.1，其属于“单分散”类别。
在一种实施方式中，通过适于测量脂质囊泡颗粒的PDI的任何仪器和/或机器来测量≤0.1的PDI。
在一种实施方式中，PDI大小分布由DLS((Malvern Instruments，UK)。
在一种实施方式中，使用MalvernZetasizer系列仪器，如例如Zetasizer Nano S、Zetasizer APS、ZetasizerμV或Zetasizer AT机器(Malvern Instruments，UK)通过DLS测量≤0.1的PDI。在一种实施方式中，使用Malvern Zetasizer Nano S机器通过DLS测量≤0.1的PDI。示例性条件和系统设置如上关于确定平均颗粒大小所述。
脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小小于120nm并且PDI小于0.1的要求意味着给定群体中一些脂质囊泡颗粒的颗粒大小大于120nm是可能的。这是可以接受的，只要平均颗粒大小保持≤120nm并且PDI保持≤0.1。如实施例2所示，大小设定以满足这些规格的脂质囊泡颗粒比非大小设定的脂质囊泡颗粒在获得适于后续在疏水载体中溶解的干燥脂质/治疗剂制剂的方面具有优势(即在获得澄清溶液方面)。
本文包括的平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒可以通过任何适合的方式制备和提供。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒以其大小受控的方式被制备，以实现≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI。在一种实施方式中，对脂质囊泡颗粒进行一个或多个大小设定步骤或方案以实现≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI。在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒可以通过在制造过程中控制其大小、进行大小设定步骤和/或本领域可获得的任何其它手段的任何组合来制备和提供。
在一种实施方式中，脂质囊泡颗粒必须经历一个或多个活性大小设定步骤，以实现≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI。在一种实施方式中，大小设定通过过滤挤出进行，其中使脂质囊泡颗粒经过具有适当孔径的过滤膜或一系列过滤膜(例如聚碳酸酯膜)。
由此，如本文所用，“大小设定的脂质囊泡颗粒”是指通过以下方式制备的脂质囊泡颗粒：其中其大小被控制以达到≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI和/或其被设定大小以满足平均颗粒大小≤120nm和PDI≤0.1的标准。技术人员将充分了解可用于提供平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒的技术。本文中“非大小设定的脂质囊泡颗粒”或“非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂”的提及是指该脂质囊泡颗粒没有经过限制其大小以满足限定大小标准的程序，和/或其不具有≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI。
在一种实施方式中，大小设定的脂质囊泡颗粒可以由天然形成所需大小的脂质囊泡颗粒的脂质前体来制备。例如但不限于，可以使用
Figure BDA0002388629480000091
(Nippon Fine Chemical，日本)制备大小设定的脂质囊泡颗粒。
Figure BDA0002388629480000092
是由不同脂质组合构成的干燥粉末前体。
Figure BDA0002388629480000093
被提供以备在适合的缓冲剂中润湿以制备脂质体。由
Figure BDA0002388629480000094
形成的脂质体的平均颗粒大小为约93nm，并且可以使用大小设定程序(例如膜挤出、高压均质化等)实现所需的平均颗粒大小≤120nm和PDI≤0.1。在一种实施方式中，
Figure BDA0002388629480000095
可以例如在pH9.0±0.5的乙酸钠中润湿以形成脂质体。在一种实施方式中，
Figure BDA0002388629480000096
散装干燥粉末可以由DOPC/胆固醇(10：1(w/w))或单独DOPC制成。
在另一实施方式中，可以采用用于制备任何大小的脂质囊泡颗粒的标准程序。例如，可以使用常规脂质体形成方法，如溶剂溶解的脂质的水合。制备脂质体的示例性方法被论述于例如Gregoriadis 1990；和Frezard，1999中。在制备脂质囊泡颗粒之后，对非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂进行大小设定程序，以获得平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒。有多种技术可用于进行脂质囊泡颗粒大小设定(参见例如Akbarzadeh 2013)。例如，在一种实施方式中，可以通过高压均质化(微流化器)、超声处理或基于膜的挤出对非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂进行大小设定。
在一种实施方式中，可以通过以下来制备大小设定的脂质囊泡颗粒：将脂质添加至适合的溶剂(例如磷酸钠，50mM，pH 7.0)中，摇动和/或搅拌脂质混合物(例如，300RPM，约1小时)，并利用基于膜的挤出而获得大小设定的脂质囊泡颗粒。基于膜的挤出的示例性非限制性实施方式包括：(i)使非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂通过0.2μm聚碳酸酯膜20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10-20次；或(ii)使非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂通过0.2μm聚碳酸酯膜20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10-20次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜10-20次。
在具体的实施方式中，可以通过以下来进行大小设定：使非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次。在另一个具体实施方式中，可以通过以下来进行大小设定：使非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜15次。
在步骤(a)的实施方式中，可以在适合的溶剂中提供大小设定的脂质囊泡颗粒，以与溶解的治疗剂混合。溶剂可以是用于溶解治疗剂的相同溶剂，或不同的相容性溶剂。“相容性”是指在步骤(b)的混合过程中该溶剂不会引起溶解的治疗剂从溶液析出。可选地，在另一实施方式中，大小设定的脂质囊泡颗粒可以以脱水形式被提供，并通过添加包含溶解的治疗剂的溶液而被重悬。
根据本公开的方法，在步骤(b)中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂混合以形成混合物。
如本文所用，术语“治疗剂”是能够在疾病、障碍或病症的治疗或预防中提供治疗活性、响应或作用的任何分子、物质或化合物，包括诊断剂和预防剂。如本文其它部分所述，术语“治疗剂”不包括或涵盖T辅助表位或佐剂，其在本说明书中被单独描述并且是本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒中可以包括或不包括的不同组分。
在一种实施方式中，治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸(例如mRNA)、激素、细胞因子、变应原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA(例如siRNA或miRNA)、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
在一种实施方式中，本文公开的方法用于在组合物中配制单一类型的治疗剂。在另一实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制多种不同治疗剂的混合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同的治疗剂。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制10-20种不同治疗剂的混合物。
在具体实施方式中，治疗剂是一种或多种本文所述的肽抗原。在一种实施方式中，肽抗原是合成产生的多肽。
肽抗原可以是任何长度的多肽。在一种实施方式中，肽抗原可以为5至120个氨基酸的长度，5至100个氨基酸的长度，5至75个氨基酸的长度，5至50个氨基酸的长度，或5至30个氨基酸的长度。在一种实施方式中，肽抗原可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的长度。
在一种实施方式中，肽抗原的长度为20至30个氨基酸。在一种实施方式中，肽抗原的长度为27个氨基酸。
在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与单一的溶解的肽抗原混合。在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与上至30种或更多种不同的溶解肽抗原混合。
在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与两种或更多种不同的溶解肽抗原混合。在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同的溶解肽抗原混合。在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与2至30种不同的溶解肽抗原、5至30种不同的溶解肽抗原、10至20种不同的溶解肽抗原、或10至15种不同的溶解肽抗原混合。在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与五种或更多种不同的溶解肽抗原混合。在一种实施方式中，将大小设定的脂质囊泡颗粒与10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的溶解肽抗原混合。
在一种实施方式中，所述一种或多种肽抗原是如本文所述的新抗原。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制多种不同新抗原的混合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同的新抗原。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制10至20种不同的新抗原的混合物。在一种实施方式中，不同的新抗原各为20至30个氨基酸的长度。
下文描述了可用于本文公开的方法的实践的治疗剂的其它示例性实施方式，但非限制。
本公开的方法允许多种不同的治疗剂配制在单一药物组合物中。在一种实施方式中，治疗剂可以具有等电点、溶解度(例如，共溶解度)、稳定性和/或免疫原性相关的不同特征，并且不需要基于这些特征来预选以在公开的方法中相容。在具体实施方式中，治疗剂是肽抗原，如新抗原。由此，在一种实施方式中，肽抗原不需要经历宽泛肽选择步骤以确定在本公开的方法中的适用性或以确定与其它肽抗原的相容性(例如共溶解性)。更具体地，在一种实施方式中，不需要基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征来预选肽抗原。
如本文所用，“等电点”在本领域中具有其普通含义，在于其指代具体分子(例如治疗剂)不携带净电荷时的pH。等电点(pi)值可影响分子在给定pH下的溶解度。例如，构成多肽/蛋白质的氨基酸本质上可以是阳性、阴性、中性或极性的，并且整体使多肽/蛋白质具有其总电荷。在其pi以下的pH时，多肽/蛋白质携带净正电荷，而在其pi以上时其携带净负电荷。因此，在药物组合物的制剂，如基于肽的制剂中，PI通常是重要的考虑因素。已经开发出许多用于估测等电点的算法，其中大多数使用Henderson-Hasselbalch方程和不同的pK值。
如本文所用，“溶解度”在本领域中具有其普通含义，在于其指代物质溶解在溶剂中的能力。物质的溶解度从根本上取决于物质和溶剂的物理和化学性质以及溶液的温度、压力和pH。可以就平衡时溶解在溶剂中的物质最大量而言测量溶解度。
如本文所用，“稳定性”是指物质在限定或合理预期的条件下随时间保持不变的能力。像溶解度一样，物质的稳定性从根本上取决于物质的物理和化学性质以及其所处的环境。可以就降解、聚集和/或错误折叠(misfolding)而言测量稳定性。
如本文所用，“免疫原性”是指诸如抗原或表位的具体物质在对象(例如人)的体内激发免疫响应的能力。在一种实施方式中，免疫原性是诱导体液(抗体)和/或细胞介导的(CTL)免疫响应的能力。本领域已知许多用于测量免疫原性的体外和体内技术，包括涉及酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点测定(ELISPOT)的技术。
如本文所用，“等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的特征”是指治疗剂的可与其等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何物理或化学性质。例如但不限于，就肽抗原而言，这种特征可包括肽长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。这些特征可以是关于肽抗原整体或其所包含的氨基酸。注意，考虑这些特征中的一个或多个在治疗剂正常工作过程中可以被观察或确定。然而，本文公开的方法的一个优点在于，无需预先确定这些性质以制备适合的干燥脂质/治疗剂制剂。
在一种实施方式中，本文公开的方法中使用的不同的溶解的治疗剂具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一个或多个不同的特征。
在一种实施方式中，在本文公开的方法中使用的不同的溶解治疗剂具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。在本文公开的方法中使用多种不同治疗剂的情况下，这些差异(不同，differences)可以就任一种或多种治疗剂之间的比较而言，并且多种治疗剂作为整体可以具有差异的任何组合。
如本文所用，“溶解的治疗剂”是指治疗剂溶解在溶剂中。在一种实施方式中，这可以由肉眼通过观察澄清溶液而视觉确定。浑浊的溶液表示不溶解，并且对于本文公开的方法不是期望的，因为这对于在后续使干燥脂质/治疗剂制剂溶解在疏水载体中时形成澄清组合物可能是有问题的。
如本文所述，本公开的方法在制备包含脂质和治疗剂的稳定无水组合物方面是有利的。为制备这种组合物，有复杂的配制要求。大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物的制备中使用的溶剂不仅必须适于将治疗剂与脂质溶解在水性环境中，而且必须适于形成与疏水载体相容的干燥脂质/治疗剂制剂(例如，任何盐和/或非挥发性溶剂应优选与疏水载体相容)。此外，在涉及多种治疗剂的实施方式中，溶剂(一种或多种)理想地适于溶解所有治疗剂和与大小设定的脂质囊泡颗粒混合。
通过广泛的研究，本发明人已经确定了多种示例性溶剂，其可在本文公开的方法中具有普遍适用性，包括用于获得澄清药物组合物的最佳盐和/或pH条件。
可以使用的示例性溶剂包括例如但不限于两性离子溶剂。两性离子溶剂的非限制性实例包括HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)和MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)。
在另一实施方式中，示例性溶剂是盐水溶液。盐提供了溶解治疗剂的有用特性，并且在本文中还已经认识到某些盐为干燥脂质/治疗剂制剂提供稳定性。这种溶剂的非限制性实例包括乙酸钠、磷酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钾、磷酸钾、碳酸钾和碳酸氢钾。
在一种实施方式中，溶剂是乙酸钠水溶液。在本发明的过程中已经观察到，乙酸钠赋予干燥脂质/治疗剂制剂以有利的性质，以便随后溶解在疏水载体中。这在宽pH范围内(例如6.0-10.5)中被观察到。为溶解多种治疗剂(例如作为通用溶剂)，可以优选在50-200mM范围内的摩尔浓度。
在一种实施方式中，乙酸钠可以是pH在6.0-10.5范围内的25-250mM乙酸钠。在一种实施方式中，溶剂是pH为6.0±1.0的100mM乙酸钠。在一种实施方式中，溶剂是pH为9.5±1.0的100mM乙酸钠。
在一种实施方式中，溶剂是pH为6.0的100mM乙酸钠。
在一种实施方式中，溶剂是pH为9.5的100mM乙酸钠。
在一种实施方式中，溶剂是磷酸钠水溶液。在本发明的过程中已经观察到，磷酸钠赋予干燥脂质/治疗剂制剂以有利的性质，以便随后溶解在疏水载体中。更具体地，已经观察到磷酸钠水溶液在较低的摩尔浓度(即≤100mM)下呈现溶解多种肽抗原的有利性质。为在疏水载体中溶解干燥脂质/治疗剂制剂，6.0-7.0范围内的pH可以是优选的。
在一种实施方式中，磷酸钠可以是pH在6.0-8.0范围内的25-250mM磷酸钠。在一种实施方式中，溶剂是pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠。在一种实施方式中，溶剂是pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠。
在一种实施方式中，溶剂是pH为7.0的50mM磷酸钠。
在一种实施方式中，溶剂是pH为6.0的100mM磷酸钠。
如本文涵盖，治疗剂在与大小设定的脂质囊泡颗粒混合之前被溶解在溶剂中，或者治疗剂在与大小设定的脂质囊泡颗粒混合之后被溶解。在后者实施方式中，可以将治疗剂作为干燥粉末添加至含有大小设定的脂质囊泡颗粒的溶液中，或者可以将大小设定的脂质囊泡颗粒和干燥治疗剂两者在新制溶剂中混合在一起。
当治疗剂在与大小设定的脂质囊泡颗粒混合之前被溶解时，在使用多于一种治疗剂的实施方式中，个体治疗剂可以一起被溶解在相同溶剂中或彼此分开在不同溶剂中。当使用三种或更多种治疗剂时，其中一些剂可以一起溶解，而其它可以个体溶解。
在一种实施方式中，所有治疗剂一起溶解相同的溶剂中作为治疗剂原液。
在本公开方法的其中要配制多种不同治疗剂的实施方式中，最初将治疗剂溶解于中/弱酸性溶剂(用于主要为碱性治疗剂的混合物)或中/弱碱性的溶剂(用于主要为酸性治疗剂的混合物)中可以是有利的。可以使用的示例性酸性溶剂包括但不限于盐酸、乙酸。可以使用的示例性碱性溶剂包括但不限于氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸钠和碳酸钠。对于主要为中性治疗剂的混合物，示例性的溶剂可以是二甲基亚砜(DMSO)。
在本文公开的方法中，治疗剂可以被溶解在本文所述的任何溶剂中。基于本公开，技术人员还可以确定可以使用的与本文所述那些呈现相似特征的其它溶剂。
如本文涵盖，任何其它可选组分(例如，T辅助表位和/或佐剂)也可以被溶解或混合在本文所述的溶剂中。同样，可以在本文所述的溶剂中提供大小设定的脂质囊泡颗粒。
在一种实施方式中，在制备溶解治疗剂或将治疗剂与大小设定的脂质囊泡颗粒混合的任何阶段，可以添加一种或多种T辅助表位和/或佐剂。佐剂和T辅助表位可以在任何阶段以任何顺序彼此独立地添加。通常，本文公开的涉及使用T辅助表位和/或佐剂的方法的实施方式是其中治疗剂包含至少一种肽抗原或编码抗原的多核苷酸的那些。
下文描述了可用于实施本文公开的方法的T辅助表位和佐剂的示例性实施方式，但并非限制。在一种实施方式中，T辅助表位包含修饰的破伤风毒素肽A16L(830至844；AQYIKANSKFIGITEL；SEQ ID NO：1)或由其组成。在一种实施方式中，佐剂是聚I：C核苷酸佐剂。
在一种实施方式中，步骤(b)的混合可以使用与用于制备大小设定的脂质囊泡颗粒和/或用于溶解治疗剂、T辅助表位和/或佐剂的溶剂相同或不同的溶剂进行。
在一种实施方式中，步骤(b)的混合在乙酸钠或磷酸钠溶液中进行。
在一种实施方式中，步骤(b)的混合在pH在6.0-10.5范围内的25-250mM乙酸钠或pH在6.0-8.0范围内的25-250mM磷酸钠中进行。
在一种实施方式中，步骤(b)的混合在pH为6.0±1.0的50mM乙酸钠、pH为9.5±1.0的100mM乙酸钠、pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠或pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠中进行。
在一种实施方式中，步骤(b)的混合在pH为7.0的50mM磷酸钠、pH为6.0的100mM磷酸钠、pH为6.0的50mM乙酸钠或pH为9.5的100mM乙酸钠中进行。
在一种实施方式中，在大小设定的脂质囊泡颗粒与溶解的治疗剂和任选的其它组分(例如T辅助表位和/或佐剂)混合后，将混合物的pH调节至10±1.0。在一种实施方式中，当乙酸钠用作溶剂时，使pH增加至10±1.0。
大小设定的脂质囊泡颗粒和至少一种溶解治疗剂的实际混合可以在任何适于获得大小设定的脂质囊泡颗粒和治疗剂的总体均匀的混合物的条件下进行。然而，混合不应在可能导致大小设定的脂质囊泡颗粒和/或治疗剂从溶液析出的激进条件下进行。在一种实施方式中，混合可以通过在100-500RPM下轻柔摇动或搅拌进行2-60分钟。在一种实施方式中，混合可以通过在300RPM下摇动/搅拌约3分钟时间进行。在另一实施方式中，混合可以通过在300RPM下摇动/搅拌约15分钟时间进行。
不论进行混合的方式，在本文公开的方法中，仅将治疗剂与大小设定的脂质囊泡颗粒(即平均颗粒大小≤120nm并且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒)混合。在大小设定之前，如例如在脂质囊泡颗粒形成期间，不将治疗剂添加至脂质囊泡颗粒。当在步骤(b)中添加治疗剂时，所提供的大小设定的脂质囊泡颗粒不包含治疗剂。如本文所述，本公开的方法的这个特征与获得澄清的药物组合物相关。
根据本公开的方法，在步骤(c)中，将大小设定的脂质囊泡颗粒和至少一种溶解的治疗剂的混合物干燥以形成干燥脂质/治疗剂制剂。
如本文所用，术语“干燥制剂(dried preparation)”、“干燥脂质/治疗剂制剂”或“包含脂质和治疗剂的干燥制剂”，其被可互换地使用，不一定表示制剂完全干燥。例如，根据本文公开的方法中使用的一种或多种溶剂，挥发性和/或非挥发性材料的小组分残留在干燥制剂中是可能的。在一种实施方式中，非挥发性材料将保留。“干燥制剂”是指制剂不再包含大量的水。用于干燥制剂的方法应该能够从大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物除去基本上所有的水。因此，在一种实施方式中，干燥制剂完全不含水。在另一实施方式中，基于干燥过程(例如冻干)的限制，干燥制剂可以包含残留的水分含量。该残留水分含量将一般为干燥制剂重量的小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.05％或更少。该残留水分含量将不大于干燥制剂重量的5％，因为这将导致产品不澄清。
可以使用各种方法来干燥大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物，这是本领域已知的。在一种实施方式中，干燥通过冻干、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥进行干燥。技术人员充分了解这些干燥技术以及其如何进行。
在一种实施方式中，干燥通过冻干进行。如本文所用，“冻干”、“冻干的”和“冷冻干燥”被可互换地使用。如本领域公知，冻干工作通过冷冻材料然后降低周围压力以使材料中的挥发性溶剂(例如水)直接从固相升华到气相来进行。
可以使用任何常规冷冻干燥程序来进行本文公开的方法的干燥步骤。在一种实施方式中，冻干通过装载、冷冻、抽真空和干燥(例如初次干燥和二次干燥)的顺序步骤进行。
在一种实施方式中，冻干根据下表8中列出的方案(实施例4)进行。简而言之，将大小设定的脂质囊泡颗粒和治疗剂的混合物经约5分钟的时间冷冻至约-40℃的温度。然后通过将压力降低至约100mT来进行抽真空。然后将混合物干燥。通过在减压下将温度升至约-30℃进行约1小时的初次干燥。然后，通过在减压下进一步将温度升至约25℃来进行约20分钟的二次干燥。
冷冻和干燥阶段的相关考虑因素包括：
·冷冻：将材料冷却至其三相点以下(即材料的固相和液相可以共存的最低温度)很重要。这确保在后续步骤中将发生升华而不是熔融。
·初次干燥：提供足够的热使升华发生。此阶段可缓慢进行(数小时至数天)。如果加入过多的热，则材料的结构可能会改变。
·二次干燥：旨在去除任何未冷冻的水分子。升高温度(通常0℃以上)以破坏水分子与冷冻材料之间已形成的任何物理化学相互作用。
在可非常适合个性化药物但也可具有更广泛应用的实施方式中，我们发现大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物的冻干可以在台式冷冻干燥机中的密封袋内进行。这可以是特别有利的，因为其减少了必须在无菌实验室环境中进行的步骤数量，并允许快速生产较小批量的产品。例如，在无菌过滤大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物后，包含混合物的无菌填充小瓶可在无菌条件下被装载和密封无菌袋中。然后，这些无菌密封单元可以利用台式冷冻干燥机在开放式实验室(即非无菌环境)中进行冻干。通过这种方法，还可以在单个冷冻干燥机中用多个不同的密封单元进行冷冻干燥。这可以通过避免在无菌实验室环境中使用大型冷冻干燥机进行昂贵的冷冻干燥步骤而减少制造成本和时间。而且，可以同时在单独的密封无菌袋中制备多个不同的小规模批次的干燥脂质/治疗剂制剂。
因此，在一种实施方式中，通过将包含步骤(b)的混合物的一个或多个容器装载到袋中，密封该袋以形成密封单元，然后在冷冻干燥机中冻干该密封单元，来进行冻干。在一种实施方式中，可以将单个密封单元装载到冷冻干燥机中以冻干。在另一实施方式中，可以将多个单独的密封单元装入单个冷冻干燥机中以冻干。在一种实施方式中，冷冻干燥机可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的密封单元以冻干。
在将多个单独的密封单元装入单个冷冻干燥机中的实施方式中，密封单元可以：(i)每一个均包含与其它密封单元相同的大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物，(ii)每一个均包含与其它密封单元不同的大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物，或(iii)其任何组合(即一些密封单元可包含与其它密封单元相同的大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物，并且一些密封单元可包含不同的大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物)。密封单元中大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物之间的差异可与用于制备囊泡颗粒的脂质、混合物中包含的治疗剂(例如不同的肽抗原或新抗原)和/或任何其它组分相关。在具体实施方式中，密封单元之间治疗剂不同。为制造药物级组合物，每个个体密封单元应仅包含具有相同的大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物的容器。
为便于处理，可将容器装载到托盘上，并将托盘密封在袋子内。在一种实施方式中，托盘是金属托盘或塑料托盘。
包含大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物的容器可以是适合冻干的任何容器。在一种实施方式中，容器是小瓶、长瓶、烧瓶、试管或任何适合的替代物。在一种实施方式中，容器是小瓶，如玻璃或塑料小瓶。在一种实施方式中，小瓶是玻璃小瓶。在一种实施方式中，容器是2ml或3ml的玻璃小瓶，如2ml或3ml的13MM FTN BB LYO PF小瓶。容器可进一步包括适合冻干的塞子和/或密封件。在一种实施方式中，塞子是通气塞子。在一种实施方式中，塞子是Fluorotec Lyophilization Closure，13MM，单一通气塞子。在一种实施方式中，密封件是压接密封件，如例如铝压接密封件。在一种实施方式中，密封件是West-SpectraFlip-Off 13MM密封件。
包含用于冻干的样品的袋可以是适合冻干的任何袋。在一种实施方式中，该袋还应能够被高压灭菌以提供无菌袋。为提供无菌袋，将袋高压灭菌并随后保持在无菌条件下。因此，在一种实施方式中，所述袋是无菌的高压灭菌袋。
在一种实施方式中，袋由纸、塑料或纸/塑料组合制成。在一种实施方式中，纸是医学级纸，塑料是聚酯/聚丙烯层压膜。适于对医疗设备灭菌的各种类型的袋在本领域中是已知的，并且可以使用这些袋中的任何一种。在一种实施方式中，无菌袋是FisherbrandTM即时密封灭菌袋(Fisher Scientific)。
冻干可以在任何适合的冷冻干燥机中进行。在一种实施方式中，冷冻干燥机是台式冷冻干燥机。在一种实施方式中，冷冻干燥机是Virtis台式冷冻干燥机。在一种实施方式中，冷冻干燥机在开放实验室(即，非无菌环境)中。
本公开的用于制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法的有利性质是，通过使用本公开的大小限制(即，≤120nm，并且PDI≤0.1)的大小设定的脂质囊泡颗粒，治疗剂能够耐受((例如不析出)在药物组合物的制备过程中遇到的多个不同相中的每一个，即水相、干燥和疏水相。这一点用非大小设定的脂质囊泡观察不到，由此尽管干燥制剂的外观适当，但最终药物组合物仍观察到具有析出物(precipitate)的混浊溶液。
而且，出乎意料地，通过利用本公开的制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法，可以产生稳定透明的无水药物组合物，而无需任何将治疗剂封装在大小设定的脂质囊泡颗粒内的主动步骤。这是有利的性质，因为本公开的方法避免了不必要的加工步骤，该加工步骤成本高，费时并且可最终导致大量治疗剂(例如未包封在脂质囊泡颗粒中的任何治疗剂)损失。
不受理论的束缚，在提供并混合大小设定的脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂之后，认为大小设定的脂质囊泡颗粒可根据加工步骤(例如干燥、在疏水载体中溶解等)而重排以形成不同的结构。)。大小设定的脂质囊泡颗粒的小而均匀的大小(即，平均颗粒大小≤120nm，并且PDI≤0.1)可使其特别适于这些构象变化。例如，当被置于疏水载体中时，大小设定的脂质囊泡颗粒可以重新排序以形成如本文所述的交替的脂质基结构。实际上，认为脂质的重排在这些随后的制造步骤中发生，如例如本文提供的SAXS分析所示。
本文公开的用于制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法可以进一步包括灭菌步骤。灭菌可以通过本领域已知的任何方法进行。在一种实施方式中，灭菌通过无菌过滤、蒸汽热灭菌、辐射(例如γ辐射)或化学灭菌进行。在具体实施方式中，灭菌通过无菌过滤进行。在一种实施方式中，可以在步骤(b)和(c)之间进行无菌过滤，即在将大小设定的脂质囊泡颗粒与治疗剂混合之后但干燥之前。
可以采用无菌过滤的任何常规程序，只要其不影响治疗剂在大小设定的脂质囊泡颗粒混合物中的溶解度和稳定性。在这方面，可期望在低压条件下(例如30-50psi之间)进行无菌过滤。
可以使用市售无菌过滤膜(例如MilliporeSigma)进行连续过滤。在一种实施方式中，使用0.22μm额定膜、0.2μm额定膜和/或0.1μm额定膜进行无菌过滤。在一种实施方式中，无菌过滤通过大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物单次通过单个过滤膜进行。在另一实施方式中，无菌过滤通过使大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物连续通过相同或不同大小设定过滤膜的组合而进行。
在非限制的情况下，在一种实施方式中，无菌过滤可以在以下条件下进行：
1)过滤压力：30-50psi氮气
2)温度：室温
3)产品接触时间：≤45分钟
4)过滤器类型：Millipak-20PVDF过滤器，0.22μm
5)大小：6L批量
在一种实施方式中，通过使步骤(b)的混合物通过单个0.22μm的Millipak-20PVDF过滤器来进行无菌过滤。在另一实施方式中，通过使步骤(b)的混合物连续通过两个或更多个无菌过滤膜来进行无菌过滤。在连续无菌过滤的实施方式中，使步骤(b)的混合物通过两个、三个、四个、五个或更多个Millipak-20PVDF0.22μm膜。在连续无菌过滤的一种实施方式中，使步骤(b)的混合物通过两个Millipak-20PVDF0.22μm膜。
