CN111065409A - Strep-tag特异性结合蛋白及其用途 - Google Patents

Strep-tag特异性结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了特异性结合strep tag肽的免疫球蛋白结合蛋白和融合蛋白，strep tag肽例如为具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的肽。还提供了在细胞免疫治疗中使用所公开的组合物的方法，其中治疗细胞表达标记肽。

Description

STREP-TAG特异性结合蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月6日提交的美国专利申请No.62/555,017的优先权权益，该专利申请出于所有目的通过引用结合到本文中，如同在此完整阐述。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用结合到说明书中。包含序列表的文本文件的名称为360056_451WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为28.9KB，创建于2018年9月3日，正在通过EFS-Web进行电子提交。
背景技术
重组蛋白和表达相同蛋白的细胞通常使用与重组蛋白融合的合成标记肽进行检测、分选和纯化。例如，合成的
Figure BDA0002402858610000011
肽可以很容易地与目标蛋白融合，并以高亲和力与工程化的链霉亲和素衍生物
Figure BDA0002402858610000012
结合。
Figure BDA0002402858610000013
系统可通过与含
Figure BDA0002402858610000014
的底物(通常是磁性纳米珠或树脂)结合而分离和亲和纯化Strep-tag标记的蛋白和细胞。
但是，需要具有附加功能的
Figure BDA0002402858610000015
结合试剂，以便更充分地利用标记目标分子在体外和体内应用中的潜力，例如检测和操纵免疫疗法中使用的标记蛋白和细胞。本公开的实施例解决了这些需求并提供了其他相关的优点。
附图说明
图1A和图1B示出了结合STII标记的CAR T细胞的鼠抗
Figure BDA0002402858610000016
(STII)单克隆抗体的特征。(A)流式细胞术数据显示抗STII单克隆抗体与STII标记的CAR T细胞特异性结合。(B)IsoStripTM表示5G2 mAb和4E2 mAb的同种型。
图2A-图2D示出了来自体内实验的数据，其中向接受STII标记的抗CD19 CAR T细胞的B细胞耗竭的小鼠施用了本公开的抗STII单克隆抗体。(A)使用抗STII mAb拯救B细胞的实验方案。(B)流式细胞仪数据显示输注前7天小鼠T细胞标记STII的CAR的表达。顶行：含有一(1)个STII标记的CAR构建体的表达。中行：包含三(3)个STII标记的CAR。最下面一行：未转导的细胞。对细胞进行CD19、CD45.1、EGFR和STII染色。(C)流式细胞术数据显示在用抗CD19-1STII CAR T细胞接着用抗STII mAb治疗的小鼠中B细胞的恢复。(D)流式细胞术数据显示在用抗CD19-3STII CAR T细胞接着用抗STII mAb处理的小鼠中B细胞的恢复。
图3A提供了示例性流式细胞术数据，其显示了使用(从上至下)对照微米珠扩增标记的CAR T细胞；微米珠涂有0.1、0.3或0.5μg抗STII单抗；微米珠或涂有抗STII mAb/抗CD28mAb(均为0.3μg)。图3B显示了细胞与涂有指示量抗体的微米珠接触后释放的IL-2(上图)和IFN-γ(下图)。
图4A提供的数据显示，经包被的微米珠刺激1、2或3(左至右)轮后，带有STII标记的CAR T细胞扩增，如图例所示。图4B显示了标记的CD8+和CD4+ CAR T细胞在刺激前和1、2或3轮刺激后表达的T细胞标志物。使用针对以下抗体的细胞对细胞进行染色：STII；CD45RO；CD62L；CD28L；CTLA4；和PD1。
具体实施方式
本公开内容提供了用于鉴定、分类、跟踪和选择性地调节包含或表达标记
Figure BDA0002402858610000021
Tag II(WSHPQFEK，SEQ ID NO：19)的重组蛋白和宿主细胞的组合物和方法。在某些方面，提供了免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白和表达它们的宿主细胞，其可用于调节标记的免疫细胞用于例如过继细胞疗法。
作为背景，已经出现了转基因T细胞的过继转移作为对各种恶性肿瘤的有效疗法。应用最广泛的策略是输注表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CARs)的患者来源T细胞。该方法可用于将T细胞靶向细胞表面抗原、规避作为肿瘤逃逸机制的主要组织相容性复合体的丧失、以及采用单一载体构建体来治疗任何患者，而与人类白细胞抗原(HLA)单倍型无关。例如，迄今为止，针对B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的CAR临床试验已经靶向了在恶性淋巴样细胞以及正常B细胞上表达的CD19、CD20或CD22抗原(Brentjens等人，Sci TranslMed 2013；5(177)：177ra38；Haso等人，Blood 2013；121(7)：1165-74；James等人，JImmunol 2008；180(10)：7028-38；Kalos等人，Sci Transl Med 2011；3(95)：95ra73；Kochenderfer等人，J Clin Oncol 2015；33(6)：540-9；Lee等人，Lancet 2015；385(9967)：517-28；J.Clin Oncol2015；33(6)：540-8Porter等人，Sci Transl 25Med 2015；7(303)：303ra139；Savoldo等人，J Clin Invest 2011；121(5)：1822-6；Till等人，Blood 2008；112(6)：2261-71；Till等人，Blood 2012；119(17)：3940-50；Coiffier等人，N Engl J Med2002；346(4)：235-42)。
用于过继细胞疗法的工具包含标记的嵌合效应子分子，例如在PCT公开号WO2015/095895中描述的那些(其标记的效应子分子通过引用并入本文)。在本公开中，产生了免疫球蛋白结合蛋白，其被证明能够以高特异性和保真度鉴定和调节(例如，活化、诱导增殖、损害或杀死)表达此类标记分子的细胞。
在更详细地阐述本公开之前，提供其用于本文的某些术语的定义可能有助于其理解。贯穿本公开阐述了附加定义。
在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包含所述范围内的任何整数的值、以及其分数(在适当时，例如，浓度的十分之一和十分之一)，除非另有说明。而且，除非另有说明，否则本文所叙述的与任何物理特征，(例如聚合物亚基、尺寸或厚度)有关的任何数值范围应理解为包含所叙述的范围内的任何整数。如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”是指所指示的范围、值或结构的±20％。应当理解，本文所用的术语“一(a)”和“一个(an)”是指所列举的组分中的“一个或更多个”。可替换(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案中的一种、两种或两种的任何组合。如本文所用，术语“包含(include)”、“具有(have)”和“包含(comprise)”是同义使用的，其术语和变体旨在被解释为非限制性的。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的元素、装配体、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包含元素、装配体、事件或情况发生的情况以及它们不发生的情况。
另外，应该理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和亚基的各种组合的单个构建体或构建体组，其程度与单独设定每个构建体或构建体组的程度相同。因此，特定结构或特定亚单元的选择在本公开的范围内。
术语“基本上由……组成”并不等同于“包含”，并且是指权利要求的指定材料或步骤，或者是指不会实质性地影响所要求保护的主题的基本特征的材料或步骤。例如，当结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包含延伸、缺失、突变或其组合(例如，氨基酸或羧基末端或结构域之间的氨基酸)构成的序列共同贡献域、区域、模块或蛋白质长度的最多20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且不会实质性影响域、区域、模块或蛋白质的活性(例如结合蛋白的靶结合亲和力)(即减少的活性不超过50％，例如不超过40％、30％、25％、0％、15％、10％、5％或1％)时，蛋白质结构域、区域或模块(例如，结合结构域、铰链区或接头)或蛋白质(可能具有一个或更多个结构域、区域或模块)“基本上”由特定氨基酸组成。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团(例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍)结合的α-碳。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。
如本文所用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列改变。突变可导致几种不同类型的序列变化，包含核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失。
“保守取代”是指不显著影响或改变特定蛋白质的结合特征的氨基酸取代。通常，保守取代是其中被取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。保守取代包含在以下组之一中发现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；第3组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；第4组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；第6组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外或可替代地，可以通过相似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族或含硫)将氨基酸分组为保守取代基。例如，出于取代的目的，脂族基团可包含Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代基包含：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性的：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族，非极性或弱极性残基：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸；极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大量的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。额外的信息可以在W.H.弗里曼公司的Creighton(1984)蛋白中找到。
如本文所用，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质适用于天然存在的氨基酸聚合物、以及其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。多肽可还包含其他组分(例如，共价结合)，例如标记、标签、生物活性分子或其任意组合。在某些实施例中，多肽可以是片段。如本文所用，“片段”是指缺少在参考序列中发现的一个或更多个氨基酸的多肽。片段可包含在参考序列中发现的结合结构域，抗原或表位。参考多肽的片段可具有参考序列氨基酸序列的至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多氨基酸。
如本文所用，“融合蛋白”是指在单链中具有至少两个不同结构域的蛋白质，其中所述结构域不是天然一起存在于蛋白质中。可以使用PCR、重组工程等构建编码融合蛋白的多核苷酸，或者可以合成此类融合蛋白。融合蛋白可还包含其他成分，例如标记、接头或转导标志物。在某些实施例中，由宿主细胞(例如，T细胞)表达或产生的融合蛋白位于细胞表面，其中融合蛋白锚定在细胞膜上(例如，通过跨膜结构域)，并包含细胞外部分(例如，包含结合结构域)和细胞内部分(例如，包含信号传导结构域、效应子结构域、共刺激结构域或其组合)。
“核酸分子”或“多核苷酸”是指包含共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如吗啉环)组成。嘌呤碱基包含腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤、嘧啶碱基包含尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包含聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，其包含cDNA、基因组DNA和合成DNA，它们可以是单链或双链的。如果是单链，则核酸分子可以是编码链或非编码(反义)链。编码氨基酸序列的核酸分子包含编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的某些形式还可以包含内含子，以至于内含子将通过共转录或转录后机制被除去。换言之，由于遗传密码的冗余或简并或通过剪接，不同的核苷酸序列可编码相同的氨基酸序列。
还考虑了本公开内容的核酸分子的变体。变体核酸分子与多核苷酸至少70％、75％、80％、85％、90％相同，并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，该多核苷酸为本文定义的或参考的或在严格杂交条件(例如约0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠在约65-68℃或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和约50％甲酰胺，在42℃)下与多核苷酸杂交的。核酸分子变体保留编码具有本文所述功能性(例如特异性结合靶分子)的融合蛋白或其结合结构域的能力。
“序列同一性百分比”是指通过比较序列确定的两个或更多个序列之间的关系。确定序列同一性的优选方法被设计为在所比较的序列之间给出最佳匹配。例如，为了最佳比较目的，比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口)。此外，出于比较的目的，可以忽略非同源序列。除非另有说明，否则本文所参考的序列同一性百分比是在参考序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在可公开获得的计算机程序中找到。序列比对和百分比同一性计算可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)进行。BLAST程序中使用的数学算法可以在Altschul等人的《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25：3389-3402，1997中找到。在本公开的上下文中，应当理解的是，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析的结果基于所引用程序的“默认值”。“默认值”是指首次初始化时最初随软件加载的任何一组值或参数。
术语“分离的”是指将材料从其原始环境(例如，如果是天然存在的自然环境)中除去。例如，没有分离出存在于活体动物中的天然存在的核酸或多肽，而是分离了与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同核酸或多肽。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸或多肽可以是组合物(例如细胞裂解物)的一部分，并且仍然被分离，因为这样的载体或组合物不是该核酸或多肽的天然环境的一部分。术语“基因”是指与产生多肽链有关的DNA片段；它包含编码区之前和之后的区域(“前导区和尾区”)以及各个编码段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“功能变体”是指与本公开的亲本或参考化合物在结构上或基本在结构上相似，但是组成略有不同的多肽或多核苷酸(例如，一个碱基、原子或官能团是不同的、添加的或去除)，使得该多肽或编码的多肽能够以至少50％的效率，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％的效率执行编码的亲本多肽的至少一种功能。亲本多肽的活性水平为90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％。换言之，当与亲本或参照多肽相比，本公开的多肽或编码的多肽的功能变体在所选测定(例如用于测量结合亲和力的测定法(例如，
Figure BDA0002402858610000061
或四聚体染色法，用于测定缔合(Ka)或解离(Kd)常数))中表现出不超过50％的性能降低时，具有“相似的结合”、“相似的亲和力”或“相似的活性”。
如本文所用，“功能性部分”或“功能性片段”是指仅包含亲本或参照化合物的结构域，部分或片段的多肽或多核苷酸，并且该多肽或编码的多肽保留与母体或参考化合物的结构域、部分或片段相关的至少50％的活性，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的亲本多肽活性水平，或提供生物学益处(例如，效应子功能)。当与亲本或参考多肽相比，功能部分或片段在所选测定(例如用于测定结合亲和力或测量效应子功能(例如，细胞因子释放)的测定)中表现出不超过50％的性能降低(优选在亲和力方面与亲本或参考相比不超过20％或10％或不超过对数差异)时，本公开内容的多肽或编码的多肽的“功能部分”或“功能片段”具有“相似的结合”或“相似的活性”。
如本文所用，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指不是宿主细胞或受试者非天然的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性，或者已被改变的宿主细胞或受试者的天然的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。异源、非内源或外源包含已突变或以其他方式改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子，使得杜天宇天然和改变后的基因、蛋白质、化合物或核酸分子而言，结构、活性或两者是不同的。在某些实施例中，异源、非内源或外源基因、蛋白质或核酸分子(例如受体、配体等)对于宿主细胞或受试者可能不是内源的，而是编码此类基因的核酸、蛋白质或核酸分子可能已经通过缀合、转化、转染、电穿孔等方法添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其他自我复制载体)。术语“同源的”或“同源的”是指在宿主细胞、物种或菌株中发现或衍生自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并编码同源多肽或活性，但是该多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任意组合。非内源性多核苷酸或基因以及所编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。
如本文所用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列生产多肽的过程。该过程可以包含转录、转录后控制、转录后修饰、转译、转译后控制、转译后修饰或其任意组合。表达的核酸分子通常可操作地连接到表达控制序列(例如启动子)。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，是的一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(即，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。“未连接”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密关联，并且其中一个的功能不影响另一个。
如本文所用，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。此类控制序列包含实现转录的启动子、控制此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和转译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化为合适的宿主，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。
在将核酸分子插入细胞中的上下文中的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包含提及将核酸分子掺入到真核或原核细胞中，其中核酸分子可以掺入细胞的基因组中(例如染色体，质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子、或瞬时表达(例如转染的mRNA)。如本文所用，术语“工程的”、“重组的”或“非天然的”是指包含至少一种遗传改变或已通过引入外源性核酸分子而被修饰的生物、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中这种改变或修饰是通过基因工程(即人为干预)引入的。遗传改变包含，例如，引入编码蛋白质、融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或其他核酸分子对细胞遗传物质的添加、缺失、取代或其他功能破坏。额外的修饰包含例如非编码调节区，其中所述修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。
如本文所用，术语“宿主”是指靶向用异源核酸分子进行遗传修饰以产生目的多肽(例如，本公开的融合蛋白)的细胞(例如，T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、B细胞等)或微生物。在某些实施例中，宿主细胞可选地已经具有或被修饰以包含赋予与例如异源蛋白质的生物合成(例如，包含可检测的标记；缺失、改变或截短的内源性TCR；或增加的共刺激因子表达)相关或不相关的期望性质的其他遗传修饰。
如本文所述，一个以上的异源核酸分子可以作为分离的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子或其任意组合被引入宿主细胞。当将两个或更多个异源核酸分子引入宿主细胞时，应当理解的是，两个或更多个异源核酸分子可作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)、在分开的载体上、整合在单个位点或多个位点或其任意组合中进入宿主染色体。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是引入宿主细胞中的分开的核酸分子的数目。
术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如细菌载体、病毒载体)中或可以整合到基因组中。“载体”是能够转运另一个核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以包含染色体、非染色体、半合成或合成的核酸分子。本公开的载体还包含转座子系统(例如，Sleeping Beauty，参见，例如，Geurts等人，Mol.Ther.8：108，2003：Mátés等人，Nat.Genet.41：753(2009))。示例性的载体是能够自主复制的载体(附加载体)或表达与其连接的核酸分子的载体(表达载体)。
