CN111084092B - 一种贝壳生长基及非损伤观察丝状体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种贝壳生长基及非损伤观察丝状体的方法，所述贝壳生长基由白色贝壳用稀酸处理至厚度不超过0.15毫米，然后让丝状体在贝壳中生长。进而，所述非损伤观察丝状体的方法将贝壳丝状体放置在培养液中用显微镜观察紫菜贝壳丝状体的生长发育，不需要使用有伤害作用的溶壳剂处理贝壳丝状体，还可以长时间连续观察丝状体的生长情况。采用本发明提供的方法能够简单、便捷地大量制备透明的贝壳生长基，并可非损伤原位观察紫菜贝壳丝状体，可以清晰地连续观测记录紫菜贝壳丝状体的生长发育情况，为发展丝状体相关生产技术奠定基础。本方法也可用于红毛菜等生活史包括贝壳丝状体阶段的藻类。

Description

一种贝壳生长基及非损伤观察丝状体的方法

技术领域

本发明涉及丝状体的育苗技术领域，尤其是一种贝壳生长基及非损伤观察丝状体的方法。

背景技术

紫菜和红毛菜等经济海藻的生活史包括丝状体世代，例如紫菜丝状体和红毛菜丝状体。以紫菜丝状体为例，其属于紫菜生活史中的微观世代，紫菜生活史分为二倍体的丝状体时期和单倍体的叶状体时期。紫菜丝状体能够溶解钙质，钻入富含钙质的贝壳中，形成贝壳丝状体渡过夏季高温。贝壳丝状体在秋季成熟然后释放壳孢子，在成熟过程中的每个阶段，对光、温和营养盐都有特殊需求。近年来，坛紫菜的养殖出现“南育北养”的需求，对工厂化培育贝壳丝状体提出了新要求。及时准确了解贝壳丝状体的生长发育情况、或了解贝壳丝状体的病害发展状况是工厂化育苗的核心工作。

目前常用的观察贝壳丝状体的方法是：用强酸配制的化学试剂将贝壳溶解，然后将丝状体从壳面上刮下来观察。显然这种方法既不方便，也会对藻体造成损伤，因此无法准确地了解贝壳丝状体的生长情况。现有技术中柏兰尼液常常作为溶壳剂用于溶解贝壳丝状体的表层，溶解后可以将丝状体从贝壳表层刮下来，用于观察贝壳丝状体的生长状况(曾呈奎1985海藻栽培学)。例如发明专利申请CN 110313395A用柏兰尼液浸泡贝壳90秒后刮取丝状体。柏兰尼液原料为具有强腐蚀性的强酸(10％硝酸和0.5％铬酸)和对生物活体有强伤害作用的有机溶剂(95％乙醇)，显然对丝状体活体有极大伤害，导致无法准确描述丝状体在贝壳中的生长发育。

此外，发明专利申请CN 109863993A采用打磨法去除贝壳外表面深色表层和内表面反光珍珠层，留下半透明的壳体，也可以观察到贝壳丝状体。打磨法显然耗时费力，成本较高，而且无法将贝壳打磨到特别薄。

观察贝壳丝状体的传统方法需将贝壳脱离海水培养基进行观察，而丝状体不耐失水，离开海水30分钟就造成部分丝状体脱水死亡，因此无法长时间观察。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的丝状体观察需要用强酸溶解并且刮下丝状体，导致丝状体受到严重伤害，提供一种贝壳生长基，其以白色贝壳为原料加工而成，所述贝壳生长基至少有一处透明区域，所述透明区域的最大处的厚度不超过0.15毫米，并且所述透明区域的透光率≥40％。

本发明选用白色较薄贝壳为原料可以方便后续透明化处理，采用这种贝壳生长基的优势在于，可以直接原位观察贝壳丝状体活体的生长发育。

而本发明采用稀酸浸泡的方法，可以大批量、迅速地获得更薄(小于0.15毫米)更透明的贝壳。

本发明所述稀酸浸泡浸泡所述贝壳生长基，目的是进一步让贝壳变薄，并且有利于出现透光率≥40％的透明区域。对于本身比较薄的贝壳，例如扇贝壳，厚度一般在0.3～0.5mm左右，以H⁺浓度为0.1-1mol/L的稀酸，浸泡时间为30分钟到1个小时，即完成酸浸泡过程。