本文公开的用于制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法可以进一步包括确认所述大小设定脂质囊泡颗粒保持≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI的步骤。如本文其它地方所述，有几种技术、仪器和服务可用于测量脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小和PDI，如但不限于TEM、SEM、AFM、FTIR、XPS、XRD、MALDI-TOF-MS、NMR和DLS。
在一种实施方式中，使用DLS ZETASIZER NANO-S颗粒大小分析仪进行确认脂质囊泡颗粒的大小和PDI的步骤。
贯穿本公开的方法，大小/PDI确认步骤可以进行一次或在多个不同的时间进行。在一种实施方式中，此步骤可以如下进行：在步骤(a)中提供大小设定的脂质囊泡颗粒之前；在步骤(b)中将大小设定的脂质囊泡颗粒与治疗剂混合之前；在将大小设定的脂质囊泡颗粒与治疗剂混合后；和/或在进行步骤(c)的干燥之前。在一种实施方式中，在步骤(b)和(c)之间进行大小确认步骤，以在干燥之前确认大小设定脂质囊泡颗粒的大小/PDI。
在一种实施方式中，可以通过分析目标制剂的小样品体积来进行大小确认步骤。在另一实施方式中，大小确认步骤可以通过分析来自与目标制剂平行制备的制剂的样品来进行。
在一种实施方式中，确认大小设定脂质囊泡颗粒的大小/PDI的步骤还包括确认大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂制剂的pH。在一种实施方式中，使用用于测量大小设定脂质囊泡颗粒的大小/PDI的同一机器测量pH。在一种实施方式中，使用任何适于测定pH的装置单独测量pH。示例性溶剂在本文其它部分被讨论，并且在一种实施方式中，该步骤涉及确认溶剂保留本文所述的期望pH。例如，在将大小设定的脂质囊泡颗粒悬浮在磷酸钠中的实施方式中，该步骤涉及确认pH为6.0-8.0。在将大小设定的脂质囊泡颗粒悬浮在乙酸钠中的实施方式中，该步骤涉及确认pH为6.0-10.5。这些溶剂基于摩尔浓度的更具体的示例性pH在本文其它部分被描述。
本文公开的用于制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法可以进一步包括在步骤(c)的干燥之前和/或之后评价治疗剂(一种或多种)的稳定性的步骤。治疗剂的稳定性可以通过任何已知的手段或方法来测量。在T辅助表位存在的实施方式中，本文公开的方法还可包括在步骤(c)的干燥之前和/或之后评价T辅助表位的稳定性的步骤。
评价治疗剂的稳定性的步骤可以例如但不限于通过高效液相色谱法(HPLC)进行。HPLC是一种可用于分离、鉴定和定量混合物中每种组分的技术。因此，通过使用HPLC，可以确定混合物中每种治疗剂的近似量，以及定性地表征治疗剂(例如观察降解产物、二聚产物等)。
在一种实施方式中，本文公开的方法能够提供大小设定脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物，其中治疗剂的原始量/浓度的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％在干燥前刻保留未降解形式。在一种实施方式中，治疗剂的原始量/浓度的100％在干燥前刻保留未降解形式。
在一种实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/治疗剂制剂，其中治疗剂的原始量/浓度的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％或至少99％在干燥后即刻保留未降解形式。在一种实施方式中，治疗剂的原始量/浓度的100％在干燥后即刻保留未降解形式。
在一种实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/治疗剂制剂，其中治疗剂原始量/浓度的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％在干燥后至少三个月保留未降解形式。在一种实施方式中，治疗剂的原始量/浓度的100％在干燥后至少三个月保留未降解形式。
在一种实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/治疗剂制剂，其中一种或多种治疗剂在干燥后上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久不显示降解。在具体的实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/治疗剂制剂，其中一种或多种治疗剂在干燥后上至三个月或更久不显示降解。
在本文公开的方法的一种实施方式中，在步骤(b)之后，每种溶解的治疗剂的浓度为约0.1mg/ml至10mg/ml。在一种实施方式中，每种溶解的治疗剂的浓度为至少约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml。
在一种实施方式中，方法包括使用五种或更多种不同的治疗剂，并且在步骤(b)之后，每种不同的溶解治疗剂的浓度为约0.5mg/ml。
在本文公开的方法的具体实施方式中，治疗剂是肽抗原。例如，本文公开的方法可用于制备基于肽的免疫原性组合物(例如疫苗)。
使用整体生物体或大蛋白的常规疫苗策略数十年来非常有效，尤其是在治疗感染性疾病方面。然而，包含不必要的抗原物质是有问题的，因为其通常引起不期望的反应性，而保护性免疫仅取决于制剂中的几个选择的肽表位。这引起了对基于肽的疫苗的极大兴趣。
完全合成的基于肽的疫苗是疫苗接种的潜在未来。肽疫苗依靠短肽片段的使用来诱导高度靶向的免疫响应。与常规疫苗相比，基于肽的疫苗提供若干优点。例如，肽抗原由于缺乏不必要的元素而不太可能引起不期望的过敏性或自身免疫性响应；化学合成实际上消除了所有与生物污染有关的问题；并且肽可以被定制，或可以采用多肽方法靶向非常具体的目标。
然而，基于肽的疫苗接种的缺点在于，由于其大小相对小，肽抗原通常免疫原性弱，因此通常需要佐剂和/或有效递送系统的协助。肽抗原也可能难以配制在药物组合物中，特别是当期望组合物包含多种不同的肽抗原时。更具体地，在诸如个性化药物的免疫疗法的新兴领域中，以时间和成本有效的方式配制适合的基于肽的组合物的困难提出了巨大挑战。
虽然在测序技术的辅助和计算机算法(例如NetMHC，其识别预测结合MHC I类和/或MHC II类蛋白的基序)的创建下识别潜在表位的效率已大大提高，但这些技术几乎无法准确预测使用肽抗原生成稳定的免疫学有效的组合物的能力。此外，虽然通常可期望使用多种肽抗原来通过抗原多样性提供更广泛的覆盖，但是这些类型的疫苗提出了另外的肽选择性要求，并且甚至更难以配制成稳定的组合物，特别是在采用独特成分如基于脂质的媒介和/或疏水载体的专用递送系统的情况下。因此，尽管取得了进展，但是适合的抗原的配制仍是基于肽的疫苗的开发中的关键和耗时的步骤。这在免疫疗法领域中提出了重大问题，其中免疫原性组合物的快速发展至关重要，如个性化的癌症疫苗。
在一种实施方式中，本发明涉及制备干燥肽抗原制剂的有利方法和包含肽抗原的药物组合物。该方法避免了费时的处理步骤，并允许制备基于肽的抗原制剂，而无需进行广泛肽选择步骤。本公开的方法允许将多种不同的肽抗原——无论其属性——配制成单一药物组合物。此外，该方法允许快速生产含有一种或多种肽抗原的药物组合物，预期该组合物在包括患者特异性新抗原的个性化癌症疫苗的环境下特别有用。
因此，在一种实施方式中，本公开涉及制备干燥肽抗原制剂的方法，包括以下步骤：提供平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒；将该脂质囊泡颗粒与一种或多种溶解的肽抗原混合以形成混合物；和干燥步骤(b)中形成的混合物以形成干燥的肽抗原制剂。
在这种方法的实施方式中，可以将所述一种或多种肽抗原的每一种一起溶解以提供抗原原液。因此，在本文公开的方法的实施方式中，步骤(b)包括：(b1)提供包含至少一种溶解的肽抗原和任选地溶解的T辅助表位的抗原原液；和(b2)将抗原原液与脂质囊泡颗粒混合以形成混合物。
在一种实施方式中，可以通过组合预溶解的抗原来制备抗原原液。在另一实施方式中，可以通过组合干燥粉末肽抗原，添加溶剂和将抗原在溶剂中混合，来制备抗原原液。在另一实施方式中，可以通过将一种或多种干燥粉末肽抗原与一种或多种预溶解的抗原组合来制备抗原原液。
例如通过在单一容器中组合干燥粉末肽抗原，和通过在溶剂中混合和/或超声处理使肽抗原溶解，可以制备抗原原液。在一种实施方式中，可通过涡旋1-5分钟和超声处理1-5分钟来溶解和混合肽抗原的干燥粉末混合物。在一种实施方式中，可以通过涡旋约1分钟和超声处理约2分钟来溶解和混合肽抗原的干燥粉末混合物。
在一种实施方式中，通过将干燥粉末T辅助表位与抗原干燥粉末混合物混合，然后溶解该混合物，而在抗原原液的制备过程中添加T辅助表位。在该实施方式中，T辅助表位成为将与大小设定的脂质囊泡颗粒混合的抗原原液的一部分。在另一实施方式中，T辅助表位可以与肽抗原分别地与大小设定的脂质囊泡颗粒混合。在该实施方式中，T辅助表位可以在肽抗原之前、之后或同时被添加至大小设定的脂质囊泡颗粒。如果使用多种肽抗原并将其分别与大小设定的脂质囊泡颗粒混合，则可以以任何顺序添加T辅助表位。
在一种实施方式中，佐剂在抗原原液的制备过程中被添加。其可通过以下被添加：将干燥粉末佐剂与抗原干燥粉末混合物组合，然后溶解该混合物。或者，可以将其加入到溶解肽抗原的溶液中。在这些实施方式中的任一个中，佐剂成为将与大小设定的脂质囊泡颗粒混合的抗原原液的一部分。在另一实施方式中，佐剂可与肽抗原分别地与大小设定的脂质囊泡颗粒混合。在此实施方式中，佐剂可以在肽抗原之前、之后或同时被添加至大小设定的脂质囊泡颗粒。如果使用多种肽抗原并且将其分别与大小设定的脂质囊泡颗粒混合，则可以以任何顺序添加佐剂。
不管肽抗原、T辅助表位和/或佐剂可被组合的顺序如何，在本文公开的方法中，这些组分仅与大小设定的脂质囊泡颗粒混合。无肽抗原(或通称治疗剂)、T辅助剂和/或佐剂被添加至大小设定前的脂质囊泡颗粒。
在一种实施方式中，本文公开的方法的有利性质是其可用于将多种不同的治疗剂配制在单一组合物中。
用于实现此目的的实施方式涉及制备包含一种或多种可溶解的肽抗原——任选地与T辅助表位一起——的抗原原液。
在一种实施方式中，可以通过将肽抗原和任选地T辅助表位的干燥粉末混合物溶解在溶剂中来如上所述制备抗原原液。在一种实施方式中，溶剂是0.1M氢氧化钠溶液(pH12.0)。在一种实施方式中，抗原各自以约0.5mg/ml至5.0mg/ml之间的浓度溶解。在一种实施方式中，抗原各自以约2.0mg/ml之间的浓度溶解。然后可以将抗原原液加入等体积(1：1)的乙酸钠或磷酸钠溶液，如例如本文所述的溶液。在一种实施方式中，可以将抗原原液添加至等体积的100mM乙酸钠，pH 6.0。在一种实施方式中，抗原原液中每种抗原的最终浓度为约1.0mg/ml。此程序是可用于制备含有多种不同肽抗原的抗原原液的通用方法的示例性实施方式。在被给予本文的公开内容后，基于本文的公开内容使用不同的溶剂来改动此程序在技术人员的能力范围内。
如本文所公开，惊人地发现，可以将肽抗原添加至平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的预形成的脂质囊泡颗粒，而仍将形成适合的干燥抗原制剂，用于在疏水载体中溶解。不受理论束缚，认为在与抗原混合后和/或在随后的干燥(例如冻干)过程中，大小均匀的小脂质囊泡小颗粒能够自身重排(例如重新排序和/或融合)。大小设定的脂质囊泡颗粒结构的重排可作用于有效地包围在不相容环境中的肽抗原，例如在水性环境中的疏水载体以及然后在疏水载体中的亲水肽。本质上，认为大小设定的脂质囊泡颗粒允许重排，其允许肽抗原有效载荷适当地存在于亲水和疏水环境两者中。这是非大小设定的脂质囊泡颗粒观察不到的，由其最终获得混浊溶液用于药物组合物。
如本文实施例5所示，HPLC分析确认该方法提供了干燥的肽抗原制剂，其中肽抗原即使在长时间(即3个月或更长)存储下也是稳定的。实施例5提供了通过HPLC评价肽的示例性方法。
首先，通过对包含已知浓度的所有肽的标准样品进行HPLC分析来表征肽(参见例如图12，HPLC色谱图显示实施例5的14种新抗原和A16L肽)。使用该标准品，然后可以在本文公开的方法中的给定时间，如例如在步骤(c)的干燥之前和/或之后，利用HPLC分析来定量大小设定的脂质囊泡颗粒/抗原混合物中的肽。例如，显示冻干之前和之后的14种新抗原的色谱图如图13-16所示。表12显示了冷冻干燥前刻、冷冻干燥后即刻(T＝0)、冷冻干燥后1个月(T＝1M)和冷冻干燥后3个月(T＝3M)的计算肽浓度。对于T＝1M和T＝3M时间点，将样品在冷冻干燥后立即保存在-20℃下，直到进行HPLC分析。
多数时间点的肽浓度在多数时间点处在设定的规格规格内。基于原始蛋白质浓度和所用的HPLC方案，新抗原的设定规格为0.40-0.60mg/ml，A16L肽的设定规格为0.2-0.3mg/mL；Mut36始终超出设定规格；然而，认为这是由于末端半胱氨酸残基导致二聚体形成。事实上，如HPLC色谱图中所示，观察到Mut36二聚体的单独峰。Mut 29a和Mut17也显示超出设定规格的值。这些肽含有内部半胱氨酸，其可导致二聚体形成以及因此肽稳定性的不准确表示。
因此，在一种实施方式中，本文公开的方法能够提供大小设定的脂质囊泡颗粒/抗原混合物，其中各肽抗原的原始肽浓度的至少80％在干燥前刻4保留未降解形式。
在另一实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/肽抗原制剂，其中各肽抗原的原始肽浓度的至少75％在干燥后即刻保留未降解形式。
在另一实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/肽抗原制剂，其中各肽抗原的原始肽浓度的至少70％在干燥后至少三个月保留未降解形式。
在另一实施方式中，本文公开的方法能够提供干燥脂质/肽抗原制剂，其中一种或多种肽抗原在干燥后上至3个月不显示降解。
总体而言，HPLC分析表明，本文公开的方法能够提供干燥脂质/肽抗原制剂，其中肽抗原是稳定的，即使长时间(即3个月或更长)存储。注意，由于个性化的新抗原癌症疫苗通常必须在数周内配制以促进免疫接种后的有效免疫响应，预期需要这些产品保存期较短。
此外，本文公开的方法有利地避免了需要用较大的肽抗原包封脂质体进行困难的大小挤出步骤。对于药物级制剂，通常需要对肽抗原包封脂质体制剂进行这些大小挤出步骤，以有效地进行无菌过滤。但是，在进行这些挤出步骤的高压(例如5000psi)可导致肽抗原从溶液析出和粘合至过滤器。惊人地，在此发现，当将肽抗原添加至平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的预形成的脂质囊泡颗粒时，不需要这些挤出步骤。即使没有这些侵入性挤出步骤，通过本文的方法制备的干燥抗原制剂也能够在溶解于疏水载体中后形成澄清的药物组合物。
如图4A、4B、4C和4D所示，通过本文公开的方法产生的干燥抗原制剂在溶解于疏水载体(例如矿物油)中后能够产生澄清溶液。相比之下，当用非大小设定的脂质囊泡颗粒制备干燥抗原制剂时，在溶解后形成混浊溶液(参见图4E、4F、4G和4H)。
在药学环境下，可再现地获得澄清溶液是有利的性质。药物产品必须满足监管批准的最低要求，包括均质性和可再现性。析出物的形成和/或溶液澄清度的缺乏不是期望的性质，因为其可表示产品中组分(例如抗原)未完全溶解。对于浑浊的溶液，可能需要另外的处理步骤以建立均质性，并且即使这样，对于药学目的该组合物也可能是不可接受的。略微混浊的溶液可以是可接受的，因为可能是盐引起混浊，而不是析出的抗原。但是，澄清的溶液是优选的，因为其避免了对确认是盐析出而不是肽抗原析出的需要。
如本文所示，通过使用大小设定的脂质囊泡颗粒，本公开的方法在溶解于疏水载体中后形成澄清溶液，而非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂则否。事实上，如图5所示，无论大小设定的脂质囊泡颗粒是用DOPC/胆固醇还是单独用DOPC制成，本公开的方法都能够提供澄清的溶液。这些结果表明，本公开的方法中使用的小脂质囊泡颗粒即使在没有胆固醇的情况下也是稳定的。此特征在药物组合物的环境中可以是有利的，因为通常优选完全合成的产物，并且如果可以避免则不期望摄入胆固醇。
在进一步具体实施方式中，本公开的生产干燥脂质/治疗剂制剂和药物组合物的方法在个性化癌症疫苗的环境中也可以是特别有利的。
个性化癌症疫苗基于患者特异性新抗原来设计，所述患者特异性新抗原是通过改变氨基酸编码序列的突变(非同义体细胞突变)产生的肿瘤特异性抗原。最近，借助测序技术，鉴定个体肿瘤的基因组(外显子组)的蛋白质编码部分内存在的突变以及从而预测潜在的新抗原已变得可能。然而，基于新抗原的个性化癌症疫苗通常必须在数周内配制，以促进免疫接种后的有效免疫响应。时间安排是至关重要的，并且构成很大的障碍。首先选择潜在的新抗原然后在该群体中选择具有适于配制稳定组合物的特性的肽所涉及的时间已使得此领域的进展困难，在最好的情况下。
在本文公开的用于制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法中，由于无需在存在肽抗原(一种或多种)的情况下制备大小设定的脂质囊泡颗粒，本公开的方法可以减少配制个性化新抗原所需的成本和时间。通过预先准备或购买大小设定的脂质囊泡颗粒的原液，可以避免耗时的处理步骤。
此外，发现本公开的方法能够配制不同肽抗原有效载荷大的稳定无水组合物。如实施例4中所示，使用本公开的方法，能够将多种不同的肽抗原——无论其属性——一起配制在单一一个组合物中。这点的实现无需进行广泛抗原选择步骤，如关于等电点、稳定性、溶解度、免疫原性和/或肽之间的交叉相容性(例如共溶性)。
将多种不同的肽抗原配制在单一组合物中是已知的制造问题。由于不同的肽抗原将具有与其等电点、稳定性和溶解度有关的不同特性，可以预期将需要选择步骤来确定制造过程(如果有的话)中何时可以将某些肽配制在一起。这部分地是由于共溶性问题，由此具有不同特性的肽会导致其它肽从溶液析出。此问题特征在涉及生产中的不同相(例如水相和疏水相)的方法中加重。但是，如实施例4所示，本公开的方法能够将14种不同的肽抗原同时配制在单一组合物中，而无需针对等电点、稳定性、溶解度和/或交叉相容性的任何肽选择步骤。所使用的肽仅仅是Castle等(2012)鉴定为潜在新抗原的那些。
此外，与油包水乳液(其中抗原可以被包含在油中形成的水滴中)相反，无水组合物需要将所有组分(例如治疗剂、佐剂等)直接掺入油中。出乎意料的是，这甚至可以对于一种肽抗原实现——通过将肽抗原在预形成的大小设定的脂质囊泡颗粒之外添加，更不用说对于14种不同的肽抗原——每种具有不同的氨基酸序列(表12；图13-16)。
尽管有这些障碍，通过使用本文公开的方法，我们能够配制包含多种不同肽抗原的稳定无水组合物。这通过使用大小设定的脂质囊泡制剂来制备有利于溶解在疏水载体中的干燥抗原制剂而实现。不受理论的束缚，认为在无水制剂中稳定地配制如此多种肽的能力可能是由于在本文公开的方法加工步骤期间大小设定的脂质囊泡颗粒的独特重排。
本文公开的方法制备包含多种不同肽抗原的稳定无水的药物组合物的能力在个性化癌症疫苗领域中可具有显著优势。
为成功利用个性化的基于新抗原的癌症疫苗提供有效免疫治疗，重要的是疫苗可以在数周内被配制并递送给患者。在这些时间限制下，通常有很少或没有时间进行广泛肽选择以鉴定与诸如等电点、稳定性、溶解度和/或免疫原性的特征相关的所谓的“最佳”的新抗原。为提供适合的治疗，目前正在临床试验中探索的新抗原疫苗在多种制剂中提供10-30种个体肽。尽管这种方法减少了选择最适合的新抗原所涉及的时间，但在制剂稳定性和/或免疫原性、成本和患者依从性方面仍然存在重大问题。理想地，抗原可以在单一稳定的制剂中被递送，而无需选择具有与等电点、稳定性、溶解度(例如，共溶解度)和/或免疫原性有关的特定一组特征的抗原的费时劳动。
本文公开的方法可以提供优点，其在于可以将多种不同的肽抗原配制在单一组合物中而无需费时的抗原选择步骤。本文公开的干燥抗原制剂可以快速溶解在疏水载体(例如油)中，并且容易通过皮下注射给药，通过避免各肽的复杂制剂制备和避免多次注射而节省时间。
本公开的方法的优点不仅在于将多种不同肽抗原配制在一起的能力，而且还在于干燥脂质/肽抗原制剂和所得药物组合物中的肽抗原量。如实施例4所示，通过本文公开的方法，干燥脂质/肽抗原制剂能够溶解在疏水载体中，以提供包含7.0mg/ml肽抗原的最终组合物。此外，组合物还包含0.25mg/ml的T辅助肽表位。
此外，本文公开的结果表明，即使在肽抗原有效载荷大的情况下，组合物在单次给予后也保持促进免疫响应快速和增强的能力。如图17所示，通过本公开的方法制备的具有14种不同新抗原的组合物能够提供相对于对照水性组合物增强的CTL免疫响应。对新抗原Mut25的免疫响应提高了约5倍，对新抗原Mut44的免疫响应提高了约3倍。鉴于没有关于强免疫原性特征预选抗原，其它新抗原未观察到统计学显著差异是不奇怪的。相反，个性化新抗原疫苗的共同目标是包括几种不同的新抗原，希望一种或多种会提供有效的免疫疗法。如本文所述，本发明的方法和组合物被认为非常适于并且有利于该目的。
制备药物组合物的方法
在一种实施方式中，本发明涉及制备药物组合物的方法。在一种实施方式中，通过首先根据本文公开的方法制备干燥脂质/治疗剂制剂，然后将该干燥制剂溶解在疏水载体中来制备药物组合物。
如本文所用，“溶解”是指通过将干燥成分溶解在疏水载体中而使干燥脂质/治疗剂制剂恢复液态。可以通过使干燥成分(例如脂质和治疗剂)溶解在疏水载体中的任何方式添加疏水载体。例如但不限于，干燥脂质/治疗剂制剂可被溶解在疏水载体中——通过将二者混合在一起。在一种实施方式中，溶解涉及将疏水载体加入干燥脂质/治疗剂制剂，使其静置1-30分钟，然后将混合物轻轻摇动或混合1-15分钟。可以重复此过程，直到干燥成分溶解在疏水载体中(例如，获得澄清溶液)。
在一种实施方式中，溶解涉及将疏水载体加入干燥脂质/治疗剂制剂中，使其静置5分钟，然后轻轻摇动或混合1分钟。可以重复此过程，直到干燥成分溶解在疏水载体中(例如，获得澄清溶液)。
如图4A、4B、4C和4D所示，通过本文公开的方法生产的干燥脂质/治疗剂制剂能够在溶解于疏水载体中后产生澄清溶液。相比之下，当用非大小设定的脂质囊泡颗粒制备干燥脂质/治疗剂制剂时，形成混浊溶液(参见图4E、4F、4G和4H)。
如本文所讨论，在药学环境下，可再现地获得澄清溶液是有利的性质。药物产品必须满足监管批准的最低要求，包括均质性和可再现性。析出物的形成和/或溶液透明性的缺乏不是期望的性质，因为其可表示产物中的组分(例如治疗剂)未完全溶解。对于浑浊的溶液，可能需要另外的处理步骤以建立均质性，并且即使这样，对于药学目的该组合物也可能是不可接受的。略微混浊的溶液可以是可接受的，如果是盐引起混浊而不是析出的治疗剂。然而，澄清的溶液是有利的。
通过使用大小设定的脂质囊泡颗粒，本公开的方法在溶解于疏水载体中后形成澄清溶液，而非大小设定的脂质囊泡颗粒制剂则否。事实上，如图5所示，无论大小设定的脂质囊泡颗粒用DOPC/胆固醇还是单独DOPC制成，本公开的方法都能够提供澄清的溶液。这些结果表明，本公开的方法中使用的大小设定的脂质囊泡颗粒即使在没有胆固醇的情况下也是稳定的。此特征在药物组合物的环境中可以是有利的，因为通常优选完全合成的产物，并且如果可以避免则不期望摄入胆固醇。
在一种实施方式中，将干燥脂质/治疗剂溶解在疏水载体中的步骤产生组合物，其中干燥成分完全溶解在疏水载体中。在一种实施方式中，干燥成分可以不完全溶解在疏水载体中，但是其溶解程度足以可再现地提供澄清溶液。
如本文所用，“疏水载体”是指液体疏水性物质。术语“疏水载体”在本文中可互换地称为“油基载体”。
疏水载体可以是基本上单纯的疏水物质或疏水物质混合物。在本文描述的方法和组合物中有用的疏水性物质是药学和/或免疫学上可接受的那些。载体通常在室温(例如约18-25℃)下为液体，但是某些在室温下不是液体的疏水性物质可以例如通过加热而液化，并且也可以是有用的。
油或油混合物是特别适用于本文公开的方法和组合物的载体。油应是药学和/或免疫学上可接受的。适合的油包括例如矿物油(特别是轻或低粘度矿物油，如
Figure BDA0002388629480000252
6VR)、植物油(例如大豆油，如MS80)、坚果油(例如花生油)或其混合物。因此，在一种实施方式中，疏水载体是疏水性物质，如植物油、坚果油或矿物油。也可以使用动物脂肪和人造疏水性聚合物材料，特别是在环境温度下为液态或相对容易液化的那些。
在一些实施方式中，疏水载体可以是或包含不完全弗氏佐剂(IFA)、基于矿物油的模型疏水载体。在另一实施方式中，疏水载体可以是或包含在矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，例如可以
Figure BDA0002388629480000251
ISA 51(SEPPIC，法国)商购。尽管这些载体常用于制备油包水乳液，但本公开涉及无水组合物。由此，这些载体在本文公开的方法和组合物中没有用水乳化。
在一种实施方式中，疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
在一种实施方式中，疏水载体是
Figure BDA0002388629480000261
ISA 51。
在一种实施方式中，疏水载体是MS80油，其是矿物油(Sigma Aldrich)和Span80(Fluka)的混合物。这些组分可以单独购买并在使用前混合。
在一种实施方式中，本公开涉及通过本文公开的方法制备的药物组合物。
小角度X射线散射(SAXS)可用于就诸如下列的参数方面确定颗粒系统的纳米级结构：平均颗粒大小、形状、分布和表面/体积比等参数。利用本公开的用大小设定的脂质囊泡颗粒制备干燥脂质/治疗剂制剂的方法，已经发现脂质在疏水载体中重排以形成具有单层脂质组装体的脂质基结构。这显示在图19和20的SAXS图谱中。
“单层脂质组装体”是指脂质形成聚集体结构，其中脂质的疏水部分朝着疏水载体向外定向，并且脂质的亲水部分作为核心聚集在中间。根据SAXS图谱，不能确定亲水部分是否形成连续的单层膜(例如反胶团)，或核心是否是不连续的聚集体。不论构型如何，脂质基结构都是包含单层脂质，而与例如在脂质体中发现的双层相反。认为在这种构型中，亲水性治疗剂处于单层脂质组装体的核心中，而疏水性治疗剂溶解在非极性油中。
不受理论的束缚，基于本文的实例认为，脂质囊泡颗粒大小设定以达到≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的PDI为干燥脂质/治疗剂制剂提供了有利的性能，其允许干燥脂质/治疗剂制剂与疏水载体更好地相容。例如，大小设定的脂质囊泡颗粒可以允许脂质囊泡颗粒在溶解于疏水载体中后更容易重排成脂质基结构，从而提供澄清的产物。这可能是由于大小设定的脂质囊泡颗粒的小而均匀的大小。还认为，此性质允许更大的有效载荷被稳定地配制在疏水载体中。
药物组合物
在一种实施方式中，本公开涉及稳定的无水药物组合物，其包含具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构、至少一种治疗剂和疏水载体。这些组分中的每一个在本文其它部分被分别更详细地描述。
如本文所用，在环境需要时，术语“药物组合物”、“组合物”、“疫苗组合物”或“疫苗”可以被互换地使用。
本文公开的药物组合物可以治疗有效量被给予对象。如本文所用，“治疗有效量”是指有效向对象提供治疗、预防或诊断益处和/或刺激、引起、维持、加强或增强对象的免疫响应的组合物或治疗剂量。在一些实施方式中，组合物的治疗有效量是能够在具体疾病或障碍的治疗中在对象中引起临床响应的量。组合物的治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的公开内容。治疗有效量可根据多种因素如对象的状况、体重、性别和年龄而变化。
本文公开的药物组合物是无水的。如本文所用，“无水”是指完全或基本上无水，即药物组合物不是乳液。
“完全不含水”是指该组合物根本不含水。相比之下，术语“基本上不含水”旨在涵盖其中疏水载体仍可以包含少量水的实施方式——只要水存在于载体的非连续相中。例如，组合物的个体组分可以具有少量的结合水，该结合水可能未通过诸如冻干或蒸发的过程而被完全去除，并且某些疏水载体可包含溶解在其中的少量水。总体上，本文公开的“基本上不含水”的组合物包含例如少于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水——组合物的载体组分的总重量的重量/重量基准。仍然包含少量水的组合物不包含足以使乳液形成的量的水。
本文公开的药物组合物是稳定的。“稳定”是指脂质和治疗剂保持溶解在疏水载体中的形式。这是本公开的组合物的有利性质。例如，在涉及多种治疗剂(例如肽抗原)的实施方式的环境下，可以在不经基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性预选的情况下将多种治疗剂配制在一起。该组合物抵抗通常在将具有不同特征(例如长度、序列分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性)的治疗剂配制在一起时出现的共溶问题。
在一种实施方式中，组合物的稳定性可以基于制备澄清或略微混浊溶液制剂的能力。在一种实施方式中，组合物的稳定性可以基于制备澄清溶液制剂的能力。“澄清溶液”是指溶液没有浑浊或不清的表观。在一种实施方式中，这可以视觉上由肉眼通过观察澄清溶液或通过使用分光光度计进行测量来确定。在一种实施方式中，可以根据EuropeanPharmacopoeia(Ph.Eur.)，第9版，第2.9.20章视觉上检查组合物。
在一种实施方式中，组合物的稳定性可以基于制备无可见析出物的制剂的能力。“可见析出物”是指位于容纳组合物的容器的壁上或组合物溶液中的析出物。在一种实施方式中，这可以视觉上由肉眼通过观察析出物不存在或通过使用分光光度计进行测量来确定。在一种实施方式中，可以根据欧洲药典(Ph.Eur.)，第9版，第2.9.20章视觉上检查组合物。
在一种实施方式中，组合物的稳定性可以基于在干燥脂质/治疗剂制剂中观察到的治疗剂稳定性。例如，组合物的稳定性可以基于经1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更长储存时间基本上恒定的治疗剂浓度。在一种实施方式中，可以通过如本文其它部分描述的HPLC分析来确定治疗剂浓度。干燥制剂中治疗剂的稳定性表示其稳定溶解在疏水载体中的能力。
在一种实施方式中，可以通过考虑下列中的一项或多项来进一步评价组合物的稳定性：治疗剂和/或脂质的鉴定和定量——包括杂质和/或降解物的鉴定(例如通过RP-HPLC)、具有单层脂质组装体的脂质基结构的颗粒大小(例如通过SAXS)；光学密度、粘度(例如根据Ph.Eur.2.2.9)；可提取的体积，如从注射器中提取的体积(例如，根据Ph.Eur.2.9.17)和免疫原性测定(例如ELISpot)。
在一种实施方式中，在溶解在疏水载体中后，本文公开的组合物稳定至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或更长时间。
如上所述，本文公开的药物组合物包含具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构。如本文所用，术语“脂质基结构”是指任何由脂质形成的结构。形成具有单层脂质组装体的脂质基结构的脂质是与本文所述的形成大小设定的脂质囊泡颗粒的脂质相同的脂质。
有多种脂质基结构可以形成，并且本文公开的组合物可以包含具有单层脂质组装体的单一类型的脂质基结构或包含不同的脂质基结构的混合物。
在一种实施方式中，具有单层脂质组装体的脂质基结构部分或完全包围治疗剂。作为一个实例，脂质基结构可以是包围治疗剂的封闭囊泡结构。在一种实施方式中，囊泡结构中的脂质的疏水部分向外朝向疏水载体定向。
作为另一实例，具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构可包含脂质的聚集体，其中脂质的疏水部分向外朝向疏水载体定向，并且脂质的亲水部分聚集作为核心。这些结构不一定形成连续的脂质层膜。在一种实施方式中，其是单体脂质的聚集体。
在一种实施方式中，具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包含反胶团。水溶液中的典型胶团形成聚集体，其中亲水部分与周围水溶液接触，隔离胶团中心的疏水部分。相比之下，在疏水载体中，形成逆/反胶团，其中疏水部分与周围的疏水溶液接触，隔离胶团中心的亲水部分。球形反胶团可以在其核心(即内部环境)内包装具有亲水亲和力的治疗剂。
在非限制的情况下，具有单层脂质组装体的脂质基结构的大小在直径2nm(20A)至20nm(200A)的范围内。在一种实施方式中，具有单层脂质组装体的脂质基结构的大小在直径约2nm至约10nm之间。在一种实施方式中，具有单层脂质组装体的脂质基结构的大小为直径约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、约7nm、约8nm、约9nm或约10nm。在一种实施方式中，脂质基结构的最大直径为约4nm或约6nm。在一种实施方式中，这些大小的脂质基结构是反胶团。
在一种实施方式中，一种或多种治疗剂在溶解于疏水载体中之后处于脂质基结构内部。“脂质基结构内部”是指治疗剂基本上被脂质包围，使得治疗剂的亲水性组分不暴露于疏水载体。在一种实施方式中，脂质基结构内的治疗剂主要是亲水的。