如本文所用，相对于混合物中细胞类型的量的“富集”或“耗尽”是指一个或更多个富集或耗竭过程或步骤中产生的细胞混合物中的“富集”类型的数量增加、“贫化”细胞的数量减少或两者兼有。因此，取决于经历富集过程的原始细胞群的来源，混合物或组合物可包含30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％的的75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多(数量或技术)“富集”的细胞。经受消耗过程的细胞可导致混合物或组合物含有50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或更少(数量或计数)的“耗尽”细胞。在某些实施例中、混合物中某种细胞类型的数量将被富集，另一种细胞类型的数量将被耗尽，例如在消耗CD8+细胞的同时富集CD4+细胞，或者在消耗CD62L–细胞的同时富集CD62L+细胞，或者其组合。
“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指对受试者(例如人类或非人类哺乳动物，例如灵长类、马、猫、狗、山羊、鼠标或老鼠)。通常，以足以引起治疗或预防益处的量施用包含表达本公开内容的融合蛋白的宿主细胞和可选地佐剂的合适剂量或治疗方案。治疗或预防/预防益处包含改善临床预后；减轻或减轻与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；更长的无病状态；疾病程度的减少，疾病状态的稳定；疾病进展延迟；缓解；生存延长生存期；或其任意组合。
表达本公开内容的融合蛋白或宿主细胞的“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生治疗效果(包含改善的临床结果)的融合蛋白或宿主细胞的量。减轻或减轻与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；更长的无病状态；疾病程度的减少，疾病状态的稳定；疾病进展延迟；缓解；生存或具有统计学意义的延长生存期。当涉及单独施用的单独的活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效量是指该成分或单独表达该成分的细胞的作用。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或辅助活性成分与表达导致治疗效果的细胞的组合细胞的组合量，无论是连续施用还是同时施用。组合也可以是表达一种以上活性成分的细胞，所述活性成分例如为特异性结合包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的标记肽的两种不同的融合蛋白(例如CARs)或本文的融合蛋白。
术语“药学上可接受的赋形剂或载体”或“生理学上可接受的赋形剂或载体”是指生物学上相容的载体，例如生理盐水，其在本文中有更详细的描述，其适用于向人类或其他非人类哺乳动物施用且通常被认为是安全的或不会引起严重不良事件的受试者。
如本文中所使用的，“统计上显著”是指当使用学生t检验计算时的p值等于或小于0.050，并表示不太可能偶然出现特定事件或测量结果。
如本文所用，术语“过继免疫疗法(adoptive immune therapy)”或“过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)”是指施用天然存在或基因工程的疾病抗原特异性免疫细胞(例如，T细胞)。过继细胞免疫疗法可以是自体的(免疫细胞来自受体)、同种异体的(免疫细胞来自相同物种的供体)或同基因的(免疫细胞来自与受体基因上相同的供体)。
免疫球蛋白结合蛋白
在某些方面，本公开提供了一种免疫球蛋白结合蛋白，其包含特异性结合至strep-tag肽的结合域。如本文所用，术语“strep-标记肽”(在本文中也称为“strep-标记”，“strep-tag”、“ST”和“标记肽”(当上下文清楚地如此表示时)并且不表示用于标记目标蛋白(例如Myc、His或Flag)的不同类型的肽，是指能够与链霉亲和素(一种从抗生物素蛋白链霉菌纯化的四聚体蛋白)特异性结合的肽由于其对生物素或工程链霉亲和素的高亲和力具有高亲和力，因此被广泛用于分子生物学实验方案中。本公开的示例性strep-tag肽与生物素竞争结合链霉亲和素或突变蛋白或变体。其(例如，
Figure BDA0002402858610000101
)并包含例如
Figure BDA0002402858610000102
标记(WRHPQFGG，SEQ ID NO：48)；
Figure BDA0002402858610000103
Tag II(在本文中也称为“STII”，其由氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID ID：19))；其变体包含例如在Schmid和Skerra，Nature Protocols，2：1528-1535(2007)，美国专利号7,981,632；以及PCT公开号WO 2015/067768，“strep-标记肽、含step-tag-肽的多肽及其序列”中公开的变体，通过引用并入本文。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白包含能够与strep-tag肽特异性结合的结合结构域，其中根据单克隆抗体3E8、5G2或4E2，该结合结构域包含包含CDR的VH结构域和VL结构域或其变体。在某些实施例中，结合结构域包含：(a)VL结构域，其包含：(i)SEQ ID NO：25中所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：26中所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：27所示的CDR3氨基酸序列或其变体；(ii)SEQ ID NO：31中所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：32中所示的CDR2氨基酸序列或其变体和SEQ ID NO：3中所示的CDR3氨基酸序列：33或其变体；(iii)SEQ ID NO：37中所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：38中所示的CDR2氨基酸序列或其变体和SEQ ID NO：3中所示的CDR3氨基酸序列NO：39或其变体、以及VH结构域(在实施例中，其可以具有至少约与SEQ ID NO：2、8或14中任何一个所示的氨基酸序列80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％的同一性。(b)VH结构域，其包含：(i)SEQ ID NO：22所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：23所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：24所示的CDR3氨基酸序列或其变体；(ii)SEQID NO：28所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：29所示的CDR2氨基酸序列或其变体和SEQ ID NO：10所示的CDR3氨基酸序列：30或其变体；(iii)SEQ ID NO：34所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：35所示的CDR2氨基酸序列或其变体和SEQ ID NO：36或其变体、以及VL结构域(在实施例中，其可以具有与SEQ ID NO：3、10或16中任何一个所示的氨基酸序列至少约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％的同一性；(c)(a)的VL结构域和(b)的VH结构域。在特定实施例中，VH结构域包含(i)SEQ ID NO：22所示的CDR1氨基酸序列，(ii)SEQ ID NO：23所示的CDR2氨基酸序列、和(iii)CDR3氨基酸序列在SEQ ID NO：24中；VL结构域包含：(iv)SEQ ID NO：25所示的CDR1氨基酸序列、(v)SEQ ID NO：26所示的CDR2氨基酸序列、和(vi)SEQ ID NO：27所示的CDR3氨基酸序列。
在其他实施例中，VH结构域包含(i)SEQ ID NO：28所示的CDR1氨基酸序列、(ii)SEQ ID NO：29所示的CDR2氨基酸序列、和(iii)CDR3氨基酸序列在SEQ ID NO：30中；且VL结构域包含(iv)SEQ ID NO：31所示的CDR1氨基酸序列、(v)SEQ ID NO：32所示的CDR2氨基酸序列、和(vi)SEQ ID NO：31所示的CDR3氨基酸序列编号：33。
在其他实施例中，VH结构域包含(i)SEQ ID NO：34所示的CDR1氨基酸序列、(ii)SEQ ID NO：35所示的CDR2氨基酸序列、和(iii)CDR3氨基酸序列在SEQ ID NO：36中；且VL结构域包含(iv)SEQ ID NO：37所示的CDR1氨基酸序列、(v)SEQ ID NO：38所示的CDR2氨基酸序列、和(vi)SEQ ID NO：39所示的CDR3氨基酸序列编号。
在任何前述实施例或本文公开的其他实施例中，所述strep-tag肽包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列或由其组成。
如本文所用，“结合结构域”或“结合区域”是指具有特异性识别和非共价结合的能力的蛋白质、多肽、寡肽或肽(例如抗体、受体)或其一部分或片段。与靶标(例如抗原、配体)结合。结合结构域包含任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的针对生物学分子或另一目标靶标的结合伴侣。示例性的结合结构域包含免疫球蛋白轻链和重链可变区(例如结构域抗体、sFv、单链Fv片段(scFv)、Fab、F(ab')2)、受体胞外域或配体。免疫球蛋白可变结构域(例如，scFv、Fab)在本文中称为“免疫球蛋白结合结构域”。已知多种测定法可用于鉴定与特定靶标特异性结合的本公开的结合域，测定法包括蛋白质印迹，ELISA和
Figure BDA0002402858610000111
分析。在某些实施例中，结合结构域是嵌合的、人的或人源化的。
在某些实施例中，结合结构域是更大的多肽或蛋白质的一部分，并被称为“结合蛋白”。“免疫球蛋白结合蛋白”或“免疫球蛋白样结合蛋白”是指含有一个或更多个免疫球蛋白结合结构域的多肽，其中该多肽可以是多种免疫球蛋白相关蛋白支架或结构的任何形式，例如抗体或其抗原结合片段、scFv Fc融合蛋白或者包含两个或更多个这种免疫球蛋白结合域或其他结合域的融合蛋白。
结合结构域的来源包含来自各种物种(包括人类、啮齿动物、禽类、野兔和绵羊)的抗体可变区。结合结构域的其他来源包含来自其他物种的抗体的可变区，其他物种例如为骆驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Ghahroudi等人，FEBS Letters 414：521，1997；Vincke等人，J.Biol.Chem.84：3273，2009；Hamers-Casterman等人，Nature 363：446，1993和Nguyen等人，J.Mol.Biol.275：413，1998)、护士鲨(Roux等人，Proc.Nat').l.Acad.Sci.(USA)95：11804，1998)、斑点鼠鱼(Nguyen等人，Immunogenetics 54：39，2002)或七鳃鳗(Herrin等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.(美国)105：2040，2008和Alder等人，NatureImmunol.9：319，2008)。这些抗体显然可以仅使用重链可变区形成抗原结合区，即这些功能性抗体仅是重链的同二聚体(称为“重链抗体”)(Jespers等人，Nature Biotechnol.22：1161，2004；Cortez-Retamozo等人，Cancer Res.64：2853，2004；Baral等人，NatureMed.12：580，2006；Barthelemy等人，J.Biol.Chem.283：3639，2008)。
抗体技术领域的技术人员所理解的术语均具有本领域所获得的含义，除非本文另有明确规定。例如，术语“抗体”是指完整的抗体，其包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的完整抗体(然而应当理解的是，缺少轻链的重链抗体也仍然被术语“抗体”仍然涵盖)、以及具有或保留结合由完整抗体识别的抗原靶分子(例如scFv)的能力的完整抗体的任何抗原结合部分或片段，例如scFv、Fab或Fab'2片段。因此，本文中术语“抗体”以最广义使用，包括多克隆抗体和单克隆抗体，这些抗体包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段，这些片段包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括遗传工程和/或以其他方式修改的免疫球蛋白形式，例如体内抗体、肽体抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂缀合抗体、多特异性抗体，例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联di-scFv、串联tri-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。
术语“VL”和“VH”分别是指来自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的、定义明确的子区组成，这些子区被称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)。术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指赋予抗原特异性和/或结合亲和力的TCR或抗体可变区中的氨基酸的非连续序列。通常，在免疫球蛋白结合蛋白的每个可变区中有三个CDR。例如，对于抗体、VH和VL区包含六个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3；LCDR1、LCDR2、LCDR3)。如本文所用，CDR的“变体”是指具有最多1-3个氨基酸取代、缺失或其组合的CDR序列的功能变体。免疫球蛋白序列可以与编号方案(例如，Kabat、EU、国际免疫遗传学信息系统(IMGT)和Aho)比对，这可以允许对等效残基位置进行注释，并可以用于使用抗原受体编号和受体分类法(ANARCI)软件工具(2016，Bioinformatics 15：298-300)进行比较的不同分子。
如本文所用，“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的免疫原性分子。该免疫应答可能涉及抗体产生、补体途径的活化、特异性免疫学上有活性的细胞(例如T细胞)的活化或两者。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。很明显，抗原可以合成、重组产生或衍生自生物学样品。可以包含一种或更多种抗原的示例性生物样品包含组织样品、肿瘤样品、细胞、生物液或其组合。抗原可以由经过修饰或基因工程以表达抗原的细胞产生。
术语“表位”或“抗原表位”包含被关联结合分子，例如免疫球蛋白，T细胞受体(TCR)，嵌合抗原受体识别并特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇，或其他结合分子、结构域或蛋白质。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，“特异性结合”是指结合蛋白或结合域(或其融合蛋白)以(即以1/M为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)等于或大于105M-1(对于该缔合反应而言，等于“缔合”速率(Kon)与“解离”速率[Koff]之比)的亲和力或Ka与靶分子(例如包含WSHPQFEK，SEQID NO；19氨基酸或由其组成的标记肽)的缔合或结合，而不会与样品中的任何其他分子或组分显著缔合或结合。结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)可分类为“高亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)或者“低亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka至少为为107M-1、至少为108M-1、至少为109M-1、至少为1010M-1、至少为1011M-1、至少为1012M-1或至少为1013M-1的结合蛋白或结合结构域。“低亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka最高为107M-1、最高为106M-1或最高为105M-1的的结合蛋白或结合结构域。或者，亲和力可以定义为以M为单位(例如10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。
已知多种测定法用于鉴定本公开的免疫球蛋白结合蛋白和特异性结合特定靶标的结合域、以及确定结合域或结合蛋白的亲和力，例如蛋白质印迹、ELISA、分析超速离心、光谱法和表面等离子体共振
Figure BDA0002402858610000131
分析(例如，参见Scatchard等人，Ann.NYAcad.Sci.51：660，1949；Wilson，Science 295：2103，2002；Wolff等人，Cancer Res.53：2560，1993；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或等同版本)。用于评估亲和力或表观亲和力或相对亲和力的测定法也是已知的。在某些实例中，通过评估与各种浓度的四聚体的结合，例如通过使用标记的四聚体的流式细胞术，来测量对免疫球蛋白结合蛋白的表观亲和力。在一些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白的表观Kd是在一定浓度范围内用标记的四聚体的2倍稀释液测量的，然后通过非线性回归确定结合曲线，表观Kd确定为产生半最大结合的配体的浓度。
术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，根据抗体同种型，其可进一步分为CH1、CH2和CH3域(IgA、IgD、IgG)，或CH1、CH2、CH3和CH4域(IgE，IgM)。“Fab”(片段抗原结合)是抗体与抗原结合的部分，并包含通过链间二硫键与轻链连接的重链的可变区和CH1。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白的VL结构域包含与SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：16中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的氨基酸序列，并且VH结构域包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14中任一个所示的氨基酸序列具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96 97、98、98、99或99.9％同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，免疫球蛋白结合蛋白的VL包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16中任一个所示的氨基酸序列或由其组成，并且VH包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14中任一个所示的氨基酸序列或由其组成。
在特定的实施例中，免疫球蛋白结合蛋白包含：
(i)包含或由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的VL结构域，和包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的VH结构域；(ii)包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的VL结构域，和包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的VH结构域；或包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由其组成的VL结构域，和包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由其组成的VH结构域。
如本文所用，“Fc区部分”是指来自抗体的Fc片段的重链恒定区片段(“可结晶片段化的区域”或Fc区)，其可以包含一个或更多个恒定域，例如CH2、CH3、CH4或其任意组合。在某些实施例中，Fc区部分包含IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3结构域或其任意组合，或者IgM或IgE抗体的CH3和CH4结构域及其任意组合。在其他实施例中，CH2CH3或CH3CH4结构具有来自相同抗体同种型的亚区域结构域并且是人的，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM(例如，来自人IgG1的CH2CH3)。作为背景，Fc区负责免疫球蛋白的效应子功能，例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体固定、与Fc受体(例如CD16、CD32、FcRn)结合(与缺乏Fc区的多肽相比，体内半衰期更长)、与蛋白A结合、甚至胎盘转移(参见Capon等人，Nature 337：525，1989)。在某些实施例中，在本公开的免疫球蛋白样结合蛋白中发现的Fc区部分将能够介导这些效应子功能中的一种或更多种，或者将通过例如一种或更多种本领域已知的突变而缺乏一种或更多种或所有这些活性。例如，用于修饰(例如，改善、减少或消除)Fc功能的氨基酸修饰(例如，取代)包含T250Q/M428L；M252Y/S254T/T256E；H433K/N434F；M428L/N434S；E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S；E333A；S239D/A330L/I332E；P257I/Q311；K326W/E333S；S239D/I332E/G236A；N297Q；K322A；S228P；L235E+E318A/K320A/K322A；L234A/L235A；以及L234A/L235A/P329G突变，这些突变在InvivoGen(2011)出版的“工程化Fc区”中进行了概述和注释，并可以从网站invivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions-invivogen.pdf？utm_source＝re view&utm_medium＝pdf&utm_campaign＝review&utm_content＝Engineered-Fc-Regions在线获得，在此通过引用并入本文。
另外，抗体具有通常位于Fab和Fc区之间的铰链序列(但是铰链的下部可以包含Fc区的氨基末端部分)。作为背景，免疫球蛋白铰链充当柔性间隔物，以允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链在结构上是多样的，在免疫球蛋白类别之间、甚至在亚类别之间，序列和长度都不同。例如，人IgG1铰链区是自由柔性的，这允许Fab片段绕它们的对称轴旋转并在以两个重链间二硫键中的第一个为中心的球内移动。相比而言，人IgG2铰链相对较短，并且包含由四个重链间二硫键稳定的刚性多脯氨酸双螺旋，从而限制了柔韧性。人IgG3铰链与其他亚类的不同之处在于其独特的延伸铰链区(约为IgG1铰链的四倍)，包含62个氨基酸(包含21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成不易弯曲的多脯氨酸双螺旋并提供具有更大的灵活性，因为Fab片段距离Fc片段相对较远。人IgG4铰链比IgG1短，但长度与IgG2相同，其柔韧性介于IgG1和IgG2之间。免疫球蛋白的结构和功能在例如Harlow等人的《抗体：实验室手册》第14章(冷泉港实验室，冷泉港，1988)中有综述。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白包含抗体或其抗原结合部分。在特定的实施例中，抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体3E8。在其他实施例中，抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体5G2。在其他实施例中，抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体4E2。在本文公开的任何实施例中，免疫球蛋白结合蛋白可以是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合部分。提供的免疫球蛋白结合蛋白中有抗体片段。“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包含但不限于：Fv；或Fab；Fab'；Fab’-SH；F(ab')2；双体线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；串联scFv；scFv-Fc；串联scFv-Fc；scFv二聚体；scFv拉链；双特异抗体-Fc；双特异抗体-CH3；sc双特异抗体；sc双特异抗体-Fc；sc双特异抗体-CH3；纳米抗体TandAbs；小抗体；小型抗体；三抗体；动物四体；scFab；Fab-scFv；Fab-scFv-Fc；scFv-CH-CL-scFv；和F(ab’)2-scFv2。
