CN111057188A - 一种双重标记荧光微球的制备方法 - Google Patents

一种双重标记荧光微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双重标记荧光微球的制备方法，以苏丹红Ⅰ(AS)和铕(Eu)为荧光标记物，制备出具有双重标记的表面羧基功能化的荧光微球。微球在无激发光激发的状态下呈现橙黄色，而360nm紫外线激发下发出红色荧光。两种标记物分别可提供470nm处紫外吸收和615nm处荧光作为检测信号。通过控制两种标记物的含量，可以制备出双重信号标记功能的微球，在生物分子检测、药物筛选等领域提供帮助。

Description

一种双重标记荧光微球的制备方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种双重标记荧光微球的制备方法。
背景技术
荧光微球在生命科学、医学等领域得到广泛的应用，如抗原检测，为抗原分型、药物筛选，等高通量检测。但是传统的有机荧光分子由于荧光发射峰宽而不对称，不同荧光分子之间易因发射峰重叠而造成干扰，一定程度上限制了荧光微球的应用。虽然现在也有技术将部分稀土元素作为荧光分子，具有荧光量子产率高、发射峰窄、荧光寿命长等优点，但是由于掺杂多种稀土配合物而造成各荧光信号减弱。
为了进一步增加荧光微球的可编码范围，同时减少稀土造成的荧光信号减弱影响，我们提供一种新的方案为荧光标记物，制备这种双重标记的荧光微球。
发明内容
本发明目的是提供一种双重标记荧光微球的制备方法，可以制备出双重信号标记功能的微球，在生物分子检测、药物筛选等领域提供帮助。
为解决上述问题，本发明提供一种双重标记荧光微球的制备方法，包括：
将苯乙烯放入带机械搅拌器的三口瓶中，然后加入水，加热搅拌；水浴升温至大于等于70℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球；将聚苯乙烯微球离心收集，超纯水清洗并超声重悬水中。
将领苯二甲酸正丁酯与的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在水浴中搅拌溶胀；然后把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀；混合液搅拌升温，加入过硫酸铵溶液，聚合，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
在聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，称取铕配合物，溶于苯乙烯中，并加入聚苯乙烯微球悬浮液；超声乳化后，避光机械搅拌；升温，加入过硫酸铵进行聚合反应；反应一段时间后，补加苯乙烯和甲基丙烯酸，继续反应，结束反应后离心收集产物，洗涤，即为羧基荧光微球；加入甲基丙烯酸，微球表面被羧基化，使微球能与生物分子偶联；以及
取聚苯乙烯微球悬浮液加入NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH大于10，在磁力搅拌下用HCl溶液返滴定，直到样品的pH为3结束，计算微球表面羧基含量。
可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，将1～50mL苯乙烯放入带机械搅拌器的500mL三口瓶中，然后加入100～300mL水，通入氮气加热搅拌；水浴升温至75℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应20h，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球。
可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，将领苯二甲酸正丁酯与0.25％的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在20℃～40℃水浴中搅拌溶胀24h。
可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀24h。
可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，混合液在氮气保护下搅拌升温至75℃，温度稳定后，加入过硫酸铵溶液，聚合24h，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，在浓度为20mg/mL的聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，使其终浓度为0.25％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，发现分别以苏丹红Ⅰ(AS)和铕(Eu)为荧光标记物，制备出具有双重标记的表面羧基功能化的荧光微球。微球在无激发光激发的状态下呈现橙黄色，而360nm紫外线激发下发出红色荧光。两种标记物分别可提供470nm处紫外吸收和615nm处荧光作为检测信号。通过控制两种标记物的含量，可以制备出双重信号标记功能的微球，在生物分子检测、药物筛选等领域提供帮助。在此基础上完成了本发明。
本发明提供一种双重标记荧光微球的制备方法，包括：
将苯乙烯放入带机械搅拌器的三口瓶中，然后加入水，加热搅拌；水浴升温至大于等于70℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球；将聚苯乙烯微球离心收集，超纯水清洗并超声重悬水中。
将领苯二甲酸正丁酯与的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在水浴中搅拌溶胀；然后把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀；混合液搅拌升温，加入过硫酸铵溶液，聚合，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
在聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，称取铕配合物，溶于苯乙烯中，并加入聚苯乙烯微球悬浮液；超声乳化后，避光机械搅拌；升温，加入过硫酸铵进行聚合反应；反应一段时间后，补加苯乙烯和甲基丙烯酸，继续反应，结束反应后离心收集产物，洗涤，即为羧基荧光微球；加入甲基丙烯酸，微球表面被羧基化，使微球能与生物分子偶联；以及
取聚苯乙烯微球悬浮液加入NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH大于10，在磁力搅拌下用HCl溶液返滴定，直到样品的pH为3结束，计算微球表面羧基含量。
可选的，可以是将1～50mL苯乙烯放入带机械搅拌器的500mL三口瓶中，然后加入100～300mL水，通入氮气加热搅拌；水浴升温至75℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应20h，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球。