在一种实施方式中，一种或多种治疗剂在溶解于疏水载体中后处于脂质基结构外部。“脂质基结构外部”是指治疗剂没有被隔离在单层脂质组装体内部的环境内。在一种实施方式中，脂质基结构外部的治疗剂主要是疏水的。
本文公开的药物组合物包含至少一种治疗剂。示例性治疗剂在本文其它部分被描述，并非限制。
在一种实施方式中，治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸(例如mRNA)、激素、细胞因子、变应原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA(例如siRNA或miRNA)、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其中任一种的片段或衍生物；或其混合物。
在具体实施方式中，治疗剂是一种或多种肽抗原。如本文所用，术语“肽抗原”是作为蛋白质或多肽的抗原。可用于组合物的肽抗原的示例性实施方式在本文中被描述，但非限制。
在一种实施方式中，组合物包含单一肽抗原。在一种实施方式中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同的肽抗原。在一种实施方式中，组合物包含5至30种不同的肽抗原、10至20种不同的肽抗原、或10至15种不同的肽抗原。在一种实施方式中，组合物包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽抗原。在一种实施方式中，组合物包含14种不同的肽抗原。
“不同的”肽抗原是指药物组合物中的肽抗原均不具有相同的氨基酸序列。抗原可以源自相同的来源(例如，病毒、细菌、原生动物、癌细胞等)或源自相同的蛋白质，但是其不具有相同的序列。
在一种实施方式中，组合物中的各肽抗原可以独立地为5至120个氨基酸的长度、5至100个氨基酸的长度、5至75个氨基酸的长度、5至50个氨基酸的长度、或5至30个氨基酸的长度。在一种实施方式中，组合物中的肽抗原可以独立地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的长度。在一种实施方式中，组合物中的肽抗原可以独立地为20至30个氨基酸的长度。各肽抗原可以长度相同或不同或其任何组合。在一种实施方式中，肽抗原的长度均为27个氨基酸。
在一种实施方式中，所述一种或多种肽抗原源自人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、疟原虫(Plasmodium)和/或存活蛋白多肽。
在一种实施方式中，所述一种或多种肽抗原源自RSV，如例如NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)和/或NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)。
在一种实施方式中，组合物中的一种或多种肽抗原是癌症相关肽抗原。在一种实施方式中，组合物中的所有肽抗原是癌症相关肽抗原。可用于本文公开的组合物的癌症相关肽抗原的示例性实施方式在下文被描述，但非限制。在一种实施方式中，癌症相关肽抗原可以是一种或多种存活蛋白抗原，如但不限于本文所述的那些。
在一种实施方式中，所述一种或多种肽抗原是FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；或其任何组合。在一种实施方式中，组合物包含全部五种这些肽抗原(SEQ ID NO：4至7)。
在一种实施方式中，组合物中的一种或多种肽抗原是新抗原。在一种实施方式中，组合物中的所有肽抗原都是新抗原。下文描述了可用于本文公开的组合物的新抗原的示例性实施方式，但非限制。在一种实施方式中，组合物是包含多种新抗原如10至30种新抗原的组合物。
在一种实施方式中，肽抗原不经基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征预选。在一种实施方式中，组合物中的肽抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。例如，肽抗原可以具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
在本文公开的组合物的实施方式中，每种肽抗原独立地处于约0.05μg/μl至约10μg/μl、0.1μg/μl至约5.0μg/μl或约0.5μg/μl至约1.0μg/μl之间的浓度。在本文公开的组合物的实施方式中，每种肽抗原独立地处于约0.1μg/μl、0.25μg/μl、约0.5μg/μl、约0.75μg/μl、约1.0μg/μl、约1.25μg/μl、约1.5μg/μl、约1.75μg/μl、约2.0μg/μl、2.25μg/μl或约2.5μg/μl的浓度。“独立地”是指组合物中每种肽抗原的量独立于任何其它肽抗原的量，并且因此每种对应的肽抗原可以具有与任何其它肽抗原相同或不同的浓度。在一种实施方式中，组合物中的每种肽抗原都处于约0.5μg/μl的浓度。
在一种实施方式中，药物组合物包含10种或更多种不同的肽抗原，并且每种肽抗原的浓度为至少约0.5μg/μl。在一种实施方式中，这10种或更多种肽抗原中的每一种独立地长度为20-30个氨基酸。
本文公开的药物组合物包含疏水载体。如本文所用，“疏水载体”是指液体疏水性物质。术语“疏水载体”在本文中可互换地称为“油基载体”。
疏水载体可以是基本上单纯的疏水物质或疏水物质的混合物。在本文所述的方法和组合物中有用的疏水性物质是药学和/或免疫学上可接受的。载体通常在室温(例如约18-25℃)下为液体，但是某些在室温下不是液体的疏水性物质可以例如通过加热而液化，并且也可以是有用的。
油或油混合物是特别适用于本文公开的方法和组合物的载体。油应该是药学和/或免疫学上可接受的。适合的油包括例如矿物油(特别是轻质或低粘度矿物油，如
Figure BDA0002388629480000301
6VR)、植物油(例如大豆油，如MS80)、坚果油(例如花生油)或其混合物。因此，在一种实施方式中，疏水载体是疏水性物质，如植物油、坚果油或矿物油。也可以使用动物脂肪和人造疏水性聚合物材料，特别是在环境温度下为液体或可相对容易液化的那些。
在一些实施方式中，疏水载体可以是或包含：不完全弗氏佐剂(IFA)，一种基于矿物油的模型疏水载体。在另一实施方式中，疏水载体可以是或包含在矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯，如可作为
Figure BDA0002388629480000302
ISA 51(SEPPIC，法国)商购的那种。尽管这些载体常用于制备油包水乳液，但本发明涉及无水组合物。由此，这些载体在本文公开的方法和组合物中没有被水乳化。
在一种实施方式中，疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
在一种实施方式中，疏水载体是
Figure BDA0002388629480000303
ISA 51。
在一种实施方式中，疏水载体是MS80油，即矿物油(Sigma Aldrich)和Span80(Fluka)的混合物。这些组分可以被单独购买并在使用前混合。
本文公开的组合物可进一步包含一种或多种本领域已知的其它组分(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA1985；和The United States Pharmacopoeia:The National Formulary(USP 24NF19)，公开于1999)。
在一种实施方式中，组合物可另外包含佐剂、T辅助表位、表面活性剂和/或赋形剂。可以使用的佐剂、T辅助表位和表面活性剂的示例性和非限制性实施方式描述如下。在一种实施方式中，如果治疗剂是一种或多种肽抗原，则组合物包含T辅助表位和/或佐剂。
在一种实施方式中，药物组合物是澄清溶液。在一种实施方式中，药物组合物没有可见的析出物。
制备本文公开的组合物的能力可具有显著的优势，特别是在涉及新抗原的个性化癌症药物领域。
关于这点，在一种实施方式中，本公开涉及稳定的无水药物组合物，其包含具有单脂质层组装体的一种或多种脂质基结构、五种或更多种不同的肽新抗原、和疏水载体，其中肽新抗原不经基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。在此实施方式中，术语“稳定”和“无水”如本文所述具有相同的含义。而且，具有单个脂质层组装体的脂质基结构和疏水载体如本文所述。
在新抗原组合物的实施方式中，新抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
如本文所述，包含新抗原的药物组合物涉及特别的考虑因素，因为其通常必须在数周内配制以促进免疫接种后的有效免疫响应。时间安排是至关重要的，并且构成很大的障碍。与其它类型的药物制剂不同，通常有很少或没有时间进行基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性选择适合的肽抗原的步骤。没有这些选择步骤的情况则难以配制具有多于甚至一种肽抗原的稳定且治疗有效的药物组合物。
然而，如实施例4中所示，在不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的特征进行预选的情况下，多种肽新抗原能够被溶解在单一组合物中。因此，认为该组合物将缓解进行费时的选择步骤以鉴定对于个性化疫苗所谓“最佳”的抗原的需求。相反，本文公开的组合物允许多种不同的肽新抗原(例如五种或更多种)各自均以有效量被包含，以诱导免疫响应，而无需抗原选择步骤。事实上，如本文所示，即使在肽抗原有效载荷大的情况下，新抗原组合物在单次给予后也保持促进快速和增强的免疫响应的能力(实施例6；图17)。
免疫响应和治疗适应症
本文公开的组合物可以用于在需要向对象给予治疗剂的任何情况下。对象可以是脊椎动物，如鱼、鸟或哺乳动物。在一种实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一种实施方式中，对象是人。
在一种实施方式中，该组合物可以用于治疗、预防或诊断治疗剂所针对的疾病、障碍或状况的方法。在一种实施方式中，该方法包括向对象给予如本文所述的药物组合物。
在一种实施方式中，该组合物可以用于在对象中调节免疫响应的方法。如本文所用，术语“调节”意图指代免疫刺激(例如，诱导或增强免疫响应)和免疫抑制(例如，预防或减少免疫响应)。通常，该方法将涉及免疫刺激或免疫抑制中的一种或另一种，但可以是该方法同涉及两者。如本文所述，“免疫响应”可以是细胞介导的(CTL)免疫响应或抗体(体液)免疫响应。
在一些实施方式中，本文公开的组合物可以用于诱导细胞介导的对治疗剂(例如肽抗原)的免疫响应。
如本文所用，“诱导”免疫响应是引起和/或增强免疫响应。诱导免疫响应包括相对于在前的免疫响应状态，例如在给予本文公开的组合物之前，引发、增强、升高、改善或增强免疫响应以益于宿主的情况。
如本文所用，术语“细胞介导的免疫响应”、“细胞免疫”、“细胞免疫响应”或“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫响应”(本文可互换地使用)是指特征如下的免疫响应：巨噬细胞和天然杀伤细胞激活，响应于抗原产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞和/或释放各种细胞因子。细胞毒性T淋巴细胞是能够引起被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞(一类白细胞)亚组；其杀死被病毒(或其它病原体)感染的细胞或者以前其它方式损坏或功能失调的细胞。
大多数细胞毒性T细胞表达可以识别与I类MHC分子结合的特定肽抗原的T细胞受体。通常，细胞毒性T细胞还表达CD8(即CD8+T细胞)，其被吸引至I类MHC分子的部分。这种亲和力使细胞毒性T细胞和靶细胞在抗原特异性激活过程中紧密结合在一起。
细胞免疫保护身体，通过例如激活能够溶解其表面上显示外源或突变抗原表位的体细胞(如显示肿瘤特异性抗原(例如新抗原)的癌细胞)的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(例如抗原特异性CD8+T细胞)；激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，使其能够破坏细胞内病原体；和刺激细胞分泌各种细胞因子，该细胞因子影响适应性免疫响应和先天性免疫响应所涉及的其它细胞的功能。
细胞免疫是适应性免疫响应的重要组分，并且在细胞通过其与抗原呈递细胞(如树突状细胞、B淋巴细胞，以及在较小程度上，巨噬细胞)相互作用而识别抗原后，通过各种机制保护身体，如：
1.激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，其能够引起在其表面上显示外源或突变抗原表位的身体细胞如显示肿瘤特异性抗原的癌细胞的凋亡；
2.激活巨噬细胞和天然杀伤细胞，使其能够破坏细胞内病原体；和
3.刺激细胞分泌各种细胞因子，该细胞因子影响适应性免疫响应和先天性免疫响应所涉及的其它细胞的功能。
细胞介导的免疫最有效在于在除被病毒感染的细胞，但也参与针对真菌、原生动物、癌症和细胞内细菌的防御。其还在移植排斥中起主要作用。
由于细胞介导的免疫涉及各种细胞类型的参与并且通过不同的机制介导，可以使用几种方法来证明疫苗接种后的免疫诱导。这些可以宽泛分类为检测：i)特定抗原呈递细胞；ii)特定效应细胞及其功能；以及iii)可溶性介体(mediators)如细胞因子的释放。
i)抗原呈递细胞：树突状细胞和B细胞(以及在较小程度上，巨噬细胞)配备有允许增强T细胞激活的特殊免疫刺激受体，并且被称为专业抗原呈递细胞(APC)。在抗原呈递给效应细胞(如CD4和CD8细胞毒性T细胞)的过程中，这些免疫刺激分子(也称为共刺激分子)在感染或疫苗接种后在这些细胞上被上调。这种共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86、I类MHC或II类MHC)可被检测，例如通过利用流式细胞术，使用针对这些分子的荧光色素缀合抗体以及特异性识别APC的抗体(如CD 11c，用于树突状细胞)。
ii)细胞毒性T细胞：(也称为Tc、杀伤性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))是T细胞的一个亚组，可诱导被病毒(和其它病原体)感染或表达肿瘤抗原的细胞死亡。这些CTL直接攻击表面上带有某些外来或异常分子的其它细胞。这种细胞的细胞毒性的能力可以利用体外细胞溶解测定(铬释放测定)来检测。因此，适应性细胞免疫的诱导可以通过这种细胞毒性T细胞的存在证明，其中当抗原负载靶细胞通过疫苗接种或感染后体内产生的特异性CTL而溶解时。
幼稚细胞毒性T细胞在其T细胞受体(TCR)与肽结合的MHCI类分子强烈相互作用时被激活。这种亲和力取决于抗原/MHC复合物的类型和定向，是保持CTL和被感染细胞结合在一起的原因。在激活后，CTL经历一个被称为克隆扩增的过程，在该过程中其获得功能并迅速分裂，从而产生一批“武装”效应细胞。然后，激活的CTL将行遍全身，寻找承载该独特MHCI类+肽的细胞。这可用于体外通过在流式细胞术分析中使用肽-MHC I类四聚体而识别这种CTL。
当暴露于这些感染或功能失调的体细胞时，效应CTL释放穿孔素和颗粒溶素：在靶细胞的质膜中形成孔，使离子和水流入被感染的细胞，并使其破裂或溶解的细胞毒素。CTL释放粒酶，一种通过孔进入细胞以引起凋亡(细胞死亡)的丝氨酸蛋白酶。这些分子从CTL的释放可以用作疫苗接种后成功诱导细胞介导的免疫响应的度量。这可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点测定来完成(ELISPOT)，其中可以定量测量CTL。由于CTL还能够产生重要的细胞因子如IFN-γ，可以通过ELISPOT以及通过流式细胞术测量这些细胞中的细胞内IFN-γ来实现对产生IFN-γ的CD8细胞的定量测量。
CD4+“辅助”T细胞：CD4+淋巴细胞或辅助T细胞是免疫响应介体，并且在建立和最大化适应性免疫响应的能力中起重要作用。这些细胞没有细胞毒性或吞噬活性；并且不能杀死被感染的细胞或清除病原体，但实质上通过指导其它细胞进行这些任务来“管理”免疫响应。可以由专业APC诱导两种类型的效应CD4+T辅助细胞响应，命名为Th1和Th2，每种均被设计以消除不同类型的病原体。
辅助T细胞表达识别与II类MHC分子结合的抗原的T细胞受体(TCR)。幼稚辅助T细胞的激活导致其释放细胞因子，其影响多种细胞类型的活性，包括激活其APC。辅助T细胞比细胞毒性T细胞需要更温和的激活刺激。辅助T细胞可以提供另外的信号，该信号“帮助”激活细胞毒性细胞。可以由专业APC诱导两种类型的效应CD4+T辅助细胞响应，命名为Th1和Th2，每种均被设计以消除不同类型的病原体。这两个Th细胞群体在产生的效应蛋白(细胞因子)的图谱方面不同。总体上，Th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性T细胞来辅助细胞介导的免疫响应。而Th2细胞则通过刺激B细胞转化为浆细胞和通过形成抗体来促进体液免疫响应。例如，由Th1细胞调控的响应可在小鼠中诱导IgG2a和IgG2b(在人中为IgG1和IgG3)，并促进细胞介导的对抗原的免疫响应。如果对抗原的IgG响应被Th2型细胞调控，则其可主要增强小鼠中IgG1(人体中IgG2)的产生。与Th1或Th2响应相关的细胞因子的度量将给出成功疫苗接种的度量。这可以通过针对Th1-细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α等、或Th2-细胞因子如IL-4、IL-5、IL10等设计的特异性ELISA来实现。
iii)细胞因子的测量：从区域性淋巴结释放很好地指示免疫接种成功。由于抗原呈递以及APC和免疫效应细胞(如CD4和CD8 T细胞)的成熟，淋巴结细胞释放了几种细胞因子。通过在抗原存在的情况下体外培养这些LNC，可以通过测量是否释放某些重要的细胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α和GM-CSF)来检测抗原特异性免疫响应。这可以使用培养上清液和重组细胞因子作为标准品通过ELISA进行。
可以通过技术人员已知的多种方式来确定成功的免疫，包括但不限于血凝抑制(HA)和血清中和抑制测定，以检测功能性抗体；挑战研究，其中用相关病原体挑战经疫苗接种的对象，以确定疫苗接种的效力；以及荧光激活细胞分选(FACS)的应用，以确定表达特定细胞表面标志物的细胞群体(例如在激活或记忆淋巴细胞的鉴定中。技术人员还可以利用其它已知方法确定用本文公开的组合物免疫接种是否引发抗体和/或细胞介导的免疫响应。参见，例如，Coligan et al.,ed.Current Protocols in Immunology,WileyInterscience,2007。
在一种实施方式中，本文公开的组合物能够针对组合物中的一种或多种治疗剂(例如肽抗原)产生增强的细胞介导的免疫响应，该免疫响应至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍大于在水基疫苗制剂溶液中配制抗原时。“水基疫苗”是指除了用水性载体代替疏水载体和水基疫苗不包含脂质基结构外，包含与本文公开的组合物相同的组分的疫苗。
在一种实施方式中，本文公开的组合物能够通过仅单次给予所述组合物产生增强的细胞介导的免疫响应。因此，在一种实施方式中，本文公开的组合物用于通过单次给药递送治疗剂(例如肽抗原)。
在一种实施方式中，本文公开的组合物可用于诱导对治疗剂(例如肽抗原)的抗体免疫响应。
“抗体免疫响应”或“体液免疫响应”(在本文中可互换地使用)，与细胞介导的免疫相反，由在B淋巴细胞谱系(B细胞)的细胞中产生的分泌抗体介导。这种分泌的抗体结合至抗原，如例如外源物质、病原体(例如病毒、细菌等)和/或癌细胞表面上的抗原，并标示其以破坏。
如本文所用，“体液免疫响应”是指抗体产生，并且还可以另外地或替代地包括其伴随的辅助过程，如例如T辅助2(Th2)细胞或T辅助17(Thl7)细胞的产生和/或激活、细胞因子产生、同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞激活。“体液免疫响应”还可以包括抗体的效应功能，例如毒素中和、经典补体激活以及吞噬作用和病原体消除的促进。体液免疫响应通常由CD4+Th2细胞辅助，因此这种细胞类型的激活或产生也可指示体液免疫响应。
“抗体”是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一个或多个多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别限定了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括含有四个多肽的蛋白质。每个抗体结构单元由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链和一个“重”链。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的可变区。抗体结构单元(例如，IgA和IgM类别)也可以彼此和与另外的多肽链组装成寡聚形式，例如与J链多肽结合的IgM五聚体。
抗体是被称为B淋巴细胞(B细胞)的白细胞子组的抗原特异性糖蛋白产物。抗原与B细胞表面表达的抗体的结合可以诱导抗体响应，包括B细胞刺激，以被激活，以发生有丝分裂和以最终分化为浆细胞，这些浆细胞专门用于抗原特异性抗体的合成和分泌。
B细胞是免疫响应期间抗体的唯一产生者，因此是有效体液免疫的关键元素。除了产生大量抗体外，B细胞还充当抗原呈递细胞，并且可以向T细胞(如T辅助CD4或细胞毒性CD8+T细胞)呈递抗原肽，从而扩大免疫响应。B细胞以及T细胞是适应性免疫响应的一部分。在例如通过疫苗接种或自然感染诱导的主动免疫响应过程中，抗原特异性B细胞被激活并克隆扩增。在扩增过程中，B细胞进化为对表位具有更高的亲和力。B细胞的增殖可以通过激活的T辅助细胞间接诱导，也可以直接通过刺激受体(如TLR)来诱导。
抗原呈递细胞，如树突状细胞和B细胞，被吸引到疫苗接种位点，并且可以与疫苗组合物中包含的抗原和佐剂相互作用。通常，佐剂刺激细胞激活，并且抗原提供靶标蓝图。不同类型的佐剂可以向细胞提供不同的刺激信号。例如，聚L：C(TLR3激动剂)可以激活树突状细胞，但不能激活B细胞。佐剂(如Pam3Cys、Pam2Cys和FSL-1)尤其擅长激活和引起B细胞的增殖，这预期促进抗体响应的产生(Moyle 2008；So 2012)。
体液免疫响应是有效感染性疾病疫苗的常用机制之一(例如，预防病毒或细菌入侵者)。但是，体液免疫响应也可用于抗击癌症。尽管癌症疫苗通常被设计以产生可识别和破坏癌细胞的细胞介导的免疫响应，但B细胞介导的响应可通过其它机制靶向癌细胞，该其它机制在某些情况下可与细胞毒性T细胞合作发挥最大益处。B细胞介导的(例如体液免疫响应介导的)抗肿瘤响应的实例包括但不限于：1)由B细胞产生的与肿瘤细胞或影响肿瘤发生的其它细胞上发现的表面抗原(例如新抗原)结合的抗体。这种抗体可例如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体固定而诱导诱导靶细胞杀伤，可能导致可被免疫系统识别的其它抗原释放。2)与肿瘤细胞上的受体结合以阻断其刺激并事实上中和其作用的抗体；3)与肿瘤或肿瘤相关细胞释放或相关的因子结合以调节支持癌症的信号传导或细胞途径的抗体；和4)结合细胞内靶标并通过目前未知的机制介导抗肿瘤活性的抗体。
评价抗体响应的一种方法是测量与具体抗原具有反应性的抗体的滴度。这可以利用本领域中已知的多种方法来进行，如从动物获得的含抗体物质的酶联免疫吸附测定(ELISA)。例如，可以在暴露于抗原之前和之后确定对象中与具体抗原结合的血清抗体的滴度。暴露于抗原后的抗原特异性抗体效价的统计学显著增加将表明对象已经对抗原建立了抗体响应。
在非限制的情况下，可以用于检测抗原特异性抗体的存在的其它测定包括免疫测定(例如放射免疫测定(RIA))、免疫沉淀测定和蛋白质印迹(例如Western印迹)测定；和中和测定(例如，体外或体内测定中病毒感染性的中和)。
本文公开的组合物可用于治疗或预防由细胞介导的免疫响应或体液免疫响应改善的疾病和/或障碍。本文公开的组合物可应用于需要向对象给予治疗剂(例如肽抗原)以诱导细胞介导的免疫响应或体液免疫响应的任何情况。在一种实施方式中，该组合物可应用于递送个性化疫苗，例如其包含新抗原。
在一种实施方式中，本公开涉及一种方法，该方法包括将本文所述的组合物给予有此需要的对象。在一种实施方式中，该方法用于治疗和/或预防对象的疾病、障碍或状况。在一种实施方式中，该方法用于治疗和/或预防感染性疾病或癌症。
在一种实施方式中，该方法用于在所述对象中诱导针对治疗剂(例如肽抗原)的抗体免疫响应和/或细胞介导的免疫响应。在一种实施方式中，这种方法用于治疗和/或预防感染性疾病或癌症。
如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment of”)或“预防”(“preventing”或“prevention of”)是指获得有益或期望结果的方法。有益或期望结果可包括但不限于一种或多种症状或状况的减轻或改善、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定化、疾病发展的预防、疾病扩散的预防、疾病进展的延迟或减缓(例如抑制)、疾病发作的延迟或减缓、赋予针对致病剂(disease-causing agent)的保护性免疫以及疾病状态的改善或缓和。“治疗”或“预防”还可以意为延长患者的存活期超过在无治疗下预期的存活期，并且还可以意为暂时抑制疾病的进展或预防疾病的发生——如通过预防对象的感染。“治疗”或“预防”还可以指肿瘤团大小减小、肿瘤的侵袭性减小等。
“治疗”与“预防”可区别在于“治疗”通常发生在已经患有疾病或障碍或已知已经暴露于感染剂(infectious agent)的对象中，而“预防”通常发生在未患有疾病或障碍或者非已知暴露于感染剂的对象中。如将理解，治疗和预防可存在重叠。例如，可以“治疗”对象中的疾病，同时“预防”该疾病的症状或进展。此外，至少在疫苗接种的情况下，“治疗”和“预防”可以重叠，因为对对象的治疗是诱导免疫响应，其可具有预防被病原体感染或预防由该病原体感染引起的潜在疾病或症状的后续效果。这些预防方面在本文中通过诸如“感染性疾病的治疗”或“癌症的治疗”的表述而被涵盖。
在一种实施方式中，本文公开的组合物可用于在有需要的对象中治疗和/或预防感染性疾病，如由病毒感染引起。对象可感染病毒或可有产生病毒感染的危险。病毒感染可以通过使用或给予本文公开的组合物来治疗和/或预防，非限制地有牛痘病毒(Cowpoxvirus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、假单痘病毒、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、巨细胞病毒、人腺病毒AF、多瘤病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、细小病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、正呼肠病毒、轮状病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、肺病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、狂犬病病毒、加利福尼亚脑炎病毒、日本脑炎病毒、汉坦病毒、淋巴细胞性脑膜炎病毒、冠状病毒、肠病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒、黄病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒和水痘。在具体实施方式中，病毒感染是人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、呼吸道合胞体病毒或流感病毒。
在一种实施方式中，本文公开的组合物可用于治疗和/或预防在需要其的对象中的感染性疾病，如由非病毒病原体(如细菌或原生动物)引起。对象可被病原体感染或可有产生病原体感染的风险。非限制性地，示例性细菌病原体可以包括炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、布鲁氏菌(Brucella)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、念珠菌(Candida)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、霍乱(Cholera)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、隐球菌(Cryptococcus)、白喉(Diphtheria)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、军团菌(Legionella)、钩端螺旋体(Leptospira)、李斯特菌(Listeria)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、分枝杆菌(Mycobacterium)、百日咳(Pertussis)、肺炎(菌)(Pneumonia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)。在具体实施方式中，细菌感染是炭疽。非限制地，示例性原生动物病原体可以包括引起疟疾的疟原虫(Plasmodium)属(镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)或诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi))。
在一种实施方式中，本文公开的组合物可用于治疗和/或预防有此需要的对象的癌症。对象可患有癌症或可有癌症罹患风险。
如本文所用，术语“癌症”、“癌细胞”、“肿瘤”和“肿瘤细胞”(可互换地使用)是指呈现异常生长的细胞，其特征在于对细胞增殖或永生细胞的控制显著丧失。术语“癌症”或“肿瘤”包括转移性和非转移性癌症或肿瘤。可以使用本领域普遍接受的标准来诊断癌症，包括恶性肿瘤的存在。
非限制地，可以通过使用或给予本文公开的组合物来治疗和/或预防的癌症包括癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、母细胞瘤、骨髓瘤和生殖细胞肿瘤。非限制地，特别适合的实施方式可以包括胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、前列腺癌或腹膜癌。在一种实施方式中，癌症可以由病原体如病毒引起。与癌症发展相关的病毒是技术人员已知的，包括但不限于人乳头瘤病毒(HPV)、John Cunningham病毒(JCV)、人疱疹病毒8、Epstein Barr尔病毒(EBV)、Merkel细胞多瘤病毒、丙型肝炎病毒和人T细胞白血病病毒-1。在一种实施方式中，癌症是表达一种或多种肿瘤特异性新抗原的癌症。
在具体实施方式中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、输卵管癌、腹膜癌、成胶质细胞瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。
本文公开的方法和组合物可用于治疗或预防癌症；例如，降低癌症严重程度(例如肿瘤大小、侵袭性和/或入侵性、恶性等)或预防癌症复发。
在一种实施方式中，用于治疗和/或预防癌症的方法首先包括鉴定患者肿瘤细胞中的一种或多种新抗原或新表位。技术人员将理解本领域已知的可用于鉴定一种或多种新抗原的方法(参见，例如，Srivastava 2015及其中引用的参考文献)。作为示例性实施方式，全基因组/外显子组测序可用于鉴定独特地存在于个体患者的肿瘤中的突变新抗原。可以分析被鉴定的新抗原的集合以选择(例如基于算法)具体的优化的新抗原和/或新表位子组，以用作个性化癌症疫苗。
鉴定和选择一种或多种新抗原后，本领域技术人员将理解，存在多种方式在体外或体内产生这种新抗原。可以通过本领域已知的任何方法来生产新抗原肽，然后可以将其配制成本文所述的组合物或试剂盒并给予于对象。
在一种实施方式中，在给予对象后，组合物在癌症的治疗中诱导肿瘤特异性免疫响应。这意味着免疫响应特异性地靶向肿瘤细胞，而对不表达新抗原的身体正常细胞没有显著影响。此外，在一种实施方式中，组合物可以包含至少一种患者特异性新表位，使得肿瘤特异性免疫响应对于对象或对象子组是患者特异性的，即个性化免疫治疗。
本文公开的组合物可以通过任何适合的途径给予。在一种实施方式中，给予途径是皮下注射。
在组合物用于注射给药的实施方式中，本文公开的药物组合物可以配制成微剂量。如本文所用，“微剂量体积”是指小于100μl的单剂量体积。在一些实施方式中，微剂量体积为约50μl、约55μl、约60μl、约65μl、约70μl、约75μl、约80μl、约85μl、约90μl或约95μl的组合物。在一些实施方式中，微剂量体积为约50μl至约75μl的组合物。在一些实施方式中，微剂量体积为约50μl或精确50μl。在一种实施方式中，通过实践本文公开的方法和使用本文公开的组合物，微剂量体积能够与多种不同的肽抗原一起以微剂量中大于5μg的总肽抗原浓度配制，并且微剂量体积能够在人对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应。