在特定的实施例中，抗体是包含可变重链区、可变轻链区或两者的单链抗体片段，例如scFv。
单结构域抗体是包含重链可变域的全部或部分或者轻链可变域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
抗体片段可以通过多种技术制备，例如完整抗体的蛋白水解消化和重组宿主细胞的生产。在一些实施例中，抗体是重组产生的片段，例如包含非天然存在的排列的片段，例如具有两个或多个抗体区域或通过合成接头例如肽接头连接的链的那些片段，和/或由天然完整抗体的酶消化。在一些方面，抗体片段(例如结合结构域)包含scFv。在一些实施例中，scFv包含VL结构域和VH结构域，该VL结构域与SEQ ID NOS：3、SEQ ID NOS：10和SEQ IDNOS：16中任何一个所示的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％相同，该VH结构域与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14中任何一个所示的氨基酸序列至少与80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％相同。
可以对本公开内容的任何scFv进行改造，使得VL结构域的C末端通过短肽序列连接至VH结构域的N末端，反之亦然(即，(N)VL(C)-接头-(N)VH(C)或(N)VH(C)-接头-(N)VL(C)。
在某些实施例中，结合结构域包含scFv，并且scFv包含单克隆抗体3E8的VL和VH。在特定实施例中，scFv包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或由其组成。
在其他实施例中，结合结构域包含scFv，并且scFv包含单克隆抗体5G2的VL和VH。在某些实施例中，scFv包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由其组成。
在其他实施例中，结合结构域包含scFv，并且scFv包含单克隆抗体4E2的VL和VH。在特定实施例中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的氨基酸序列或由其组成。在任何本公开的实施例中，scFv接头可以包含具有一个至约十个重复的甘氨酸-丝氨酸氨基酸链，其中x和y各自独立地是0到10的整数，条件是x和y不均为0(例如(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：20)、(Gly3Ser)2(SEQ ID NO：21)、Gly2Ser或其组合，例如((Gly3Ser)2Gly2Ser)(SEQ ID NO：49))。
在某些方面，免疫球蛋白结合蛋白包含多特异性结合蛋白，其中该多特异性结合蛋白包含特异性结合标记肽的结合结构域和特异性结合至少一个非标记肽的靶标的结合结构域。在特定的实施例中，多特异性结合蛋白包含双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白的形式包括本文所述的抗体片段，并且包括例如双特异性T细胞衔接器(BiTE)、DART、旋钮入孔(KIH)装配体、scFv-CH3-KIH装配体、KIH通用轻链抗体、TandAb、三联体、TriBi微型抗体、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv2、四价HCab、体内抗体、CrossMab、双重作用Fab(DAF)(二合一或四合一)、DutaMabs、DT-IgG、电荷对、Fab-臂交换、SEED抗体、Triomabs、LUZ-Y装配体、Fcabs、κλ抗体、正交Fabs、DVD-IgGs、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L、H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody和DVI-IgG(四合一)。双特异性抗体片段的形式是本领域已知的，并且在例如Spiess等人，Mol.Biol.215：403-10.免疫67(2)：95(2015)以及在Brinkmann和Kontermann，mAbs 9(2)：182-212(2017)中描述，其抗体和抗体片段形式通过引用并入本文中。在某些实施例中，双特异性结合蛋白结合标记肽，并且非strep-tag肽的至少一个靶标是免疫细胞标志物。在具体的实施例中，免疫细胞标志物是CD3或CD16。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合strep-tag肽，并且至少一个非strep-tag肽的靶标选自与疾病或病症相关的抗原。例如，CD19、CD20、CD22、ROR1、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、GD2、GD3、HPV E6、HPV E7、Her2、L1-CAM、Lewis A、Lewis Y、MUC1、MUC16、PSCA、PSMA、CD56、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD44v7/8、CD38、CD56、CD123、CA125、c-MET、FcRH5、WT1、叶酸受体α、VEGF-α、VEGFR1、VEGFR2、IL-13Rα2、IL-11Rα、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、SSX-2、PRAME、HA-1、PSA、ephrin A2、ephrin B2、NKG2D、NY-ESO-1、TAG-72、间皮素、NY-ESO、5T4、BCMA、FAP、碳酸酐酶9、ERBB2、BRAFV600E或CEA抗原。
在一些实施例中，本公开的免疫球蛋白结合蛋白是单价的(即，具有单个结合域，该结合域特异性地结合标记肽)或多价的(即，具有一个以上结合域，其中至少一个结合域特异性结合标记肽)，在这种情况下，它们可以是多特异性的。在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白是多价的。在特定的实施例中，免疫球蛋白结合蛋白是二价的。
在一些方面，本公开的免疫球蛋白结合蛋白包含在融合蛋白中。在某些实施例中，融合蛋白包含含有本文公开的结合结构域的细胞外组分和含有效应子结构域的细胞内组分，其中细胞外组分和细胞内组分通过跨膜结构域连接。在其他实施例中，结合结构域包含scFv，并且细胞外组分还包含具有铰链的连接区。
如本文所用，“效应子结构域”是融合蛋白或受体的细胞内部分或结构域，当接收适当的信号时，其可以直接或间接地促进细胞中的生物学或生理学应答。在某些实施例中，效应子结构域来自蛋白质或其一部分或蛋白质复合物，其在结合时或者当蛋白质或其一部分或蛋白质复合物直接结合靶分子并触发来自效应子结构域的信号时接收信号。
当效应子结构域包含一个或更多个信号域或基序，例如在共刺激分子中发现的基于细胞内酪氨酸的激活基序(ITAM)时，它可能直接促进细胞应答。不希望受理论的束缚，据信ITAM对于由T细胞受体或包含T细胞效应子结构域的融合蛋白进行配体结合后的T细胞活化是重要的。在某些实施例中，细胞内组分包含ITAM。示范性效应子结构域包含来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任意组合。在某些实施例中，效应子结构域包含淋巴细胞受体信号传导结构域(例如，CD3ζ)。
在其他实施例中，融合蛋白的细胞内组分包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)或其组合的共刺激结构域或其一部分。在某些实施例中，细胞内组分包含CD28共刺激结构域或其一部分(其可选地在天然CD28蛋白的186-187位置处的LL到GG突变(参见Nguyen等人，Blood 102：4320，(2003))、4-1BB共刺激域或其一部分、或两者。
在某些实施例中，效应子结构域包含CD3ζ或其功能部分。在其他实施例中，效应子结构域包含来自CD27的一部分或结构域。在其他实施例中，效应子结构域包含来自CD28的一部分或结构域。在其他实施例中，效应子结构域包含4-1BB的一部分或结构域。在其他实施例中，效应子结构域包含来自OX40的一部分或结构域。
本公开的细胞外组分和细胞内组分通过跨膜结构域连接。如本文所用，“跨膜结构域”是可以插入或跨过细胞膜的跨膜蛋白的一部分。跨膜结构域具有在细胞膜中热力学稳定的三维结构，并且长度范围通常为约15个氨基酸至约30个氨基酸。跨膜结构域的结构可包含α螺旋、β桶、β折叠、β螺旋或其任意组合。在某些实施例中，跨膜结构域包含或衍生自已知的跨膜蛋白(即，CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD27跨膜结构域、CD28跨膜结构域或其任意组合)。
在某些实施例中，融合蛋白的细胞外组分还包含位于结合结构域和跨膜结构域之间的接头。如本文所用，当指连接结合和跨膜结构域的融合蛋白的组分时，“接头”可以是具有约两个氨基酸至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以提供用于通过接头连接的两个区域、域、主题、片段或模块之间的运动的柔性和构象空间。例如，本公开的接头可以使结合结构域远离表达融合蛋白的宿主细胞的表面，以使得宿主细胞与靶细胞之间能够适当接触、抗原结合和激活(Patel等人，Gene Therapy 6：412-419，1999)。可以基于所选的靶分子、所选的结合表位或抗原结合结构域的捕获和亲和力来改变接头长度以使抗原识别最大化(参见例如，Guest等人，J.Immunother.28：203-11，2005；PCT公开号WO 2014/031687)。示例性的接头包含具有一个至约十个重复GlyxSery的甘氨酸-丝氨酸氨基酸链接头，其中x和y各自独立地为0至10的整数，条件是x和y不均为0(例如(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：20)、(Gly3Ser)2(SEQ ID NO：21)、Gly2Ser或其组合，例如((Gly3Ser)2Gly2Ser)(SEQ ID NO：49))。
本公开的接头还包含免疫球蛋白恒定区(即，任何同种型的CH1、CH2、CH3或CL)及其一部分。在某些实施例中，接头包含CH3结构域、CH2结构域或两者。在某些实施例中，接头包含CH2结构域和CH3结构域。在其他实施例中，CH2结构域和CH3结构域各自是相同的同种型。在特定的实施例中，CH2结构域和CH3结构域是IgG4或IgG1同种型。在其他实施例中，CH2结构域和CH3结构域各自是不同的同种型。在特定的实施例中，CH2包含N297Q突变。不希望受理论的束缚，据信具有N297Q突变的CH2结构域不结合FcγR(参见例如，Sazinsky等人，PNAS 105(51)：20167(2008))。在某些实施例中，接头包含人免疫球蛋白恒定区或其一部分。
在本文描述的任何实施例中，接头可包含铰链区或其一部分。铰链区是具有可变长度和序列的柔性氨基酸聚合物(通常富含脯氨酸和半胱氨酸氨基酸)，并连接免疫球蛋白蛋白质的较大和较不柔性的区域。例如，铰链区连接抗体的Fc和Fab区，并连接TCR的恒定区和跨膜区。在某些实施例中，接头包含免疫球蛋白恒定区或其一部分和铰链区或其一部分。在某些实施例中，接头包含甘氨酸-丝氨酸接头，甘氨酸-丝氨酸接头包含SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施例中，细胞外组分、结合结构域、接头、跨膜结构域、细胞内组分或共刺激结构域中的一个或更多个包含连接氨基酸。“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指蛋白质的两个相邻结构域、基序、区域、模块或片段之间的一个或更多个(例如，约2-20个)氨基酸残基，例如在结合结构域和相邻接头之间，在跨膜结构域与相邻细胞外或细胞内结构域之间，或在连接两个结构域、基序、区域、模块或片段的接头的一端或两端(例如，在接头和相邻结合域之间或接头和相邻的铰链之间)。连接氨基酸可以由融合蛋白的构建体设计产生(例如，在构建编码融合蛋白的多核苷酸期间，由于使用限制酶位点或自切割肽序列而产生的氨基酸残基)。例如，融合蛋白的跨膜结构域可以在氨基末端、羧基末端或这两个末端处具有一个或更多个连接氨基酸。
在一些实施例中，本公开的融合蛋白可还包含蛋白标记(在本文中也称为肽标记或标记肽)，条件是该蛋白标记不是strep-tag肽。蛋白标记是固定在目标蛋白质上或在基因上融合或成为目标蛋白质一部分的独特肽序列，可以被例如异源或非内源同源结合分子或底物(例如，受体、配体、抗体、碳水化合物或金属基质)。蛋白标记可用于检测、鉴定、分离、跟踪、纯化、富集、靶向，或在生物学上或化学上修饰目标标记的蛋白质，特别是当标记的蛋白质是细胞异源群体的一部分时(例如，像外周血)。在提供的融合蛋白中，一个或更多个标记被同源结合分子特异性结合的能力不同于或者是除了一个或更多个结合结构域特异性结合一个或更多个靶分子的能力之外的附加能力(即，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽)。在某些实施例中，蛋白标记是Myc标记、His标记、Flag标记、Xpress标记、Avi标记、钙调蛋白标记、聚谷氨酸标记、HA标记、Nus标记、S标记、X标记、SBP标记、Softag、V5标记、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标记或其任意组合。
在特定的实施例中，融合蛋白包含嵌合抗原受体或T细胞受体。“嵌合抗原受体”(CAR)是指本公开内容的融合蛋白，其经工程改造以包含以在宿主细胞中非天然存在或非天然存在的方式连接在一起的两个或更多个天然存在的氨基酸序列，当融合蛋白存在于细胞表面时，该融合蛋白可以充当受体。本公开内容的CAR包括包含抗原结合结构域(即，得自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子的抗原结合结构域，例如得自对癌症抗原特异的抗体或TCR的scFv或者衍生自或得自来自NK细胞的杀伤性免疫受体的抗原结合结构域)的细胞外部分，该细胞外部分与跨膜结构域和一种或更多种细胞内信号传导结构域(可选包含共刺激结构域)连接(参见例如Sadelain等人，Cancer Discov.，3(4)：388(2013)；另请参见Harris和Kranz，Trends Pharmacol.Sci.，37(3)：220(2016)；Stone等人，CancerImmunol.Immunother，63(11)：1163(2014))。
“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变的结合结构域、恒定结构域、跨膜区域和短的细胞质尾区；参见，例如，Janeway等人，Immunobiology：ImmuneSystem).Health and Disease，第3版，Current Biology Publications，第4:33页，1997)，其能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。可以发现TCR在细胞表面或呈可溶性形式，通常由具有α链和β链(分别也已知为TCR和TCR)或者γ和δ链链(也已知为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。像免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如，α链、β链)包含两个免疫球蛋白结构域、可变域(例如，α链可变域或Vα、β链可变域或Vβ；通常为位于N末端的基于Kabat编号(Kabat等人，“免疫学意义的蛋白质序列，美国卫生与人类服务部，美国国立卫生研究院公共卫生服务，1991年，第5版”)的氨基酸1到116，以及与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的氨基酸117至295)。类似于免疫球蛋白，可变域包含由框架区(FR)隔开的互补决定区(CDR；也称为高变区或HVR)(参见，例如，Jores等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)87：9138，1990；Chothia等人，EMBO J.7：3745，1988；另请参见Lefr anc等人，Dev.Comp.Immunol.27:55，2003)。通常，TCR可变域的CDR3是主要接触肽抗原的CDR，而CDR1和2主要接触MHC。在某些实施例中，TCR被发现在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上并与CD3复合物缔合。如本公开中使用的TCR的来源可以来自各种动物物种，例如人、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳动物。
“主要组织相容性复合物分子”(MHC分子)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。MHC I类分子是异源二聚体，由跨过α链的膜(具有三个α域)和非共价结合的β2微球蛋白组成。MHC II类分子由两个跨膜糖蛋白α和β组成，两者都跨膜。每个链都有两个域。MHC I类分子将起源于胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中CD8+ T细胞可识别肽：MHC复合物。MHCII类分子将起源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在此处被CD4+ T细胞识别。MHC分子可以来自各种动物物种，包含人、小鼠、大鼠、猫、狗、山羊、马或其他哺乳动物。
制备包含CAR在内的融合蛋白的方法描述于例如，美国专利号6,410,319；美国专利号6,410,319；美国专利号5,410,319；和美国专利号5,410,319；美国专利号7,446,191；美国专利公开号2010/065818；美国专利号8,822,647；PCT公开号WO 2014/031687；美国专利号7,514,537；Walseng等人，Scientific Reports 7：10713，2017；和Brentjens等人，2007，Clin.Cancer Res.13：5426，其技术通过引用并入本文中。生产工程改造的TCR的方法描述于例如Bowerman等人，Mol.Biol.215：403-10.Immunol.，46(15)：3000(2009)，其技术引用参考并入本文中。
在某些实施例中，TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)，其包含TCRVα和Vβ结构域TCR两者，但仅包含单个TCR恒定结构域(Cα或Cβ)。在某些实施例中，TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体是嵌合的(例如，包含来自一个以上供体或物种的氨基酸残基或基序)、人源化的(例如，包含来自非人生物的残基，该非人生物被改变或取代了以降低人的免疫原性的风险)、或者人的。
举例来说，用于分离和纯化重组产生的可溶性免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的方法可包含从合适的宿主细胞/载体系统获得上清液，所述宿主细胞/载体系统将可溶性蛋白分泌到培养基中，该方法然后使用市售的过滤器浓缩培养基。浓缩后，可将浓缩物施用于单个合适的纯化基质或一系列合适的基质，例如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或更多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。从自然环境中分离免疫原时，也可以使用这些纯化方法。用于本文所述的一种或更多种分离/重组可溶性蛋白的大规模生产的方法包括分批细胞培养，对其进行监测和控制以维持合适的培养条件。可溶性蛋白质的纯化可以根据本文所述和本领域已知的方法进行，并且该方法符合国内外监管机构的法律和准则。
在一些实施例中，本文公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白还包含一种或更多种细胞毒性剂(例如化学治疗剂或细菌毒素)、放射性同位素、放射性金属或可检测剂。示例性可检测剂包含酶(例如生色报告酶、例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))、染料(例如花青染料、香豆素、若丹明、氧杂蒽、荧光素或其磺化衍生物、荧光蛋白，包括Shaner等人在Nature Methods(2005))中描述的蛋白)，荧光标签或部分(例如PE、太平洋蓝、Alexafluor、APC和FITC)DNA条码(例如，长度为从5到75个核苷酸)和肽标记，条件是该肽标记不包含或不包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。如本文所用，“肽标记”或“蛋白标记”或“非strep-tag肽标记”或“strep-tag蛋白标记”是指独特的肽序列，该序列：附着于、融合至或部分融合于目的蛋白(例如，本公开的免疫球蛋白结合蛋白)；不是strep-tag肽；并被异源或非内源同源结合分子特异性结合，该结合特性可用于检测、鉴定、分离或纯化、跟踪、富集或靶向标记的肽或蛋白质或表达标记的肽或蛋白质的细胞，特别是当标记的肽或蛋白质是蛋白质或其他材料的异种群体的一部分时，或者当表达标记的肽或蛋白质的细胞是细胞(例如生物样品)的异种群体的一部分时。示例性非strep-tag肽标记包含Myc标记、His标记、Flag标记、Xpress标记、Avi标记、钙调蛋白标记、聚谷氨酸标记、HA标记、Nus标记、S标记、X标记、SBP标记、Softag、V5标记、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标记或其任意组合。
在另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含如本文所述的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。用于诊断和治疗用途的药学上可接受的载体在药学领域是众所周知的，并且描述于例如Remington's PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(AR Gennaro(Ed.)，第18版，1990)和CRC Handbook of食品，药物和化妆品赋形剂，CRC Press LLC(SC Smolinski编辑，1992年)。示例性的药学上可接受的载体包含任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂或其任意组合。例如，在生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水可以是合适的药学上可接受的载体。药物组合物中也可以提供防腐剂、稳定剂、染料等。另外，也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。药物组合物还可包含稀释剂，例如水、缓冲液、抗氧化剂、例如抗坏血酸、低分子量多肽(少于约10个残基)、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、糊精)、螯合剂(例如，EDTA)、谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性稀释剂。