在本发明一个实施例中，将领苯二甲酸正丁酯与0.25％的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在20℃～40℃水浴中搅拌溶胀24h。
在本发明一个实施例中，把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀24h。
在本发明一个实施例中，混合液在氮气保护下搅拌升温至75℃，温度稳定后，加入过硫酸铵溶液，聚合24h，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
在本发明一个实施例中，在浓度为20mg/mL的聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，使其终浓度为0.25％。
具体实例如下：
将10mL苯乙烯放入带机械搅拌器的500mL三口瓶中,然后加入200mL水，通入氮气加热搅拌；水浴升温至75℃时，加入过硫酸铵溶液(APS,100mg过硫酸铵溶于5mL纯水中)，继续搅拌反应20h，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球(PSt)。将聚苯乙烯微球离心收集，超纯水水清洗6次，最后超声重悬水中。
将领苯二甲酸正丁酯(DBP)与0.25％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在30℃水浴中搅拌溶胀24h。然后把含有苯乙烯(St)、二乙烯基苯(DVB)、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ(AS)的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀24h。混合液在氮气保护下搅拌升温至75℃，温度稳定后，加入过硫酸铵溶液，聚合24h，产物通过离心收集并用乙醇和水洗4次。
在浓度为20mg/mL的聚苯乙烯微球(PSt)乳液中加入十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，使其终浓度为0.25％。称取60mg铕(Eu)配合物，溶于1mL苯乙烯(St)中，并加入至50mL聚苯乙烯微球(PSt)悬浮液，超声乳化后，避光机械搅拌48h，通入氮气，升温至75℃，加入300mg过硫酸铵进行聚合反应。反应2h后，补加1mL苯乙烯(St)和0.3mL甲基丙烯酸(MAA)，继续反应6h。结束反应后离心收集产物，洗涤6次，即为羧基荧光微球。加入甲基丙烯酸，微球表面被羧基化，使微球能与生物分子偶联。
其中，稀土Eu配合物根据文献“Jiang X,Jen KY,Huang D,et al.The effect ofligandConjugation length on europium complex performance in light-emittingdiodes[J].Synthetic metals,2002,125(3):331-336.”制备。
取1ml聚苯乙烯微球悬浮液加入5ml的0.01M的NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH为11左右，在磁力搅拌下用0.01M的HCl溶液返滴定，直到样品的pH为3结束。计算微球表面羧基含量约为1mmol/mg。
苏丹红Ⅰ在470nm左右最大吸收，而稀土铕(EU)配合物在这一波长没有吸收，铕(EU)配合物在600nm以上有狭窄的荧光发射峰，最强荧光在615nm左右。选用苏丹红Ⅰ(AS)和铕(EU)配合物的组合，不会因为紫外吸收谱的重叠产生干扰，同时也避免了苏丹红Ⅰ(AS)的吸收谱和铕(EU)配合物的发射谱重叠而导致荧光减弱因此，由这两种物质标记制得的微球可以采用470nm处紫外吸收强度(苏丹红Ⅰ)和615nm处荧光强度作为两组检测信号。通过控制二者的比例，可以制备双标记荧光微球。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，包括：
将苯乙烯放入带机械搅拌器的三口瓶中，然后加入水，加热搅拌；水浴升温至大于等于70℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球；将聚苯乙烯微球离心收集，超纯水清洗并超声重悬水中。
将领苯二甲酸正丁酯与的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在水浴中搅拌溶胀；然后把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀；混合液搅拌升温，加入过硫酸铵溶液，聚合，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
在聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，称取铕配合物，溶于苯乙烯中，并加入聚苯乙烯微球悬浮液；超声乳化后，避光机械搅拌；升温，加入过硫酸铵进行聚合反应；反应一段时间后，补加苯乙烯和甲基丙烯酸，继续反应，结束反应后离心收集产物，洗涤，即为羧基荧光微球；加入甲基丙烯酸，微球表面被羧基化，使微球能与生物分子偶联；以及
取聚苯乙烯微球悬浮液加入NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH大于10，在磁力搅拌下用HCl溶液返滴定，直到样品的pH为3结束，计算微球表面羧基含量。
2.根据权利要求1所述的双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，将1～50mL苯乙烯放入带机械搅拌器的500mL三口瓶中，然后加入100～300mL水，通入氮气加热搅拌；水浴升温至75℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应20h，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求1所述的双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，将领苯二甲酸正丁酯与0.25％的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在20℃～40℃水浴中搅拌溶胀24h。
4.根据权利要求1或3所述的双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀24h。
5.根据权利要求1或3所述的双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，混合液在氮气保护下搅拌升温至75℃，温度稳定后，加入过硫酸铵溶液，聚合24h，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。
6.根据权利要求1所述的双重标记荧光微球的制备方法，其特征在于，在浓度为20mg/mL的聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，使其终浓度为0.25％。
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