试剂盒
本文公开的组合物任选地作为试剂盒提供给使用者。在一种实施方式中，试剂盒用于制备用于治疗、预防和/或诊断疾病、障碍或状况的组合物。在一种实施方式中，试剂盒用于制备用于诱导抗体和/或CTL免疫响应的组合物。
在一种实施方式中，本公开的试剂盒包括包含通过本文公开的方法制备的干燥脂质/治疗剂制剂的容器和包含疏水载体的容器。干燥脂质/治疗剂制剂可以是本文所述那些的任意种。在一种实施方式中，干燥脂质/治疗剂制剂包含十种或更多种不同的肽抗原。在一种实施方式中，肽抗原是新抗原。疏水载体如本文所述，并且在一种实施方式中是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
在另一实施方式中，本公开的试剂盒包括包含通过本文公开的方法制备的干燥脂质/治疗剂制剂的容器。在这种实施方式中，试剂盒不包括疏水载体，而是疏水载体被单独提供或已经被最终使用者拥有。在一种实施方式中，干燥脂质/治疗剂制剂包含十种或更多种不同的肽抗原。在一种实施方式中，肽抗原是新抗原。
试剂盒可进一步包含一种或多种其它试剂、包装材料以及详细说明使用试剂盒组分的优选方法的说明书或使用者手册。在一种实施方式中，容器是小瓶。
方法、干燥制剂、组合物、用途&试剂盒的组分
本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒联用或包含一种或多种治疗剂，并且可以进一步非限制地联用或包含一种或多种另外的组分，如例如T辅助表位、佐剂和表面活性剂。尽管本文描述了这些组分的示例性实施方式，但将理解，也可以使用其它组分，如赋形剂、防腐剂或其它非活性成分。
如本文所用，术语“治疗剂”不包括或涵盖T辅助表位或佐剂，其在下文被单独描述，并且是本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒可包含或可不包含的不同组分。此外，在一种实施方式中，只有在治疗剂是抗原时才包括T辅助表位和/或佐剂。
治疗剂
可用于本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒中的治疗剂包括能够在疾病、障碍或状况的治疗或预防中提供治疗活性、响应或作用的任何分子、物质或化合物，包括诊断和预防剂。术语“治疗剂”包括常称为“活性药物成分”或“活性成分”的分子、化合物和物质或其部分，其代表药物的生物活性成分。
如本文所用，“治疗剂”不是T辅助表位或佐剂，其在下面被单独描述。
治疗剂包括抗原、药物和其它剂，包括但不限于在美国药典(United StatesPharmacopeia)和其它已知药典中列出的那些。在有或无任何化学修饰的情况下，治疗剂可用于本发明的实践。治疗剂包括蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、多糖和药物(例如小分子或生物制剂(biologics))。
在一种实施方式中，治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸、激素、细胞因子、变应原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制多种不同治疗剂的混合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同治疗剂的混合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制10-20种不同治疗剂的混合物。
在涉及多种不同治疗剂的实施方式中，一方面，所有治疗剂可以是相同类型(例如，全部肽抗原、全部小分子药物、全部编码多肽的多核苷酸、等)。在其它方面，治疗剂可以是不同类型(例如，一种或多种肽抗原与一种或多种小分子药物组合)。
在一种实施方式中，治疗剂是与水溶液或疏水溶液中的一者或两者不相容(例如不溶或不稳定)的治疗剂。在一种实施方式中，治疗剂是亲水的或基本上亲水的，并且在疏水环境中不是天然相容的。在一种实施方式中，治疗剂是疏水的或基本上疏水的，并且在亲水(例如水性)环境中不是天然相容的。在一种实施方式中，治疗剂是与大小挤出程序不相容的治疗剂(例如，在通过膜高压挤出下(例如5000psi背压和0.22μm膜)析出)。
治疗剂的示例性实施方式在下文描述，而非限制。
肽抗原
在一种实施方式中，治疗剂是一种或多种肽抗原。
在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备包含单一肽抗原的药物组合物。在一种实施方式中，本文公开的方法可以用于制备包含上至30种或更多种不同的溶解肽抗原的药物组合物。
在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备包含两种或更多种不同肽抗原的药物组合物。在一种实施方式中，本文公开的方法可以用于制备包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同肽抗原的药物组合物。在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备药物组合物，所述药物组合物包含2至30种不同的溶解肽抗原、5至30种不同的肽抗原、10至20种不同的肽抗原、或10至15种不同的肽抗原。在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备包含五种或更多种不同的溶解肽抗原的药物组合物。在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同肽抗原的药物组合物。
如本文所用，术语“抗原”是指可以与免疫系统的组分特异性结合的任何物质或分子。在一些实施方式中，适合的抗原是能够在对象中诱导或产生免疫响应的那些。能够诱导免疫响应的抗原被称为具有免疫原性，并且也可以称为免疫原。因此，如本文所用，术语“抗原”包括免疫原，并且除非另外特别说明，该术语可以互换使用。
如本文所用，术语“肽抗原”是如上定义的属于蛋白质或多肽的抗原。在一种实施方式中，肽抗原可以源自微生物，如例如活的、减毒的、灭活的或被杀死的细菌、病毒或原生动物或其部分。在一种实施方式中，肽抗原可以源自动物如例如人，或与之基本相关的抗原。
如本文所用，术语“源自”非限制地包括：直接从起源来源(例如，对象)分离或获得的肽抗原；与源自起源来源的肽抗原相同或基本相关的合成的或重组产生的肽抗原；或者由起源来源的肽抗原或其片段制成的肽抗原。当称肽抗原“来自”来源时，术语“来自”可以等同于“源自”。在本文中，术语“基本相关”是指肽抗原可已经通过化学、物理或其它方式修饰(例如序列修饰)，但是所得产物仍然能够对原始肽抗原和/或原始抗原相关的疾病或障碍产生免疫响应。“基本相关”包括天然肽抗原的变体和/或衍生物。
在一种实施方式中，可以从天然来源分离肽抗原。在一些实施方式中，可以将肽抗原纯化至约90％至约95％纯、约95％至约98％纯、约98％至约99％纯、或大于99％纯。
在一种实施方式中，肽抗原可以重组产生，如例如通过体外或体内表达。
在一种实施方式中，肽抗原是基于天然靶蛋白的氨基酸序列的合成产生的多肽。肽抗原可以全部或部分使用本领域公知的化学方法(参见例如Caruthers 1980、Horn1980、Banga1995)合成。例如，肽合成可以使用各种固相技术(参见例如Roberge 1995、Merrifield 1997)进行，并且自动化合成可以例如使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)根据由制造商提供的说明实现。
如本文可互换地使用，术语“变体”或“修饰的变体”是指已经通过任何化学、物理或其它方式修饰的治疗剂以提供改变的治疗剂。修饰的变体可以与未修饰的对应物相比具有一种或多种改善的特性(例如溶解性、稳定性、活性等)。取决于治疗剂的类型(例如肽抗原、激素、催化性DNA或RNA等)，不同类型的修饰可在本领域中是已知的，并且可以用于制备修饰的变体。
在肽抗原的背景下，多种不同类型的肽修饰是本领域已知的，并且可以在本发明的实践中使用。例如但不限于，肽抗原可以被修饰以改善其溶解性、稳定性和/或免疫原性。可以进行的修饰的非限制性实例包括N端修饰、C端修饰、酰胺化、乙酰化、通过形成二硫桥而肽环化、磷酸化、甲基化、与其它分子(例如BSA、KLH、OVA)缀合、PEG化和纳入非天然氨基酸。
在一种实施方式中，修饰可以是氨基酸序列修饰，例如删除、取代或插入。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。在进行这样的改变时，可以基于侧链取代基的相对相似性，例如其大小、电荷、疏水性、亲水性等，进行相似氨基酸残基的取代，并且可以通过常规测试来测定这种取代对肽功能的影响。保守取代的具体非限制性实例包括以下实例：
原始残基 保守取代
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln、His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
His Asn、Gln
Ile Leu、Val
Leu Ile、Val
Lys Arg、Gln、Glu
Met Leu、Ile
Phe Met、Leu、Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Val Ile、Leu
在一种实施方式中，肽抗原可以为5至120个氨基酸的长度、5至100个氨基酸的长度、5至75个氨基酸的长度、5至50个氨基酸的长度、或5至30个氨基酸的长度。在一种实施方式中，肽抗原可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的长度。
在一种实施方式中，肽抗原的长度为20至30个氨基酸。在一种实施方式中，肽抗原的长度为27个氨基酸。
在一种实施方式中，肽抗原包含至少一个B细胞表位、至少一个CTL表位或其任何组合。
B细胞表位是被B细胞和被抗体识别的表位。B细胞肽表位的长度一般为至少五个氨基酸，更常为至少六个氨基酸，还更常为至少七个或八个氨基酸，并且可以是连续的(“线性的”)或不连续的(“构象的”)；后者例如通过折叠蛋白质以使一级氨基酸序列的非连续部分物理接近而形成。
CTL表位是细胞毒性T淋巴细胞识别的分子。CTL表位通常在抗原呈递细胞的表面上呈递，与MHC分子复合。如本文所用，术语“CTL表位”是指与抗原的天然CTL表位基本上相同的肽。CTL表位与其天然对应物相比可以被修饰，如被一个或两个氨基酸修饰。除非另有说明，本文中对CTL表位的提及是指能够被细胞摄取并呈递在抗原呈递细胞表面上的未结合分子。
CTL表位应一般是适于被T细胞受体识别以便可以发生细胞介导的免疫响应的抗原表位。对于肽，CTL表位可以与I类或II类MHC分子相互作用。通过MHC I类分子呈递的CTL表位通常是长度在8至15个氨基酸之间的肽，更通常是长度在9至11个氨基酸之间的肽。通过MHC II类分子呈递的CTL表位通常是长度在5到24个氨基酸之间的肽，更通常是长度在13到17个氨基酸之间的肽。如果抗原大于这些大小，其将被免疫系统加工成更适合与MHCI类或II类分子相互作用的大小的片段。因此，CTL表位可以是比上述那些更大的肽抗原的一部分。
多种CTL表位是已知的。鉴定另外的CTL表位的几种技术是本领域公认的。总体上，这些涉及制备可能提供CTL表位的分子和表征对该分子的免疫响应。
在一种实施方式中，肽抗原可以是与癌症、感染性疾病、成瘾性疾病或任何其它疾病或障碍相关的抗原。
可以衍生出肽抗原的病毒或其部分包括例如但不限于牛痘病毒(Cowpoxvirus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、假单痘病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、巨细胞病毒、人腺病毒AF、多瘤病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、细小病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、塞内卡谷地病毒(SVV)、正呼肠病毒、轮状病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、流感病毒(例如H5N1流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、肺炎病毒、呼吸道合胞体病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、狂犬病病毒、加利福尼亚脑炎病毒、日本脑炎病毒、汉坦病毒、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒、冠状病毒、肠病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒、黄病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒和水痘。
在一种实施方式中，肽抗原源自HPV。在一种实施方式中，HPV肽抗原是与HPV相关的宫颈癌或HPV相关的头颈癌相关的肽抗原。在一种实施方式中，肽抗原是包含序列RAHYNIVTF的肽(HPV16E7(H-2Db)肽49-57；R9F；SEQ ID NO：9)。在一种实施方式中，肽抗原是包含序列YMLNLGPET的肽(HPV Y9T肽；SEQ ID NO：10)。
在一种实施方式中，肽抗原源自HIV。在一种实施方式中，HIV肽抗原可以源自HIV-1gp120的V3环。在一种实施方式中，HIV肽抗原可以是RGP10(RGPGRAFVTI；SEQ ID NO：11)。RGP10可以从Genscript(Piscataway，NJ)购买。在另一实施方式中，肽抗原可以是AMQ9(AMQMLKETI；SEQ ID NO：12)。AMQ9肽是H-2Kd单倍型小鼠的免疫优势MHC I类表位gag。AMQ9也可以从Genscript购买。
在一种实施方式中，肽抗原源自RSV。RSV病毒体是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成员，由具有15,222个核苷酸的负义RNA单链构成。该核苷酸编码三种跨膜表面蛋白(F、G和小疏水蛋白或SH)、两种基质蛋白(M和M2)、三种核衣壳蛋白(N、P和L)和两种非结构蛋白(NS 1和NS2))。在一种实施方式中，肽抗原可以源自任意一种或多种RSV蛋白。在具体实施方式中，肽抗原可以源自RSV或任何其它副粘病毒的SH蛋白或其片段。RSV肽抗原可以是在WO 2012/065997中描述或公开的任意一种或多种RSV肽。
存在于多种副粘病毒中的SH蛋白(Collins 1990)是具有胞外域或“细胞外”组分的跨膜蛋白。人RSV SH蛋白包含64个氨基酸(亚组A)和65个氨基酸(亚组B)，并且高度保守。
人RSV SH(亚组A)：
MENTSITIEFSSKFWPYFTLIHMITTIISLLIIISIMIAILNKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQID NO：13)
人RSV SH(亚组B)：
MGNTSITIEFTSKFWPYFTLIHMILTLISLLIIITIMIAILNKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQID NO：14)
在一种实施方式中，肽抗原包含副粘病毒的SH蛋白(SHe)的胞外域或其片段或修饰变体，或由之组成。在一种实施方式中，SHe源自牛RSV。在另一实施方式中，SHe源自亚组A人RSV毒株或亚组B人RSV毒株。
亚组A人RSV SHe(RSV SHe A)：
NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)
亚组B人RSV SHe(RSV SHe B)：
NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)
在一种实施方式中，RSV肽抗原可以是单体形式、二聚体形式或其它寡聚体形式或其任何组合。在一种实施方式中，包含SHe A和/或SHe B的肽抗原是单体(例如单个多肽)。在另一实施方式中，包含SHe A和/或SHe B的肽抗原是二聚体(例如，二聚化的两个单独的多肽)。二聚化的手段是本领域已知的。一种示例性的程序是将RSV SHe肽抗原溶解在10％DMSO/0.5％乙酸的水(w/w)混合物中，并在37℃加热过夜。
在一种实施方式中，源自RSV的肽抗原可包含以下任意一种或多种或由以下任意一种或多种组成：
Figure BDA0002388629480000431
Figure BDA0002388629480000441
如例如WO 2012/065997中所述，SHe肽抗原可被以遗传或化学方式连接至载体。适于呈递肽抗原的载体的示例性实施方式是本领域已知的，其中一些被描述于WO2012/065997。在另一实施方式中，SHe肽抗原可以被连接至如本文所述的大小设定的脂质囊泡颗粒或由其形成或通过制造方法由其产生的结构。
在另一实施方式中，肽抗原源自流感病毒。流感是正粘病毒科的单链RNA病毒，并且通常基于病毒颗粒外部的两大糖蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)——表征。已经鉴定出甲型流感的多种HA亚型(Kawaoka 1990；Webster 1983)。在一些实施方式中，抗原可以源自HA或NA糖蛋白。在具体实施方式中，抗原可以是重组HA抗原(H5N1，A/Vietnam/1203/2004；Protein Sciences；USA)，如源自以GenBank登录号AY818135发现的序列或其任何适合的序列变体。
可以衍生肽抗原的细菌或其部分包括，例如但不限于，炭疽(炭疽杆菌)、布鲁氏菌、百日咳博德特氏菌、念珠菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、霍乱、肉毒梭菌、粗球孢子菌、隐球菌、白喉、大肠杆菌0157：H7、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、军团菌、钩端螺旋体、李斯特菌、脑膜炎球菌、肺炎支原体、分枝杆菌、百日咳、肺炎(菌)、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。
在一种实施方式中，肽抗原源自炭疽杆菌。非限制地，肽抗原可以例如源自炭疽重组保护性抗原(rPA)(List Biological Laboratories，Inc.；Campbell，CA)或炭疽突变体重组保护性抗原(mrPA)。rPA的大致分子量为83,000道尔顿(Da)，并且与炭疽杆菌产生的三蛋白外毒素的细胞结合组分相应。保护性抗原介导炭疽致死因子和水肿因子进入靶细胞。在一些实施方式中，抗原可以源自以GenBank登录号P13423发现的序列或其任何适合的序列变体。
可以衍生出肽抗原的原生动物或其部分包括例如但不限于引起疟疾的疟原虫属(镰状疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫)。
在一种实施方式中，肽抗原源自疟原虫种类。例如并且非限制地，肽抗原可源自环子孢子蛋白(circumsporozoite protein)(CSP)，其是疟疾寄生虫(疟原虫种类)子孢子期的分泌蛋白。CSP的氨基酸序列由下列组：免疫显性的中央重复区域，侧翼是N和C端的在寄生虫从蚊子迁移到哺乳动物载体时蛋白质加工涉及的保守基序。CSP的结构和功能在感染人类、非人类灵长动物和啮齿动物的各种疟疾株中高度保守。在一种实施方式中，源自CSP的肽抗原是疟疾病毒样颗粒(VLP)抗原，其包含在土拨鼠肝炎病毒核心抗原上显示的环子孢子T和B细胞表位。
在另一实施方式中，肽抗原可以源自癌症或肿瘤相关蛋白，如例如膜表面结合的癌症抗原。
在一种实施方式中，癌症可以是由病原体如病毒引起的癌症。与癌症的发展有关的病毒是技术人员已知的，包括但不限于人乳头瘤病毒(HPV)、John Cunningham病毒(JCV)、人疱疹病毒8、Epstein Barr尔病毒(EBV)、Merkel细胞多瘤病毒、丙型肝炎病毒和人T细胞白血病病毒-1。因此，在一种实施方式中，肽抗原可以源自与癌症的发展有关的病毒。
在一种实施方式中，肽抗原是癌症相关抗原。多种癌症或肿瘤相关蛋白是本领域已知的，如例如但不限于WO 2016/176761中描述的那些。本文公开的方法、干燥的制剂、组合物、用途和试剂盒可以利用或包含癌症相关抗原的任何肽抗原或其片段或修饰的变体。
在具体实施方式中，肽抗原是一种或多种存活蛋白抗原。
存活蛋白，也称为杆状病毒抑制剂——凋亡重复序列包含(蛋白)5(BIRC5)，是细胞凋亡负调控涉及的蛋白质。其已被归类为凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族的成员。存活蛋白是16.5kDa的细胞质蛋白，其包含单个BIR基序和带高电荷的羧基末端卷曲区域——代替RING指。编码存活蛋白的基因与效应细胞蛋白酶受体1(EPR-1)的序列几乎相同，但以相反方向定向。存活蛋白(智人)的编码序列为429个核苷酸长，包括终止密码子：
Figure BDA0002388629480000451
SEQ ID NO：21
编码的蛋白存活蛋白(智人)为142个氨基酸长：
Figure BDA0002388629480000461
SEQ ID NO：22
在一种实施方式中，肽抗原是源自存活蛋白的任何肽、多肽或其变体或其片段。
在一种实施方式中，肽抗原可以是存活蛋白抗原，如例如但不限于WO 2016/176761中公开的那些。
在一种实施方式中，存活蛋白肽抗原可包含全长存活蛋白多肽。或者，存活蛋白肽抗原可以是包含存活蛋白的任何长度的片段的存活蛋白肽。示例性实施方式包括包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的存活蛋白肽。在具体的实施方式中，存活蛋白肽由七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽组成，分别由存活蛋白的7、8、9、10、11个连续氨基酸残基组成(例如SEQ ID NO：22)。存活蛋白抗原的具体实施方式包括约9或10个氨基酸的存活蛋白肽。
存活蛋白肽抗原还包括天然存活蛋白肽的变体和功能等同形式。存活蛋白肽的变体或功能等同形式包括与存活蛋白的具体序列相比呈现具有差异(如一个或多个氨基酸取代、删除或添加或其任意组合)的氨基酸序列的肽。差异可作为存活蛋白序列与存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等同形式之间的同一性降低来测量。
在一种实施方式中，本发明的疫苗组合物可包含WO 2004/067023；WO 2006/081826或WO 2016/176761中公开的存活蛋白肽、存活蛋白肽变体或存活蛋白肽功能等同显示中的任意一种或多种。
在具体实施方式中，存活蛋白肽抗原可以是以下任意一种或多种：
i)FEELTLGEF[HLA-A1](SEQ ID NO:23)
ii)FTELTLGEF[HLA-A1](SEQ ID NO:4)
iii)LTLGEFLKL[HLA-A2](SEQ ID NO:24)
iv)LMLGEFLKL[HLA-A2](SEQ ID NO:5)
v)RISTFKNWPF[HLA-A3](SEQ ID NO:25)
vi)RISTFKNWPK[HLA-A3](SEQ ID NO:6)
vii)STFKNWPFL[HLA-A24](SEQ ID NO:7)
viii)LPPAWQPFL[HLA-B7](SEQ ID NO:8)
上面列出的存活蛋白肽非限制地代表示例性的MHC I类限制肽。各存活蛋白肽被认为结合的具体MHC I类HLA分子显示在右侧方括号中。
在一种实施方式中，本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒利用或包含一种或多种以下存活蛋白肽抗原：
i)FTELTLGEF[HLA-A1](SEQ ID NO:4)
ii)LMLGEFLKL[HLA-A2] (SEQ ID NO:5)
iii)RISTFKNWPK[HLA-A3] (SEQ ID NO:6)
iv)STFKNWPFL[HLA-A24] (SEQ ID NO:7)
v)LPPAWQPFL[HLA-B7] (SEQ ID NO:8)
在一种实施方式中，本文公开的方法、干燥的制剂、组合物、用途和试剂盒利用或包含以上列出的全部五种存活蛋白肽抗原。
在一种实施方式中，肽抗原是自身抗原。如本领域中公知，自身抗原是源于对象体内的抗原。在正常稳态条件下，免疫系统通常对自身抗原无反应。因此，这些类型的抗原给靶向免疫治疗的发展提出了困难。在一种实施方式中，肽抗原是自身抗原或其片段或修饰变体。
在一种实施方式中，肽抗原是新抗原。如本文所用，术语“新抗原”是指一类肿瘤抗原，其由表达的蛋白质中的肿瘤特异性突变产生。新抗原可以源自任何癌症、肿瘤或其细胞。
在新抗原的环境中，如本文所用，术语“源自”包括但不限于：直接从起源来源(例如，对象)分离或获得的新抗原；或合成或重组产生的新抗原——序列与来自起源来源的新抗原相同；或由起源来源的新抗原或其片段制成的新抗原。
表达蛋白中产生新抗原的突变可以是患者特异性的。“患者特异性”意为突变(一个或多个)是个体对象独有的。但是，有可能超过一个对象会共有相同的突变。因此，“患者特异性”突变可以被小或大亚群的对象共有。
新抗原可包含一个或多个新表位。如本文所用，术语“表位”是指可以被免疫系统，具体地抗体、B细胞或T细胞，识别的肽序列。“新表位”是与天然氨基酸序列相比包含肿瘤特异性突变的新抗原的表位。总体上，新表位可以通过筛选新抗原的有结合患者HLA的潜能的锚残基来鉴定。通常利用可预测肽与HLA结合的算法(如NetMHC)对新表位进行排名。
“T细胞新表位”将被理解为意指可以肽呈递MHC分子或MHC复合物的形式被I或II类MHC分子结合的突变肽序列。T细胞新表位应一般是适于被T细胞受体识别从而可以发生细胞介导的免疫响应的表位。“B细胞新表位”将被理解为是指可被B细胞和/或抗体识别的突变肽序列。
在一些实施方式中，新抗原的新表位中的至少一个是患者特异性新表位。如本文所用，“患者特异性新表位”是指新表位中个体对象独有的突变。但是，有可能超过一个对象会共有相同的突变(一种或多种)。因此，“患者特异性新表位”可以被小或大亚群的对象共有。
由上显而易见，新抗原可以包含个体独有的不同组肽。这些肽可具有不同的溶解度特性，使其难以配制成常规类型的疫苗制剂，如水性缓冲剂或乳液型制剂。另外，在衍生这些肽的宿主中可能有预先存在的对这些肽的耐受性。这些方面等可导致新抗原具有弱免疫原性。因此，将其在能够产生强免疫响应的组合物中递送是重要的，如本文本公开。
如本文所用，“弱免疫原性”是指在常规疫苗(例如水性疫苗、乳液等)中，新抗原几乎没有或没有诱导、维持和/或增强新抗原特异性免疫响应的能力。在一种实施方式中，弱免疫原性新抗原是在单次给予该新抗原后几乎没有或没有能力诱导、维持和/或增强新抗原特异性免疫响应的新抗原。
在一种实施方式中，可以从癌症的突变的体蛋白中选择新抗原——利用诸如NetMHC的选择算法，其寻找预期与MHC I类和/或MHC II类蛋白结合的基序。
在一种实施方式中，新抗原可以源自在前已与癌症表型关联的突变基因或蛋白质，如例如肿瘤抑制基因(例如p53)；DNA修复途径蛋白(例如BRCA2)和致癌基因。通常包含引起癌症表型的突变的基因的示例性实施方式被描述于例如Castle 2012。技术人员将公知与癌症相关的其它突变基因和/或蛋白质，并且这些可从其它文献来源获得。
在一些实施方式中，新抗原可包含Castle 2012公开的新抗原或由其组成。Castle2012没有提供新抗原的实际序列，但是提供了突变肽的基因ID和位置，由其利用例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的可在线获得的PubMed数据库可以鉴定实际序列。
在一种实施方式中，新抗原可以是Castle 2012的表1中公开的Mutl-50新抗原中的一种或多种、或者相同或相关蛋白质(例如人同源物)的新抗原。在一种实施方式中，新抗原可以选自本文表5中列出的新抗原肽、或者相同或相关蛋白质(例如人同源物)的新抗原。在一种实施方式中，新抗原可以是下列中的一种或多种：Mut25(STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEK；SEQ ID NO：26)、Mut30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL；SEQ ID NO：27)和Mut44(EFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGM；SEQ ID NO：28)，或相同或相关蛋白质(例如人同源物)的新抗原。
在一种实施方式中，本文公开的方法可用于制备在单一组合物中包含多种不同新抗原的混合物的药物组合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种不同新抗原的混合物。在一种实施方式中，本文公开的方法用于在单一组合物中配制10-20种不同新抗原的混合物。在一种实施方式中，每种不同新抗原的长度为20至30个氨基酸。如本文所述，本公开的方法能够提供包含这些多种不同新抗原的稳定组合物，而无需大量的新抗原选择步骤。
编码多肽的DNA或RNA多核苷酸
在一种实施方式中，治疗剂可以是编码多肽的DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。在一种实施方式中，该DNA或RNA多核苷酸编码本文所述的肽抗原中的一种或多种。
如本文所用，“DNA或RNA多核苷酸”包含任何长度(例如9、12、15、18、21、24、27、30、60、90、120、150、300、600、1200、1500或更多个核苷酸)或链数(例如单链或双链)的核苷酸链。多核苷酸可以是DNA(例如基因组DNA、cDNA、质粒DNA)或RNA(例如mRNA)或其组合。该多核苷酸可以是天然存在的或合成的(例如化学合成)。考虑该多核苷酸可包含在核苷酸链中的一个或多个含氮碱基、戊糖或磷酸基团的修饰。这样的修饰在本领域中是公知的，并且可以出于以下目的：例如提高多核苷酸的稳定性、溶解性或转录/翻译活性。
在一种实施方式中，多核苷酸编码要在对象中体内表达的多肽。本发明不限于任何特定类型的多肽的表达。
该多核苷酸可以以各种形式使用。在一种实施方式中，裸多核苷酸可以以线性形式或被插入质粒如表达质粒中使用。在其它实施方式中，可以使用活载体，如病毒载体或细菌载体。
根据多核苷酸的性质和预期用途，可以存在有助于DNA转录成RNA和/或RNA翻译成多肽的一种或多种调控序列。例如，如果意图或不需要多核苷酸转录或翻译，则可以不存在这种调控序列。在一些情况下，如在多核苷酸为信使RNA(mRNA)分子的情况下，不需要与转录过程有关的调控序列(例如启动子)，并且蛋白质表达可在没有启动子的情况下实现。技术人员可以根据情况加入适合的调控序列。
在一些实施方式中，该多核苷酸存在于表达盒中，其中该多核苷酸与允许该多核苷酸在对象中表达的调控序列可操作地连接。表达盒的选择取决于对象以及表达的多肽所需的特征。
一般，表达盒包括在对象中有功能并且可以是组成型或诱导型的启动子；核糖体结合位点；必要时，起始密码子(ATG)；编码目的多肽的多核苷酸；终止密码子；以及任选地3'端区域(翻译和/或转录终止子)。可以包括其它序列，例如编码信号肽的区域。编码目的多肽的多核苷酸可以与表达盒中的任何其它调控序列同源或异源。要与目的多肽一起表达的序列(如信号肽编码区)通常位于编码待表达蛋白质的多核苷酸附近，并被置于适当的阅读框中。由编码仅待表达的蛋白质自己或连同任何其它待表达序列(例如信号肽)的多核苷酸构成的开放阅读框处于启动子的控制下，从而在被给予组合物的对象中发生转录和翻译。
适于在多种宿主系统中表达多核苷酸的启动子是本领域公知的。适用于在哺乳动物中表达多核苷酸的启动子包括组成性、遍在性或组织特异性地起作用的那些。非组织特异性启动子的实例包括病毒来源的启动子。病毒启动子的实例包括小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复(HIV LTR)启动子、Moloney病毒、禽白血病病毒(ALV)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子/增强子、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺相关病毒(AAV)启动子；腺病毒启动子和Epstein Barr病毒(EBV)启动子。病毒启动子与某些多肽的相容性是一个考虑，因为其组合可影响表达水平。可以使用合成的启动子/增强子来优化表达(参见例如美国专利公开2004/0171573)。
组织特异性启动子的一个实例是在肌肉细胞中驱动表达的结蛋白(desmin)启动子(Li1989；Li&Paulin 1991；和Li&Paulin 1993)。其它实例包括人工启动子，如合成肌肉特异性启动子和嵌合肌肉特异性/CMV启动子(Li 1999；Hagstrom 2000)。
如上所述，目的多核苷酸与任何必要的调控序列一起可以被裸递送，例如单独或作为质粒的一部分，或者可以在病毒或细菌或细菌载体中递送。