本文还提供了试剂盒，其包含(a)表达载体或编码包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽的多核苷酸、以及用于将该载体或多核苷酸转导至宿主细胞中的任选试剂；(b)本公开的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、组合物、分离的多核苷酸或表达载体、以及用于将多核苷酸或表达载体转导至宿主细胞和/或包含该多核苷酸或表达构建体，其中宿主细胞表达编码的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白。
在另一方面，提供了一种基质组合物，其包含(i)包含本文公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的基质组合物，和(ii)特异性结合免疫共刺激分子的结合多肽，其中该结合增加免疫共刺激分子的活性水平。在某些实施例中，基质组合物还包含藻酸盐、基底膜基质或生物聚合物或其任意组合。
在另一方面，提供了一种装置，其中该装置包含：(i)如本文公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白；(ii)与免疫共刺激分子特异性结合的结合多肽，其中该结合提高免疫共刺激分子的活性水平。在该装置的特定实施例中，(i)和(ii)之一或两者均置于固体表面、琼脂糖珠、树脂、3D织物基质或珠子上。
多核苷酸，载体和宿主细胞
在某些方面，提供了编码本文所述的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白中的任何一种或更多种的核酸分子。在某些实施例中，本公开的多核苷酸包含(a)具有与SEQ ID NOS：1、SEQ ID NOS：7和SEQ ID NOS：13中任一序列所示的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸；以及(b)具有与SEQ IDNOS：4、SEQ ID NOS：9和SEQ ID NOS：15中任一序列所示的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸中的一个或两个。
编码所需免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸可以使用本领域已知使用标准技术的重组方法来获得或产生，例如从表达所需序列或其一部分的细胞中筛选库，通过从已知序列的载体中衍生得到序列、或直接从包含序列的细胞或组织中分离出序列或其一部分。或者，可以以合成的方式产生目的序列。
在本文所述的任何实施例中，本公开的多核苷酸可以针对含有该多核苷酸的宿主细胞进行密码子优化(参见例如，Scholten等人，Clin.Immunol.119：135-145(2006))。如本文所用，“密码子优化的”多核苷酸是具有被沉默突变修饰的密码子的异源多核苷酸，所述沉默突变对应于宿主细胞tRNA水平的丰度。
在其他方面，提供了表达构建体，其中所述表达构建体包含可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)的本公开的多核苷酸。在某些实施例中，表达构建体包含在载体中，用于引入到目的宿主细胞(例如，B细胞、CHO细胞、HEK-293细胞、T细胞、NK细胞或NK-T细胞)中。示例性载体可包含能够转运与其连接的另一种多核苷酸或能够在宿主生物中复制的多核苷酸。载体的一些实例包含质粒、病毒载体、粘粒和其他。一些载体可能能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)，而其他载体可能整合到宿主细胞的基因组中或促进在引入宿主细胞时插入的多核苷酸的整合，并因此与宿主基因组(例如慢病毒载体、逆转录病毒载体)一起复制。另外，一些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达(这些载体可以称为“表达载体”)。根据相关实施例，还应当理解的是，如果将一种或更多种试剂(例如，如本文所述的编码融合蛋白的多核苷酸)共同施用给受试者，则每种试剂可存在于分开的或相同的载体中，不过并且多个载体(它们各自包含不同的试剂或相同的试剂)可以被引入细胞或细胞群体或被施用于受试者。
在某些实施例中，本公开的多核苷酸可以可操作地连接至载体的某些元件。例如，实现所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列可以可操作地连接。表达控制序列可包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强转译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与目的基因和表达控制序列邻接，那么它们可以以反式或远距离作用来控制目的基因。
在某些实施例中，载体包括质粒载体或病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(例如正粘液病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒、包含腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。例如，其他病毒包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、巴波病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤，哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒，泡沫病毒属(Coffin，J.M，Retroviridae:The viruses and their replication，InFundamental Virology，Third Edition，B.N.Fields et al.，Eds.，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996)。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，可以使用逆转录酶将其逆转录到DNA中，然后将逆转录的DNA整合入宿主细胞基因组。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科。γ逆转录病毒的例子包含小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽流感、网状内皮病病毒。
如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在三个或更多质粒瞬时转染(包装、包膜和转移)到生产细胞后产生的。与HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合体介导。逆转录产物是双链线性病毒DNA，是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。
在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包含源自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和Maedi-Visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。利用含有CAR转基因的病毒颗粒使用逆转录病毒和慢病毒载体和包装细胞转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已描述于例如美国专利8,119,772；Walchli等人，PLoS One 6:327930,2011；Zhao等人，J.Immunol.174:4415,2005；Engels等人，Hum.Gene Ther.14:1155,2003；Frecha等人，Mol.Ther.18:1748，2010；以及Verhoeyen等人，Methods Mol.Biol.506:97,2009中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺伴随病毒(AAV)的载体；源自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒的HSV(Krisky等人，Gene Ther.5：1517，1998)。
当病毒载体基因组包含在宿主细胞中作为单独的转录本表达的多个多核苷酸时，病毒载体还可以包含两个(或多个)转录本之间的附加序列，允许双顺反子或多顺反子表达。病毒载体中使用的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽或其任意组合。
在本文所述的任何实施例中，多核苷酸还可以包含编码自切割多肽的多核苷酸，其中编码自切割多肽的多核苷酸位于编码免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸与编码标志物的自切割多肽的多核苷酸之间。
在某些实施例中，自切割多肽包含来自猪破伤风病毒1(P2A；SEQ ID NO：40或41)、Thosea asigna病毒(T2A；SEQ ID NO：42或43)、马鼻炎A病毒(E2A；SEQ ID NO：44或45)、或口蹄疫病毒(F2A)的2A肽。2A肽的其他示例性核酸和氨基酸序列在例如Kim等人，PLOS One6：e18556，2011中阐明，该2A核酸和氨基酸序列通过引用整体并入本文。
为基因治疗用途开发的其他载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。此类载体包含衍生自杆状病毒和α病毒(Jolly,D J.1999.Emerging Viral Vectors.pp 209-40in Friedmann T.ed.The Development of Human Gene Therapy.New York：ColdSpring Harbor Lab)，或质粒载体(例如睡美人或其他转座子载体)。
可通过使用本领域已知的任何合适的分子生物学工程技术来完成用于基因工程和产生目的融合蛋白的表达载体的构建。为了获得有效的转录和转译，每个重组表达构建体中的多核苷酸包含至少一个合适的表达控制序列(也称为调节序列)，例如与编码目的蛋白质或肽核苷酸序列可操作(即可操作地)连接的前导序列，特别是启动子。
标志物有时用于鉴定或监测异源多核苷酸被转导的宿主细胞表达，或检测表达目的融合蛋白的细胞。在某些实施例中，多核苷酸还包含编码标志物的多核苷酸。在某些实施例中，编码标志物的多核苷酸位于编码免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸的3'。在其他实施例中，编码标志物的多核苷酸位于编码免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸的5'。示例性标记包含绿色荧光蛋白、人CD2的胞外域、截短的人EGFR(huEGFRt；参见Wang等人，Blood 118：1255(2011))、截短的人CD19(huCD19t)、截短的人CD34(huCD34t)；或截短的人NGFR(huNGFRt)。在某些实施例中，编码的标记物包含EGFRt，CD19t，CD34t或NGFRt。
在某些方面，本公开的免疫球蛋白结合蛋白和融合蛋白可以在宿主细胞的表面上表达或由宿主细胞分泌或分离。宿主细胞可以包含可以接受载体或掺入核酸或表达蛋白的任何单个细胞或细胞培养物。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传上还是在表型上相同或不同。合适的宿主细胞可以取决于载体，并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、通过磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其他方法诱导这些细胞掺入载体或其他材料。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2d ed.(Cold SpringHarbor Laboratory，1989)。
因此，在某些实施例中，提供了包含本公开的多核苷酸或表达构建体的宿主细胞，其中该多核苷酸或表达构建体编码免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白，并且宿主细胞表达编码的免疫球蛋白结合蛋白或编码的融合蛋白。使用本领域已知的任何方法(包括转化、转染和转导)将编码免疫球蛋白结合蛋白的多核苷酸或克隆/表达构建体引入合适的细胞中。宿主细胞包括经历离体细胞疗法(包括例如离体基因疗法)的受试者的细胞(例如T细胞或其他免疫细胞)、以及用于细胞疗法的同种异体或同基因细胞。
在某些实施例中，转导以表达本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。如本文所用，“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如免疫系统细胞)的细胞。典型的造血祖细胞包括具有CD24Lo Lin–CD117+表型的细胞或在胸腺中发现的细胞(称为祖细胞)。
如本文所用，“免疫系统细胞”是指源自骨髓中造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系，即髓系祖细胞(其产生诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴样祖细胞(产生淋巴样细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和NK-T细胞)。示例性免疫系统细胞包含B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、天然杀伤细胞(例如NK细胞或NK-T细胞)和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“APC”，它们是专门的细胞，当与肽复合的APC表面的主要组织相容性复合物(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时，可以激活T细胞。
“T细胞”或“T淋巴细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，而CD45RO的表达减少)记忆性T细胞(TM)(经历抗原和长久存活的细胞)和效应细胞(经历过抗原的细胞毒性的)。TM可进一步分为中央记忆T细胞(TCM，与幼稚T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，而CD54RA的表达减少)、干细胞记忆T细胞、和效应记忆T细胞(TEM，与幼稚T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达减少，而CD127的表达增加)的子集。
效应T细胞(TE)是指经历过抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，与TCM相比，其CD62L、CCR7和CD28的表达减少，并且其颗粒酶和穿孔素呈阳性。辅助性T细胞(TH)是CD4+细胞，通过释放细胞因子来影响其他免疫细胞的活性。CD4+ T细胞可以激活和抑制适应性免疫反应，而这两种功能中的哪一种被诱导将取决于其他细胞和信号的存在。可以使用已知技术收集T细胞，并且可以通过已知技术(例如通过与抗体的亲和结合、流式细胞术或免疫磁选择)来富集或消除各种亚群或其组合。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，例如CD4+ CD25+(Foxp3+)调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+ CD28-和Qa-1受限T细胞。
“T细胞谱系的细胞”是指表现出T细胞的至少一种表型特征的细胞，或者该细胞的区分该细胞与其他淋巴样细胞以及红系或髓系谱系的细胞的前体或祖细胞。这样的表型特征可以包括对T细胞特异的一种或更多种蛋白质(例如，CD3+、CD4+、CD8+)或对T细胞特异的生理、形态、功能或免疫学特征的表达。例如，T细胞谱系的细胞可以是定型为T细胞谱系的祖细胞或前体细胞；CD25+未成熟和灭活的T细胞；已经历CD4或CD8谱系定型的细胞；CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞祖细胞；单阳性CD4+或CD8+；TCRαβ或TCRγ；或成熟的功能性或活化的T细胞。
已经描述了用期望的核酸转染/转导T细胞的方法(例如，美国专利申请公开号US2004/0087025)，其具有使用具有期望靶特异性(例如，Schmitt等人，Hum.Gen.20：1240，2009；Dossett等人，Mol.Ther.17：742，2009；Till等人，Blood 112：2261，2008；Wang等人，Hum.Gene Ther.18：712.，2007；Kuball等人，Blood 109：2331，2007；US 2011/0243972；US2011/0189141；Leen等人，Ann.Rev.Immunol.25：243，2007)的T细胞的过继转移程序，基于本文的教导，考虑了将这些方法适用于本文公开的实施例，包括针对本公开的免疫球蛋白结合蛋白和融合蛋白的实施例。
当包含根据本公开的多核苷酸、载体或蛋白质时，作为本公开的一个方面考虑的真核宿主细胞除了包括人类免疫细胞(例如人类患者自身的免疫细胞)之外，还包括VERO细胞，HeLa细胞，中国人仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包含能够修饰表达的多价结合分子糖基化模式的修饰CHO细胞，请参见美国专利申请公开号2003/0115614)，COS细胞(例如COS-7)，W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞，HepG2细胞，N细胞，3T3细胞，草地贪夜蛾细胞(例如Sf9细胞)，酿酒酵母细胞或本领域已知可用于表达和可选地分离根据本公开的蛋白质或肽的任何其他真核细胞。还考虑了原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、链霉菌或本领域已知适合表达和任选分离根据本公开的蛋白质或肽的任何原核细胞。特别地，在从原核细胞分离蛋白质或肽时，可以考虑使用本领域已知的从包涵体提取蛋白质的技术。考虑了糖基化本公开的免疫球蛋白结合蛋白和融合蛋白的宿主细胞。
转化的或转染的宿主细胞可以按照常规方法在含有营养物质和所选宿主细胞生长所需的其他成分的培养基中培养。包括确定的介质和复杂的介质的多种合适的介质是本领域已知的，并且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基还可以包含诸如生长因子或血清的成分。生长培养基通常将通过例如药物选择或必需营养素的缺乏来选择含有外源添加的多核苷酸的细胞，所述必需营养素由表达载体上携带的选择标记或共转染到宿主细胞中的选择标记来补充。
在实施例中，本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白在宿主细胞的表面上表达，使得与标记肽的结合引起来自宿主细胞的活性或应答。可以根据许多本领域公认的用于测定宿主细胞(例如T细胞)活性的方法，包括确定T细胞结合、激活或诱导，还包括确定T细胞的响应是抗原特异性的。实例包括确定T细胞增殖、T细胞细胞因子释放、抗原特异性T细胞刺激、MHC限制性T细胞刺激、CTL活性(例如，通过检测预载靶细胞的51Cr或Europium释放)、T细胞表型变化标记物表达和其他T细胞功能指标。例如，进行这些和类似测定的程序可以在Lefkovits(Immunology Methods Manual：Technical Sourcebook of Techniques，1998)中找到。另见Current Protocols in Immunology；Weir，Handbook of ExperimentalImmunology,Blackwell Scientific，Boston，MA(1986)；Mishell and Shigii(eds.)Selected Methods in Cellular Immunology，Freeman Publishing，San Francisco，CA(1979)；Green and Reed，Science281：1309(1998)及其中引用的参考文献。
可以根据本文所述和本领域中实践的方法确定细胞因子的水平，包括例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。可以通过分离淋巴细胞(例如外周血细胞或来自淋巴结的细胞的样品中的循环淋巴细胞)、用抗原刺激这些细胞以及测量抗原细胞因子的产生、细胞增殖和/或细胞活力(例如通过掺入tri化的胸苷或非放射性测定，例如MTT测定等)来确定由抗原特异性引发或刺激免疫应答引起的免疫细胞增殖和克隆扩增。可以例如通过确定Th1细胞因子(例如IFN-γ、IL-12、IL-2和TNF-β以及2型细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13)的水平来检查本文所述的免疫原对Th1免疫应答和Th2免疫应答之间的平衡的作用。
在其他方面，提供了试剂盒，其包括(a)本文所述的载体或表达构建体和用于将载体或表达构建体转导至宿主细胞中的任选试剂，和(b)(i)免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、本文公开的分离的多核苷酸或表达载体、以及用于将多核苷酸或表达载体转导到宿主细胞中的任选试剂，和(c)本公开的宿主细胞。
用途
在其他方面，提供了用于使用本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白来鉴定表达具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列(即包括或由其组成)的标记肽的细胞或细胞群的方法。此类方法可能有用，例如，用于确定在过继细胞疗法中使用的标记细胞是否已成功转移至有需要的受试者，或者标记细胞在接受过继细胞疗法的受试者中是否增殖、持续或定位于目的位点。在某些实施例中，方法包括(i)使来自受试者的包含一种或更多种标记细胞的样品与本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白接触，和(ii)检测免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白与一个或更多个标记细胞的特异性结合，从而鉴定出表达标记肽的一个或更多个细胞。
在其他方面，提供了从受试者富集或分离标记细胞或标记细胞群的方法，其中所述方法包括(i)使来自受试者的包含在细胞表面表达标记肽的一种或更多种标记细胞的样品与本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白接触，该标记肽包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成，和(ii)选择或分选由免疫球蛋白结合蛋白或蛋白特异性结合的标记细胞融合蛋白，从而富集或分离出一个或更多个表达标记肽的细胞。此类方法可用于有效地从受试者或受试者样品(例如，从全血、PBMC，或肿瘤组织或部位)中分选和分离目的标记细胞，以进行分析或处理，从而例如告知或改善使用标记细胞的过继细胞疗法。
在某些实施例中，标记肽包含在由待鉴定或富集或分离的一个或更多个细胞表达的细胞表面蛋白中。在特定实施例中，细胞表面蛋白包含CAR或TCR(例如可以在包含表达CAR或TCR的细胞的过继细胞疗法中用于靶向与疾病相关的抗原)、标志物(例如在细胞表面上表达的可检测标志物，例如选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt的转导标志物)、或其组合。在某些实施例中，细胞表面蛋白包含标志物。在其他实施例中，标志物包含EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。代表性的标记嵌合效应分子(例如含有一种或更多种标记肽的CAR)在PCT公开号WO 2015/095895中描述，其标记和标记的效应分子通过引用并入本文。示例性标记肽包括以高亲和性与细菌蛋白链霉亲和素(Streptavidin)及其衍生物Strep-Tactin结合的
Figure BDA0002402858610000291
(WRHPQFGG，SEQ ID NO：48)及其变体
Figure BDA0002402858610000292
(WSHPQFEK，SEQ ID NO：19)。参见例如美国专利号7,981,632(其Strep-tag通过引用并入本文)。