对于较厚的大贝壳，例如河蚌壳，厚度一般在1-3mm。采用沿垂直贝壳表面的方向切割成长条，例如10cm*2cm，切割的薄片以H⁺浓度为0.1-1mol/L的稀酸，浸泡时间为30分钟到1个小时，即完成酸浸泡过程。

需要说明的是，本发明所述稀酸为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中至少一种。优选地，所述稀酸中H+浓度为0.1-1mol/L，浸泡时间为0.5-1个小时。

本发明还提供一种丝状体的观察装置，包括所述贝壳生长基，还包括海水培养基，将所述长有丝状体的贝壳生长基放置在观察装置的凹槽中，所述凹槽装有所述海水培养基。

本发明还提供一种非损伤观察丝状体的方法，首先制作带有一个深度～1mm的凹槽。然后将长有丝状体的贝壳生长基，放置于装有培养基的凹槽底部。通过定期更换培养基的方法，可以连续定点观测贝壳生长基某块区域中丝状体的生长情况；也可定期从培养容器中取一片贝壳生长基用于观察丝状体生长。本发明提供的方法可防止传统观察方法导致的脱水伤害，进而可以长时间连续观测丝状体的生长。

优选地，本发明所述非损伤观察丝状体的方法中，在贝壳丝状体连续培养6-8天后，用消毒纱布擦洗所述贝壳生长基，去除游离的丝状体，并更换所述容器和所述海水培养基为新的培养容器和新鲜的所述海水培养基，继续培养贝壳丝状体。这样做不仅去除了游离丝状体，避免与贝壳丝状体竞争营养，也方便显微镜观察。

具体方案如下：

一种贝壳生长基，所述贝壳生长基为白色贝壳，所述贝壳生长基至少有一处透明区域，所述透明区域的最大处的厚度不超过0.15毫米，并且所述透明区域的透光率≥40％。

进一步的，所述贝壳生长基的制备方法包括以下步骤：选用厚度不超过1毫米的白色天然贝壳，将其用稀酸浸泡，定时测量贝壳边缘厚度，降至0.15毫米以下时取出，用水冲洗。

进一步的，所述贝壳生长基的制备方法包括以下步骤：选用厚度为1-10mm的白色贝壳，将其沿垂直贝壳表面的方向切割成厚度不超过0.5毫米的薄片，将其用稀酸浸泡，定时测量贝壳边缘厚度。取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗。

进一步的，所述稀酸为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中至少一种，所述稀酸中H⁺浓度为0.1-1mol/L，浸泡时间为30分钟到1个小时。

本发明还保护一种所述贝壳生长基的制备方法，选用厚度不超过1毫米的白色天然贝壳，将其用稀酸浸泡，定时测量贝壳边缘厚度，降至0.15毫米以下时取出，用水冲洗；或者，

选用厚度为1-10mm的白色贝壳，将其沿垂直贝壳表面的方向切割成厚度不超过0.5毫米的薄片，将其用稀酸浸泡，定时测量贝壳边缘厚度。取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗。

本发明还保护一种丝状体的观察装置，所述丝状体的观察装置包括所述贝壳生长基，用所述贝壳生长基进行贝壳丝状体采苗，将所述贝壳生长基平铺在培养容器底部，将果孢子或粉碎的自由丝状体加入所述培养容器，搅拌均匀，使所述果孢子或所述自由丝状体均匀落在所述贝壳生长基上进行贝壳丝状体采苗，得到长有丝状体的贝壳生长基；将所述长有丝状体的贝壳生长基放置在观察装置的凹槽中，所述凹槽装有海水培养基。

进一步的，所述海水培养基为富含氮磷的海水，优选为PES培养基。

进一步的，所述孢子为条斑紫菜果孢子、坛紫菜果孢子或红毛菜果孢子；所述丝状体包括条斑紫菜丝状体、坛紫菜丝状体或红毛菜丝状体。

本发明还保护一种非损伤观察丝状体的方法，采用所述丝状体的培养装置，借助观察设备进行观察，利用显微镜观察所述贝壳生长基的透明区域，可清晰观察贝壳丝状体的生长情况。

进一步的，为了方便后续观察，贝壳丝状体培养6-8天后，用消毒纱布擦洗所述贝壳生长基，去除游离的丝状体，并更换所述培养容器和观察装置为新的培养容器和观察装置；更换所述海水培养基为新鲜的所述海水培养基，继续培养贝壳丝状体。