无论使用质粒型载体还是细菌或病毒载体，都可能期望该载体不能在对象中基本复制或整合。这样的载体包括其序列不含与对象的基因组基本相同的区域以使宿主-载体重组的风险最小化的那些。一种这样做的方法是使用非源自受体基因组的启动子来驱动目的多肽的表达。例如，如果受体是哺乳动物，则启动子优选是非哺乳动物来源的——尽管其应该能够在哺乳动物细胞中起作用，例如病毒启动子。
可用于递送多核苷酸的病毒载体包括例如腺病毒和痘病毒。有用的细菌载体包括例如志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、乳杆菌(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille bilie de Calmette-Guerin)(BCG)和链球菌(Streptococcus)。
腺病毒载体的实例以及构建能够表达多核苷酸的腺病毒载体的方法在美国专利号4,920,209中被描述。痘病毒载体包括牛痘(vaccinia)和金丝雀痘(canary pox)病毒，其分别在美国专利号4,722,848和美国专利号5,364,773中被描述。还参见例如Tartaglia1992关于牛痘(vaccinia)病毒载体的描述和Taylor 1995关于金丝雀痘的提及。
如Kieny 1984所述，能够表达目的多核苷酸的痘病毒载体可以通过同源重组获得，使得多核苷酸在适合的条件下被插入病毒基因组中以在哺乳动物细胞中表达。
关于细菌载体，已知可用于在宿主中表达外源多核苷酸的非产毒性(non-toxicogenic)霍乱弧菌突变株。Mekalanos 1983和美国专利第4,882,278号描述了这样的菌株：两个ctxA等位基因中的每一个的大量编码序列被删除，因此不产生功能性霍乱毒素。WO 92/11354描述了通过突变使irgA基因座失活的菌株。该突变可与ctxA突变结合在一个菌株中。WO94/01533描述了缺少功能性ctxA和attRS1 DNA序列的缺失突变体。如WO 94/19482中所述，这些突变株被基因工程改造以表达异源蛋白质。
被基因改造以进行异源蛋白重组表达的减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株被描述于Nakayama 1988和WO 92/11361中。
可用作在对象中表达外源蛋白的载体的其它细菌菌株被描述于：弗氏志贺菌(Shigella flexneri)，High 1992和Sizemore 1995；戈登链球菌(Streptococcusgordonii)，Medaglini 1995；卡介苗(Bacille Calmette Guerin)，Flynn1994、WO 88/06626、WO 90/00594、WO 91/13157、WO 92/01796和WO 92/21376。
在细菌载体中，目的多核苷酸可以被插入细菌基因组中或作为质粒的一部分保持游离状态。
激素
在一种实施方式中，治疗剂可以是激素或其片段、类似物或变体。激素、其片段、类似物或变体可以从天然来源获得或被合成制备。
示例性激素包括但不限于支链淀粉(amylin)、胰岛素、胰高血糖素、促红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、黑素细胞刺激激素(MSH)、甲状旁腺激素(PTH)、甲状腺刺激激素、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、降钙素、生长抑素、生长介素(胰岛素样生长因子)、白介素(例如白介素1-17)、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、睾丸激素、干扰素(例如干扰素α或γ)、瘦素、促黄体生成激素(LH)、卵泡刺激激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、脑啡肽(enkephalin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))、促黄体生成激素、促性腺激素释放激素(GnRH)、脑源性利钠肽(BNP)、组织纤溶酶原激活因子(TPA)、催产素、松弛素、类固醇(例如雄激素、雌激素、糖皮质激素、孕激素和开环类固醇(secosteroids))及其类似物和组合。
细胞因子
在一种实施方式中，治疗剂可以是细胞因子或其片段、类似物或变体。细胞因子、其片段、类似物或变体可以从天然来源获得或被合成制备。
示例性细胞因子包括但不限于趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子及其类似物。
过敏原
在一种实施方式中，治疗剂可以是过敏原或其片段、类似物或变体。过敏原、其片段、类似物或变体可以从天然来源获得或被合成制备。
如本文所用，“过敏原”是指可以引起过敏的任何物质。过敏原可以非限制地来自植物、动物、真菌、昆虫、食物、药物、灰尘和螨虫的细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其它分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。过敏原包括但不限于环境空气过敏原；植物花粉(例如豚草/花粉热)；杂草花粉过敏原；草花粉过敏原；Johnson草；树花粉过敏原；黑麦草过敏原；蜘蛛纲过敏原(例如屋尘螨过敏原)；储存螨过敏原；日本雪松花粉/花粉症；霉菌/真菌孢子过敏原；动物过敏原(例如狗、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等过敏原)；食物过敏原(例如甲壳类、坚果、柑橘类水果、面粉、咖啡)；昆虫过敏原(例如跳蚤、蟑螂)；毒液：(膜翅目(Hymenoptera)、黄夹克(yellowjacket)、蜜蜂、黄蜂、大黄蜂、火蚁)；细菌过敏原(例如链球菌抗原；寄生虫过敏原，如蛔虫抗原)；病毒过敏原；药物过敏原(例如青霉素)；激素(例如胰岛素)；酶(例如链激酶)；以及能够充当不完全抗原或半抗原的药物或化学剂(例如酸酐和异氰酸酯)。
催化性DNA或RNA
在一种实施方式中，治疗剂可以是催化性DNA(脱氧核酶)或催化性RNA(核酶)。
如本文所用，术语“催化性DNA”是指具有酶活性的任何DNA分子。在一种实施方式中，催化性DNA是单链DNA分子。在一种实施方式中，与天然存在相反，催化性DNA是合成产生的。
催化性DNA可以进行一种或多种化学反应。在一种实施方式中，催化性DNA是核糖核酸酶，由此催化性DNA催化核糖核苷酸磷酸二酯键的切割。在另一实施方式中，催化性DNA是DNA连接酶，由此催化性DNA通过形成新键来催化两个多核苷酸分子的连接。在其它实施方式中，催化性DNA可以催化DNA磷酸化、DNA腺苷酸化、DNA去糖基化、卟啉金属化、胸腺嘧啶二聚体光还原或DNA切割。
如本文所用，术语“催化性RNA”是指具有酶活性的任何RNA分子。催化性RNA涉及多种生物学过程，包括RNA加工和蛋白质合成。在一种实施方式中，催化性RNA是天然存在的RNA。在一种实施方式中，催化性RNA是合成产生的。
反义RNA
在一种实施方式中，治疗剂可以是反义RNA。
如本文所用，“反义RNA”是与信使RNA(mRNA)互补的任何单链RNA。反义RNA可以呈现与mRNA的100％互补性或小于100％的互补性——只要反义RNA仍然能够通过与mRNA碱基配对而抑制mRNA的翻译，从而阻碍翻译机制。
在一种实施方式中，反义RNA是高度结构化的，由一个或多个茎环二级结构构成，侧接单链(未配对)区域或被单链(未配对)区域隔开。在一些实施方式中，诸如假结的三级结构可以在两个或更多个二级结构元件之间形成。
干扰RNA和Antagomirs
在一种实施方式中，治疗剂可以是干扰RNA，如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
RNA干扰(RNAi)是生物学过程，其中RNA分子通过中和被靶向的mRNA分子来抑制基因表达或翻译。两种类型的小核糖核酸(RNA)分子——微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)——是RNA干扰的中心。
siRNA是一类双链RNA分子，其长度通常为20-25个碱基对。其通过在转录后降解mRNA而干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达，从而阻止翻译。siRNA的天然结构通常是短的20-25双链RNA，各端都有两个悬垂核苷酸。Dicer酶催化由长dsRNA和小发夹RNA(shRNA)生成siRNA。shRNA是具有紧急发夹转弯的人工RNA分子。siRNA分子的设计和产生以及作用机理是本领域已知的。
miRNA与siRNA相似，除了miRNA源自RNA转录物中在自身上回折以形成短发卡的区域，而siRNA源自较长的双链RNA。
在一种实施方式中，治疗剂可以是这些干扰RNA(siRNA、miRNA或shRNA)中的任意一种或多种。干扰RNA应是能够降低或沉默(防止)其内源细胞对应物的基因/mRNA表达的RNA。在一种实施方式中，干扰RNA源自天然存在的干扰RNA。在一种实施方式中，干扰RNA是合成产生的。
在一种实施方式中，治疗剂可以是antagomir。Antagomirs(也称为抗miRs或blockmirs)是沉默内源性miRNA的合成工程化寡核苷酸。尚不清楚antagomir化(antagomir抑制miRNA活性的过程)如何运作，但认为其通过不可逆地结合miRNA而进行抑制。由于微RNA的混杂(promiscuity)，antagomirs可影响多种不同mRNA分子的调控。Antagomirs被设计以具有与充当微RNA结合位点的mRNA序列互补的序列。
药物
在一种实施方式中，治疗剂是药物，即用于治疗、治愈、预防或诊断疾病、障碍或状况的化学物质。
在一种实施方式中，并且非限制地，示例性药物包括免疫调节剂(免疫刺激剂和免疫抑制剂)、免疫响应检查点分子、退热剂、镇痛剂、抗偏头痛剂、抗凝剂、止吐剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、心血管剂、中枢神经系统剂、抗高血压剂和血管扩张剂、镇静剂、麻醉激动剂、螯合剂、抗利尿剂、和抗癌剂、抗肿瘤剂。实例包括下列：
在一种实施方式中，药物是小分子药物。如本文所用，术语“小分子药物”是指可用于治疗、治愈、预防或诊断疾病、障碍或状况的有机化合物。
术语“小分子”被理解为是指低分子量化合物，其可以被合成生产或从天然来源获得，并且通常具有小于2000Da、小于1000Da或小于600Da的分子量。在具体的实施方式中，小分子的分子量小于900Da，这允许迅速扩散穿过细胞膜的可能性。更具体地，小分子的分子量小于600Da，甚至更具体地小于500Da。
在一种实施方式中，小分子药物具有如下分子量：约100Da至约2000Da之间；约100Da至约1500Da；约100Da至约1000Da；约100Da至约900Da；约100Da至约800Da；约100Da至约700Da；约100Da至约600Da；或约100Da至大约500Da。在一种实施方式中，小分子药物的分子量为约100Da、约150Da、约200Da、约250Da、约300Da、约350Da、约400Da、约450Da、约500Da、550Da、约600Da、约650Da、约700Da、约750Da、约800Da、约850Da、约900Da、约950Da或约1000Da。在一种实施方式中，小分子药物可以具有约1nm的大小。
在一种实施方式中，小分子药物是以下的一种或多种：依帕卡司他(Epacadostat)、雷帕霉素、多柔比星、丙戊酸、米托蒽醌、伏立诺他、环磷酰胺、伊立替康、顺铂或甲氨蝶呤。在具体实施方式中，小分子药物是环磷酰胺。
在一种实施方式中，小分子药物是干扰DNA复制的试剂。如本文所用，表述“干扰DNA复制”旨在涵盖防止、抑制或延迟拷贝(即，复制)细胞DNA的生物学过程的任何作用。本领域技术人员将理解，存在用于防止、抑制或延迟DNA复制的各种机制，如例如DNA交联、DNA甲基化、碱基取代等。本公开包括通过本领域已知的任何方式干扰DNA复制的任何试剂的使用。这种试剂的示例性非限制性实施方式在例如WO2014/153636和/或PCT/CA2017/050539中被描述。在一种实施方式中，干扰DNA复制的试剂是烷基化试剂，如例如氮芥烷基化试剂。在一种实施方式中，干扰DNA复制的试剂是环磷酰胺。
在一种实施方式中，小分子药物是免疫响应检查点抑制剂。如本文所用，“免疫响应检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的任何化合物或分子。检查点蛋白调控T细胞的激活或功能。多种检查点蛋白是已知的，如例如CTLA-4及其配体CD80和CD86；以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。检查点蛋白负责T细胞响应的共刺激或抑制相互作用。检查点蛋白调控并维持自我耐受性以及生理免疫响应的持续时间和幅度。在本文中，术语“免疫响应检查点抑制剂”可与“检查点抑制剂”互换使用。在下文中描述检查点抑制剂的示例性非限制性实施方式。
在一种实施方式中，免疫响应检查点抑制剂是下列的抑制剂：程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7-H1、CD274)、程序性死亡1(PD-1，CD279)、CTLA-4(CD154)、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG3(CD223)、TIM3(HAVCR2、CD366)、41BB(CD137)、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HVEM、IDO1、ID02、ICOS(诱导性T细胞共刺激物)、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、PS(磷脂酰丝氨酸)、OX-40、SLAM、TIGIT、VISTA、VTCN1或其任何组合。
在一种实施方式中，免疫响应检查点抑制剂是PD-L1、PD-1、CTLA-4或其任何组合的抑制剂。
在一种实施方式中，药物是生物药物。如本文所用，“生物药物”是由生物来源制造、提取或半合成的任何药学药物产品。在一种实施方式中，生物药物是血液成分、细胞、细胞组分、过敏原、抗体、基因或其片段、组织、组织组分或重组蛋白。
抗体
在一种实施方式中，治疗剂是抗体、其抗原结合片段或其衍生物。
本文所用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体、或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体、或其混合物——其对期望的表位或由其衍生的序列呈现足够的结合特异性。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人类物种的这样的抗体：结合具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的期望抗原。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的任何片段或部分或其仍能够结合全长抗体的特定靶抗原的变体。在一种实施方式中，抗原结合片段包含抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
在一种实施方式中，抗体可以是抗PD-1抗体、其变体或其抗原结合片段或其组合。在一种实施方式中，PD-1抗体可以是Nivolumab(Opdivo TM)。在一种实施方式中，PD-1抗体可以是派姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda TM)。
在其它实施方式中，非限制地，抗体可以是抗PD1或抗PDL1抗体，如例如WO2015/103602中公开的那些。例如，在一种实施方式中，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体可以选自：尼沃单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、匹立单抗(pidilizumab)、BMS-936559(参见ClinicalTrials.gov；标识符NCT02028403)、MPDL3280A(Roche，参见ClinicalTrials.gov；标识符NCT02008227)、MDX1105-01(Bristol Myers Squibb，参见ClinicalTrials.gov；标识符NCT00729664)、MEDI4736(Medlmmune，参见ClinicalTrials.gov；标识符NCT01693562)和MK-3475(Merck，参见ClinicalTrials.gov；标识符NCT02129556)。在一种实施方式中，抗PD-1抗体可以是RMP1-4或J43(BioXCell)或者其人或人源化的对应物。
在一种实施方式中，抗体是抗CTL4抗体、其变体或其抗原结合片段或其组合。抗CTL4抗体可以抑制CTL4活性，从而诱导、引发或增强免疫响应。在一种实施方式中，抗CTLA-4抗体可以是依匹莫单抗(ipilimumab)(Bristol-Myers Squibb)或BN13(BioXCell)。在另一实施方式中，抗CTLA-4抗体可以是UC10-4F10-11、9D9或9H10(BioXCell)或者其人或人源化对应物。
任何具体治疗剂的量可取决于治疗剂的类型(例如肽抗原、小分子药物、抗体等)。本领域技术人员可以通过经验测试容易地确定具体应用中所需的治疗剂量。
T辅助表位
在一些实施方式中，一种或多种T辅助表位可以用于本文公开的方法、干燥的制剂、组合物、用途或试剂盒中。在一种实施方式中，当至少一种治疗剂是抗原时使用T辅助表位。
T辅助表位是具有T辅助活性的氨基酸(天然或非天然氨基酸)序列。T辅助表位被T辅助淋巴细胞识别——其在建立和最大化免疫系统的能力中起重要作用，并涉及激活和指导其它免疫细胞，如例如细胞毒性T淋巴细胞。T辅助表位可以由连续或不连续的表位组成。因此，并非T辅助(细胞)的每个氨基酸都必定是表位的一部分。
因此，T辅助表位，包括T辅助表位的类似物和片段，能够增强或刺激免疫响应。免疫显性T辅助表位在MHC类型大相径庭的动物和人群体中广泛具有反应性(Celis 1988、Demotz 1989、Chong 1992)。主题肽的T辅助结构域可以具有约10至约50个氨基酸，更具体地约10至约30个氨基酸。当存在多个T辅助表位时，则各T辅助表位独立地发挥作用。
在另一实施方式中，T辅助表位可以是T辅助表位类似物或T辅助细胞片段。T辅助表位类似物可包括T辅助表位中1至约10个氨基酸残基的取代、删除和插入。T辅助片段是T辅助表位的足以增强或刺激免疫响应的连续部分。T辅助片段的实例是源自单一较长的肽的一系列重叠肽。
在一些实施方式中，T辅助表位可以形成本文描述的肽抗原的一部分。具体地，如果肽抗原具有足够的大小，则其可以包含充当T辅助表位的表位。在其它实施方式中，T辅助表位是与肽抗原分开的分子。在其它实施方式中，T辅助表位可以与肽抗原融合。
在具体实施方式中，T辅助表位可以是修饰的破伤风毒素肽A16L(氨基酸830至844；AQYIKANSKFIGITEL；SEQ ID NO：1)，其中在其氨基末端添加丙氨酸残基以增强稳定性(Slingluff 2001)。
可以使用的T辅助表位的其它来源包括，例如，乙型肝炎表面抗原辅助T细胞表位、百日咳毒素辅助T细胞表位、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomitis)主要外膜蛋白辅助T细胞表位、白喉毒素辅助T细胞表位、镰状疟原虫环子孢子辅助T细胞表位、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)三糖磷酸异构酶辅助T细胞表位、大肠杆菌(Escherichia coli)TraT辅助T细胞表位以及这些T辅助表位中任意种的免疫增强类似物和片段。
在一些实施方式中，T辅助表位可以是通用T辅助表位。本文所用的通用T辅助表位是指以II类(CD4+T细胞)限制方式激活T细胞功能的方式与多种MHC II类分子结合的肽或其它免疫原性分子或其片段。通用T辅助表位的实例是包含肽序列AKXVAAWTLKAAA的PADRE(泛DR表位)，其中X可以是环己基丙氨酰基(SEQ ID NO：29)。PADRE特异性地具有CD4+T辅助表位，即，其刺激PADRE特异性CD4+T辅助响应的诱导。
除了前面提到的修饰的破伤风毒素肽A16L，破伤风类毒素还有其它T辅助表位，其作用方式与PADRE类似。破伤风和白喉毒素具有人类CD4+细胞(Diethelm-Okita 2000)的通用表位。在另一实施方式中，T辅助表位可以是破伤风类毒素肽，如F21E，其包含肽序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(氨基酸947至967；SEQ ID NO：30)。
多种其它T辅助表位是本领域已知的，并且这些T辅助表位中的任一个可用于实施本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途和试剂盒。
在一种实施方式中，本文公开的干燥制剂或组合物包含单一类型的T辅助表位。在另一实施方式中，本文公开的干燥制剂或组合物包含多种不同类型的T辅助表位(例如1、2、3、4或5种不同的T辅助表位)。
在一种实施方式中，本文公开的干燥制剂或组合物不包含T辅助表位。例如，这可以是在治疗剂不是抗原时的情况。
T辅助表位的用量可以取决于治疗剂的类型和数量以及T辅助表位的类型。本领域技术人员可以通过经验测试容易地确定具体应用中所需的T辅助表位量。
佐剂
在一些实施方式中，一种或多种佐剂可用于本文公开的方法、干燥制剂、组合物、用途或试剂盒中。
多种佐剂已经被描述并且是本领域技术人员已知的。示例性佐剂包括但不限于明矾、铝的其它化合物、Calmette-Guerin芽孢杆菌(BCG)、TiterMaxTM、RibiTM、弗氏完全佐剂(FCA)、含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、脂质A模拟物或类似物、脂肽和聚I：C多核苷酸。
在一种实施方式中，佐剂是CpG ODN。CpG ODN是包含一个或多个未甲基化CpG基序(由中心未甲基化CG二核苷酸+侧翼区域组成)的DNA分子。示例性CpG ODN是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQ ID NO：31)。技术人员可以基于目标物种和功效容易地选择其它适合的CpG ODN。
在一种实施方式中，佐剂可以是聚I：C多核苷酸。
聚I：C多核苷酸是包含肌苷酸残基(I)和胞苷酸残基(C)的多核苷酸分子(RNA或DNA或DNA和RNA的组合)，其诱导产生炎性细胞因子，如干扰素。在一种实施方式中，聚I：C多核苷酸是双链的。在这样的实施方式中，其可以由完全由含胞嘧啶的核苷酸组成的一条链和完全由含肌苷的核苷酸组成的一条链构成，尽管其它构型也是可能的。例如，各链可同时含有含胞嘧啶的核苷酸和含肌苷的核苷酸。在一些情况下，任一或两条链可以另外包含一个或多个非胞嘧啶或非肌苷核苷酸。
已报道，聚I：C可以每16个残基进行分段，而不会影响其干扰素激活能力(Bobst1981)。此外，通过每12个重复胞苷酸残基引入(一个)尿苷残基而错配的聚I：C分子的干扰素诱导能力(Hendrix 1993)表明，12个残基的最小双链聚I：C分子足以促进干扰素产生。其它也已提出，与双链多核苷酸的0.5-1螺旋圈相应的少至6-12个残基的区域能够引发诱导过程(Greene 1978)。如果合成制备，则聚I：C多核苷酸的长度通常约为20个或更多个残基(通常22、24、26、28或30个残基的长度)。如果半合成制备(例如使用酶)，则链长度可以是500、1000或更多个残基。
因此，如本文所用，“聚I：C”、“聚I：C多核苷酸”或“聚I：C多核苷酸佐剂”是双链或单链多核苷酸分子(RNA或DNA或DNA和RNA的组合)，其每条链含有至少6个连续的肌苷酸或胞苷酸残基或选自肌苷酸和胞苷酸的任何顺序的6个连续的残基(例如，(IICIIC或ICICIC)，并且其能够在哺乳动物对象中诱导或增强至少一种炎性细胞因子如干扰素的产生。聚I：C多核苷酸的长度通常约为8、10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、500、1000或更多个残基。优选的聚I：C多核苷酸可具有约6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的最小长度，以及约1000、500、300、200、100、90、80、70、60、50、45或40个核苷酸的最大长度。
双链聚I：C多核苷酸的每条链可以是肌苷酸或胞苷酸残基的均聚物，或者每条链可以是包含肌苷酸和胞苷酸残基两者的杂聚物。在任一种情况下，该聚合物可以被一个或多个非肌苷酸或非胞苷酸残基(例如尿苷)打断，条件是存在如上所述的6I、6C或6I/C残基的至少一个连续区域。通常，聚I：C多核苷酸的每条链将包含每6个VC残基不超过1个非I/C残基，更优选每8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个I/C残基不超过1个非I/C残基。
聚I：C多核苷酸中的肌苷酸或胞苷酸(或其它)残基可以如本领域中已知那样被衍生化或修饰，条件是保留了聚I：C多核苷酸促进炎性细胞因子如干扰素产生的能力。衍生物或修饰的非限制性实例包括例如叠氮基修饰、氟修饰或使用硫酯(或类似)连接代替天然磷酸二酯连接来增强体内稳定性。聚I：C多核苷酸也可以被修饰以例如增强其对体内降解的抗性——通过例如使该分子与带正电荷的聚赖氨酸和羧甲基纤维素或与带正电荷的合成肽络合。
在一种实施方式中，聚I：C多核苷酸可以是含有肌苷酸残基(I)和胞苷酸残基(C)的单链分子。作为实例，非限制地，单链聚I：C的序列可以是重复dIdC的序列。在具体实施方式中，单链聚I：C的序列可以是(IC)13的26聚体序列，即，ICICICICICICICICICICICICIC(SEQID NO：32)。本领域技术人员将理解，由于其性质(例如互补性)，预期重复dIdC的这些单链分子将自然形成同二聚体，因此其在概念上类似于聚I/聚C二聚体。
在一种实施方式中，聚I：C多核苷酸佐剂是近似分子量为989,486道尔顿的聚I：C的传统形式，其包含不同链长的数百个碱基对的聚I和聚C的混合物(Thermo Scientific；美国)。
在一种实施方式中，佐剂可以是激活或增加TLR2活性的佐剂。如本文所用，“激活”或“增加”TLR2活性的佐剂包括充当TLR2激动剂的任何佐剂，在一些实施方式中为基于脂质的佐剂。此外，激活或增加TLR2活性包括其以任何单体、同二聚体或异二聚体形式激活，并且具体地包括TLR2作为与TLR1或TLR6的异二聚体(即，TLR1/2或TLR2/6)的激活。激活或增加TLR2活性的佐剂的示例性实施方式包括基于脂质的佐剂，如WO2013/049941中所述的那些。
在一种实施方式中，佐剂可以是基于脂质的佐剂，如在WO2013/049941中公开。在一种实施方式中，基于脂质的佐剂是包含棕榈酸部分如二棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸(PAM2Cys)或三棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸(PAM3Cys)的佐剂。在一种实施方式中，佐剂是脂肽。示例性脂肽包括但不限于PAM2Cys-Ser-(Lys)4(SEQ ID NO：33)或PAM3Cys-Ser-(Lys)4(SEQ ID NO：33)。
在一种实施方式中，佐剂是PAM3Cys-SKKKK(EMC Microcollections，德国；SEQ IDNO：33)或其变体、同源物和类似物。PAM2家族的脂肽已被证明是PAM3家族的脂肽的有效替代物。
在一种实施方式中，佐剂可以是脂质A模拟物或类似物佐剂，如例如在WO2016/109880和其中引用的参考文献中公开的那些。在具体的实施方式中，佐剂可以是JL-265或JL-266，如WO2016/109880公开。
在一种实施方式中，可以使用聚I：C多核苷酸佐剂和基于脂质的佐剂的组合，如在WO2017/083963中公开的佐剂系统中所述。
可以使用的佐剂的其它实例包括但不限于趋化因子、集落刺激因子、细胞因子、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS04、AS15、ABM2、Adjumer、Algammulin、AS01B、AS02(SBASA)、AS02A、BCG、骨化三醇、壳聚糖、霍乱毒素、CP-870,893、CpG、聚I：C、CyaA、DETOX(RibiImmunochemicals)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、dSLIM、γ菊粉、GM-CSF、GMDP、甘油、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、ISPatch、ISCOM、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、LPS、脂质核心蛋白、MF59、单磷酰脂质A及其类似物或模拟物、
Figure BDA0002388629480000591
IMS 1312、
Figure BDA0002388629480000592
系佐剂(例如Montanide ISA-51、-50和-70)、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel载体系统、其它基于棕榈酰基的分子、PLG微粒、雷西莫德(resiquimod)、角鲨烯(squalene)、SLR172、YF-17DBCG、QS21、QuilA、P1005、泊洛沙姆、皂苷(Saponin)、合成多核苷酸、酵母聚糖(Zymosan)、百日咳毒素。
在一种实施方式中，至少一种治疗剂可以与至少一种佐剂偶联。在一种实施方式中，佐剂不与任何治疗剂偶联。
佐剂的用量可取决于治疗剂的类型和数量以及佐剂的类型。本领域技术人员可以通过经验测试容易地确定具体应用中所需的佐剂的量。
表面活性剂
在一种实施方式中，本文公开的组合物可包含一种或多种表面活性剂。表面活性剂可以是单一试剂或试剂混合物。表面活性剂(一种或多种)应是药学和/或免疫学上可接受的。
在一些实施方式中，表面活性剂可用于帮助在疏水载体中稳定具有单层脂质组装体的脂质基结构、治疗剂和/或其它组分(例如佐剂和/或T辅助表位)。表面活性剂的使用可以例如通过降低表面张力来促进这些组分的混合物的更均匀分布。在一种实施方式中，当本文公开的组合物将包含多种不同的治疗剂(例如五种或更多种不同的肽抗原)或相对高浓度的治疗剂(例如≥5mg/mg总治疗剂)时，可以使用表面活性剂。
表面活性剂可以是两亲性的，因此表面活性剂可以包括多种化合物。可以使用的表面活性剂的实例包括聚山梨酯————衍生自聚乙二醇化山梨糖醇(polyethyleneglycolyated sorbital)的油性液体，和山梨聚糖酯。聚山梨酯可包括例如脱水山梨糖醇单油酸酯。一般的表面活性剂是本领域公知的，包括但不限于二缩甘露醇油酸酯(ArlacelTMA)、卵磷脂、TweenTM 80、SpansTM 20、80、83和85。在一种实施方式中，用于组合物中的表面活性剂是二缩甘露醇油酸酯。在一种实施方式中，用于组合物中的表面活性剂是Span80。
通常将表面活性剂与疏水载体预混合。在一些实施方式中，可以使用已经包含表面活性剂的疏水载体。例如，疏水载体如MontanideTMISA 51已经包含表面活性剂二缩甘露醇油酸酯。在其它实施方式中，可以在与其它组分(例如干燥脂质/治疗剂制剂)组合之前将疏水载体与表面活性剂混合。
使用有效促进干燥的制剂在疏水载体中均匀分布和/或有助于脂质基结构单层组装体形成的量的表面活性剂。通常，疏水载体与表面活性剂的体积比(v/v)为约4∶1至约15∶1。
在一种实施方式中，组合物不包含表面活性剂。在这样的实施方式中，大小设定的脂质囊泡颗粒的均匀小大小可以允许脂质容易地重排以，在治疗剂和/或其它组分(例如佐剂和/或T辅助表位)存在于疏水载体中的情况下，形成具有单层脂质组装体的脂质基结构。因此，在这样的实施方式中，不需要表面活性剂。
实施方式
本发明的具体实施方式包括但不限于以下：
(1)用于制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供脂质囊泡颗粒，其具有≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的多分散指数(PDI)；(b)将脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂混合以形成混合物；(c)干燥步骤(b)中形成的混合物以形成包含脂质和治疗剂的干燥制剂。
(2)款(paragraph)(1)的方法，其中步骤(a)包括将脂质囊泡颗粒进行大小设定以提供平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒。
(3)款(2)的方法，其中，所述大小设定通过过滤器挤出进行。
(4)款(2)或(3)的方法，其中所述大小设定是通过穿过一个或多个聚碳酸酯膜如0.2μm聚碳酸酯膜、0.1μm聚碳酸酯膜和/或0.08μm聚碳酸酯膜挤出进行的。