本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白可包含可检测部分，以辅助或使得能够鉴定、跟踪、富集或分离结合的标记细胞。例如，可检测部分可以包含酶、染料、荧光标签或肽标记中的一种或更多种，条件是该肽标记不包含strep-tag肽(例如，不包括包含SEQ IDNO：19中所示的氨基酸序列或由其组成的肽标记)。
在一些实施例中，可检测部分包含酶，并且该酶包含生色报告酶，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可以偶联至本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的荧光标签包含花青染料、香豆素、若丹明、黄嘌呤、荧光素或其磺化衍生物、荧光蛋白或其任意组合。在本公开的方法中有用的肽标记包含Myc标记、His标记、Flag标记、Xpress标记、Avi标记、钙调蛋白标记、聚谷氨酸标记、HA标记、Nus标记、S标记、X标记、SBP标记、Softag、V5标记、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标记或其任意组合。在特定的实施例中，可检测部分包含肽标记，并且肽标记包含His标记或Myc标记。在实施例中，荧光部分可以选自PE、太平洋蓝、Alexafluor、APC或FITC。
在任何本公开的方法和组合物中以及相关的标记策略和成像技术(例如，PET、MRI、NIR)中有用的其他可检测部分包含在Freese和Wu，Mol Immunol.67(200)：142-152(2015)和Moek等人,J.Nucl.Med.58:83S-90S(2017)中公开的那些，所有内容均通过引用并入本文。在某些实施例中，可检测部分包含放射性核素、放射性金属、MRI造影剂、微泡、碳纳米管、金颗粒、氟脱氧葡萄糖、发色团、不透射线的标记或其任意组合。在一些实施例中，可检测部分包含选自68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F和124T的放射性核素。在某些此类实施例中，可检测地标记的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白还包含放射性核素螯合剂，其选自马来酰亚胺标记的DOTA、N-羟基琥珀酰亚胺-DOTA和去铁胺(DFO)。
可检测结合的标记细胞可以使用已知技术进行鉴定、选择、分类、富集或分离。例如，在某些实施例中，使用流式细胞术鉴定、选择或分类细胞或细胞群。在一些实施例中，通过磁柱色谱法从样品的其他组分富集或分离与免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白特异性结合的标记细胞或标记细胞群。
在一些实施例中，待鉴定的标记细胞包含在来自受试者的样品中。在某些实施例中，样品是血液或组织。在本文公开的任何实施例中，受试者可以是人。
在其他方面，提供了用于活化经修饰以在其细胞表面上表达标记肽的免疫细胞的方法，所述标记肽包含或由SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列组成，其中所述方法包括在足以诱导经修饰免疫细胞活化的条件和时间下，使经修饰免疫细胞与本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白接触。简而言之，诸如T细胞之类的免疫细胞需要外部刺激来激活以执行免疫应答功能(例如释放细胞因子和细胞毒素以杀死感染的或癌细胞；提供募集其他免疫细胞的信号)。启动用于过继治疗的表达CAR或TCR的T细胞的启动通常是通过将表达的CAR或TCR暴露于其同源抗原，或将T细胞暴露于与存在于细胞表面的共刺激蛋白(例如CD3、CD28)结合的微米珠偶联抗体。
本公开的免疫球蛋白结合蛋白和融合蛋白可用于激活标记的免疫细胞，例如通过结合至免疫细胞表达的CAR或TCR中包含的标记(例如，不特异性地与同源抗原(例如细胞外铰链部分)结合的CAR或TCR的一部分中包含的标记)来激活，从而模拟抗原结合事件。这有利地允许免疫细胞独立于表达的CAR或TCR的抗原识别而被激活。可替换地，本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白可用于结合标记的免疫细胞和使标记的免疫细胞与激活该标记的免疫细胞的其他试剂接近(例如，使用包含本公开抗体的微米珠和激动性结合共刺激分子(例如CD3或CD28)的抗体)。当标记肽不包含在发出激活信号的蛋白质中时(例如，如果标记肽与诸如EGFRt的标志物蛋白融合)，这种方法可能是有用的。在某些实施例中，标记肽包含在经修饰免疫细胞表达的细胞表面蛋白中。在其他实施例中，细胞表面蛋白包含CAR、TCR、标志物或其组合；可选地，其中标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。在一些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于固体表面，例如平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子(例如，微米珠或纳米珠)。
在某些实施例中，标记的免疫细胞在体外或离体被激活，例如在过继治疗方案中初始施用标记的免疫细胞之前或之后。在其他实施例中，用于活化标记的免疫细胞的方法包括在富集或分离之前扩大活化的标记的免疫细胞的群体(例如，在来自受试者的样品中)的附加步骤。在本文公开的任何实施例中，表达标记肽的细胞可以是或包含人T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
本文还提供了用于局部激活经修饰免疫细胞的体内方法，其中所述方法包括向受试者施用(i)包含(a)本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白的基质组合物或装置，和(b)对共刺激分子(例如CD3、CD27、CD28、OX40或CD137)具有特异性的结合多肽，以及(ii)在其细胞表面表达包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽的经修饰免疫细胞，其中标记肽包含在CAR、TCR、标志物或其组合中；可选地，其中标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt，其中子部分(i)的基质组合物的(a)与细胞表面标记肽的缔合激活了经修饰免疫细胞。在一些实施例中，对共刺激分子具有特异性的结合多肽包含在基质组合物或装置中的多特异性免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白中。这样的体内方法可能是有用的，例如，在细胞活性的期望部位处或附近激活标记的免疫细胞，例如在肿瘤部位或感染部位处或附近。在某些实施例中，基质组合物包含藻酸盐、基底膜基质或生物聚合物。在本文公开的任何实施例中，表达标记肽的细胞可以是或包含人T细胞、NK细胞或NK-T细胞。免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白、结合多肽和经修饰免疫细胞的施用可以以任何顺序进行，但是通常将一同或同时进行。
在另一方面，提供了促进细胞增殖的方法，其中所述方法包括在足以允许标记细胞增殖的条件和时间下，使表达包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽的细胞与(a)本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白以及(b)生长因子细胞因子接触。在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白可通过直接激活细胞(例如结合细胞所表达的CAR、TCR或共刺激分子中包含的标记肽)来激活细胞，从而促进增殖(例如，使用包含免疫球蛋白蛋白和任选的抗-CD3或抗-CD28抗体的珠子；参见例如，图3A-4B)。在一些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于固体表面，例如平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子(例如，微米珠或纳米珠)。根据本公开的方法，可以使用任何生长因子细胞因子来促进细胞增殖，只要该生长因子细胞因子刺激细胞增殖即可。这样的细胞因子是本领域已知的，并且包含例如IL-12、IL-15等、及其组合。
在其他实施例中，该方法另外包含将标记的细胞与与该细胞表达的共刺激蛋白激动性结合的试剂孵育。在某些实施例中，所述试剂是抗CD27结合蛋白、抗CD28结合蛋白、抗CD137结合蛋白、抗OX40结合蛋白或其任意组合，其中一种或更多种结合蛋白被连接到坚固的表面。在其他实施例中，抗CD27结合蛋白、抗CD28结合蛋白、抗CD137结合蛋白、抗OX40结合蛋白或其任意组合被附着于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子。
本公开的方法可用于促进例如T细胞、NK细胞或NK-T细胞的增殖。在某些实施例中，细胞是经功能性修饰T细胞。在特定的实施例中，经功能性修饰T细胞是病毒特异性细胞、肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、效应T细胞或CD4+ CD25+调节性T细胞。在其他实施例中，标记肽可以包含在细胞表达的细胞表面蛋白中(例如，CAR、TCR、共刺激分子、标志物或其组合；可选地，其中标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt)。
可以根据本公开的任何方法在体外、体内或离体细胞中促进或诱导标记细胞的增殖。在特定的实施例中，体内或离体促进或诱导增殖。免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白和生长因子细胞因子的施用可以任何顺序发生(例如，首先施用生长因子细胞因子)，但是通常将同时或一同进行。
在其他方面，提供了体内成像方法，其中所述方法包括(a)对已经接受表达了包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽的修饰细胞的受试者施用一种或更多种本公开的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白，其中所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白还包含适合于体内成像的可检测部分，和(b)对受试者进行成像。此类方法可用于例如跟踪体内标记细胞的迁移、定位、增殖或持久性。
在体内获得高质量、信息丰富的细胞图像取决于几个因素，例如，成像剂选择性地以高保留率结合细胞、迅速穿透一种或更多种组织并达到必要深度、以及迅速从血液中清除的能力。在实施例中，可检测地标记的免疫球蛋白结合蛋白包含含有抗体的抗原结合片段的结合结构域，其中所述抗原结合片段具有适合于体内成像的形式或结构。例如，在某些实施例中，抗原结合片段包含scFv、串联scFv、scFv-Fc、scFv二聚体、scFv拉链、双特异抗体、小抗体、三抗体、四抗体、Fab、F(ab)'2、scFab、微型抗体、纳米抗体、纳米抗体-HAS、双特异性T细胞衔接器(BiTE)、DART、sc双特异抗体、sc双特异抗体-CH3或scFv-CH3旋钮入孔(KIH)装配体。
适用于体内成像的任何可检测部分都可用于本公开的方法中。在某些实施例中，可检测部分包含放射性示踪剂，例如68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F和124T。正电子发射断层扫描(PET)是根据本公开方法对放射性标记的目标成像的示例性技术。可用于体内成像的其他成像技术包含但不限于磁共振成像(MRI)和近红外(NIR)成像。其他可检测部分包括例如磁性颗粒、超顺磁性氧化铁(SPIO)、氟脱氧葡萄糖(18F)和荧光化合物，例如荧光蛋白或部分。
在其他方面，提供了用于靶向消融标记的免疫治疗细胞的方法，其中所述方法包括向受试者施用一种或更多种本公开的(a)免疫球蛋白结合蛋白，(b)融合蛋白或(c)组合物，其中所述受试者先前已被施用包含标记肽的表达细胞表面蛋白(例如，CAR、TCR或标志物，例如EGFRt)的标记的免疫治疗细胞，所述标记肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或由其组成，其中所述免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物在与标记肽结合后能够在足以引起标记的免疫治疗细胞消融的条件和时间下直接或间接诱导细胞死亡。
如本文所用，“靶向消融”是指选择性杀伤(例如，通过诱导的细胞凋亡、裂解、吞噬作用、细胞毒性剂的递送、抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)、补体导向的细胞毒性(CDC)、靶细胞(例如，表达具有SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列的标记肽的细胞)或通过另一种机制)。当先前施用的加标记的免疫治疗细胞(例如，表达抗原特异性细胞表面受体如CAR或TCR的免疫治疗细胞)的数量过多或具有不希望的活性(例如，识别并引发针对受试者的脱靶细胞或组织的免疫应答)或活动水平(例如，引发强度、持续时间或两者不适当的免疫应答，例如CRS事件)，本公开的靶向消融方法可能是有用的。在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物施用于具有与标记的免疫治疗细胞的存在相关的至少一种不良事件的受试者。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物包含细胞毒性剂，例如化学治疗剂。化学治疗剂包含但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、DNA破坏剂、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰类似物))、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(例如嵌入剂)和DNA修复抑制剂。示例性化学治疗剂包含但不限于以下组：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，例如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰物、例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和萘维滨、表鬼臼毒苷、表鬼臼苦苷药剂(放线菌素、氨苯磺酸、蒽环类药物、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、细胞黄素、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺草胺甲氧嘧啶、草胺嘧啶、草胺嘧啶、草胺嘧啶、草甘膦、三氯氰菊酯、草甘膦紫杉醇、紫杉醇、替莫唑胺、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16))；抗生素、如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、阿霉素(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(线霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶可全身性代谢L-天冬酰胺、并剥夺没有能力合成其自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂、例如氮芥子气(甲氯乙胺、环磷酰胺及其类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙炔亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替帕)、烷基磺酸盐-丁硫丹、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲菌灵—(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物、例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴嗪、羟基脲、米托坦、氨基谷氨酰胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；反移民代理；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗、利妥昔单抗)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素(阿霉素)、氨水扁桃碱、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达柔比星、伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌、托泊替康、甲基氢化可的松、氢化可的松、伊立替康、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍的诱因、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素等毒素、以及胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。
使用本公开的免疫球蛋白结合蛋白(例如在抗体-药物缀合物分子中)或融合蛋白制备细胞毒性或可检测试剂的试剂和化学方法、以及相关的机理和方法，包括在Nareshkumar等人，Pharm.Res.32：3526-3540(2015)中公开的那些，其组成、方法和技术通过引用整体并入本文。可用于产生蛋白质-药物缀合物的点击化学包含在Meyer等人，Bioconjug.Chem.27(12)：2791-2807(2016)中描述的那些，并通过引用整体并入本文。
使用蛋白质-药物缀合物可递送的其他细胞毒性和可检测的试剂包含在Parslow等人，Biomedicines 4:14(2016)中公开的那些，该试剂和蛋白质-药物缀合物的设计原理通过引用并入本文。
在其他实施例中，免疫球蛋白结合蛋白包含在与标记肽结合后能够引发以下一项或多项的抗体：(a)调理作用；(b)吞噬作用；(c)抗体导向的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；(d)针对标记的免疫治疗细胞的补体导向细胞毒性(CDC)。
此外，免疫球蛋白结合蛋白可以被格式化以促进针对标记的免疫治疗细胞的细胞介导的细胞毒性。例如，在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白是双特异性的，并且能够与其结合至标记肽的同时结合(a)T细胞标志物(例如CD3)或(b)NK细胞标志物(例如CD28)，从而使标记的细胞与T细胞或NK细胞接近，以促进针对标记的细胞的细胞毒活性。在特定的实施例中，免疫球蛋白结合蛋白是双特异性的，并且包含双特异性scFv、双特异性T细胞接合子(BiTE)分子、纳米抗体、双特异抗体、DART、TandAb、sc双特异抗体、sc双特异抗体-CH3、双特异抗体-CH3、三抗体、微型抗体、微型抗体、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、sc双特异抗体-Fc、双特异抗体-Fc、串联scFv-Fc、体内抗体、Dock and Lock融合蛋白、ImmTAC、HSAbody、sc双特异抗体-HSA、串联scFv、crossMab、DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、旋钮入孔(KIH)装配体、KIH通用轻链抗体、电荷对、Fab-臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ-抗体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L、H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv cFv4-Ig、Zybody或DVI-IgG(四合一)。
在某些实施例中，标记的免疫疗法细胞先前作为移植物或移植物(例如，器官或组织移植物或移植物)施用，或用于治疗疾病例如过度增殖性疾病。如本文所用，“过度增殖性疾病”是指与正常或未患病的细胞相比过度生长或增殖。示例性的过度增殖性疾病包含肿瘤、癌症、赘生性组织、癌、肉瘤、恶性细胞、恶性前细胞、以及非肿瘤性或非恶性过度增殖性疾病(例如，腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、血管瘤、纤维化、再狭窄以及自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、炎症性肠病等)。
此外，“癌症”可以指细胞的任何加速增殖，包含实体瘤、腹水瘤、血液或淋巴瘤或其他恶性肿瘤；结缔组织恶性肿瘤；转移性疾病；器官或干细胞移植后残留疾病极少；多药耐药性癌症、原发性或继发性恶性肿瘤、与恶性肿瘤相关的血管生成或其他形式的癌症。
在任何前述实施例中，细胞表面蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、标志物或其组合。在某些实施例中，细胞表面蛋白包含标志物。在特定的实施例中，标记物包含EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
当在包含标记的免疫治疗细胞的移植或治疗后受试者证明存在与标记的免疫治疗细胞相关的一种或更多种不良反应时，例如的移植物抗宿主疾病(GvHD)、宿主抗移植物疾病(HvGD)或细胞因子释放综合征(CRS)时，可以确定消融标记的免疫治疗细胞是否必要。可能指示需要消融标记的免疫疗法细胞的症状包含，例如炎症、发烧、肺或脑水肿、血压或心率变化、健康细胞(例如白细胞)计数低、不希望有的高标记细胞的数量、细胞因子水平升高、皮疹、水疱、黄疸、腹泻、呕吐、腹部绞痛、疲劳、疼痛、僵硬、呼吸急促、体重减轻、眼睛或视力改变、口干、阴道干燥和肌肉弱点。
在用免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物处理后，可以直接或间接确定标记的免疫治疗细胞的靶向消融。例如，在某些实施例中，一种方法在消融之后还包含：(i)对受试者进行体内成像；(ii)对从受试者获得的样品进行检测方法；(iii)监测受试者中一种或更多种细胞因子(例如促炎性细胞因子，例如IL-12、IL-18或IFN-γ)的水平；(iv)在受试者或从受试者获得的样品中检测被标记的免疫治疗细胞靶向的靶细胞或组织(例如，被标记的抗CD19 CAR T细胞靶向的B细胞)的存在和/或数量)；(v)对标记的免疫治疗细胞进行体内跟踪；或(vi)其任意组合。
标记的免疫疗法细胞的体内跟踪可以例如通过使用包含以下的缀合物来进行：(i)免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白；(ii)磁性粒子、超顺磁性氧化铁(SPIO)、氟脱氧葡萄糖(18F)、荧光化合物；或其任意组合。在一些实施例中，体内跟踪包括使用MRI、PET或近红外成像。可以使用本公开的方法在体内跟踪的标记免疫治疗细胞包含T细胞、NK细胞、NK-T细胞、造血干细胞、组织细胞、间充质细胞或其任意组合。
可以通过本公开治疗的受试者通常是人类和其他灵长类动物，例如兽医用的猴子和猿猴。在任何上述实施方式中，受试者可以是人类受试者。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。根据本公开的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物可以按照医学领域技术人员确定的适合于待治疗的疾病、病症或失调的方式施用。在任何上述实施例中，本文所述的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物经静脉内、腹膜内、肿瘤内、骨髓、淋巴结或脑脊髓液施用，从而遇到待消融的标记细胞或标记免疫治疗细胞。组合物的合适剂量、合适的持续时间和施用频率将由诸如患者的状况等因素来确定；优选地，取决于患者的状况、疾病、状况或失调的大小、类型和严重性；标记的免疫治疗细胞的不良类型、水平或活性、活性成分的特定形式；以及管理方法。
还考虑了包含如本文公开的免疫球蛋白结合蛋白，融合蛋白或组合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。合适的赋形剂包含水、盐水、葡萄糖、甘油、或类似物以及其组合。在实施例中，药物组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)、5％葡萄糖水溶液，可以使用林格氏乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白或其他人血清成分。