有益效果：

本发明提供的贝壳生长基及包含所述贝壳生长基的观察方法，不仅有利于丝状体采苗和培养，而且可以原位、简单、便捷、非损伤、连续地观察丝状体的生长情况，为发展丝状体相关生产技术奠定基础。

本方法也可用于红毛菜等生活史包括贝壳丝状体阶段的藻类。观察完后，贝壳丝状体可以放回原位继续培养。

具体实施方式

下面给出本发明中使用的部分术语的定义，其他未述及的术语具有本领域所公知的定义和含义：

丝状体：指部分经济红藻特有的在贝壳中完成的丝状体世代，例如紫菜丝状体和红毛菜丝状体。其中紫菜为条斑紫菜、坛紫菜或其他紫菜，或其他生活史包括贝壳丝状体阶段的藻类。

贝壳丝状体：果孢子或自由丝状体钻入碳酸钙质的贝壳中，蔓延生长形成的丝状藻体。

贝壳丝状体采苗：从将果孢子或粉碎的自由丝状体泼洒到贝壳上，到贝壳丝状体开始发育的过程。采苗的关键技术点是：1、按生产要求的采苗密度准备果孢子或粉碎的自由丝状体；2、要让果孢子或粉碎的自由丝状体均匀分布在采苗池中。

在本发明中，所述贝壳丝状体采苗可以用果孢子或者粉碎的自由丝状体，果孢子或自由丝状体钻壳萌发后的管理培养方法均可以与现有技术相同，对此本领域技术人员均能知悉，在此不作赘述。采用本发明提供的方法培育的贝壳丝状体能够达到生产上对丝状体成熟度和壳孢子放散量的要求。

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例1：非损伤观察坛紫菜贝壳丝状体的方法

(1)贝壳生长基原料选择白色扇贝壳；

(2)将贝壳生长基用0.5mol/L稀盐酸浸泡半小时，定时测量贝壳边缘厚度。取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗3遍待用；

(3)将稀酸处理过的贝壳生长基浸泡在海水中，煮沸消毒10分钟；

(4)将消毒过的贝壳生长基平铺在容器底部，添加PES培养基，然后将坛紫菜自由丝状体粉碎后加入容器，轻轻搅拌促进自由丝状体均匀分散。

(5)定期取一小块贝壳，放置到装有海水培养基的观察装置中，用显微镜观察贝壳的透明区域，可清晰观察贝壳丝状体的生长情况。

(6)为了方便后续观察，一周后，用消毒纱布擦洗贝壳，去除游离的丝状体，更换培养容器，用新鲜的海水培养基继续培养贝壳丝状体。

实施例2：非损伤观察条斑紫菜贝壳丝状体的方法

(1)贝壳生长基原料选择河蚌壳切割的薄片(厚度约为0.5毫米)；

(2)将贝壳生长基用0.25mol/L稀硫酸浸泡半小时，定时测量贝壳边缘厚度。取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗3遍待用；

(3)将稀酸处理过的贝壳生长基浸泡在海水中，煮沸消毒15分钟；

(4)将消毒过的贝壳生长基平铺在容器底部，添加PES培养基，然后将条斑紫菜果孢子水加入容器，轻轻搅拌促进均匀分散，让采苗更均匀。

(5)取一小块贝壳，用消毒纱布擦洗表面，然后放置到装有海水培养基的观察装置中，可长时间连续观察贝壳的透明区域，记录贝壳丝状体的生长情况。可通过更换培养基的方法促进生长，延长观察时间。

实施例3：非损伤观察红毛菜贝壳丝状体的方法

(1)贝壳生长基原料选择白色扇贝壳；

(2)将贝壳生长基用0.5mol/L稀盐酸浸泡半小时，定时测量贝壳边缘厚度。取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗3遍待用；

(3)将稀酸处理过的贝壳生长基浸泡在海水中，煮沸消毒10分钟；

(4)将消毒过的贝壳生长基平铺在容器底部，添加PES培养基，然后将红毛菜果孢子或粉碎后的自由丝状体加入容器，轻轻搅拌促进均匀分散。

(5)取一小块贝壳，用消毒纱布擦洗表面，然后放置到装有海水培养基的观察装置中，可长时间连续观察贝壳的透明区域，记录贝壳丝状体的生长情况。可通过更换培养基的方法促进生长，延长观察时间。

