CN111073851A - 一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞的分离方法。本发明能够快速、高效地从鲫外周血中分离大量的高纯度白细胞，分离步骤包括血液富集、红细胞去除和白细胞富集等。本发明克服了现有白细胞分离技术存在的操作复杂、分离的白细胞不纯、状态不佳的问题。本发明能够快速、高效地分离和获得纯度高且状态好的鲫鱼外周血白细胞，为以后研究鲫白细胞形态特征和免疫机能提供帮助。

Description

一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法
技术领域
本发明属于白细胞的分离技术领域，具体涉及一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法。
背景技术
淇河鲫（Carassius auratus）俗称“双背鲫”，是天然的三倍体鱼类，具有独特的生物学特性，是经济价值较高的鲫鱼地方亚种，其肉质鲜美具有较高的营养价值。淇河鲫是河南鹤壁市“淇河三珍”之一，也是全国农产品地理标志，成为河南省重点推广的名特优鱼类，养殖密度和面积不断增加。但是随着养殖密度提高，淇河鲫不断受到各种病害的侵袭，在这种形势下，亟需开展淇河鲫免疫防病的基础研究。
白细胞是鱼类免疫系统的重要组成部分，也是连接鱼类细胞免疫和体液免疫的关键桥梁，在鱼类免疫调节和疾病防御中发挥重要作用。鱼类白血细胞包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、浆细胞和巨噬细胞等，并且鱼类白细胞已具有类似T、B淋巴细胞的分类，能被抗原所激活并产生相应的抗体和免疫因子。近年来，离体培养的白细胞在水产动物免疫学、水产动物病原学、鱼类生理学和水产药物学等多个学科领域内被研究应用。因此，建立成熟的鱼类外周血白细胞分离方法，获得足够数量、高纯度的鱼类白细胞对免疫学相关研究至关重要。
虽然，目前有一些关于鱼类白细胞的提取方法，然而，由于鱼类是低等脊椎动物，血细胞的组成和血液指数在不同物种间具有较大差异，鱼类外周血白细胞分离方法目前没有统一的标准。并且，已经建立的各种鱼类白细胞分离方法都具有不同程度的差异，没有形成一套成熟的分离方法。另外，关于鲫外周血白细胞的研究主要集中在其形态方面，关于外周血白细胞分离技术的研究尚未见报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法，其特征在于具体过程为：
步骤S1：用酒精棉擦拭鲫鱼尾部消毒，使用含有5-6mL预冷抗凝剂的注射器从鲫鱼尾静脉抽取1mL血液，其中抗凝剂为含3-5g/mL BSA和15-20IU/mL Heparin的1640细胞培养基，配制好后于4℃预冷；
步骤S2：将步骤S1得到的稀释血液在4℃、50-150g离心条件下水平离心10-20min，离心结束后用移液枪将上清移至干净离心管中；
步骤S3：使用无菌胎牛血清润洗10mL无菌离心管，润洗后的离心管在试管架上静置1-3min，使用移液枪去除管底多余胎牛血清，向试管中加入3-5mL 1.080-1.085g/mL的percoll分离液；
步骤S4：取3-5mL步骤S2中得到的上清加至步骤S3中制备的percoll分离液上方，在4℃，800-900g离心条件下水平离心20-30min，使用1mL注射器从中间层吸取白细胞溶液，将白细胞溶液置于1.5mL无菌离心管，再加入等体积的磷酸盐缓冲液，然后在500-600g离心条件下离心5-10min，由此富集到高纯度的鲫鱼外周血白细胞。
进一步优选，步骤S3中所述percoll分离液是由1.130g/mL percoll母液、1.5mol/L NaCl溶液和H2O配制而成的比重为1.080-1.085g/mL的percoll分离液。
进一步优选，步骤S1中所述鲫鱼为淇河鲫。
本发明具有以下优点：本发明涉及的淇河鲫外周血白细胞分离方法能够便捷、快速的提取淇河鲫外周血白细胞，分离得到的白细胞数量多且纯度高。并且使用的分离介质percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，不能穿透细胞膜，对细胞无毒、无害，因此分离出的白细胞可以用于细胞培养，并用于细胞毒性以及免疫相关的实验。本发明的分离方法同样适用于其它鲫鱼外周血白细胞的分离。另外本发明中的抗凝剂为含3-5g/mL BSA和15-20IU/mL Heparin的1640细胞培养基，其中加入的BSA可以起到润滑作用，减少白细胞在提取过程中受到的伤害。
附图说明
图1是本发明的分离步骤示意图；
图2是本发明的分离效果图；
图3是显微镜拍摄本发明分离出的白细胞效果图；
图4是本发明分离出的白细胞吉姆萨染色效果图；
图5是扫描电子显微镜拍摄本发明分离出的白细胞效果图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
步骤S1：用酒精棉擦拭淇河鲫尾部消毒，使用含有5-6mL预冷抗凝剂（1640细胞培养基含3-5g/mL BSA和15-20IU/mL Heparin）的注射器从淇河鲫尾静脉抽取1mL血液；
步骤S2：将步骤S1得到的稀释血液在4℃、50-150g离心条件下水平离心10-20min，离心结束后用移液枪将上清移至干净离心管中；
步骤S3：使用无菌胎牛血清润洗10mL无菌离心管，润洗后的离心管需在试管架上静置1-3min，使用移液枪去除管底多余胎牛血清，向试管中加入3-5mL 1.080-1.085g/mL的percoll分离液（由1.130g/mL percoll母液、1.5mol/L NaCl溶液和H2O配制而成）；
步骤S4：取3-5mL步骤S2中得到的上清缓慢加至步骤S3中制备的percoll分离液上方，在4℃，800-900g离心条件下水平离心20-30min，使用1mL注射器缓慢从中间层吸取白细胞，并防止动作过大扰动白细胞层，而影响分离效果，将吸出的白细胞溶液置入1.5mL无菌离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，然后在500-600g离心条件下离心5-10min，由此富集到高纯度的淇河鲫外周血白细胞。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (3)

1.一种简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法，其特征在于具体过程为：
步骤S1：用酒精棉擦拭鲫鱼尾部消毒，使用含有5-6mL预冷抗凝剂的注射器从鲫鱼尾静脉抽取1mL血液，其中抗凝剂为含3-5g/mL BSA和15-20IU/mL Heparin的1640细胞培养基，配制好后于4℃预冷；
步骤S2：将步骤S1得到的稀释血液在4℃、50-150g离心条件下水平离心10-20min，离心结束后用移液枪将上清移至干净离心管中；
步骤S3：使用无菌胎牛血清润洗10mL无菌离心管，润洗后的离心管在试管架上静置1-3min，使用移液枪去除管底多余胎牛血清，向试管中加入3-5mL 1.080-1.085g/mL的percoll分离液；
步骤S4：取3-5mL步骤S2中得到的上清加至步骤S3中制备的percoll分离液上方，在4℃，800-900g离心条件下水平离心20-30min，使用1mL注射器从中间层吸取白细胞溶液，将白细胞溶液置于1.5mL无菌离心管，再加入等体积的磷酸盐缓冲液，然后在500-600g离心条件下离心5-10min，由此富集到高纯度的鲫鱼外周血白细胞。
2.根据权利要求1所述的简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法，其特征在于：步骤S3中所述percoll分离液是由1.130g/mL percoll母液、1.5mol/L NaCl溶液和H2O配制而成的比重为1.080-1.085g/mL的percoll分离液。
3.根据权利要求1所述的简单高效的鲫鱼外周血白细胞分离方法，其特征在于：步骤S1中所述鲫鱼为淇河鲫。
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