如医学领域技术人员所确定的，可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或状况的方式施用药物组合物。组合物的合适剂量、合适的持续时间和施用频率将由一下因素确定，诸如患者的健康状况，患者的体重(即体重、质量或体表面积)，药物的类型和严重性，患者的病情，标记的免疫治疗细胞的不良类型、水平或活性，活性成分的特定形式以及施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供一种或更多种组合物(例如本文所述，包含改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解、或更长时间的无疾病和/或总体生存率、或症状严重程度的减轻)。为了预防使用，剂量应足以预防、延迟与疾病或病症相关的疾病的发作或减轻其严重性。可以通过进行临床前(包含体外和体内动物研究)和临床研究，并分析通过适当的统计学、生物学和临床方法及技术从中获得的数据，来确定根据本文所述方法施用的免疫原性组合物的预防益处，所有这些都可以由本领域技术人员容易地实践。
本文考虑的某些治疗或预防方法包括施用包含稳定整合到细胞染色体中的本文所述所需多核苷酸的宿主细胞(可以是自体的、同种异体的或同基因的)。例如，可以使用自体的、同种异体的或同基因的免疫系统细胞(例如，T细胞、抗原呈递细胞、天然杀伤细胞)离体产生这种细胞组合物，以便对受试者施用作为过继免疫疗法的所需的表达融合蛋白的T细胞组合物。在某些实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫细胞。在某些实施例中，免疫系统细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞或其任意组合。在某些实施例中，免疫系统细胞是幼稚T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任意组合。在特定的实施例中，细胞是CD4+ T细胞。
如本文所用，组合物的施用是指将其递送至受试者，而与递送的途径或方式无关。施用可以连续或间歇地和肠胃外进行。施用可以用于治疗已经被证实具有公认的病状、疾病或疾病状态的受试者，或者用于治疗易感或处于发展这种病状、疾病或疾病状态的受试者。与辅助疗法共同施用可包含以任何顺序和任何施用时间表同时和/或顺序递送多种药物(例如，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或具有一种或更多种细胞因子的组合物；免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任意组合)。
在某些实施例中，向受试者施用多种剂量的本文所述的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物，其可以以约两周至约四周的施用间隔施用。
在其他实施例中，被治疗的受试者进一步接受免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任意组合。在其他实施例中，被治疗的受试者已经接受了非清髓性或造血性造血细胞移植，其中可以在所述非清髓性的造血细胞移植后至少两至至少三个月施用所述治疗，并且其中所述移植的细胞可以可选地用包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的肽标记。
药物组合物的有效量是指在所需剂量和所需时间段内足以达到所需临床结果或有益治疗的量，如本文所述。有效量可以一次或多次施用方式递送。如果对已知或已确认患有某种疾病或疾病状态的受试者施用，则术语“治疗量”可用于治疗，而“预防有效量”可用于描述作为预防过程对易感或有患疾病或疾病状态(例如复发)的风险的受试者施用的有效量。
CTL免疫应答的水平可以通过本文所述和本领域常规实践的多种免疫学方法中的任何一种来确定。可以在施用由例如T细胞表达的本文描述的任何一种融合蛋白之前和之后确定CTL免疫应答的水平。可以使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任一种来进行用于确定CTL活性的细胞毒性测定(参见例如Henkart等人，"Cytotoxic T-Lymphocytes"in Fundamental Immunology，Paul(ed.)(2003 Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)，1127-50页，以及其中引用的参考文献)。
抗原特异性T细胞应答通常通过根据本文所述的任何T细胞功能参数(例如，增殖、细胞因子释放、CTL活性、改变的细胞表面标志物表型等)通过观察的T细胞应答的比较来确定。在适当情况下暴露于同源抗原的T细胞(例如，当由免疫相容性抗原呈递细胞呈递时用于引发或激活T细胞的抗原)与来自相同来源群体的T细胞之间产生的结构上不同或无关的对照抗原。具有统计学显著性的对同源抗原的应答大于对对照抗原的应答表示抗原特异性。
可以从受试者获得生物学样品，以确定如本文所述的对标记的蛋白质或细胞的免疫应答的存在和水平。本文所用的“生物样品”可以是血液样品(可以从中制备血清或血浆)、活检样品、体液(例如肺灌洗液、腹水、粘膜洗涤液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或受试者或生物学来源的任何其他组织或细胞制剂。也可以在接受任何免疫原性组合物之前从受试者获得生物样品，该生物样品可用作建立基线(即免疫前)数据的对照。
本文所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶或小瓶中。这样的容器可以冷冻直到保持制剂的稳定性。在某些实施例中，单位剂量包含约107细胞/m2至约1011细胞/m2的本文所述的重组宿主细胞。开发用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案，包含例如肠胃外或静脉内施用或制剂。
如果本公开的组合物肠胃外施用，则该组合物还可包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂包含水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液可还包含一种或更多种缓冲剂，例如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料应是药学上纯的，并且在使用量上基本上是无毒的。另外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和制剂中。如本文所用，剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为待治疗受试者的单位剂量；每个单元可包含预定量的重组细胞或活性化合物，所述重组细胞或活性化合物经计算可与合适的药物载体结合产生期望的效果。
通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗或预防益处的量提供活性分子或细胞。与未治疗的受试者相比，可以通过在治疗的受试者中建立改善的临床结果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病生存期)来监测这种反应。预先存在的针对肿瘤蛋白的免疫反应的增加通常与改善的临床结果相关。通常可以使用本领域中常规的标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法来评估此类免疫应答，并且可以使用在治疗之前和之后从受试者获得的样品来进行此类免疫应答。
根据本公开的方法可以还包含在联合疗法中施用一种或更多种其他药剂来治疗疾病或病症。例如，在某些实施例中，组合疗法包含与免疫检查点抑制剂(一同、同时或按顺序)一起施用免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白(或表达相同的工程宿主细胞)或组合物。在一些实施例中，组合疗法包含将本公开的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、宿主细胞或组合物(或表达它们的工程宿主细胞)与刺激性免疫检查点剂的激动剂一起施用。在其他实施例中，组合疗法包含将本公开的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、宿主细胞或组合物(或表达其的工程宿主细胞)与第二种疗法，例如化学治疗剂、放射疗法、手术、抗体或其任意组合。
如本文所用，术语“免疫抑制剂”或“免疫抑制剂”是指提供抑制信号以帮助控制或抑制免疫应答的一种或更多种细胞、蛋白质、分子、化合物或复合物。例如，免疫抑制剂包含那些部分或全部阻断免疫刺激，减少、预防或延迟免疫激活；或增加、激活或上调免疫抑制的分子。靶向的示例性免疫抑制剂(例如，带有免疫检查点抑制剂)包含PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G(CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制细胞因子(例如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精氨酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg细胞或其任意组合。
免疫抑制剂抑制剂(也称为免疫检查点抑制剂)可以是化合物、抗体、抗体片段或融合多肽(例如Fc融合物，例如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反义分子、核酶或RNAi分子、或低分子量有机分子。在本文公开的任何实施例中，方法可以包括将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程化宿主细胞)与以下免疫抑制成分中的任一种的一种或更多种抑制剂单独或以任何组合施用。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、宿主细胞或与PD-1抑制剂例如PD-1特异性抗体或其结合片段结合使用的组合物，例如pidilizumab、nivolumab(Keytruda，以前为MDX-1106)、派姆单抗(Opdivo，以前为MK-3475)、MEDI0680(以前为AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任意组合。在其他实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、宿主细胞或组合物与PD-L1特异性抗体或其结合片段结合使用，例如BMS-936559、durvalumab(MEDI4736)、atezolizumab(RG7446)、avelumab(MSB0010718C)、MPDL3280A或其任意组合。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、宿主细胞或组合物与LAG3抑制剂例如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任意组合组合使用。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白，融合蛋白，宿主细胞或组合物与CTLA4的抑制剂组合使用。在特定实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白，融合蛋白，细胞或组合物与CTLA4特异性抗体或其结合片段组合使用，例如易普利姆玛、特美历姆玛(tremelimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白(例如，阿巴西普、贝拉西普)、或其任意组合。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与B7-H3特异性抗体或其结合片段(例如依诺单抗(MGA271)，376.96或两者)组合使用。B7-H4抗体结合片段可以是scFv或其融合蛋白，例如在Dangaj等人，Cancer Res.73：4820，2013、以及美国专利第9,574,000号和PCT专利公开第WO 2016/40724和WO 2013/025779号中所述的那些。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与CD244的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与BLTA、HVEM、CD160或其任何抑制剂的抑制剂组合使用。抗CD-160抗体描述于例如PCT公开号WO 2010/084158。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与TIM3的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与Gal9的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与腺苷信号传导抑制剂(例如诱饵腺苷受体)组合使用。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与A2aR抑制剂组合使用。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与KIR抑制剂(例如lirilumab(BMS-986015))组合使用。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与抑制性细胞因子(通常是除TGFβ以外的细胞因子)或Treg发育或活性的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与IDO抑制剂例如左-1-甲基色氨酸、依帕多司他(IDCB024360；Liu等人，Blood 115：3520-30，2010)，ebselen(Terentis等人，Biochem.49：591-600，2010)、吲哚美莫、NLG919(Mautino等人，2013American Association for Cancer Research年第104届年会，2013年4月6日至10日)、1-甲基色氨酸(1-MT)-tira-pazamine或其任意组合。
在某些实施例中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与精氨酸酶抑制剂例如N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羟基结合使用-nor-l-精氨酸(nor-NOHA)、L NOHA、2(S)-氨基-6-硼代己酸(ABH)、S-(2-硼代乙基)-L-半胱氨酸(BEC)或其任意组合。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与VISTA的抑制剂例如CA-170(Curis，Lexington，Mass)组合使用。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与TIGIT的抑制剂联合使用，例如COM902(Compugen，多伦多，加拿大安大略省)、CD155的抑制剂(例如COM701(Compugen))或两者。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与PVRIG、PVRL2或两者的抑制剂组合使用。抗PVRIG抗体描述于例如PCT公开号WO 2016/134333。抗PVRL2抗体描述于例如PCT公开号WO 2017/021526。
在某些实施例中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与LAIR1抑制剂组合使用。
在某些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5或其任何抑制剂的抑制剂组合使用。
在某些实施方案中，将免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与增加刺激性免疫检查点分子的活性(即是激动剂)的试剂组合使用。例如，免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物可以与CD137(4-1BB)激动剂(例如urelumab)、CD134(OX-40)激动剂(例如(例如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、来那度胺、泊马利度胺、CD27激动剂(例如CDX-1127)、CD28激动剂(例如TGN1412、CD80或CD86)、CD40激动剂(例如CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122激动剂(例如IL-2)、GITR激动剂(例如PCT专利公开号WO 2016/054638)中所述的人源化单克隆抗体)、ICOS(CD278)的激动剂(例如GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8或其任意组合)。
在本文公开的任何实施方案中，方法可包括单独或以任何组合施用免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物与刺激性免疫检查点分子的一种或多种激动剂，单独或组合地包括任何前述物质。
在某些实施方案中，联合疗法包括免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物、以及二次疗法，其包含以下一种或多种：对非抗原表达的癌症抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段、发炎的实体瘤、放射治疗、手术、化学治疗剂、细胞因子、RNAi或其任何组合。
在某些实施方案中，组合疗法方法包括给予免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物，并且还包括给予放射治疗或手术。放射疗法包括例如X射线疗法，例如γ射线疗法、以及放射药物疗法。适合于治疗受试者中给定的癌症或非发炎的实体瘤的手术和外科技术是本领域普通技术人员众所周知的。
在某些实施例中，组合疗法方法包括施用免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白、细胞或组合物，并且还包含施用化学治疗剂。化学治疗剂包含但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、DNA破坏剂、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰类似物)、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(例如嵌入剂)和DNA修复抑制剂。示例性化学治疗剂包含但不限于以下组：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，例如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰物、例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和萘维滨、表鬼臼毒苷、表鬼臼苦苷药剂(放线菌素、氨苯磺酸、蒽环类药物、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、细胞黄素、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺草胺甲氧嘧啶、草胺嘧啶、草胺嘧啶、草胺嘧啶、草甘膦、三氯氰菊酯、草甘膦紫杉醇、紫杉醇、替莫唑胺、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16))；抗生素，如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、阿霉素(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(线霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶可全身性代谢L-天冬酰胺、并剥夺没有能力合成其自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂，例如氮芥子气(甲氯乙胺、环磷酰胺及其类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙炔亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替帕)、烷基磺酸盐-丁硫丹、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲菌灵—(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物、例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴嗪、羟基脲、米托坦、氨基谷氨酰胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；反移民代理；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗、利妥昔单抗)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素(阿霉素)、氨水扁桃碱、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达柔比星、伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌、托泊替康、甲基氢化可的松、氢化可的松、伊立替康、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍的诱因、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素等毒素、以及胱天蛋白酶激活剂；和染色质破坏剂。
细胞因子用于操纵宿主针对抗癌活性的免疫反应。参见例如Semin&Floros&Tarhini.Oncol.42(4)：539-548，2015。可用于促进免疫抗癌或抗肿瘤反应的细胞因子包括例如IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24和GM-CSF单个或与表达本公开内容的结合蛋白或细胞的任意组合。
实例
实例1
抗STII单克隆抗体的开发与表征
使用常规免疫和杂交瘤方法开发了
Figure BDA0002402858610000441
(“STII”)特异性mAb。简而言之，抗STII单克隆抗体杂交瘤克隆4E2、5G2和3E8是通过用与KLH载体偶联的单个STII肽或STII肽的与马来酰亚胺序列(Ac-C(dPEG4)NWSHPQFEK-酰胺(SEQ ID NO：50)、H2N-CGNWSHPQFEK-酰胺(SEQ ID NO：51)、H2N-CGNWSHPQFEKGC-OH(SEQ ID NO：52))的组合免疫10-12周龄雌性小鼠(BALB/c或CD1或Swiss Webster或B57BL/6)而产生的。在使用弗氏完全/不完全或佐剂佐剂的12周加强方案后，从高滴度小鼠中分离脾细胞，并电融合至FoxNY骨髓瘤(BTX，哈佛仪器)。使用ClonePix2(Molecular Devices)集落选择器鉴定并分离分泌肽特异性抗体的杂交瘤。使用细胞计数珠阵列，通过流式细胞术验证来自挑选出的克隆的抗体的肽结合能力，该阵列携带有马来酰亚胺偶联至BSA载体蛋白的STII肽。使用ClonePix2选择器将所选的杂交瘤细胞克隆亚克隆，并反复验证肽结合。从每个克隆(4E2、5G2和3E8)衍生的多个亚克隆中鉴定出编码IgG的DNA序列。然后，进一步在体外和体内对来自杂交瘤的亲和纯化IgG进行表征。
首先，在体外测试抗体与含有一个(CD19-1ST-4-1BBζ)、三个(CD19-3ST-4-1BBζ)或零个(CD19-4-1BBz)STII标记的CAR T细胞的特异性结合。还测试了通过单独免疫获得的STII单克隆抗体4C4和3C9。使用STII特异性mAb(5G2、4E2、3E8、4C4、3C9)或市售的STII特异性抗体(Genscript)然后是FITC偶联的山羊抗小鼠第二抗体对CD19 Strep-tag CAR T细胞(1ST-4-1BBζ和3ST-41BBζ)和对照细胞(CD19-4-1BBζ)染色。参见图1A。这些结果表明，本公开的STII mAb特异性靶向STII标记的蛋白，例如STII标记的CAR T细胞。