对比例1

按照实施例1的方法利用扇贝壳培养坛紫菜贝壳丝状体，不同的是，步骤(1)中选育厚文蛤壳，其厚度约为3毫米壳体不透明。结果表明，稀酸处理后贝壳依然很厚(>1毫米)，无法大量快速制备薄贝壳生长基；显微镜下无法清晰看到生长于贝壳中的丝状体，无法获得清晰的图片，不能对丝状体的发育状况进行观察。

对比例2

按照实施例1的方法利用扇贝壳培养坛紫菜贝壳丝状体，不同的是，步骤(2)中未用稀酸浸泡扇贝壳。结果表明，壳体不透明，显微镜下无法清晰看到贝壳丝状体的生长情况，无法获得清晰的图片，不能对丝状体的发育状况进行观察。

对比例3

按照实施例2的方法利用河蚌壳切割的薄片培养条斑紫菜贝壳丝状体，不同的是，步骤(5)中没有使用观察装置而用传统方法观察贝壳丝状体(传统方法观察贝壳丝状体是指将贝壳脱离海水培养基，在脱离海水的状态下用显微镜观察)。结果表明，可以观察到贝壳丝状体的生长情况，但不能连续长时间观察，否则丝状体死亡。

对比例4

按照实施例3的方法利用扇贝壳培养红毛菜贝壳丝状体，不同的是，步骤(1)中选用文蛤壳。结果表明，半小时稀酸处理后，贝壳生长基依然不透明，显微镜下无法清晰看到贝壳丝状体的生长情况，无法获得清晰的图片，不能对丝状体的发育状况进行观察。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种用于丝状体生长的贝壳生长基的制备方法，其特征在于：所述贝壳生长基的制备方法包括以下步骤：选用厚度为1-10mm的白色贝壳，将其沿垂直贝壳表面的方向切割成厚度不超过0.5毫米的薄片，将其用稀酸浸泡，定时测量贝壳边缘厚度，取出厚度降至0.15毫米以下的贝壳，用水冲洗，得到所述贝壳生长基；所述稀酸为盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液中至少一种，所述稀酸中H⁺浓度为0.1-1mol/L，浸泡时间为30分钟到1个小时；所述贝壳生长基至少有一处透明区域，所述透明区域的最大处的厚度不超过0.15毫米，并且所述透明区域的透光率≥40%。

2.一种非损伤观察丝状体的方法，其特征在于：采用丝状体的培养装置，所述丝状体的观察装置包括权利要求1所述贝壳生长基的制备方法制备得到的贝壳生长基，用所述贝壳生长基进行贝壳丝状体采苗，将所述贝壳生长基平铺在培养容器底部，将果孢子或粉碎的自由丝状体加入所述培养容器，搅拌均匀，使所述果孢子或所述自由丝状体均匀落在所述贝壳生长基上进行贝壳丝状体采苗，得到长有丝状体的贝壳生长基；将所述长有丝状体的贝壳生长基放置在观察装置的凹槽中，所述凹槽装有海水培养基；借助观察设备进行观察，利用显微镜观察所述贝壳生长基的透明区域，清晰观察贝壳丝状体的生长情况。

3.根据权利要求2所述非损伤观察丝状体的方法，其特征在于：所述海水培养基为富含氮磷的海水。

4.根据权利要求3所述非损伤观察丝状体的方法，其特征在于：所述海水培养基为PES培养基。

5.根据权利要求2-4任一项所述非损伤观察丝状体的方法，其特征在于：所述果孢子为条斑紫菜果孢子、坛紫菜果孢子或红毛菜果孢子；所述丝状体包括条斑紫菜丝状体、坛紫菜丝状体或红毛菜丝状体。

6.根据权利要求3所述非损伤观察丝状体的方法，其特征在于：为了方便后续观察，贝壳丝状体培养6-8天后，用消毒纱布擦洗所述贝壳生长基，去除游离的丝状体，并更换所述培养容器和观察装置为新的培养容器和观察装置；更换所述海水培养基为新鲜的所述海水培养基，继续培养贝壳丝状体。