(5)款(2)至(4)中任一项的方法，其中所述大小设定是通过(i)通过0.2μm聚碳酸酯膜挤出20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜挤出10-20次；或(ii)通过0.2μm聚碳酸酯膜挤出20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜挤出10-20次，并且然后通过0.08μm聚碳酸酯膜挤出10-20次进行的。
(6)款(2)至(5)中任一项的方法，其中所述大小设定是通过以下进行的：(i)通过0.2μm聚碳酸酯膜挤出25次，然后通过0.1μm的聚碳酸酯膜挤出10次，或者(ii)通过0.2μm聚碳酸酯膜挤出25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜挤出10次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜挤出15次。
(7)款(1)至(6)中任一项的方法，其中脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在约80nm至约120nm之间。
(8)款(1)至(7)中任一项的方法，其中脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小为约80nm、约81nm、约82nm、约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm、约88nm、约89nm、约90nm、约91nm、约92nm、约93nm、约94nm、约95nm、约96nm、约97nm、约98nm、约99nm、约100nm、约101nm、约102nm、约103nm、约104nm、约105nm、约106nm、约107nm、约108nm、约109nm、约110nm、约111nm、约112nm、约113nm、约114nm或约115nm。
(9)款(1)至(8)中任一项的方法，其中脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小≤100nm。
(10)款(1)至(9)中任一项的方法，其中所述脂质囊泡颗粒包含合成脂质。
(11)款(10)的方法，其中脂质囊泡颗粒包含合成的二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或合成的DOPC和胆固醇。
(12)款(11)的方法，其中所述脂质囊泡颗粒包含DOPC：胆固醇比为10：1(w/w)的合成DOPC和胆固醇。
(13)款(1)至(12)中任一项的方法，其中步骤(a)的脂质囊泡颗粒由脂质体前体制备。
(14)款(13)的方法，其中脂质体前体是
Figure BDA0002388629480000611
(15)款(1)至(14)中任一项的方法，其中脂质囊泡颗粒是脂质体。
(16)款(15)的方法，其中脂质体是单层的、多层的、多囊的或其混合物。
(17)款(1)至(16)中任一项的方法，其中将所述至少一种治疗剂溶解在乙酸钠、磷酸钠或氢氧化钠中的一种或多种中。
(18)款(1)至(17)中任一项的方法，其中所述至少一种治疗剂溶解于下列一种或多种中：0.1M氢氧化钠、pH为6.0±1.0的100mM乙酸钠、pH为9.5±1.0的100mM的乙酸钠、pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠或pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠。
(19)款(1)至(18)中任一项的方法，其中步骤(b)的混合在乙酸钠或磷酸钠溶液中进行。
(20)款(19)的方法，其中步骤(b)的混合在pH在6.0-10.5范围内的25-250mM乙酸钠或pH在6.0-8.0范围内的25-250mM磷酸钠中进行。
(21)款(19)的方法，其中步骤(b)的混合在pH为6.0±1.0的50mM乙酸钠、pH为9.5±1.0的100mM乙酸钠、pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠或pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠中进行。
(22)款(19)的方法，其中步骤(b)的混合在pH为7.0的50mM磷酸钠、pH为6.0的100mM磷酸钠、pH为6.0的50mM乙酸钠、或pH值为9.5的100mM乙酸钠中进行。
(23)款(1)至(22)中任一项的方法，其中所述治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸、激素、细胞因子、过敏原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
(24)款(1)至(22)中任一项的方法，其中所述治疗剂是一种或多种肽抗原。
(25)款(24)的方法，其中所述一种或多种肽抗原的长度为20-30个氨基酸。
(26)款(24)或(25)的方法，其中所述一种或多种肽抗原是新抗原。
(27)款(24)的方法，其中所述一种或多种肽抗原源自人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSVJ)、炭疽杆菌、疟原虫或存活蛋白多肽。
(28)款(27)的方法，其中所述一种或多种肽抗原是FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；或其任何组合。
(29)款(27)的方法，其中所述一种或多种肽抗原是NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)和/或NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)。
(30)款(24)至(27)中任一项的方法，其中步骤(b)包括将五种或更多种不同的溶解肽抗原与脂质囊泡颗粒混合。
(31)款(30)的方法，其中步骤(b)包括将上至30种不同的溶解肽抗原与脂质囊泡颗粒混合。
(32)款(30)的方法，其中步骤(b)包括将10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的溶解肽抗原与脂质囊泡颗粒混合。
(33)款(30)至(32)中任一项的方法，其中在步骤(b)之后，每种不同的溶解肽抗原的浓度为至少约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml。
(34)款(30)至(33)中任一项的方法，其中在步骤(b)之后，每种不同的溶解肽抗原的浓度为约0.5mg/ml。
(35)款(30)至(34)中任一项的方法，其中所述不同的溶解肽抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征被预选。
(36)款(30)至(35)中任一项的方法，其中所述不同的溶解肽抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。
(37)款(30)至(36)中任一项的方法，其中所述不同的溶解肽抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
(38)款(24)至(37)中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括以任何顺序将溶解的T辅助表位与脂质囊泡颗粒和所述一种或多种肽抗原混合。
(39)款(37)的方法，其中步骤(b)包括将10-15种新抗原与一种溶解的T辅助表位混合，其中所述T辅助表位包含氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO：1)。
(40)款(24)至(39)中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括以任何顺序将佐剂与脂质囊泡颗粒和所述一种或多种肽抗原混合。
(41)款(38)或(39)的方法，其中步骤(b)包括：(b1)提供包含所述一种或多种肽抗原和溶解的T辅助表位的抗原原液；(b2)将抗原原液与脂质囊泡颗粒混合以形成混合物。
(42)款(41)的方法，其中，在步骤(b1)中，抗原原液是在100mM氢氧化钠中制备的，其中每种溶解的抗原具有约2.0mg/ml的浓度。
(43)款(42)的方法，其中用pH值为6.0±0.5的50mM乙酸钠1：1稀释抗原原液，以提供约1.0mg/ml浓度的每种溶解的抗原。
(44)款(41)至(43)中任一项的方法，其中在步骤(b2)中混合之后并且在干燥之前，将混合物的pH调节至10±1.0。
(45)款(41)至(44)中任一项的方法，其中步骤(b2)进一步包括将所述混合物与佐剂混合。
(46)款(40)或(45)的方法，其中所述佐剂是聚I：C核苷酸佐剂。
(47)款(1)至(46)中任一项的方法，进一步包括在干燥之前无菌过滤步骤(b)中形成的混合物的步骤。
(48)款(1)至(47)中任一项的方法，进一步包括，在步骤(b)和(c)之间，确认脂质囊泡颗粒仍具有≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的多分散指数(PDI)的步骤。
(49)款(1)至(48)中任一项的方法，其中所述干燥通过冻干、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥进行。
(50)款(49)的方法，其中所述干燥通过冻干进行。
(51)款(50)的方法，其中冻干通过以下进行：将包含步骤(b)的混合物的一个或多个容器装载到袋中，将袋密封以形成密封单元，和在冷冻干燥机中冻干该密封单元。
(52)款(51)的方法，其中，所述袋是无菌高压灭菌袋。
(53)款(51)或(52)的方法，其中所述冷冻干燥机是台式冷冻干燥机。
(54)款(51)至(53)中任一项的方法，其中所述冷冻干燥机在冻干期间包含多于一个密封单元。
(55)款(54)的方法，其中各密封单元包含通过步骤(a)和(b)制备的不同混合物。
(56)款(1)至(55)中任一项的方法，进一步包括在步骤(c)的干燥之前和/或之后评价所述至少一种溶解治疗剂的稳定性的步骤。
(57)款(56)的方法，其中所述治疗剂的稳定性通过HPLC分析来评价。
(58)款(56)或(57)的方法，其中所述治疗剂是肽抗原，并且在干燥之前评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少80％以未降解形式保留。
(59)款(60)的方法，其中当在干燥后即刻评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少75％以未降解形式保留。
(60)款(58)或(59)的方法，其中当在干燥三个月后评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少70％以未降解形式保留。
(61)款(58)至(60)中任一项的方法，其中一种或多种肽抗原在干燥后上至3个月内未显示降解。
(62)制备药物组合物的方法，包括将通过款(1)至(61)中任一项的方法获得的干燥制剂溶解在疏水载体中。
(63)款(62)的方法，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
(64)款(62)或(63)的方法，其中疏水载体是
Figure BDA0002388629480000631
ISA 51。
(65)通过款(62)至(64)中任一项的方法制备的药物组合物。
(66)款(65)的药物组合物，其中脂质在疏水载体中是具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构的形式。
(67)款(66)的药物组合物，其中在疏水载体中，脂质为脂质的反胶团和/或聚集体形式，其中脂质的疏水部分朝向疏水载体向外定向并且脂质的亲水部分聚集为核心。
(68)稳定的无水药物组合物，其包含一种或多种具有单层脂质组装体的脂质基结构、至少一种治疗剂和疏水载体。
(69)款(68)的药物组合物，其中所述治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸、激素、细胞因子、过敏原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
(70)款(68)或(69)的药物组合物，其中所述治疗剂是一种或多种肽抗原。
(71)款(70)的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原的长度为20-30个氨基酸。
(72)款(70)或(71)的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是新抗原。
(73)款(70)的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原源自人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、炭疽杆菌、疟原虫或存活蛋白多肽。
(74)款(73)的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；或其任何组合。
(75)款(73)的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)和/或NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)。
(76)款(70)至(73)中任一项的药物组合物，其包含五种或更多种不同的肽抗原。
(77)款(76)的药物组合物，其包含上至30种不同的肽抗原。
(78)款(76)的药物组合物，其包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽抗原。
(79)款(76)至(78)中任一项的药物组合物，其中每种肽抗原独立地处于约0.1μg/μl至约5.0μg/μl之间的浓度。
(80)款(76)至(79)中任一项的药物组合物，其中每种肽抗原独立地处于约0.25μg/μl、约0.5μg/μl、约0.75μg/μl、约1.0μg/μl、约1.25μg/μl、约1.5μg/μl、约1.75μg/μl、约2.0μg/μl、约2.25μg/μl或约2.5μg/μl的浓度。
(81)款(76)至(80)中任一项的药物组合物，其包含10种或更多种不同的肽抗原，每种肽抗原的浓度为至少约0.5μg/μl。
(82)款(76)至(81)中任一项的药物组合物，其中所述肽抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。
(83)款(76)至(82)中任一项的药物组合物，其中所述肽抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。
(84)款(76)至(83)中任一项的药物组合物，其中所述肽抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
(85)款(68)至(84)中任一项的药物组合物，其进一步包含T辅助表位和佐剂中的一者或两者。
(86)款(68)至(85)中任一项的药物组合物，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
(87)款(68)至(86)中任一项的药物组合物，其中所述疏水载体是
Figure BDA0002388629480000651
ISA51。
(88)款(68)至(87)中任一项的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包含脂质的聚集体，其中脂质的疏水部分朝向疏水载体向外定向并且脂质的亲水部分聚集为核心。
(89)款(68)至(88)中任一项的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包含反胶团。
(90)款(68)至(89)中任一项的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在脂质基结构内部。
(91)款(68)至(90)中任一项的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在脂质基结构外部。
(92)款(68)至(91)中任一项的药物组合物，其为澄清溶液。
(93)款(68)至(92)中任一项的药物组合物，其没有可见的析出物。
(94)稳定的无水药物组合物，其包含一种或多种具有单层组装体的脂质基结构、五种或更多种不同的肽新抗原和疏水载体，其中肽新抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。
(95)款(94)的药物组合物，其包含上至30种不同的肽新抗原。
(96)款(94)或(95)的药物组合物，其包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽新抗原。
(97)款(94)至(96)中任一项的药物组合物，其中每种肽新抗原独立地处于约0.1μg/μl至约5.0μg/μl之间的浓度。
(98)款(94)至(97)中任一项的药物组合物，其中每种肽新抗原独立地处于约0.25μg/μl、约0.5μg/μl、约0.75μg/μl、约1.0μg/μl、约1.25μg/μl、约1.5μg/μl、约1.75μg/μl、约2.0μg/μl、约2.25μg/μl或约2.5μg/μl的浓度。
(99)款(94)至(98)中任一项的药物组合物，其包含至少14种不同的肽新抗原，每种肽新抗原处于至少约0.5μg/μl的浓度。
(100)款(94)至(99)中任一项的药物组合物，其中所述肽新抗原的长度为20-30个氨基酸。
(101)款(94)至(100)中任一项的药物组合物，其中肽新抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。
(102)款(94)至(101)中任一项的药物组合物，其中新抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
(103)款(94)至(102)中任一项的药物组合物，其进一步包含T辅助表位和佐剂中的一者或两者。
(104)款(94)至(103)中任一项的药物组合物，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
(105)款(94)至(104)中任一项的药物组合物，其中所述疏水载体是
Figure BDA0002388629480000661
ISA 51。
(106)款(94)至(105)中任一项的药物组合物，其中所述脂质基结构是囊泡结构，其中所述脂质的疏水部分朝向所述疏水载体向外定向。
(107)款(94)至(106)中任一项的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包含反胶团和/或脂质的聚集体，其中脂质的疏水部分朝向疏水载体向外定向并且脂质的亲水部分聚集为核心。
(108)款(94)至(107)中任一项的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在脂质基结构内部。
(109)款(94)至(108)中任一项的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在脂质基结构外部。
(110)款(94)至(109)中任一项的药物组合物，其是澄清溶液。
(111)款(94)至(110)中任一项的药物组合物，其不具有可见的析出物。
(112)款(65)至(111)中任一项的药物组合物，其能够被配制成用于通过注射给予的微剂量。
(113)款(112)的药物组合物，其中所述微剂量是约50μl、55μl、60μl、65μl、70μl或75μl的单剂量体积。
(114)款(66)至(112)中任一项的药物组合物，其中所述脂质基结构的大小在约2nm至约10nm直径之间。
(115)在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的方法，包括向对象给予款(65)至(114)中任一项的药物组合物。
(116)款(115)的方法，其用于治疗癌症或感染性疾病。
(117)款(65)至(114)中任一项的药物组合物用于在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的用途。
(118)款(117)的用途，用于治疗癌症。
(119)款(117)的用途，用于治疗感染性疾病。
(120)用于制备用于诱导抗体和/或CTL免疫响应的药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括：包含通过款(1)至(62)中任一项的方法制备的干燥制剂的容器；和包含疏水载体的容器。
(121)款(120)的试剂盒，其中所述干燥制剂包含十种或更多种不同的肽抗原。
(122)款(120)或(121)的试剂盒，其中疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
通过以下非限制性实施例进一步示例本发明。
实施例
现在将参考附图通过非限制性实施例来描述本发明。
实施例1
干燥脂质/治疗剂的制备
为制备干燥的脂质/治疗剂制剂，将10：1(w：w)DOPC和胆固醇的均质混合物(Lipoid GmbH，德国)以132mg/ml的浓度添加至100mM，pH 7.0的磷酸钠中，并以300RPM摇动约1小时，以形成脂质囊泡颗粒。然后通过使该材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次和通过0.1μm聚碳酸酯膜10次以达到≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的pdi，对混合物进行大小设定。向大小设定的脂质囊泡颗粒以0.5mg/mL的浓度添加HPV抗原(Y9T肽；YMLNLGPET；SEQ ID NO：10)，和以0.2mg/mL的浓度添加佐剂(dIdC寡核苷酸)，两者均伴以300RPM的摇动约15分钟。然后以0.25mg/ml的浓度将T辅助肽(A16L肽；AQYIKANSKFIGITEL；SEQ ID NO：1)加入大小设定的脂质囊泡颗粒/抗原-佐剂混合物，伴以300RPM的摇动约5分钟。然后将混合物进行连续无菌过滤——通过经过Millipak-20PVDF 0.22μm膜。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。以下将这种干燥的脂质/治疗剂制剂称为批次#1。
为使用不同的缓冲剂制备干燥的脂质/治疗剂制剂，遵循与上述相同的方案，除了用50mM，pH 7.0的磷酸钠代替100mM，pH 7.0的磷酸钠。制备了两批，以下称为批次#2和批次#3。
在疏水载体中溶解
将批次#1、#2和#3的干燥脂质/治疗剂制剂各自分别溶解在油稀释剂(即
Figure BDA0002388629480000671
ISA 51)中，以提供具有下表所示特征的最终组合物：
表1：示例性产品特征
Figure BDA0002388629480000672
下表和图1-3中描述了溶解后所得组合物的特征。
表2：产品特征-缓冲剂和pH值的影响
Figure BDA0002388629480000673
Figure BDA0002388629480000681
出乎意料地发现，即使将肽抗原添加至预形成的大小设定的脂质囊泡颗粒外部时，也可以将抗原溶解在疏水载体中，以获得没有明显析出物的澄清溶液。
实施例2
将使用大小设定的脂质囊泡颗粒的效果与非大小设定的脂质囊泡颗粒比较。
为利用大小设定的脂质囊泡颗粒配制组合物，遵循实施例1中制备批次#1的程序，除了使用以下抗原：
·批次#4a利用购自List Biologies(Campbell，CA)的炭疽重组保护性抗原来制备。该重组蛋白具有83,000道尔顿的近似分子量，并且相应于保护性抗原——炭疽杆菌产生的三蛋白外毒素的细胞结合组分。在制剂中采用0.25mg/ml的浓度。该抗原在本文中称为rPA。在此制剂中，批次#1中使用的dIdC寡核苷酸佐剂被脂肽佐剂(R-Pam3Cys)替代。
·批次#4b利用从Genscript(Piscataway，NJ)购买的HIV肽抗原AMQ9(AMQMLKETI；SEQ ID NO：12)和RGP10(RGPGRAFVTI；SEQ ID NO：11)来制备。RGP10肽源自HIV-1gp120的V3环，并且AMQ9肽是H-2Kd单倍型小鼠的gag的免疫显性MHC I类表位。已知两者均诱导特异性免疫响应。两者均以0.5mg/mL的浓度使用。
·批次#4c利用从Polypeptide(San Diego，CA)购买的具有下列氨基酸序列的五种合成存活蛋白肽抗原来制备：FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)和LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)。在该配方中，与批次#1相比，使用了相同的T辅助表位和佐剂。每种存活蛋白肽抗原在制造期间以0.5mg/ml的浓度用在制剂中。
·批次#4d利用二聚体形式的RSV肽抗原(SHe A肽；NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT；SEQ ID NO：2)来制备。制剂中采用0.25mg/ml的浓度。在该制剂中，不包括T辅助表位，并且dIdC寡核苷酸佐剂被脂肽佐剂(R-Pam3Cys)替代。
为使用非大小设定的囊泡颗粒配制组合物，遵循实施例1中用于制备批次#1的程序，除了不进行将材料进行大小设定以达到颗粒大小≤120nm且pdi≤0.1的步骤。制备四个批次，每批次使用如上关于批次#4a、4b、4c和4d所述的不同的抗原。具体地，非大小设定的脂质囊泡颗粒组合物是批次#5a(rPA抗原)；是批次#5b(HIV抗原)；是批次#5c(存活蛋白抗原)；和批次#5d(RSV抗原)。抗原用量与大小设定的脂质囊泡颗粒组合物相同。
在下表和图4中描述了在
Figure BDA0002388629480000682
ISA 51中溶解后的所得组合物的特征。
表3：产品特征-大小设定型vs非大小设定型的影响
Figure BDA0002388629480000683
Figure BDA0002388629480000691
结果表明，与使用非大小设定的脂质囊泡颗粒制备的组合物相比，使用大小设定的脂质囊泡颗粒制备的组合物具有改善的药学性质。
实施例3
研究利用和不利用胆固醇制备大小设定的脂质囊泡颗粒的影响。
大小设定的DOPC/胆固醇制剂
批次#6：为利用DOPC/胆固醇脂质囊泡颗粒制备干燥存活蛋白抗原制剂，将DOPC和胆固醇的10：1(w：w)均匀混合物(Lipoid GmbH，德国)加入100mM，pH 9.5的乙酸钠，伴以300RPM下的摇动约1小时。然后将该混合物进行大小设定——通过使材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，以得到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi。添加五种合成存活蛋白肽抗原(FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)和LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；每种0.5mg/mL)和dIdC寡核苷酸佐剂(0.2mg/mL)，并以300RPM摇动约15分钟。然后将T辅助肽(A16L肽；AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO：1)；0.25mg/mL)加入到大小设定的脂质囊泡颗粒/存活蛋白抗原-佐剂混合物中，并以300RPM摇动约5分钟。然后使混合物进行连续无菌过滤——通过经过Millipak-20PVDF0.22μm膜。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。
批次#7：为利用DOPC/胆固醇脂质囊泡颗粒制备干燥RSV抗原制剂，将DOPC和胆固醇的10：1(w：w)均匀混合物(Lipoid GmbH，德国)添加至100mM，pH 6.0的磷酸钠，并以300RPM摇动约1小时。然后对混合物进行大小设定——通过使材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi。加入二聚体形式的RSV肽抗原(SheA肽；0.25mg/mL的NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)，0.25mg/mL)和脂肽佐剂(R-Pam3Cys；0.02mg/mL)，并以300RPM摇动约15分钟。然后使混合物进行无菌过滤——通过使混合物通过单个Millipak-20PVDF 0.22μm膜。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。
大小设定的DOPC制剂
批次#8：为仅用DOPC脂质囊泡颗粒制备干燥存活蛋白抗原制剂，将DOPC(LipoidGmbH，德国)添加至100mM，pH 9.5的乙酸钠，并在300RPM下摇动约1小时。然后将混合物进行大小设定——通过使材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜15次以得到≤100nm的颗粒大小和≤0.1的pdi。添加五种合成存活蛋白肽抗原(FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ IDNO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)和LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；每种0.5mg/mL)和dIdC寡核苷酸佐剂(0.2mg/mL)和dIdC寡核苷酸佐剂(0.2mg/mL)，并在300RPM下摇动约15分钟。然后将T辅助肽(A16L肽；AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO：1)；以0.25mg/mL)加入到大小设定的脂质囊泡颗粒/存活蛋白抗原-佐剂混合物，并以300RPM摇动约5分钟。然后使混合物进行连续无菌过滤——通过经过Millipak-20PVDF 0.22μm膜。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。
批次#9：为仅用DOPC脂质囊泡颗粒制备干燥的RSV抗原制剂，将DOPC(LipoidGmbH，德国)添加至100mM，pH 6.0的磷酸钠中，并在300RPM下摇动约1小时。然后通过使材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜15次以达到≤100nm的颗粒大小和≤0.1的pdi，来对混合物进行大小设定。加入RSV肽抗原(SHe A肽；0.25mg/mL的NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)，0.25mg/mL)和脂肽佐剂(R-Pam3Cys；0.02mg/mL)并以300RPM摇动约15分钟。然后使混合物进行无菌过滤——通过使混合物通过单个Millipak-20PVDF 0.22μm膜。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。
将批次#6、#7、#8和#9的干燥脂质/治疗剂制剂各自分别溶解于
Figure BDA0002388629480000701
ISA51，以提供最终组合物。
下表和图5中描述了溶解后所得组合物的特征。
表4：产品特征-DOPC/胆固醇vs单独DOPC
Figure BDA0002388629480000702
Figure BDA0002388629480000711
结果表明，就在油载体中的溶解而言，使用DOPC和胆固醇两者或单独DOPC制备的组合物具有相似的药学性质。
实施例4
本文公开的此方法在配制肽新抗原中具有示例性应用。
下表中显示了本实施例中使用的新抗原。这些抗原由Castle等(2012)于常见的小鼠黑素瘤肿瘤，B16-F10鉴定和发表。
表5：新抗原肽列表
肽 序列
Mut17 VVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLAS(SEQ ID NO:34)
Mut20 FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM(SEQ ID NO:35)
Mut22 PKPDFSQLQRNILPSNPRVTRFHINWD(SEQ ID NO:36)
Mut24 TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD(SEQ ID NO:37)
Mut25 STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEK(SEQ ID NO:26)
Mut28 NIEGIDKLTQLKKPFLVNNKINKIENI(SEQ ID NO:38)
Mut29A IPSGTTILNCFHDVLSGKLSGGSPGVP(SEQ ID NO:39)