使用小鼠同种分型试剂盒(IsoStripTM，Sigma-Aldrich)确定5G2和4E2 mAb的同种型。结果显示5G2 mAb是IgG2b，而4E2 mAb是IgG2a(图1B)。
实例2
体内靶向STII标记的CAR T细胞
STII特异性抗体可用于改善采用STII标记的CAR T细胞的疗法。为了测试STII特异性抗体是否可以减少或逆转与CAR T活性相关的不良副作用，设计了体内B细胞耗竭试验(图2A)，其中CD45.2+ C57/BL6小鼠接受了亚致死辐射(6Gy TBI)和输注5x106 CD45.1+STII标记的(1STII或3STII)抗CD19-CD28ζ_EGFRtCAR T细胞，以诱导B细胞发育不良。在第+37和+42天，将小鼠用抗STII 5G2 mAb或西妥昔单抗(靶向STII-CAR转导标记EGFRt)治疗1mg/小鼠，腹腔注射。如图2B所示，在将转导的细胞输注到受体小鼠中之前，使用流式细胞术在转导后7天测量小鼠T细胞中的EGFRt和STII-CAR表达。这些数据表明1STII-CAR和3STII-CAR构建体均由T细胞表达。
然后根据图2A所示的时间表对小鼠进行治疗。在整个研究过程中，通过流式细胞仪监测健康和治疗小鼠的PBMC中的T和B细胞计数。图2C显示了接受辐射和抗CD19-1STIICAR T细胞并进行抗体治疗的小鼠的B细胞恢复。图2D示出了接受放射和抗CD19-3STII CART细胞并随后进行抗体治疗的小鼠的B细胞恢复。
简而言之，所有组的小鼠在第1天接受6Gy TBI。未治疗组：仅对小鼠进行辐照，不接受任何T细胞输注；mCD19 CAR组：在第1天给小鼠注入mCD19-1STII-CD28z或mCD193STII-CD28z CAR T细胞，并且未接受抗体治疗；西妥昔单抗组：小鼠在第1天接受mCD19II-1ST-CD28z或抗CD3STII-CD28z CAR T细胞，在第35天和第42天接受西妥昔单抗(1毫克/小鼠，腹腔注射)；5G2组：小鼠在第1天接受mCD19-1STII-CD28z或mCD19-3STII-CD28z CAR T细胞，并在第35天和第42天接受抗STII 5G2 mAb(1mg/小鼠，腹腔注射)。
结果表明，抗STII单克隆抗体能够像西妥昔单抗一样有效地挽救mCD19-STIICAR-T细胞诱导的B细胞发育不全，西妥昔单抗将靶向标志物EGFRt靶向于CAR-T细胞。
实施例3
STII标记的CAR T细胞的功能刺激
抗STII单克隆抗体也可用于刺激标记的CAR T细胞。例如，在将标记的CAR T细胞输注到患者体内作为免疫疗法之前。CD19-1STII CAR T细胞(CD28z或4-1BBz)使用表达抗原的Raji细胞，抗体包被的微米珠(0.1μg/0.3μg或0.5μg的抗STII或抗STII和抗CD28，均为0.3μg)。对照是仅在无抗原(培养基)的培养基中的CD19-1STII CAR T细胞。使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞。通过FACS测量增殖。如图3A所示，与单独的培养基相比，抗STII包被的微米珠刺激增殖，最低水平的抗STII mAb具有最大的作用。测量了受刺激的CAR T细胞产生的细胞因子。如图3B所示，CAR T细胞产生的IL-2和IFN-γ随抗STII mAb的存在而增加。细胞因子产生的最高水平是由使用抗STII/抗CD28涂层的微米珠刺激的细胞产生的。
实施例4
带有STII标记的CAR T细胞的扩展
为了进一步研究抗STII mAb对引发标记的免疫治疗细胞的有用性，使用包被有抗STII mAb的微米珠或与抗CD28抗体组合的微米珠对含CD8+和CD4+ STII的CAR T细胞进行3次刺激。
如图4A所示，每一轮刺激均导致T细胞群体的实质性扩增。涂有抗STII和抗CD28的微米珠具有最大的作用，并且CD4+ CAR T细胞的扩增大于CD8+细胞。
实施例5
受刺激的STII标记的CAR T细胞的表征
检查了CAR T细胞(刺激前、或第一次、第二次或第三次刺激后；见实施例4)的STII表达以及T细胞成熟、活化或抑制的几种标志物(CD45RO、CD62L、CD28、CTLA4和PD1)。使用每种标志物的抗体对细胞进行染色，然后进行流式细胞术。数据示于图4B。
令人惊讶的是，即使在第二和第三刺激之后，与刺激前细胞相比，受刺激的细胞显示出所有标志物的相似或什至减少的表达。这些数据表明，使用本公开的抗STII mAb可以在体外有效地扩增和刺激标记的CAR T细胞，而不会增加T细胞抑制或衰竭的风险。
可以将上述各种实施例组合以提供其他实施例。本说明书中提及的和/或美国临时专利申请第62/555,017号和/或申请数据表列出有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容通过引用并入本文中。必要的话可以修改实施例的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念以提供其他实施例。
可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施例，而是应解释为包含所有可能的实施例以及等同物的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110> 弗雷德哈钦森癌症研究中心
刘凌峰
S·R·里德尔
B·霍夫斯特龙
<120> STREP-TAG特异性结合蛋白及其用途
<130> 360056.451WO
<140> PCT
<141> 2018-09-06
<150> US 62/555,017
<151> 2017-09-06
<160> 52
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VH
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagac tgggggaggc tttgtgaagc ctggaggctc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc atcaccagtg atggcggtgg cacccactat 180
ccagatactg tgaagggccg attcaccatc tccagagact ttgccaaaaa caccctgtac 240
ctgcagatga gcagtctgag gtctgaggac acagcctggt atttctgtgc aagacatgag 300
ccccgactga tagcctggtt tgctcactgg ggccaaggaa ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VH
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VL
<400> 3
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1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VL
<400> 4
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctct 60
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tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acgaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 3E8 scFv
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
165 170 175
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser
180 185 190
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 6
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 3E8 scFv
<400> 6
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1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<220>
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ggtgagaaat tcaagggcca ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagacgctat 300
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 5G2 VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
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Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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<213> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
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Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
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Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 12
<211> 247
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<213> 人工序列
<220>
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Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
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Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
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Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
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Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<211> 360
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atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagacgctat 300
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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245
<210> 18
<211> 247
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 4E2 scFv
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115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu Lys
180 185 190
Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Strep-Tag II
<400> 19
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1 5
<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Gly3Ser)2接头
<400> 21
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 22
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 23
Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 HCDR3
<400> 24
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His
1 5 10
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR1
<400> 25
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1 5 10 15
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR2
<400> 26
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR3
<400> 27
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1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 28
Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 HCDR2
<400> 29
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 HCDR3
<400> 30
Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR1
<400> 31
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR2
<400> 32
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR3
<400> 33
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR1
<400> 34
Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR2
<400> 35
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR3
<400> 36
Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR1
<400> 37
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR2
<400> 38
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR3
<400> 39
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列P2A
<400> 40
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列P2A mod
<400> 41
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列T2A
<400> 42
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列T2A mod
<400> 43
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 44
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列E2A
<400> 44
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列E2A mod
<400> 45
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列F2A
<400> 46
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列F2A mod
<400> 47
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Strep-tag
<400> 48
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Gly3Ser)2Gly2Ser接头
<400> 49
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列重组ST肽
<220>
<221> 乙酰化
<222> 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> dPEG4
<220>
<221> 酰胺化
<222> 10
<400> 50
Cys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列重组ST肽
<220>
<221> 酰胺化
<222> 11
<400> 51
Cys Gly Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列重组ST肽
<400> 52
Cys Gly Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Cys
1 5 10

Claims (110)

1.一种免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合蛋白包含与标记肽特异性结合的结合结构域，所述标记肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或由其组成，并且所述结合结构域包含：
(a)VL结构域，包含：
i.SEQ ID NO：31所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：32所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：33所示的CDR3氨基酸序列或其变体；
ii.SEQ ID NO：25所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：26所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：27所示的CDR3氨基酸序列或其变体；或者
iii.SEQ ID NO：37所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：38所示的CDR2氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：39所示的CDR3氨基酸序列或其变体、以及VH结构域；或者
(b)VH结构域，包含：
i.SEQ ID NO：28所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：29所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：30所示的CDR3氨基酸序列或其变体；
ii.SEQ ID NO：22所示的CDR1氨基酸序列或其变体，SEQ ID NO：23所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：24所示的CDR3氨基酸序列或其变体；或者
iii.SEQ ID NO：34所示的CDR1氨基酸序列或其变体、SEQ ID NO：35所示的CDR2氨基酸序列或其变体、以及SEQ ID NO：36所示的CDR3氨基酸序列或其变体，和VL结构域；或者
(c)(a)的VL结构域以及(b)的VH结构域。
2.根据权利要求1的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述VL结构域包含与SEQ ID NO：3、SEQID NO：10和SEQ ID NO：16中任一个所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且所述VH结构域包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14中任一个所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述VL包含SEQ ID NOS：10、SEQ IDNOS：3和SEQ ID NOS：16中任一项所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述VH包含SEQ IDNOS：8、SEQ ID NOS：2和SEQ ID NOS：14中的任何一个所示的氨基酸序列或由其组成。
4.根据权利要求3的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述VL包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述VH包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成。
5.根据权利要求3的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述VL包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述VH包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成。
6.根据权利要求3的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述VL包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述VH包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由其组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中所述免疫球蛋白结合蛋白包含抗体或其抗原结合部分。
8.根据权利要求7的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体5G2。
9.根据权利要求7的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体3E8。
10.根据权利要求7的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体4E2。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白是嵌合的、人源化的或者人的抗体或其抗原结合部分。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合结构域包含scFv、串联scFv、scFv-Fc、串联scFv-Fc、scFv二聚体、scFv拉链、双特异抗体、双特异抗体-Fc、双特异抗体-CH3、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc、sc双特异抗体-CH3、纳米抗体、微型抗体、微抗体、三抗体、四抗体、Fab、F(ab)'2、scFab、Fab-scFv、Fab-scFv-Fc、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv2、双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子、DART、旋钮入孔(KIH)装配体、scFv-CH3-KIH装配体、KIH通用轻链抗体、TandAb、三抗体、TriBi微型抗体、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv2、四价HCab、体内抗体、CrossMab、双重作用Fab(DAF)(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、电荷对、Fab-臂交换、SEED抗体、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ-抗体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L、H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody或DVI-IgG(四合一)。
13.根据权利要求12的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合结构域包含scFv，并且所述该scFv包含单克隆抗体3E8的VL和VH。
14.根据权利要求13的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：5或SEQID NO：6的氨基酸序列或由其组成。
15.根据权利要求12的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合结构域包含scFv，并且该scFv包含单克隆抗体5G2的VL和VH。
16.根据权利要求15的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：11或SEQID NO：12的氨基酸序列或由其组成。
17.根据权利要求12的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合结构域包含scFv，并且该scFv包含单克隆抗体4E2的VL和VH。
18.根据权利要求17的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：17或SEQID NO：18的氨基酸序列或由其组成。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白包含多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白包含与所述标记肽特异性结合的结合域以及与并非所述标记肽的至少一个靶标特异性结合的结合域。
20.根据权利要求19的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述多特异性结合蛋白包含双特异性结合蛋白。
21.根据权利要求19或20的免疫球蛋白结合蛋白，其中，并非所述标记肽的所述至少一个靶标是免疫细胞标志物。
22.根据权利要求21所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述免疫细胞标志物是CD3或CD16。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述结合域包含双特异性scFv。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白是多价的。
25.根据权利要求24所述的免疫球蛋白结合蛋白，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白是二价的。
26.一种融合蛋白，其包括包含权利要求1-25中任一项所述的结合结构域的细胞外组分以及包含效应子结构域的细胞内组分，其中所述细胞外组分和细胞内组分通过跨膜结构域连接。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域包含scFv，并且所述细胞外组分还包含具有铰链的连接区。
28.根据权利要求26或27所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含嵌合抗原受体。
29.根据权利要求1-25中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，或权利要求26-28中任一项所述的融合蛋白，还包含细胞毒性剂、放射性同位素、放射性金属或可检测剂。
30.一种组合物，包含(a)权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或(b)权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白、以及药学上可接受的载体或赋形剂。
31.一种分离的多核苷酸，编码(a)权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或(b)权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸，其包含：
(a)多核苷酸，与SEQ ID NOS：1、SEQ ID NOS：7和SEQ ID NOS：13中的任一者中所述的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的同一性；和/或
(b)多核苷酸，与SEQ ID NOS：4、SEQ ID NOS：9和SEQ ID NOS：15中的任一者中所述的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的同一性。
33.根据权利要求31或32所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸针对包含所述多核苷酸的宿主细胞进行了密码子优化。
34.一种表达构建体，包含与表达控制序列可操作连接的权利要求31-33中任一项所述的多核苷酸。
35.一种载体，其包含权利要求3所述4的表达构建体。
36.根据权利要求35所述的载体，其中，所述载体是质粒载体或病毒载体。
37.根据权利要求36所述的载体，其中，所述载体是病毒载体，并且所述病毒载体选自慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
38.一种宿主细胞，包含权利要求31-33中任一项所述的多核苷酸或权利要求34的表达构建体，其中，所述多核苷酸或所述表达构建体编码所述免疫球蛋白结合蛋白或所述融合蛋白，并且所述宿主细胞表达编码的所述免疫球蛋白结合蛋白或编码的所述融合蛋白。
39.一种鉴定标记细胞或标记细胞群的方法，所述标记细胞或标记细胞群在细胞表面上表达包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列或由其组成的标记肽，该方法包括：
(i)使来自包含一种或更多种标记细胞的受试者的样品与权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白接触；和
(ii)检测所述免疫球蛋白结合蛋白或所述融合蛋白与所述一种或更多种标记细胞的特异性结合，从而鉴定出表达所述标记肽的一种或更多种细胞。
40.一种从受试者富集或分离标记细胞或标记细胞群的方法，该方法包括：
(i)使来自包含一种或更多种细胞的受试者的样品与权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白接触，所述一种或更多种细胞在细胞表面上表达包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的标记肽；和
(ii)选择或分选与所述免疫球蛋白结合蛋白或所述融合蛋白特异性结合的一种或更多种标记细胞，从而富集或分离表达所述标记肽的一种或更多种细胞。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述细胞表面标记肽包含在细胞表面蛋白中。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、标志物或其组合。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含标志物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白包含可检测部分。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述可检测部分包含酶、染料、荧光标签或肽标记中的一种或更多种，条件是所述肽标记不包含SEQ ID NO：19中所述的氨基酸序列或由其组成。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述可检测部分包含所述酶，并且所述酶包含生色报告酶。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述生色报告酶包含辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，所述可检测部分包含所述染料。
50.根据权利要求46所述的方法，其中，所述可检测部分包含所述荧光标签。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述荧光标签物包含花青染料、香豆素、若丹明、氧杂蒽、荧光素或其磺化衍生物、荧光蛋白或其任意组合。
52.根据权利要求46所述的方法，其中，所述可检测部分包含肽标记，并且所述肽标记包含His标记或Myc标记。
53.根据权利要求46所述的方法，其中，所述可检测部分包含荧光部分。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述荧光部分是PE、太平洋蓝、Alexa fluor、APC或FITC。
55.根据权利要求39-54中任一项所述的方法，其中，使用流式细胞术对所述标记细胞或标记细胞群进行鉴定、检测或分类。
56.根据权利要求39-55中任一项所述的方法，其中，通过磁柱色谱法从所述样品的其他组分富集或分离与所述免疫球蛋白结合蛋白或所述融合蛋白特异性结合的标记细胞或标记细胞群。
57.根据权利要求39-56中任一项所述的方法，其中，所述样品是血液。
58.根据权利要求39-56中任一项所述的方法，其中，所述样品是组织。
59.根据权利要求39-58中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
60.一种活化免疫细胞的方法，所述免疫细胞被修饰以在其细胞表面上表达标记肽，所述标记肽包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列或由其组成，该方法包括在足以诱导所述经修饰免疫细胞活化的条件和时间下，使所述经修饰免疫细胞与权利要求1 25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白接触。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述经修饰免疫细胞的活化在体外或离体进行。
62.根据权利要求60或61所述的方法，还包括在富集或分离之前扩增所述样品中的活化免疫细胞群的步骤。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中，所述标记肽包含在由所述经修饰免疫细胞表达的细胞表面蛋白中。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述标记的细胞表面蛋白包含CAR、TCR、标志物或其组合，可选地，其中所述标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的方法，其中，表达所述标记肽的细胞包含人T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
66.根据权利要求39-65中任一项所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于固体表面。
67.根据权利要求39-66中任一项所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于微米珠或纳米珠。
69.一种用于局部激活经修饰免疫细胞的体内方法，该方法包括向受试者施用：
(i)基质组合物或装置，包括：
(a)权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白，和
(b)对共刺激分子具有特异性的结合多肽；以及
(ii)在其细胞表面表达标记肽的经修饰免疫细胞，所述标记肽包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列或由其组成，其中所述标记肽包含在CAR、TCR、标志物或其组合中，可选地，其中所述标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt，
其中子部分(i)的基质组合物(a)与细胞表面标记肽的结合激活所述经修饰免疫细胞。
70.根据权利要求69的方法，其中，所述基质组合物包含藻酸盐、基底膜基质或生物聚合物。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中，所述经修饰细胞是T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
72.一种促进细胞增殖的方法，该方法包括在足以允许标记细胞增殖的条件和时间下，使表达包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列或由其组成的标记肽的细胞与以下物质接触：
(a)权利要求1-29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白，和
(b)生长因子细胞因子。
73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于固体表面。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于平面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白附着于微米珠或纳米珠。
76.根据权利要求72-75中任一项所述的方法，其中，所述生长因子细胞因子包含IL-12、IL-15或两者。
77.根据权利要求75-76中任一项所述的方法，其中，所述方法还包含将所述细胞与抗CD27结合蛋白、抗CD28结合蛋白、抗CD137结合蛋白、抗OX40结合蛋白或其任意组合一起孵育，其中这些结合蛋白中的一种或更多种附着在固体表面上。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述抗CD27结合蛋白、抗CD28结合蛋白、抗CD137结合蛋白、抗OX40结合蛋白或其任意组合附着在平坦表面、琼脂糖、树脂、3D织物基质或珠子。
79.根据权利要求72-78中任一项所述的方法，其中，所述增殖是在体内或离体诱导的。
80.根据权利要求72-79中任一项所述的方法，其中，所述细胞是T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述细胞是经功能性修饰T细胞。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述经功能性修饰T细胞是病毒特异性细胞、肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、效应T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞。
83.根据权利要求72-76中任一项所述的方法，其中，所述标记肽包含在由所述细胞表达的细胞表面蛋白中。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含CAR、TCR、标志物或其组合；可选地，其中所述标志物选自EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
85.根据权利要求72-84中任一项所述的方法，其中，所述增殖是在体外或离体诱导的。
86.一种体内成像方法，该方法包括：
(a)对已接受经修饰细胞的受试者施用以下一种或更多种，所述经修饰细胞表达包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列或由其组成的标记肽：
(i)权利要求1-25或29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，或
(ii)权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白，
其中所述免疫球蛋白结合蛋白或融合蛋白还包含适于体内成像的可检测部分；和
(b)对受试者进行成像。
87.根据权利要求86所述的方法，其中，所述可检测部分包含放射性示踪剂。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，所述放射性示踪剂是68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F或124T。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中，所述成像包括正电子发射断层扫描(PET)。
90.根据权利要求86-89中任一项所述的方法，其中，所述结合结构域包含抗体的抗原结合片段，并且所述抗原结合片段是scFv、串联scFv、scFv-Fc、scFv二聚体、scFv拉链、双特异抗体、微型抗体、三抗体、四抗体、Fab、F(ab)'2、scFab、微型抗体、纳米抗体、纳米抗体-HAS、双特异性T细胞抗体(BiTE)、DART、sc双特异抗体、sc双特异抗体-CH3或scFv-CH3旋钮入孔(KIH)装配体。
91.一种标记的免疫治疗细胞的靶向消融方法，包括在足以引起标记的免疫治疗细胞消融的条件和时间下对受试者施用：
(a)权利要求1-25或29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白；
(b)权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白；或者
(c)权利要求30所述的组合物，
其中所述受试者先前已被施用表达细胞表面蛋白的标记免疫治疗细胞，所述细胞表面蛋白包含标记肽，所述标记肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或由其组成，
其中所述免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物能够在结合所述标记肽后直接或间接诱导细胞死亡。
92.根据权利要求91所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物包含细胞毒性剂。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白包含能够在结合所述标记肽后针对所述标记的免疫治疗细胞引发以下一种或更多种的抗体：
(a)调理；
(b)吞噬作用；
(c)抗体导向的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；和
(d)补体导向的细胞毒性(CDC)。
94.根据权利要求93所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白是双特异性的，并且能够在结合所述标记肽的同时与(a)T细胞标志物或(b)NK细胞标志物结合。
95.根据权利要求94所述的方法，其中，所述T细胞标志物是CD3，或者所述NK细胞标志物是CD16。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合蛋白包含双特异性scFv、双特异性T细胞接合剂(BiTE)分子、纳米抗体、双特异抗体、DART、TandAb、sc双特异抗体、sc双特异抗体-CH3、双特异抗体-CH3、三抗体、微型抗体、微型抗体、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、sc双特异抗体-Fc、双特异抗体-Fc、串联scFv-Fc、体内抗体、对接锁定融合蛋白、ImmTAC、HAS抗体、sc双特异抗体-HAS、串联scFv、crossMab、DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG，旋钮入孔(KIH)装配体、KIH通用轻链抗体、电荷对、Fab-臂交换、SEED抗体、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ抗体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4–Ig、Zybody或DVI-IgG(四合一)。
97.根据权利要求91-96中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含CAR、TCR、标志物或其组合。
98.根据权利要求91-97中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含标志物蛋白。
99.根据权利要求98所述的方法，其中，所述标志物蛋白是EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
100.根据权利要求91-99中任一项所述的方法，其中，将所述免疫球蛋白结合蛋白、融合蛋白或组合物施用于具有与所述标记的免疫治疗细胞的存在相关的至少一种不良事件的受试者。
101.根据权利要求91-100中任一项所述的方法，还包括在所述消融之后：
(i)对根据权利要求86-90中任一项所述的受试者进行体内成像；
(ii)在从所述受试者获得的样品中进行权利要求39-59中任一项所述的检测方法；
(iii)监测所述受试者中一种或更多种细胞因子的水平；
(iv)在受试者或从受试者获得的样品中检测被标记的免疫治疗细胞靶向的靶细胞或组织的存在和/或数量；
(v)对标记的免疫治疗细胞进行体内跟踪；或者
(vi)其任意组合。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述体内跟踪包含与以下物质偶联使用的所述免疫球蛋白结合蛋白或所述融合蛋白：磁性颗粒；和超顺磁性氧化铁(SPIO)；氟脱氧葡萄糖(18F)；荧光化合物；或其任意组合。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中，所述体内跟踪包括使用MRI、PET或近红外成像。
104.根据权利要求91-103中任一项所述的方法，其中，所述标记的免疫治疗细胞包含T细胞、NK细胞、NK-T细胞、造血干细胞、组织细胞、间充质细胞或其任意组合。
105.根据权利要求91-104中任一项所述的方法，其中，所述受试者在经历包含一种或更多种标记的免疫疗法细胞的移植后患有或被怀疑患有移植物抗宿主疾病(GvHD)、宿主抗移植物疾病(HvGD)或细胞因子释放综合征(CRS)。
106.一种试剂盒，包含：
(a)编码标志物肽的表达载体或多核苷酸、以及用于将该载体或多核苷酸转导至宿主细胞的任选试剂，所述标记肽包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列或由其组成；和
(b)(i)权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，
(ii)权利要求23-29中任一项所述的融合蛋白，
(iii)权利要求30所述的组合物，
(iv)权利要求31-33中任一项所述的分离的多核苷酸或权利要求34-37中任一项所述的表达载体、以及用于将所述多核苷酸或表达载体转导到宿主细胞中的任选试剂，和/或
(v)权利要求38所述的宿主细胞。
107.基质组合物，包含：
(i)包含权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白的基质组合物；和
(ii)特异性结合免疫共刺激分子的结合多肽，其中该结合提高所述免疫共刺激分子的活性水平。
108.根据权利要求107所述的基质组合物，其还包含藻酸盐、基膜基质、或生物聚合物、或其任意组合。
109.一种装置，包含：
(i)权利要求1-25和29中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白，或权利要求26-29中任一项所述的融合蛋白；和
(ii)特异性结合免疫共刺激分子的结合多肽，其中该结合提高所述免疫共刺激分子的活性水平。
110.根据权利要求109所述的装置，其中，(i)和(ii)之一或两者均布置在固体表面、琼脂糖珠、树脂、3D织物基质或珠子上。
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