Mut29B SFACLRQPSQGPTVGVKGGAAGGGYAQ(SEQ ID NO:40)
Mut30 PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL(SEQ ID NO:27)
Mut36 CGTAFFINFIAIYHHASRAIPFGTMVA(SEQ ID NO:41)
Mut44 EFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGM(SEQ ID NO:28)
Mut45 ECRITSNFVIPSEYWVEEKEEKQKLIQ(SEQ ID NO:42)
Mut48 SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS(SEQ ID NO:43)
Mut50 GFSQPLRRLVLHVVSAAQAERLARAEE(SEQ ID NO:44)
简而言之，上述列出的新抗原在一个无菌容器中被一个接一个地称重。再将T辅助肽A16L(AQYIKANSKFIGITEL；SEQ ID NO：1)以新抗原重量的一半加入到称重的粉末混合物。然后将整个新抗原/T辅助剂粉末混合物以每种新抗原和A16L2 mg/gm的浓度溶解在氢氧化钠100mM溶液中——通过涡旋1分钟和超声2分钟。向制得的新抗原原液，快速加入等份(1：1)的乙酸钠，100mM，pH 6.0溶液，以实现每种新抗原的浓度为1mg/gm，A16L肽抗原的浓度为0.5mg/gm。
分别地，通过在无菌水中混合DNA系聚I：C多核苷酸佐剂(dIdC)，制备10mg/mL浓度的核苷酸佐剂原液，并将其以0.2mg/mL的浓度用于制剂中。
向稀释的新抗原原液溶液中，加入在前制备的DOPC：胆固醇(10：1w/w)大小设定脂质囊泡颗粒在乙酸钠中的50mM，pH 6.0原液(大小<100nm，pdi<0.1)，并利用磁力搅拌棒/摇床以300RPM充分混合3分钟。接下来，将核苷酸佐剂原液添加至新抗原大小设定脂质囊泡颗粒，并通过在300RPM下摇动/搅拌2分钟而充分混合。用冰乙酸将pH调节至10±1。在进行至下一个步骤之前，使用DLS ZETASIZER NANO-S颗粒大小分析仪确认大小设定的脂质囊泡颗粒/新抗原混合物的大小和pH。
对大小设定的脂质囊泡颗粒/新抗原混合物进行无菌过滤——通过使该混合物通过Millipak-20灭菌级Durapore膜。过滤利用医疗级氮气压力<55psi进行。简而言之，将大小设定的脂质囊泡颗粒/新抗原混合物装入配备Millipak-20PVDF 0.22μm膜的压力容器中，并利用40psi的氮气使其通过以完成无菌过滤。
无菌过滤后，将适当体积(例如1.0ml/小瓶)的无菌大小设定脂质囊泡颗粒/新抗原混合物无菌填充到无菌小瓶中，以提供下表中列出的在干燥制剂随后溶解于
Figure BDA0002388629480000721
ISA51中时的浓度。
表6：制剂组分和浓度
Figure BDA0002388629480000722
用于的小瓶和其它产品规格如下表详示。
表7：主要包装规格(产品容器)
Figure BDA0002388629480000723
关于冻干，将无菌填充的小瓶在无菌条件下装入并密封在无菌高压灭菌袋中，然后冻干(图6-10)。冻干进行时间为约75小时，在-30℃下一次干燥50小时，在+25℃下二次干燥16小时。更具体地，冻干根据以下方案进行：
表8：示例性冻干(冷冻干燥)循环
Figure BDA0002388629480000724
Figure BDA0002388629480000731
然后将干燥脂质/治疗剂制剂溶解于
Figure BDA0002388629480000732
ISA 51，可将组分配制为无水组合物。下表显示了新抗原、T辅助肽和寡核苷酸佐剂与脂质组分相比的摩尔比。
表9：14种新抗原、A16L和寡核苷酸佐剂与脂质浓度相比的摩尔浓度
Figure BDA0002388629480000733
冷冻干燥的产品形成了均匀干燥的饼状物，并在
Figure BDA0002388629480000734
ISA 51中溶解后形成澄清至微浑浊的溶液(见图11)。
实施例5
将如实施例4中所述制备的包含14种新抗原和A16L T辅助肽的组合物进行HPLC分析，以评价冻干之前和之后的肽稳定性。下表列出了HPLC仪器条件和测试的梯度特征。
表10：HPLC仪器条件
Figure BDA0002388629480000735
Figure BDA0002388629480000741
表11：梯度特征
Figure BDA0002388629480000742
实验条件：
IPQC溶液：用甲醇稀释IPQC溶液，然后用流动相A稀释，例如如下：
100mg过程中(In-Process)测试溶液
+450μl甲醇，混合
+450μl流动相A，混合
通过涡旋混合。含脂质的样品将轻微混浊。稀释系数＝10×。
冻干物(用于释放和稳定性测试)：用Ultrapure实验室用水溶解冻干物。加入3-4个玻璃珠并剧烈涡旋1分钟，以确保完全均匀。用甲醇稀释溶液，然后用流动相A稀释，例如如下：
100mg过程中测试溶液
+450μl甲醇，混合
+450μl流动相A，混合
通过涡旋混合。样品制剂将轻微混浊。稀释系数＝20×。
包含14种新抗原和A16L T辅助肽的标准品的HPLC色谱图如图12所示。
在冷冻干燥之前和之后利用HPLC方法对根据实施例4制备的新抗原和A16L材料进行定量表征。显示了冷冻干燥前的14种新抗原和A16L T辅助肽的HPLC色谱图显示在图13中。
冷冻干燥后获得的T＝0、T＝1M和T＝3M的HPLC色谱图分别显示在图14-16中。干燥的制剂被溶解于水中以进行HPLC分析。T＝0是从冷冻干燥机中取出样品的那天。T＝1M和T＝3M分别是在T＝0之后的1个月和3个月，其中干燥的制剂已被储存在-20℃下。下表描述了计算的肽回收率。
表12：冷冻干燥前后的新抗原和A16L回收率
Figure BDA0002388629480000751
图13-16和上面表12中显示的结果表明，当通过所述方法制备时，干燥脂质/治疗剂制剂中的肽是稳定的，并且肽浓度在设定的规格内。(设定规格：新抗原0.40-0.60mg/ml，A16L 0.2-0.3mg/mL。)
实施例6
从Charles River Laboratories(St.Constant，PQ)购买6-8周龄的无病原体C57BL/6NCrl小鼠，并根据机构指南在过滤器控制的空气循环下圈养，自由采食水和食物。新抗原是由Genscript合成的，并列于表5中。
第1组(n＝5)的小鼠疫苗接种100微升水性非贮库形成疫苗(non-depot formingvaccine)，其在pH 10.5的乙酸钠缓冲剂中含有14种新抗原——各50微克剂量，A16L T辅助肽——50微克剂量，DNA系聚I：C——40微克剂量。
第2组(n＝5)的小鼠疫苗接种100微升的油基贮库形成疫苗，其在ISA51 VG油中包含14种新抗原——各50微克剂量，A16L T辅助肽——50微克剂量，DNA系聚I：C——40毫克剂量，12毫克DOPC，1.2毫克胆固醇。
疫苗接种后八天，将小鼠处死并收集脾脏。在IFN-γELISPOT板(BD Biosciences)中刺激脾细胞，其中同系树突状细胞无加载(背景；BG)或加载有不相关肽(RAHYNIVTF；SEQID NO：9)或各新抗原(17、20、22、24、25、28、29A，29B，30、36、44、45、48、50)。培养18小时后，使板显影，并利用Immunospot读取器(C.T.L.)计数斑点形成单元(SFU)的数量。结果示于图17中，为平均响应±SEM。统计学分析通过双因素方差分析(2-way ANOVA)进行，Bonferroni事后检验比较对每种肽的组响应。
结果表明，油基制剂在单次免疫接种后比水性制剂更好地增强免疫响应。
实施例7
通过小角度X射线散射技术(SAXS)分析来自实施例1的批次#4c(存活蛋白)和批次#4a(rPA)组合物，以确定用大小设定的脂质囊泡颗粒制备组合物时疏水载体中存在的脂质基结构的大小和形状。
SAXS图谱在加拿大QC舍布鲁克大学(University of Sherbrooke)用BrukerAXSNanostar系统收集，该系统配备有45kV/0.65mA的Microfocus铜阳极，MONTAL OPTICS和距离样品27.3cm的VANTEC 2000 2D检测器。在测量之前，用山嵛酸银标准物校准距离。将样品注入0.6mm直径的特殊玻璃毛细管中，密封并放置在预定位置。定位微调是通过纳米技术完成的；2秒逐步扫描对X和Y扫描，以找到样品的确切位置。散射强度用ATSAS 2.3软件的Primus GNOM 3.0程序处理。
测量下列的扫描：(1)Montanide ISA 51VG(空白对照)，(2)批次#4c组合物，和(3)批次#4a组合物。对于Montanide ISA 51VG样品、批次#4c样品和批次#4a样品，扫描进行800秒暴露。从批次#4c和批次#4a样品中数学扣减Montanide ISA 51VG，以通过对距离分布函数确定颗粒大小和形状。高斯曲线形状一般用于球形颗粒。
图18显示了Montanide ISA 51VG(空白对照)的结果。没有观察到颗粒结构。因此，没有进行颗粒大小的评价。
图19显示了批次#4c组合物(存活蛋白)的结果。该图像表明脂质形成单层组装体。如颗粒大小评价所示，Dmax颗粒大小为约5.8nm，并且通过SAXS估测的形状为球形。这相应于反胶团的大小。
图20显示了批次#4a组合物(rPA)的结果。该图像表明脂质形成单层组装体。如颗粒大小评价所示，Dmax颗粒大小为约4.0nm，并且通过SAXS估测的形状为球形。这相应于反胶团的大小。
实施例8
研究了用DOPC/胆固醇或S100卵磷脂在MS80油载体中制备大小设定的脂质囊泡颗粒的影响。MS80油是矿物油(Sigma Aldrich)和Span80(Fluka)的混合物，单独购买并混合。
MS80中的大小DOPC/胆固醇制剂
批次#10：为制备包含重组保护性抗原(rPA；与批次#4a相同的抗原)的干燥制剂，将DOPC/胆固醇(Lipoid GmbH，德国)的10：1(w：w)均质混合物添加至100mM，pH7.0的磷酸钠，并在300RPM下摇动约1小时。然后通过使材料通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi，来对混合物进行大小设定。加入rPA抗原(0.25mg/mL)和脂肽佐剂(R-Pam3Cys；0.02mg/ml)，并以300RPM摇动约15分钟。然后通过使混合物通过Millipak-20PVDF 0.22μm膜，使混合物进行连续无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。向干燥的制剂加入700μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动2分钟。如图21A所示，获得澄清溶液。
批次#11：为制备包含二聚体形式的RSV肽抗原(SHe A肽；NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT；SEQ ID NO：2)的干燥制剂，将DOPC/胆固醇的10：1(w：w)均匀混合物(Lipoid GmbH，德国)加入100mM，pH 6.0的磷酸钠，并在300RPM下摇动约1小时。然后通过使材料通过0.2μm的聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm的聚碳酸酯膜10次，以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi，来进行混合物大小设定。加入RSV肽抗原二聚体(0.25mg/mL)和脂肽佐剂(R-Pam3Cys；0.02mg/ml)，并以300RPM摇动约15分钟。然后通过使混合物通过单个Millipak-20PVDF 0.22μm膜，对混合物进行无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。向干燥的制剂加入450μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动2分钟。如图21B所示，获得澄清溶液。
在MS80中的大小设定的S100卵磷脂制剂
批次#12：为制备包含二聚体形式的RSV肽抗原(SHE A肽；NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT；SEQ ID NO：2)的干燥制剂，将类脂质S100卵磷脂(LipoidGmbH，德国)添加至100mM，pH 6.0的乙酸钠，并以300RPM摇晃约1小时。然后通过使材料通过0.2μm的聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm的聚碳酸酯膜10次，以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi，来对混合物进行大小设定。加入RSV肽抗原二聚体(0.25mg/mL)和脂肽佐剂(R-Pam3Cys；0.02mg/ml)，并以300RPM摇动约15分钟。然后通过使混合物通过单个Millipak-20PVDF 0.22μm膜，进行混合物无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥脂质/治疗剂制剂。向干燥的制剂中，加入450μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动2分钟。如图21C所示，获得澄清的黄色溶液。该溶液是黄色的，因为S100(大豆卵磷脂)材料的颜色是黄色，因此溶解的组合物也是黄色的。
批次#13：为用S100卵磷脂囊泡颗粒制备干燥的存活蛋白抗原制剂，将类脂质S100卵磷脂(Lipoid GmbH，德国)加入到100mM，pH 9.5的乙酸钠，并在300RPM下摇动约1小时。然后通过使材料通过0.2μm的聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm的聚碳酸酯膜10次，以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的PDI，来对混合物进行大小设定。加入五种合成存活蛋白肽抗原(FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)和LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；各0.5mg/mL)和dIdC寡核苷酸佐剂(0.2mg/mL)，并在300RPM下摇动约15分钟。然后将T辅助肽(A16L肽；AQYIKANSKFIGITEL(SEQID NO：1)；0.25mg/mL)加入到大小设定的脂质囊泡颗粒/存活蛋白抗原-佐剂混合物，并以300RPM摇动约5分钟。然后通过使混合物通过Millipak-20PVDF 0.22μm膜，对混合物进行连续无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥的脂质/治疗剂制剂。向干燥的制剂加入700μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动2分钟。如图21D中所示，获得了透明的黄色溶液。再次，溶液是黄色的是因为S100(大豆卵磷脂)材料是黄色的，因此溶解的组合物也是黄色的。
批次#14：为制备包含疟疾抗原的干燥制剂，重复上文批次#13所述的程序，除了用疟疾VLP抗原(土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)上显示的环子孢子(CS)T和B细胞表位；0.2mg/mL)代替存活蛋白肽抗原和T辅助表位)。向干燥的制剂加入545μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动2分钟。如图21E所示，获得了澄清的黄色溶液。再次，溶液是黄色的是因为S100(大豆卵磷脂)材料是黄色的，因此溶解的组合物也是黄色的。
在MS80中的大小设定的S100卵磷脂/胆固醇制剂
批次#15：为制备包含购自Genscript(Piscataway，NJ)的HIV肽抗原AMQ9(AMQMLKETI；SEQ ID NO：12)和RGP10(RGPGRAFVTI；SEQ ID NO：11)的干燥制剂，将类脂质S100卵磷脂/胆固醇(Lipoid GmbH，德国)的10：1(w：w)的均匀混合物加入到100mM，pH 9.5的乙酸钠，并在300RPM下摇动约1小时。然后通过使材料通过0.2μm的聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm的聚碳酸酯膜10次，以达到≤120nm的颗粒大小和≤0.1的pdi，来对混合物进行大小设定。加入HIV肽抗原(各0.5mg/mL)和dIdC寡核苷酸佐剂(0.2mg/mL)，并以300RPM摇动约15分钟。然后将T辅助肽(A16L肽；AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO：1)；0.25mg/mL)加入到大小设定的脂质囊泡颗粒/HIV抗原佐剂混合物，并在300RPM下摇动约5分钟。然后通过使混合物通过Millipak-20PVDF 0.22μm膜，对混合物进行连续无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥脂质/治疗剂制剂。向干燥的制剂加入700μl的MS80油，并浸泡5分钟，然后摇动4分钟。如图21E所示，获得了澄清的黄色溶液。再次，溶液是黄色的是因为S100(大豆卵磷脂)材料是黄色的，因此溶解的组合物也是黄色的。
下表和图21中描述了溶解后所得组合物的特征。
表13：产品特征-MS80中的DOPC/胆固醇或S100卵磷脂
Figure BDA0002388629480000781
结果表明，使用由DOPC/胆固醇、S100卵磷脂和S100卵磷脂/胆固醇制备的大小设定的脂质囊泡颗粒制备的组合物全部都在MS80油载体中溶解后提供澄清的溶液。这例证了Montanide ISA 51中的表面活性剂(即二缩甘露醇油酸酯)对于获得适合的药物组合物不是至关重要的。
实施例9
干燥脂质/治疗剂的制备
为制备干燥脂质/治疗剂制剂，将DOPC和胆固醇的10：1(w：w)均质混合物(LipoidGmbH，德国)以132mg/ml的浓度添加至100mM，pH 9.5的乙酸钠，并以300RPM摇动约1小时，以形成脂质囊泡颗粒。然后通过使材料通过0.2μm的聚碳酸酯膜25次和通过0.1μm的聚碳酸酯膜10次以达到≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的pdi，来对混合物进行大小设定。向大小设定的脂质囊泡颗粒以2.0mg/mL的浓度添加小分子药物(环磷酰胺)，并以300RPM摇动约15分钟。然后通过使混合物通过Millipak-20PVDF 0.22μm膜，对混合物进行连续无菌过滤。将无菌溶液等分到小瓶中并冷冻干燥，以制备干燥脂质/治疗剂制剂。该干燥脂质/治疗剂制剂在下文中称为批次#16。如图22所示，该干燥制剂的外观看起来良好，即其是干燥，白色且无塌陷的。
在疏水载体中的溶解
将批次#16的干燥脂质/治疗剂制剂溶解在油稀释剂(即
Figure BDA0002388629480000791
ISA 51VG)中，以提供具有4.0mg/mL环磷酰胺和132mg/ml DOPC/胆固醇(10：1w/w)的最终组合物。
如图22所示，通过使用本文公开的方法，可以将环磷酰胺溶解在疏水载体中，以获得不含颗粒的澄清至轻微混浊的溶液。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同具体地和单独地指出每个单独的出版物或专利申请均被通过引用并入。任何出版物的引用都是出于其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权早于该出版物。
尽管出于清楚理解的目的已经通过示例和实例的方式详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下可以进行某些改变和修改。
必须注意，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应该理解为是指如此关联的元素中的“任一者或两者”，即在某些情况下合取地存在而在其它情况下析取地存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即，如此关联的元素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”子句明确标识的元素之外的其它元素可以任选地存在，无论与那些具体标识的元素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，“A和/或B”的提及在与开放式语言(如“包含”)结合使用时，在一种实施方式中，可以指代仅A(任选地包括B以外的元素)；在另一实施方式中，仅B(任选地包括A以外的元素)；在又一种实施例中，A和B(任选地包括其它元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中所使用，“或”应理解为包含与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列举中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为是包括性的，即包括多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地其它未列出的项目。
如本文使用，无论是在说明书中还是在所附权利要求书中，过渡术语“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”等应被理解为是包括性的或开放式的(即，意为包括但不限于)，并且其不排除未记载的要素、材料或方法步骤。关于本文的权利要求和示例性实施方式段落，仅过渡短语“由……组成”和“主要由……构成”是分别是封闭式或半封闭式过渡短语。过渡短语“由……组成”排除未具体记载的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将范围限制为指定的元素、材料或步骤以及不实质性影响本文所公开和/或要求保护的发明的基本特征的那些。
参考文献：
1)Akbarzadeh,A.；Rezaei-Sadabady,R.；Davaran,S.；Joo,S.W.；Zarghami,N.；Hanifehpour,Y.；Samiei,M.；Kouhi,M.；and Nejati-Koshki,K.(2013)Liposome:classification,preparation,and applications,Nanoscale Res Lett.8(1),102.
2)Banga,A.K.Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processingand Delivery Systems(Lancaster,PA:Technomic Publishing Co.,1995).
3)Bobst,A.M.；Langemeier,P.W.；Torrence,P.F.；De Clercq,E.(1981)Interferon Induction by Poly(inosinic acid)·Poly(cytidylic acid)Segmented bySpin-Labels,Biochemistry 20(16),4798-4803.
4)Caruthers,M.H.；Beaucage,S.L.；Efcavitch,J.W.；Fisher,E.F.；Matteucci,M.D.；Stabinsky,Y.(1980)New chemical methods for synthesizing polynucleotides,Nucleic Acids Res.Symp.Ser.(7),215-223.
5)Castle,J.C.:Kreiter,S.；Diekmann,J.；Lower,M.；van de Roemer,N.；deGraaf,J.；Selmi,A.；Diken,M.；Boegel,S.；Paret,C.；Koslowski,M.；Kuhn,A.N.；Britten,C.M.；Huber,C.；Turesi,O.；and Sahin,U.(2012)Exploiting the Mutanome for TumorVaccination.Cancer Res,72(5):1081-1091.
6)Celis,E.；Ou,D.；Otvos,L.Jr.(1988)Recognition of hepatitis B surfaceantigen by human T lymphocytes.Proliferative and cytotoxic responses to amajor antigenic determinant defined by synthetic peptides,J.Immunol.140,1808-1815.
7)Chong,P.；Zobrist,G.；Sia,C.；Loosmore,S.；Klein,M.(1992)Identificationof T-and B-cell epitopes of the S2 and S3 subunits of pertussis toxin by useof synthetic peptides,Infect Immun.60,4640–4647.
8)Coligan et al.,ed.Current Protocols in Immunology,WileyInterscience,2007
9)Collins,P.L.；Olmsted,R.A.；Johnson,P.R.(1990)The small hydrophobicprotein of human respiratory syncytial virus:comparison between antigenicsubgroups A and B,J Gen Virol.71(7),1571-6.
10)Demotz,S.；Lanzavecchia,A.；Eisel,U.；Niemann,H.；Widmann,C.；Corradin,G.P.(1989)Delineation of several DR-restricted epitopes in tetanus toxin,J.Immunol.142,394-402.
11)Diethelm-Okita,B.M.；Okita,D.K.；Banaszak,L.；Conti-Fine,B.M.(2000)Universal epitopes for human CD4+cells on tetanus and diphtheria toxins,J.Infect.Dis.181,1001–1009.
12)Flynn,J.L.(1994)Recombinant BCG as an antigen delivery system,Cell.MoI.Biol.40(suppl.1),31-36.
13)Frezard,F.(1999)Liposomes:from biophysics to the design of peptidevaccines,Braz.J.Med.Bio.Res.32,181-189.
14)Greene,J.J.；Alderfer,J.L.；Tazawa,I.；Tazawa,S.；Ts'o,P.O.；O'Malley,J.A.；Carter,W.A.(1978)Interferon induction and its dependence on the primaryand secondary structure of poly(inosinic acid).poly(cytidylic acid),Biochemistry 17(20),4214-4220.
15)Gregoriadis G.(1990)Immunological adjuvants:a role for liposomes,Immunol.Today 11,89-97.
16)Hacohen,N.；Wu,C.J.；Fritsch,E.F.；Combination therapy withNeoantigen Vaccine,US20160339090A1.
17)Hagstrom,N.J.；Couto,L.B.；Scallan,C.；Burton,M.；McCleland,M.L.；Fields,P.A.；Arruda,V.R.；Herzog,R.W.and High,K.A.(2000)Blood,95,2536-2542.
18)Hendrix,C.W.；Margolick,J.B.；Petty,B.G.；Markham,R.B.；Nerhood,L.；Farzadegan,H.；Ts'o,P.O.；Lietman,P.S.(1993)Biologic effects after a singledose of poly(I):poly(C12U)in healthy volunteers,Antimicrob.AgentsChemother.37(3),429-435.
19)High,N.；Mounier,J.；Prévost,M.C.；Sansonetti,P.J.(1992)IpaB ofShigella flexneri causes entry into epithelial cells and escape from thephagocytic vacuole,EMBO J11,1991-1999.
20)Horn,T.；Vasser,M.P.；Struble,M.E.；Crea,R.(1980)Synthesis ofoligonucleotides on cellulose.Part II:Design and synthetic strategy to thesynthesis of 22oligodeoxynucleotides coding for gastric inhibitorypolypeptide(GIP),Nucleic Acids Symp.Ser.(7),225-232.
21)Kawaoka,Y.；Yamnikova,S.；Chambers,T.M.；Lvov,D.K.；Webster,R.G.(1990)Molecular characterization of a new hemagglutinin,subtype H14,of influenza Avirus,Virology 179(2),759-767.
22)Kieny,M.P.；Lathe,R.；Drillien,R.；Spehner,D.；Skory,S.；Schmitt,D.；Wiktor,T.；Koprowski,H.and Lecocq,J.P.(1984)Expression of rabies virusglycoprotein from a recombinant vaccinia virus,Nature 312,163-166.
23)Levey,D.L.；Castle,J.C.；Stein,R.B.and Buell,J.S.Vaccines fortreatment and prevention of cancer,US20160331821A1.
24)Li,X.；Eastman,E.M.；Schwartz,R.J.；and Draghia-Akli,R.(1999)Synthetic muscle promoters:activities exceeding naturally occurringregulatory sequences,Nat.Biotechnol 17,241-245.
25)Li,Z.L.and Paulin,D.(1991)High level desmin expression depends ona muscle-specific enhancer,J.Biol.Chem.266,6562-6570.
26)Li,Z.L.and Paulin,D.(1993)Different factors interact withmyoblast-specific and myotube-specific enhancer regions of the human desmingene,J.Biol.Chem.268,10403-10415.
27)Medaglini,D.；Pozzi,G.；King,T.P.and Fischetti,V.A.(1995)Mucosal andsystemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surfaceof the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oralcolonization,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6868-6872.
28)Mekalanos,J.J.；Swartz,D.J.；Pearson,G.D.N.；Harford,N.；Groyne,F.andde wilde,M.(1983)Cholera toxin genes:nucleotide sequence,deletion analysisand vaccine development,Nature 306,551-557.
29)Merrifield,B.(1997)Concept and early development of solid-phasepeptide synthesis,Methods Enzymol.289,3-13.
30)Moyle,P.M.；Toth.I.(2008)Self-adjuvanting lipopeptide vaccines,Curr.Med.Chem.15(5),506-516.
31)Mullard A.(2016)The cancer vaccine resurgence,Nat Rev Drug Disc15,663-665.
32)Nakayama,K.；Kelly,S.M.and Curtis,R.III(1988)Construction of an Asd+expression cloning vector:stable maintenance and high level expression ofcloned genes in a Salmonella strain,Bio/Technology 6,693-697.
33)Roberge,J.Y.；Beebe,X.；Danishefsky,S.J.(1995)A strategy for aconvergent synthesis of N-linked glycopeptides on a solid support,Science 269(5221),202-204.
34)Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA 1985.
35)Sizemore,D.R.；Branstrom,A.A.；and Sadoff,J.C.(1995)AttenuatedShigella as a DNA Delivery Vehicle for DNA-Mediated Immunization,Science 270,299-303.
36)Slingluff,C.L.Jr.；Yamshchikov,G.；Neese,P.；Galavotti,H.；Eastham,S.；Engelhard,V.H.；Kittlesen,D.；Deacon,D.；Hibbitts,S.；Grosh,W.W.；Petroni,G.；Cohen,R.；Wiernasz,C.；Patterson,J.W.；Conway,B.P.；Ross,W.G.(2001)Phase I trialof a melanoma vaccine with gp100(280–288)peptide and tetanus helper peptidein adjuvant:Immunologic and clinical outcomes,Clin Cancer Res.7,3012–3024.
37)Skwarczynski,M.and Toth,I.(2016)Peptide-based synthetic vaccines,Chem.Sci.7,842-854.
38)So,N.S.Y.；Ostrowski,M.A.；Gray-Owen,S.D.(2012)Vigorous Response ofHuman Innate Functioning IgM Memory B Cells upon Infection by Neisseriagonorrhoeae,J.Immunol.188(8),4008-4022.
39)Srivastava,P.(2015)Neoepitopes of Cancers:Looking Back,LookingAhead,Cancer Immunol.Res.3,969-977.
40)Tartaglia,J.；Perkus,M.E.；Taylor,J.；Norton,E.K.；Audonnet,J.C.；Cox,W.I.；Davis,S.W.；van der Hoeven,J.；Meignier,B.；Riviere,M.；et al.(1992)NYVAC:ahighly attenuated strain of vaccinia virus,Virology 188,217-232.
41)Taylor,J.；Meignier,B.；Tartaglia,J.；Languet,B.；VanderHoeven,J.；Franchini,G.；Trimarchi,C.；and Paoletti E.(1995)Biological and immunogenicproperties of a canarypox-rabies recombinant,ALVAC-RG(vCP65)in non-avianspecies,Vaccine 13,539-549.
42)The United States Pharmacopoeia:The National Formulary(USP 24NF19)published in 1999.
43)Webster,R.G.；Laver,W.G.；Air,G.M.Antigenic variation among type Ainfluenza viruses,p.127-168.In:Palese,P.&Kingsbury,D.W.,eds.Genetics ofinfluenza viruses.(New York:Springer-Verlag,1983).
44)Zhenlin,L.；Lilienbaum,A.；Butler-Browne,G.；Paulin,D.(1989)Humandesmin-coding gene:complete nucleotide sequence,characterization andregulation of expression during myogenesis and development,Gene 78,243-254.
序列表
<110> 免疫疫苗技术公司
<120> 药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其用途
<130> 78961-210
<140> PCT/CA2017/xxxxxx
<141> 2017-11-09
<150> US 62/530,498
<151> 2017-07-10
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A16Y T辅助表位
<400> 1
Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV SHeA
<400> 2
Asn Lys Leu Cys Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu
1 5 10 15
Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr
20
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV SHeB
<400> 3
Asn Lys Leu Ser Glu His Lys Thr Phe Cys Asn Lys Thr Leu Glu Gln
1 5 10 15
Gly Gln Met Tyr Gln Ile Asn Thr
20
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A1 (修饰)
<400> 4
Phe Thr Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A2 (修饰)
<400> 5
Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A3 (修饰)
<400> 6
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A24
<400> 7
Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-B7
<400> 8
Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV 16E7
<400> 9
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV Y9T
<400> 10
Tyr Met Leu Asn Leu Gly Pro Glu Thr
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV RGP10
<400> 11
Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV AMQ9
<400> 12
Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
1 5
<210> 13
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV亚型A
<400> 13
Met Glu Asn Thr Ser Ile Thr Ile Glu Phe Ser Ser Lys Phe Trp Pro
1 5 10 15
Tyr Phe Thr Leu Ile His Met Ile Thr Thr Ile Ile Ser Leu Leu Ile
20 25 30
Ile Ile Ser Ile Met Ile Ala Ile Leu Asn Lys Leu Cys Glu Tyr Asn
35 40 45
Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr
50 55 60
<210> 14
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV亚型B
<400> 14
Met Gly Asn Thr Ser Ile Thr Ile Glu Phe Thr Ser Lys Phe Trp Pro
1 5 10 15
Tyr Phe Thr Leu Ile His Met Ile Leu Thr Leu Ile Ser Leu Leu Ile
20 25 30
Ile Ile Thr Ile Met Ile Ala Ile Leu Asn Lys Leu Ser Glu His Lys
35 40 45
Thr Phe Cys Asn Lys Thr Leu Glu Gln Gly Gln Met Tyr Gln Ile Asn
50 55 60
Thr
65
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV SHeA C45S
<400> 15
Asn Lys Leu Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu
1 5 10 15
Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr
20
<210> 16
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV bSHeA
<400> 16
Asn Lys Leu Cys Asp Leu Asn Asp His His Thr Asn Ser Leu Asp Ile
1 5 10 15
Arg Thr Arg Leu Arg Asn Asp Thr Gln Leu Ile Thr Arg Ala His Glu
20 25 30
Gly Ser Ile Asn Gln Ser Ser Asn
35 40
<210> 17
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV bSHeA C45S
<400> 17
Asn Lys Leu Ser Asp Leu Asn Asp His His Thr Asn Ser Leu Asp Ile
1 5 10 15
Arg Thr Arg Leu Arg Asn Asp Thr Gln Leu Ile Thr Arg Ala His Glu
20 25 30
Gly Ser Ile Asn Gln Ser Ser Asn
35 40
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV SHeB C51S
<400> 18
Asn Lys Leu Ser Glu His Lys Thr Phe Ser Asn Lys Thr Leu Glu Gln
1 5 10 15
Gly Gln Met Tyr Gln Ile Asn Thr
20
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV SHeB C45S
<400> 19
Asn Lys Leu Cys Glu His Lys Thr Phe Ser Asn Lys Thr Leu Glu Gln
1 5 10 15
Gly Gln Met Tyr Gln Ile Asn Thr
20
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV L-SHeB C51S
<400> 20
Cys Gly Gly Gly Ser Asn Lys Leu Ser Glu His Lys Thr Phe Ser Asn
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu Gln Gly Gln Met Tyr Gln Ile Asn Thr
20 25
<210> 21
<211> 429
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggattga 429
<210> 22
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A1
<400> 23
Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A2
<400> 24
Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 存活蛋白HLA-A3
<400> 25
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut25
<400> 26
Ser Thr Ala Asn Tyr Asn Thr Ser His Leu Asn Asn Asp Val Trp Gln
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Lys
20 25
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut30
<400> 27
Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser
1 5 10 15
Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu
20 25
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut44
<400> 28
Glu Phe Lys His Ile Lys Ala Phe Asp Arg Thr Phe Ala Asn Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro Met Val Val Phe Ala Thr Pro Gly Met
20 25
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PADRE T辅助表位
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是环己基丙氨酰基
<400> 29
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F21E T辅助表位
<400> 30
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG寡核苷酸
<400> 31
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚I：C寡核苷酸 (dIdC)
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (5)..(5)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (5)..(5)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (7)..(7)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(7)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (9)..(9)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (9)..(9)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (11)..(11)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(11)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (13)..(13)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (13)..(13)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (15)..(15)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (17)..(17)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (17)..(17)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (19)..(19)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (21)..(21)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> 修饰_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 肌苷
<220>
<221> misc_特征
<222> (23)..(23)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (25)..(25)
<223> n是a、c、g或t
<400> 32
ncncncncnc ncncncncnc ncncnc 26
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 棕榈酸佐剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> 连接至PAM2或PAM3
<400> 33
Cys Ser Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut17
<400> 34
Val Val Asp Arg Asn Pro Gln Phe Leu Asp Pro Val Leu Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser
20 25
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut20
<400> 35
Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Met Asp
1 5 10 15
Glu Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met
20 25
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut22
<400> 36
Pro Lys Pro Asp Phe Ser Gln Leu Gln Arg Asn Ile Leu Pro Ser Asn
1 5 10 15
Pro Arg Val Thr Arg Phe His Ile Asn Trp Asp
20 25
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut24
<400> 37
Thr Ala Val Ile Thr Pro Pro Thr Thr Thr Thr Lys Lys Ala Arg Val
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ala Thr Pro Ser Thr Asp
20 25
<210> 38
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut28
<400> 38
Asn Ile Glu Gly Ile Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Lys Pro Phe Leu
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Ile Asn Lys Ile Glu Asn Ile
20 25
<210> 39
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut29A
<400> 39
Ile Pro Ser Gly Thr Thr Ile Leu Asn Cys Phe His Asp Val Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Leu Ser Gly Gly Ser Pro Gly Val Pro
20 25
<210> 40
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut29B
<400> 40
Ser Phe Ala Cys Leu Arg Gln Pro Ser Gln Gly Pro Thr Val Gly Val
1 5 10 15
Lys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Ala Gln
20 25
<210> 41
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut36
<400> 41
Cys Gly Thr Ala Phe Phe Ile Asn Phe Ile Ala Ile Tyr His His Ala
1 5 10 15
Ser Arg Ala Ile Pro Phe Gly Thr Met Val Ala
20 25
<210> 42
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut45
<400> 42
Glu Cys Arg Ile Thr Ser Asn Phe Val Ile Pro Ser Glu Tyr Trp Val
1 5 10 15
Glu Glu Lys Glu Glu Lys Gln Lys Leu Ile Gln
20 25
<210> 43
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut48
<400> 43
Ser His Cys His Trp Asn Asp Leu Ala Val Ile Pro Ala Gly Val Val
1 5 10 15
His Asn Trp Asp Phe Glu Pro Arg Lys Val Ser
20 25
<210> 44
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mut50
<400> 44
Gly Phe Ser Gln Pro Leu Arg Arg Leu Val Leu His Val Val Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Glu Arg Leu Ala Arg Ala Glu Glu
20 25

Claims (102)

1.制备包含脂质和治疗剂的干燥制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供平均颗粒大小≤120nm且多分散指数(PDI)≤0.1的脂质囊泡颗粒；
(b)将所述脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的治疗剂混合以形成混合物；和
(c)干燥步骤(b)中形成的所述混合物以形成包含脂质和治疗剂的干燥制剂。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括将脂质囊泡颗粒进行大小设定以提供平均颗粒大小≤120nm且PDI≤0.1的脂质囊泡颗粒。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小在约80nm至约120nm之间。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小为约80nm、约81nm、约82nm、约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm、约88nm、约89nm、约90nm、约91nm、约92nm、约93nm、约94nm、约95nm、约96nm、约97nm、约98nm、约99nm、约100nm、约101nm、约102nm、约103nm、约104nm、约105nm、约106nm、约107nm、约108nm、约109nm、约110nm、约111nm、约112nm、约113nm、约114nm或约115nm。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小≤100nm。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒包含合成脂质。
7.权利要求6所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒包含合成的二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或合成的DOPC和胆固醇。
8.权利要求7所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒包含合成的DOPC和胆固醇，DOPC：胆固醇比为10：1(w/w)。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(a)的脂质囊泡颗粒由脂质体前体制备。
10.权利要求9所述的方法，其中脂质体前体是
Figure FDA0002388629470000011
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述脂质囊泡颗粒是脂质体。
12.权利要求11所述的方法，其中脂质体是单层的、多层的、多囊的或其混合型。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种治疗剂被溶解在乙酸钠、磷酸钠或氢氧化钠中的一种或多种中。
14.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种治疗剂被溶解在以下一种或多种中：0.1M氢氧化钠、pH 6.0为1.0±1.0的100mM乙酸钠、pH为9.5±1.0的100mM乙酸钠、pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠或pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤(b)的混合在乙酸钠或磷酸钠溶液中进行。
16.权利要求15所述的方法，其中步骤(b)的混合在pH在6.0-10.5范围内的25-250mM乙酸钠或pH在6.0-8.0范围内的25-250mM磷酸钠中进行。
17.权利要求15所述的方法，其中步骤(b)的混合在pH为6.0±1.0的50mM乙酸钠、pH为9.5±1.0的100mM乙酸钠、pH为7.0±1.0的50mM磷酸钠、或pH为6.0±1.0的100mM磷酸钠中进行。
18.权利要求15所述的方法，其中步骤(b)的混合在pH为7.0的50mM磷酸钠、pH为6.0的100mM磷酸钠、pH为6.0的50mM乙酸钠或pH值为9.5的100mM乙酸钠中进行。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸、激素、细胞因子、过敏原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
20.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是一种或多种肽抗原。
21.权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种肽抗原的长度是20-30个氨基酸。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述一种或多种肽抗原是新抗原。
23.权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种肽抗原源自人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、炭疽杆菌、疟原虫或存活蛋白多肽。
24.权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种肽抗原是FTELTLGEF(SEQ ID NO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；或其任何组合。
25.权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种肽抗原是NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)和/或NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)。
26.权利要求20至23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将五种或更多种不同的溶解肽抗原与所述脂质囊泡颗粒混合。
27.权利要求26所述的方法，其中步骤(b)包括将上至30种不同的溶解肽抗原与所述脂质囊泡颗粒混合。
28.权利要求26所述的方法，其中步骤(b)包括将10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的溶解肽抗原与所述脂质囊泡颗粒混合。
29.权利要求26至28中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)之后，所述不同的溶解肽抗原中的每一种的浓度为至少约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml。
30.权利要求26至29中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)之后，所述不同的溶解肽抗原中的每一种的浓度为约0.5mg/ml。
31.权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述不同的溶解肽抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。
32.权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述不同的溶解肽抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。
33.权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述不同的溶解肽抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
34.权利要求20至33中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括以任何顺序将溶解的T辅助表位与所述脂质囊泡颗粒和所述一种或多种肽抗原混合。
35.权利要求33所述的方法，其中步骤(b)包括将10-15种新抗原与一种溶解的T辅助表位混合，其中所述T辅助表位包含氨基酸序列AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO：1)。
36.权利要求20至35中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括以任何顺序将佐剂与所述脂质囊泡颗粒和所述一种或多种肽抗原混合。
37.权利要求34或35所述的方法，其中步骤(b)包括：
(b1)提供包含所述一种或多种肽抗原和所述溶解的T辅助表位的抗原原液；以及
(b2)将所述抗原原液与所述脂质囊泡颗粒混合以形成混合物。
38.权利要求37所述的方法，其中，在步骤(b1)中，所述抗原原液在100mM氢氧化钠中制备，其中每种溶解的抗原的浓度为约2.0mg/ml。
39.权利要求38所述的方法，其中用pH为6.0±0.5的50mM乙酸钠1∶1稀释所述抗原原液，以提供约1.0mg/ml浓度的各溶解抗原。
40.权利要求37至39中任一项所述的方法，其中在步骤(b2)的混合之后并且干燥之前，将所述混合物的pH调节至10±1.0。
41.权利要求37至40中任一项所述的方法，其中步骤(b2)进一步包括将所述混合物与佐剂混合。
42.权利要求36或41所述的方法，其中所述佐剂是聚I：C核苷酸佐剂。
43.权利要求1-42中任一项所述的方法，还包括在干燥之前对步骤(b)中形成的混合物进行无菌过滤的步骤。
44.权利要求1至43中任一项所述的方法，还包括，在步骤(b)和(c)之间，确认所述脂质囊泡颗粒仍具有≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的多分散指数(PDI)的步骤。
45.权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述干燥通过冻干、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥进行。
46.权利要求45所述的方法，其中所述干燥通过冻干进行。
47.权利要求46所述的方法，其中所述冻干通过以下进行：将包含步骤(b)的混合物的一个或多个容器装载到袋中，将所述袋密封以形成密封单元，和在冷冻干燥机中冻干所述密封单元。
48.权利要求47所述的方法，其中所述袋是无菌高压灭菌袋。
49.权利要求47或48所述的方法，其中所述冷冻干燥机是台式冷冻干燥机。
50.权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述冷冻干燥机在冻干期间包含多于一个密封单元。
51.权利要求50所述的方法，其中各密封单元包含通过步骤(a)和(b)制备的不同混合物。
52.权利要求1至51中任一项所述的方法，还包括以下步骤：在步骤(c)的干燥之前和/或之后，评价所述至少一种溶解的治疗剂的稳定性。
53.权利要求52所述的方法，其中所述治疗剂的稳定性通过HPLC分析来评价。
54.权利要求52或53所述的方法，其中所述治疗剂是肽抗原，并且在干燥之前进行评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少80％以未降解形式保留。
55.权利要求54所述的方法，其中当在干燥后即刻评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少75％以未降解形式保留。
56.权利要求54或55所述的方法，其中当在干燥后三个月评价时，各肽抗原的原始肽浓度的至少70％以未降解形式保留。
57.权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述肽抗原中的一种或多种干燥后上至3个月不显示降解。
58.制备药物组合物的方法，包括将通过权利要求1至57中任一项所述的方法获得的干燥制剂溶解在疏水载体中。
59.权利要求58所述的方法，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
60.权利要求58或59所述的方法，其中所述疏水载体是
Figure FDA0002388629470000051
ISA 51。
61.通过权利要求58至60中任一项所述的方法制备的药物组合物。
62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述脂质在所述疏水载体中是具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构的形式。
63.权利要求62所述的药物组合物，其中在所述疏水载体中，所述脂质是以下形式：反胶团和/或脂质聚集体，其中脂质的疏水部分朝向疏水载体向外定向，并且脂质的亲水部分聚集作为核心。
64.权利要求62或63所述的药物组合物，其中所述脂质基结构的大小在约2nm至约10nm直径之间。
65.稳定的无水药物组合物，其包含具有单层脂质组装体的一种或多种脂质基结构、至少一种治疗剂和疏水载体。
66.权利要求65所述的药物组合物，其中所述治疗剂为肽抗原、编码多肽的DNA或RNA多核苷酸、激素、细胞因子、过敏原、催化性DNA(脱氧核酶)、催化性RNA(核酶)、反义RNA、干扰RNA、antagomir、小分子药物、生物药物、抗体或其任一种的片段或衍生物；或其混合物。
67.权利要求65或66所述的药物组合物，其中所述治疗剂是一种或多种肽抗原。
68.权利要求67所述的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原的长度为20-30个氨基酸。
69.权利要求67或68所述的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是新抗原。
70.权利要求67所述的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原源自人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、炭疽杆菌，疟原虫或存活蛋白多肽。
71.权利要求70所述的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是FTELTLGEF(SEQ IDNO：4)、LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、RISTFKNWPK(SEQ ID NO：6)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：7)或LPPAWQPFL(SEQ ID NO：8)；或其任何组合。
72.权利要求70所述的药物组合物，其中所述一种或多种肽抗原是NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT(SEQ ID NO：2)和/或NKLSEHKTFCNKTLEQGQMYQINT(SEQ ID NO：3)。
73.权利要求67至70中任一项所述的药物组合物，其包含五种或更多种不同的肽抗原。
74.权利要求73的药物组合物，其包含上至30种不同的肽抗原。
75.权利要求73所述的药物组合物，其包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽抗原。
76.权利要求73至75中任一项所述的药物组合物，其中每种所述肽抗原独立地处于约0.1μg/μl至约5.0μg/μl之间的浓度。
77.权利要求73至76中任一项所述的药物组合物，其中每种所述肽抗原独立地处于约0.25μg/μl、约0.5μg/μl、约0.75μg/μl、约1.0μg/μl、约1.25μg/μl、约1.5μg/μl、约1.75μg/μl、约2.0μg/μl、约2.25μg/μl或约2.5μg/μl的浓度。
78.权利要求73至77中任一项所述的药物组合物，其包含10种或更多种不同的肽抗原，每种肽抗原的浓度为至少约0.5μg/μl。
79.权利要求73至78中任一项所述的药物组合物，其中所述肽抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。
80.权利要求73至79中任一项所述的药物组合物，其中所述肽抗原具有等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的一种或多种不同的特征。
81.权利要求73至80中任一项所述的药物组合物，其中所述肽抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
82.权利要求65至81中任一项所述的药物组合物，其进一步包含T辅助表位和佐剂中的一者或两者。
83.权利要求65至82中任一项所述的药物组合物，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
84.权利要求65至83中任一项所述的药物组合物，其中所述疏水载体是
Figure FDA0002388629470000071
ISA51。
85.权利要求65至84中任一项所述的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包括脂质的聚集体，所述脂质的疏水部分朝向所述疏水载体向外定向，并且所述脂质的亲水部分聚集为核心。
86.权利要求65至85中任一项所述的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包括反胶团。
87.权利要求65至86中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质基结构的大小在约2nm至约10nm直径之间。
88.权利要求65至87中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在所述脂质基结构内部。
89.权利要求65至88中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂中的一种或多种在所述脂质基结构外部。
90.权利要求65至89中任一项所述的药物组合物，其为澄清溶液。
91.权利要求65至90中任一项所述的药物组合物，其不具有可见的析出物。
92.稳定的无水药物组合物，其包含具有单层组装体的一种或多种脂质基结构、五种或更多种不同的肽新抗原、和疏水载体，其中所述肽新抗原不基于等电点、溶解度、稳定性和/或免疫原性相关的任何特征而预选。
93.权利要求92所述的药物组合物，其中所述新抗原具有不同的长度、序列、分子量、电荷、极性、疏水性和/或亲水性。
94.权利要求92或93所述的药物组合物，其中具有单层脂质组装体的所述一种或多种脂质基结构包括反胶团和/或脂质的聚集体，其中所述脂质的疏水部分朝向所述疏水载体向外定向，并且所述脂质的亲水部分聚集为核心。
95.权利要求92或94中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质基结构的大小在约2nm至约10nm直径之间。
96.在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的方法，包括向所述对象给予权利要求61至95中任一项所述的药物组合物。
97.权利要求96所述的方法，其用于治疗癌症或感染性疾病。
98.权利要求61至95中任一项所述的药物组合物用于在对象中诱导抗体和/或CTL免疫响应的用途。
99.权利要求98所述的用途，其用于治疗癌症或感染性疾病。
100.用于制备用于诱导抗体和/或CTL免疫响应的药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包括：
-包含通过权利要求1至57中任一项所述的方法制备的干燥制剂的容器；和
-包含疏水载体的容器。
101.权利要求100所述的试剂盒，其中所述干燥的制剂包含十种或更多种不同的肽抗原。
102.权利要求100或101所述的试剂盒，其中所述疏水载体是矿物油或二缩甘露醇油酸酯的矿物油溶液。
CN201780094129.5A 2017-07-10 2017-11-09 药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其用途 Pending CN111093623A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762530498P 2017-07-10 2017-07-10
US62/530,498 2017-07-10
PCT/CA2017/051336 WO2019010560A1 (en) 2017-07-10 2017-11-09 PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHODS OF PREPARATION USING LIPID VESICLE PARTICLES OF A DEFINED SIZE, AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111093623A true CN111093623A (zh) 2020-05-01

Family

ID=65000992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780094129.5A Pending CN111093623A (zh) 2017-07-10 2017-11-09 药物组合物、使用限定大小的脂质囊泡颗粒的制备方法及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20200230057A1 (zh)
EP (1) EP3651733A4 (zh)
JP (1) JP7409594B2 (zh)
CN (1) CN111093623A (zh)
AU (1) AU2017423053A1 (zh)
CA (1) CA3069019A1 (zh)
WO (1) WO2019010560A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112188887A (zh) * 2018-03-20 2021-01-05 免疫疫苗技术公司 用于将活性剂和免疫调节剂靶向递送至淋巴结的方法和组合物
MX2021002449A (es) 2018-09-04 2021-08-05 Treos Bio Ltd Vacunas peptidicas.
KR20220125149A (ko) * 2019-05-25 2022-09-14 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 애주번트 백신 에멀션을 분무 건조시키기 위한 조성물 및 방법
CA3197163A1 (en) * 2020-09-28 2022-03-31 Immunovaccine Technologies Inc. Lipid compositions comprising polynucleotide antigens

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103998058A (zh) * 2011-10-06 2014-08-20 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
CN105188685A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 奎尔波特股份有限公司 用于制备脂质纳米颗粒的方法和装置
WO2017028811A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Shanghai Ginposome Pharmatech Co., Ltd. Liposomes with ginsenoside as membrane material and preparations and use thereof
WO2017083963A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Immunovaccine Technologies Inc. Adjuvanting systems and water-free vaccine compositions comprising a polyi:c polynucleotide adjuvant and a lipid-based adjuvant

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2906110A (en) * 1959-09-29 Silencing attachment for seamless
US20060035853A1 (en) 2004-01-07 2006-02-16 Biomedical Research Models, Inc. Methods for tailoring the immune response to an antigen or immunogen
CA2723918C (en) 2008-06-05 2018-01-09 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
JP5429710B2 (ja) 2009-03-30 2014-02-26 独立行政法人放射線医学総合研究所 治療薬剤の標的部位への集積及び放出を追跡可能な治療薬剤含有リポソームおよびその製造方法
KR101102834B1 (ko) * 2010-02-24 2012-01-05 충남대학교산학협력단 신규한 리포좀 제조 방법 및 장치
CU20100144A7 (es) 2010-07-06 2012-06-21 Centro Inmunologia Molecular Composiciones vacunales a base de sticholisina encapsulada en liposomas
JP2014519496A (ja) 2011-05-11 2014-08-14 ナノヴァレント ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ａｌｃａｍ細胞表面受容体を標的とする細胞毒性重合リポソームナノ粒子による増強された骨肉腫の増殖抑制
EP2768484B1 (en) * 2011-10-21 2019-07-24 Jazz Pharmaceuticals Research LLC Lyophilized liposomes
RU2647476C2 (ru) * 2011-11-04 2018-03-15 Нитто Денко Корпорейшн Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства
SG10201610887WA (en) 2012-07-05 2017-02-27 Taiwan Liposome Co Ltd Methods of treating arthritis
EP3388055B1 (en) 2015-12-08 2021-11-17 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Method for preparing liposome

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103998058A (zh) * 2011-10-06 2014-08-20 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
CN105188685A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 奎尔波特股份有限公司 用于制备脂质纳米颗粒的方法和装置
WO2017028811A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Shanghai Ginposome Pharmatech Co., Ltd. Liposomes with ginsenoside as membrane material and preparations and use thereof
WO2017083963A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Immunovaccine Technologies Inc. Adjuvanting systems and water-free vaccine compositions comprising a polyi:c polynucleotide adjuvant and a lipid-based adjuvant

Also Published As

Publication number Publication date
EP3651733A4 (en) 2021-04-07
JP2020526530A (ja) 2020-08-31
EP3651733A1 (en) 2020-05-20
JP7409594B2 (ja) 2024-01-09
AU2017423053A1 (en) 2020-01-23
WO2019010560A1 (en) 2019-01-17
US20200230057A1 (en) 2020-07-23
CA3069019A1 (en) 2019-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019226197B2 (en) Compositions and methods for delivery of biomacromolecule agents
JP2018008964A (ja) Ｔｌｒ２を活性化するか、またはその活性を増加させるアジュバントを含むリポソーム組成物およびその使用
JP6851983B2 (ja) デポー形成及びデポー非形成ワクチンを使用して免疫応答を強化する方法
JP7409594B2 (ja) 医薬組成物、規定のサイズの脂質ベシクル粒子を使用する調製物のための方法、及びそれらの使用
US20230000769A1 (en) Oil-in-water emulsion formulations for delivery of active or therapeutic agents
Song et al. A novel emulsion-type adjuvant containing CpG oligodeoxynucleotides enhances CD8+ T-cell-mediated anti-tumor immunity
JP7103726B2 (ja) 医薬組成物、脂質ベシクル粒子の分粒を含む調製のための方法、及びそれらの使用
US11759508B2 (en) Antigenic peptides for treatment of B-cell malignancy
US20230381309A1 (en) Methods of treating diffuse large b-cell lymphoma
US20220288181A1 (en) Antiviral vaccines using spherical nucleic acids
AU2022354218A1 (en) Survivin and mage-a9 dual-targeted immunotherapy
Udhayakumar Development and validation of synthetic-virus like vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination