CN111050797A - 抗tim-3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗TIM‑3抗体及其抗原结合片段。本发明还提供了编码该抗体的核酸、包含该抗体的组合物，以及制备该抗体并使用该抗体治疗或预防诸如癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、和/或感染性疾病的疾病的方法。

Description

抗TIM-3抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年7月28日提交的美国临时申请62/538,277的优先权。其全部内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及单克隆抗TIM-3抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、包含该载体的重组细胞，以及包含该抗体的组合物。本发明还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体来治疗疾病的方法，所述疾病包括癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、代谢性疾病(例如，肥胖症，胰岛素抵抗和糖尿病)和/或相关并发症。
电子提交的序列表的引用
本申请包含序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名为“689204.3WO序列表”，创建日期为2018年7月25日，大小为78kb。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，其全文通过引用并入本文。
发明背景
T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3(TIM-3)是一种在髓样细胞上表达的受体，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和NK细胞，以及一部分淋巴样细胞，如T细胞。已记录的TIM-3配体包括半乳凝素9(Gal-9)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。Gal-9和PtdSer的连接由TIM-3的可变免疫球蛋白结构域(IgV)介导。IgV的糖基化对于Gal-9的结合是必需的，而对于PtdSer的结合则不是。通过与这些配体相互作用，TIM-3调节先天性免疫和适应性免疫。HMGB1在肥胖症的脂肪组织慢性炎症中也起着重要作用，表明TIM-3的功能可能与炎症相关的代谢变化有关。
在髓样细胞表面，TIM-3的高表达抑制巨噬细胞和DC产生细胞因子。该抑制可以通过来自T细胞的刺激逆转，也可以通过阻断单克隆抗体来逆转。在肿瘤中，保护和促进癌症的M2巨噬细胞与TIM-3高水平表达相关，而抗癌的M1巨噬细胞与TIM-3低水平表达相关。用单克隆抗体阻断TIM-3是否能将M2转化为癌细胞吞噬的M1巨噬细胞仍有待证明。
在T细胞表面，TIM-3通过与配体Gal-9相互作用来调节适应性免疫。TIM-3在CD4+辅助细胞(Th1和Th17)、调节性(Treg)和CD8+细胞毒性1(Tc1)T细胞上表达。TIM-3与Gal-9的慢性连接可诱导Th1细胞凋亡，从而下调免疫反应和持续时间。TIM-3的表面表达或可能的功能取决于与CEACAM1的顺式和反式结合。值得注意的是，TIM-3通常在表达免疫抑制性PD-1的CD8+T细胞上发现。已经提出TIM-3和PD-1是导致肿瘤内T细胞功能异常的共同抑制因子。这使得单独应用或与PD-1/PDL-1和/或其他免疫肿瘤疗法联合应用的TIM-3拮抗剂抗体成为一种潜在的很好的治疗方法。
除了调节免疫细胞，TIM-3在急性髓性白血病(AML)的白血病干细胞(LSC)中也高表达。在LSC上，TIM-3和Gal-9形成自分泌刺激环，以驱动癌性LSC的自我更新途径以及白血病的进展。有趣的是，TIM-3并不存在于造血干细胞(HSC)的表面上，从而提供了使用阻断性/消耗性/细胞毒性的治疗性TIM-3抗体治疗AML和其他髓性白血病的可能。
TIM-3调节先天性和适应性免疫细胞的活性。TIM-3封闭性单克隆抗体具有通过清除癌细胞的独特机制释放免疫系统的潜力。
发明概述
在一个一般方面，本发明涉及结合TIM-3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其具有以下多肽序列：
(1)分别为SEQ ID NO：43、44、169、106、107和170；
(2)分别为SEQ ID NO：55、56、57、118、119和120；
(3)分别为SEQ ID NO：58、59、60、121、122和123；
(4)分别为SEQ ID NO：61、62、63、124、125和126；
(5)分别为SEQ ID NO：64、65、66、127、128和129；
(6)分别为SEQ ID NO：67、68、69、130、131和132；
(7)分别为SEQ ID NO：70、71、72、133、134和135；
(8)分别为SEQ ID NO：73、74、75、136、137和138；
(9)分别为SEQ ID NO：76、77、78、139、140和141；
(10)分别为SEQ ID NO：79、80、81、142、143和144；
(11)分别为SEQ ID NO：82、83、84、145、146和147；
(12)分别为SEQ ID NO：85、86、87、148、149和150；
(13)分别为SEQ ID NO：88、89、90、151、152和153；
(14)分别为SEQ ID NO：91、92、93、154、155和156；
(15)分别为SEQ ID NO：94、95、96、157、158和159；
(16)分别为SEQ ID NO：97、98、99、160、161和162；
(17)分别为SEQ ID NO：100、101、102、163、164和165；或
(18)分别为SEQ ID NO：103、104、105、166、167和168；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TIM-3，优选人TIM-3。SEQ ID NO：169由氨基酸序列ARDX1X2DY表示，其中X1是选自A、T和L的氨基酸，并且X2是选自M和E的氨基酸。SEQ ID NO：170由氨基酸序列SQX1X2HVPX3T表示，其中X1是选自N、T和S的氨基酸，X2是选自T和I的氨基酸，并且X3是选自W和Y的氨基酸。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或抗原结合片段包含含有与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41具有至少95％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42具有至少95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或抗原结合片段包括：
(a)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：3的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：4的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：5的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：6的多肽序列的轻链可变区；
(d)具有SEQ ID NO：7的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：8的多肽序列的轻链可变区；
(e)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10的多肽序列的轻链可变区；
(f)具有SEQ ID NO：11的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：12的多肽序列的轻链可变区；
(g)具有SEQ ID NO：13的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14的多肽序列的轻链可变区；
(h)具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：16的多肽序列的轻链可变区；
(i)具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的轻链可变区；
(j)具有SEQ ID NO：19的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：20的多肽序列的轻链可变区；
(k)具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：22的多肽序列的轻链可变区；
(l)具有SEQ ID NO：23的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24的多肽序列的轻链可变区；
(m)具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：26的多肽序列的轻链可变区；
(n)具有SEQ ID NO：27的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：28的多肽序列的轻链可变区；
(o)具有SEQ ID NO：29的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：30的多肽序列的轻链可变区；
(p)具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：32的多肽序列的轻链可变区；
(q)具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：34的多肽序列的轻链可变区；
(r)具有SEQ ID NO：35的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：36的多肽序列的轻链可变区；
(s)具有SEQ ID NO：37的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：38的多肽序列的轻链可变区；
(t)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：40的多肽序列的轻链可变区；或
(u)具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：42的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
在某些实施方式中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
在某些实施方式中，所述人源化的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：
(a)具有SEQ ID NO：171的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：172的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：173的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区；或
(d)具有SEQ ID NO：174的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段能够阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)、TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)、和/或TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的结合。
还提供了本发明所公开的分离的核酸，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了载体，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
本发明还提供了宿主细胞，其含有包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。
在某些实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
本发明还提供了在有所需要的受试者中阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)、TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)、和/或TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)结合的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了在有所需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。所述癌症可以是任何液体或实体癌，例如，其可以选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。
本发明还提供了在有所需要的受试者中治疗感染性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了在有所需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了在有所需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了在有所需要的受试者中治疗代谢性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
本发明还提供了制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，所述方法包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
本发明还提供了测定受试者中TIM-3水平的方法。所述方法包括(a)从受试者获得样品；(b)使所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测定受试者中TIM-3的水平。在某些实施方式中，所述样品是组织或血液样品。所述组织样品可以例如是癌组织样品。所述血液样品可以例如包括癌细胞。
附图简要说明
当结合附图阅读时，将能更好地理解本发明的前述概述以及以下对本申请的优选实施例的详细描述。然而，应理解，本申请不限于附图中所示的明确实施例。
图1显示了抗TIM-3单克隆抗体(mAb)对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。将ELISA板用PtdSer或PtdChol包被，洗涤并与包含各种浓度的纯化抗体和TIM3(ECD)-huFc的预平衡混合物孵育。对板进行洗涤，然后通过与HRP偶联的抗-huFc二抗孵育，随后与HRP底物一同孵育来检测信号。TIM-3与PtdSer的结合用作100％信号，而TIM-3与PtdChol的结合用作零(背景)，以计算给定mAb的抑制百分比。图1A显示了抗TIM-3抗体20-L10-A、16-K5-A、15-L23-A和2-K2-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。图1B显示了抗TIM-3抗体12-G18-A、5-C11-A和19-A14-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。图1C显示了抗TIM-3抗体10-M21-A、18-N1-A和16-L3-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。图1D显示了抗TIM-3抗体12-M11-A、5-K4-A和16-J5-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。图1E显示了抗TIM-3抗体7-P15-A、8-F3-A、10-O15-A和18-O22-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。图1F显示了抗TIM-3抗体6-I 13-A、6-H6-A和7-N2-A对人TIM-3与PtdSer结合的抑制作用。
图2显示了抗TIM-3mAb的FACS结合分析。通过FACS检测了3种不同浓度的纯化抗TIM-3mAb与瞬时转染人TIM-3的HEK293细胞(标记为“HuTIM-3细胞”)或亲代HEK293细胞(标记为“CTL细胞”)的结合。使用抗小鼠二抗AlexaFluor488进行检测。
图3A和3B显示了ELISA分析的嵌合和人源化形式的16-K5-A单抗与固定在板上的重组人TIM-3(ECD)-6His结合的结果。
发明详述
在背景和整个说明书中，引用或描述了多种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个都通过引用整体并入本文。本说明书中包含的文件、法案、材料、装置、文章等的讨论用于提供本发明的背景。对于所公开或要求保护的任何发明内容，这种讨论并非承认所有这些或任何这些事项构成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。否则，本文中使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。
需要注意的是，除非上下文另有明确指示，如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，如本文所用，所用数值范围特别地包括所有可能的子范围，在该范围内的所有单个数值，包括在这样的范围内的整数以及该值的分数。
除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元素。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方式的多种等同方案。本发明旨在涵盖这样的等同方案。
如本文所用，术语“包含”、“包含有”、“包括”、“包括有”、“具有”、“有”、“含有”或“含”或其任何其他变型将被理解为隐含地包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、步骤、方法、物品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括此组合物、混合物、步骤、方法、物品或设备中未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确指出相反的意思，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，以下任一条件都满足条件A或B：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)、A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
如本文所用，多个叙述的元素之间的连接术语“和/或”应理解为包括单独的和组合的选择。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指适用第一个元素而没有第二个元素。第二个选项是指适用第二个元素而没有第一个元素。第三个选项是指第一和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都应理解为落入该含义内，并因此满足本文所用术语“和/或”的要求。一个以上选项的并行适用也应理解为在其含义之内，因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“由……组成”或诸如“由……构成”或“由……所组成”的变体表示包括任何所述整数或整数组，但是指定的方法、结构或组合物中没有增加其他的整数或整数组。
如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由...组成”或诸如“基本上由...构成”或“基本上由...所组成”的变体表示包括任何所述的整数或整数组，并且可选地包含不会实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖性质的任何所述整数或整数组。见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选为哺乳动物，最优选为人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，但更优选人。
词语“右”、“左”、“下”和“上”表示附图中的参考方向。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，如本文所用的术语“大约”、“约”、“通常”、“基本上”以及类似术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除其在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的那样。至少，包括数字参数的此类引用将包括使用本领域公认的数学和工业原理(例如，四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最小有效位数的变化。
在两个或多个核酸或多肽序列(例如抗TIM-3抗体、TIM-3多肽和编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指，当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以例如通过如下算法进行，例如通过Smith和Waterman，高等应用数学，2：482(1981)的局部同源算法进行，通过Needleman和Wunsch，分子生物学杂志，48：443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson和Lipman，美国国家科学院学报，85：2444(1988)的相似性方法研究进行，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，位于威斯康星州的575科学Madison博士的遗传学计算机组的遗传学软件包中)，或通过目视检查实现(通常参见，分子生物学实验室指南，F.M.Ausubel等编辑，实验室指南，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)和约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)的合资企业(1995年副刊)(Ausubel))。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法在Altschul等(1990)，分子生物学杂志，215：403-410和Altschul等(1997)，核酸研究，25：3389-3402中分别进行了描述。可通过国家生物技术信息中心的公开途径获得进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短序列来识别高分序列对(HSP)，这些短序列在与数据库序列中相同长度的序列对齐时匹配或满足某个正值阈值T。T被称为邻近序列分数阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻近序列的命中充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后沿着两个方向将序列的命中在每个序列延伸至累积比对得分不再增加。
对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的加分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止序列的命中在每个方向上的延伸：累积比对得分比其最大获得值降低数值X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3、期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，美国国家科学院学报，89：10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，美国国家科学院学报，90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，它提供了偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
如下所述，若由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应，则进一步指示两个核酸序列或多肽基本上相同。因此，例如，当两条多肽中仅通过保守取代而不同，则通常认为其中一条多肽与第二多肽基本相同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。
抗体
本发明主要涉及分离的抗TIM-3抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、包含该载体的重组细胞，以及包含该抗体的组合物。本发明还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体来治疗疾病的方法，所述疾病包括癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、和/或感染性疾病。本发明的抗体具有一种或多种理想的功能特性，包括但不限于与TIM-3结合的高亲和力、对TIM-3的高特异性、阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的能力、阻断TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)结合的能力、阻断TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)结合的能力、阻断TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)结合的能力、刺激细胞因子(例如但不限于IL-2和IFN-γ)产生的能力，以及单独施用或与其他抗癌疗法联合施用时，抑制动物模型和受试者的肿瘤生长的能力。
在一个一般方面，本发明涉及结合TIM-3的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”以广义使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，包括单克隆或多克隆的人、人源化、复合和嵌合抗体，以及抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白或肽链。抗体的结构是众所周知的。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类型(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五个主要类型或相应亚类中的任何一个。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据其恒定区的氨基酸序列，可以将脊椎动物物种的抗体轻链归类为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据具体的实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，两者均包含三个结构域(即互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。所述轻链可变区结构域可替代地称为LCDR1、LCDR2和LCRD3，所述重链可变区结构域可替代地称为HCDR1、HCRD2和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合TIM-3的分离的抗体基本上不含不结合TIM-3的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然的突变以外，包含种群的单个抗体是同一的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单一淋巴细胞基因克隆技术，或通过重组DNA方法制备。例如，所述单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自具有人源重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(如转基因小鼠或大鼠)的B细胞。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(双价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼源单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合。根据特定的实施方式，所述抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他具体实施方式，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指通过人生产的抗体，或利用本领域已知的任何技术制备的具有对应于通过人生产的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指为增强其与人抗体的序列同源性而进行修饰的非人类抗体，以保留抗体的抗原结合特性，并降低其在人体中的抗原性。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链可变区都对应于衍生自一种哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔等)的具有期望的特异性、亲和力、和性能的抗体的可变区，而恒定区对应于衍生自另一种哺乳动物(例如人)的抗体的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在相同抗原上，例如，在相同的蛋白(或多聚蛋白的亚基)上。在一个实施方式中，所述第一和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位不重叠或基本不重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在不同抗原上，例如，在不同的蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方式中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体，或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在相同抗原上，例如，在相同的蛋白(或多聚蛋白的亚基)上。在一个实施方式中，所述第一和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在不同抗原上，例如，在不同的蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结合域序列和轻链可变结构域序列，和对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方式中，所述第一表位位于TIM-3上，并且所述第二表位位于PD-1、PD-L1、LAG-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、DLL-3、CD73、爱帕琳肽(apelin)、CD3、CD47、TIP-1、CLDN18.2、FOLR1和/或其他与肿瘤相关的免疫抑制剂或表面抗原上。
如本文所用，术语“TIM-3”是指T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3(TIM-3)，其是一种在髓样细胞上表达的受体，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞，以及一部分淋巴样细胞，如T细胞。TIM-3能够与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合，这是对凋亡小体或细胞的吞噬作用的主要信号。当PtdSer和TIM-3的结合被特异性抗体阻断时，凋亡小体不会被清除，这会诱导免疫异常，例如自身抗体的产生(综述于Ocana-Guzman等，“TIM-3在巨噬细胞中调节不同功能”，《免疫学前沿》第7卷，第229条(2016))。TIM-3可以调节单核细胞和巨噬细胞中细胞因子的产生和释放(综述于Ocana-Guzman等，Id)。术语“人TIM-3”是指源自人的TIM-3。GenBank登录号Q8TDQ0.3或GenBank登录号NP_116171.3显示了人TIM-3的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO：177)。
如本文所用，“特异性结合TIM-3”的抗体是指以1×10-7M以下，优选地为1×10-8M以下，更优选地为5×10-9M以下、1×10-9M以下、5×10-10M以下或1×10-10M以下的KD结合TIM-3，优选地结合人TIM-3的抗体。术语“KD”是指解离常数，其是从Kd与Ka之比(即，Kd/Ka)获得的，并被表示为摩尔浓度(M)。鉴于本公开，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，诸如通过使用生物传感器系统，例如
Figure BDA0002379622370000131
系统，或通过使用生物膜层干涉测量技术，例如Octet RED96系统。
抗体的KD值越小，所述抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
根据一个特定的方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其具有以下多肽序列：
(1)分别为SEQ ID NO：43、44、169、106、107和170；
(2)分别为SEQ ID NO：55、56、57、118、119和120；
(3)分别为SEQ ID NO：58、59、60、121、122和123；
(4)分别为SEQ ID NO：61、62、63、124、125和126；
(5)分别为SEQ ID NO：64、65、66、127、128和129；
(6)分别为SEQ ID NO：67、68、69、130、131和132；
(7)分别为SEQ ID NO：70、71、72、133、134和135；
(8)分别为SEQ ID NO：73、74、75、136、137和138；
(9)分别为SEQ ID NO：76、77、78、139、140和141；
(10)分别为SEQ ID NO：79、80、81、142、143和144；
(11)分别为SEQ ID NO：82、83、84、145、146和147；
(12)分别为SEQ ID NO：85、86、87、148、149和150；
(13)分别为SEQ ID NO：88、89、90、151、152和153；
(14)分别为SEQ ID NO：91、92、93、154、155和156；
(15)分别为SEQ ID NO：94、95、96、157、158和159；
(16)分别为SEQ ID NO：97、98、99、160、161和162；
(17)分别为SEQ ID NO：100、101、102、163、164和165；或
(18)分别为SEQ ID NO：103、104、105、166、167和168；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TIM-3，优选人TIM-3。
SEQ ID NO：169由氨基酸序列ARDX1X2DY表示，其中X1是选自A、T和L的氨基酸，并且X2是选自M和E的氨基酸。
SEQ ID NO：170由氨基酸序列SQX1X2HVPX3T表示，其中X1是选自N、T和S的氨基酸，X2是选自T和I的氨基酸，并且X3是选自W和Y的氨基酸。
根据另一个特定方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41之一具有至少85％，优选地90％，更优选地95％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42之一具有至少85％，优选地90％，更优选地95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。根据一个优选的实施方式，本发明所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41具有至少85％，优选地90％，更优选地95％的同一性的多肽序列的重链可变区，并且含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42具有至少85％，优选地90％，更优选地95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。
根据另一个特定方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：
a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：3的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：4的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：5的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：6的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO：7的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：8的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO：11的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：12的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO：13的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：16的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO：19的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：20的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：22的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO：23的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：26的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO：27的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：28的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO：29的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：30的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：32的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：34的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO：35的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：36的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO：37的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：38的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：40的多肽序列的轻链可变区；或
u.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：42的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：43、44、45、106、107和108所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：1至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：2至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：46、47、48、109、110和111所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：3至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：4至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：3的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：4的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：49、50、51、112、113和114所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：5至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：6至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：5的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：6的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：52、53、54、115、116和117所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：7至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：8至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：7的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：8的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：55、56、57、118、119和120所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：9至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：10至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：58、59、60、121、122和123所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：11至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：12至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：11的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：12的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：61、62、63、124、125和126所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：13至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：14至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：13的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：64、65、66、127、128和129所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：15至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：16至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：16的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：67、68、69、130、131和132所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：17至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：18至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：70、71、72、133、134和135所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：19至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：20至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：19的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：20的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：73、74、75、136、137和138所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：21至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：22至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：22的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：76、77、78、139、140和141所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：23至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：24至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：23的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：79、80、81、142、143和144所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：25至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：26至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：26的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：82、83、84、145、146和147所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：27至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：28至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：27的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：28的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：85、86、87、148、149和150所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：29至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：30至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：29的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：30的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：88、89、90、151、152和153所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：31至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：32至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：32的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：91、92、93、154、155和156所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：33至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：34至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：34的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：94、95、96、157、158和159所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：35至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：36至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：35的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：36的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：97、98、99、160、161和162所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：37至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：38至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：37的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：38的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：100、101、102、163、164和165所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：39至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：40至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：40的多肽序列的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO：103、104、105、166、167和168所示的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：41至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：42至少85％，较佳的90％，更佳的95％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：42的多肽序列的轻链可变区。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的分离的人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有SEQ ID NO：171的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：172的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：173的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区；或
(d)具有SEQ ID NO：174的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区。
根据另一个特定方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段能够阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)、TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)、和/或TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的结合。
在另一个一般方面，本发明涉及一种编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域技术人员可以理解，蛋白质的编码序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被改变(例如替换、删除、插入等)。因此，本领域技术人员能够理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
在另一个一般方面，本发明涉及一种载体，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是重组表达载体，如质粒。所述载体可以包括用于构建表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。本领域已知，许多表达载体能够将核酸递送至细胞，其可以在本发明中使用，用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方式，可以利用常规克隆技术或人工基因合成生产重组表达载体。
在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体的实施方式，通过常规方法例如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。
在另一个一般方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物(如从上清液中)中回收抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并根据本领域已知的和本文所述的常规技术进行纯化。
药物组合物
在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含分离的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的产品。本发明的抗体和包含它们的组合物也可用于制备药物，所述药物用于本发明提及的治疗性应用。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球体、脂质包封体、或本领域已知的用于药物制剂的其他物质。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于具体应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明所述组合物的有效性或本发明所述组合物的生物活性的无毒物质。根据具体实施方式，鉴于本公开内容，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
用药学上可接受的载体进行药学活性成分的配制是本领域已知的，例如雷明顿：制药科学与实践(例如，第21版(2005年)以及任何更高版本)。其他成分的非限制性实例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可以用于配制本发明的药物组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物是液体制剂。液体制剂的优选实例是水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可以包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w的水。
在一种实施方式中，所述药物组合物可以配制成可以，例如通过注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。例如，可以皮下、肌肉内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送注射剂。
在另一种实施方式中，所述药物组合物是固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可以原样使用，或在使用前由医师或患者向其添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，例如压制片剂和/或包衣片剂，以及胶囊剂(例如，硬或软明胶胶囊)。所述药物组合物也可以是例如小包装、糖衣丸、粉末、颗粒、锭剂或用于重构的粉末的形式。
所述剂型可以是立即释放的，在这种情况下，其可以包含水溶性或分散性载体，或者其可以是延缓释放、持续释放或调节释放的，在这种情况下，其可以包含调节该剂型在胃肠道或皮下溶解速率的水不溶性聚合物。
在其他实施方式中，所述药物组合物可以通过鼻内、颊内或舌下递送。
水性制剂中的pH可以在pH 3至pH 10之间。在本发明的一种实施方式中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一种实施方式中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括：精氨酸、天冬氨酸、二甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸、酒石酸、三甲基甘氨酸和三(羟甲基)-氨基甲烷及其混合物。缓冲剂可以单独存在，或以总计约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪唑烷脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞及其混合物。防腐剂可以单独存在，或以总计约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含等渗剂。该实施方式的非限制性实例包括盐(例如氯化钠)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、醛醇(alditol)(例如丙三醇、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个实例包括糖。糖的非限制性实例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个实例是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性实例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可以单独存在，或以总计约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性实例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)盐及其混合物。螯合剂可以单独存在，或以总计约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂是羧基-/羟基纤维素及其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫基乙醇、聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(例如氯化钠)、含硫物质(例如硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可以单独存在，或以总计约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的其他实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂、或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可以例如选自下组：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以单独存在，或以总计约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA和/或盐酸(HCl)苯甲脒。蛋白酶抑制剂可以单独存在，或以总计约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。
在另一个一般方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
使用方法
在另一个一般方面，本发明涉及一种阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的方法、一种阻断TIM-3与半乳凝素9结合的方法、一种阻断TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)结合的方法，或一种阻断TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)结合的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的药物组合物。
与TIM-3结合的抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的和本文所述的方法进行表征。与TIM-3结合的抗体及其抗原结合片段的表征方法包括但不限于：亲和力和特异性分析，包括Biacore、ELISA和OctetRed分析；受体配体结合分析，以检测TIM-3与PtdSer、半乳凝素-9、CEACAM1和/或HMGB1的结合是否受阻；抗TIM-3mAb抑制PtdSer-TIM-3相互作用的功能作用可以在基于细胞的吞噬作用分析中进行检测，其中将表达TIM-3的巨噬细胞与经历凋亡(并因此表达PtdSer)的细胞一起温育，mAb对PtdSer-TIM-3相互作用的阻断将导致吞噬作用增加。抗TIM-3mAb抑制Gal-9-TIM-3相互作用的功能作用可以在基于细胞的分析中进行检测，其中mAb对AML细胞上Gal-9与NK细胞上TIM-3的结合的阻断将诱导IFN-γ分泌和细胞杀伤。抗TIM-3mAb抑制HMGB1-TIM-3相互作用的功能作用可以在基于细胞的分析中进行检测，其中将表达TIM-3的细胞与B-DNA孵育，mAb对HMGB1-TIM-3相互作用的阻断将导致INF-β1产量增加。还可以在混合淋巴细胞反应(MLR)分析中评估抗TIM-3mAb的功能活性，其中，在mAb的存在下，将来自不同供体的树突状细胞和CD4+细胞进行混合，检测细胞因子分泌的刺激作用。根据特定的实施方式，与TIM-3结合的抗体及其抗原结合片段的表征方法包括以下描述的那些。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。所述癌症可以，例如，选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的炎症性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的代谢性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
根据本发明的实施方式，所述药物组合物包含治疗有效量的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。根据所述目的，可以以经验和常规方式确定治疗有效量。
如本文所用，对于抗TIM-3抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指在有需要的受试者中调控免疫应答的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段的量。同样地，如本文所用，对于抗TIM-3抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症发展；或减轻或完全减轻与疾病、障碍或病症有关的症状的抗TIM-3抗体或其抗原结合片段的量。
根据特定的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是癌症，优选选自下组的癌症：肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。根据其他具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病和/或代谢性疾病。
根据具体的实施方式，治疗有效量是指足以实现1、2、3、4或更多种以下效果的治疗量：(i)减轻或改善待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展；(iv)使待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状退化；(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的发展或发作；(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的复发；(vii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活率；(xi)抑制或减轻受试者中待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，例如待治疗的疾病、障碍或病症、给药方式、靶位点、受试者的生理状态(包括，例如年龄、体重、健康状况)、受试者是人还是动物、施用的其他药物、以及该处理是预防还是治疗。优化滴定的治疗剂量，以优化安全性和有效性。
根据具体的实施方式，配制本文所述的组合物，以使其适合向受试者施用的预期途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合于静脉内、皮下或肌肉内施用形式。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”均指改善或逆转至少一种与下述疾病相关的可测的生理参数，所述疾病包括：癌症，感染性疾病、障碍或病症，免疫性疾病、障碍或病症，自身免疫性疾病、障碍或病症，或炎症性疾病、障碍或病症，和/或代谢性疾病、障碍或病症，其在受试者中未必必须被辨别，但在受试者中可以被辨别。术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”还可指使得疾病、障碍或病症消退、阻碍其进展、或至少减缓其进展。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指减轻、预防与疾病、障碍或病症(例如肿瘤，更优选地为癌症)相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少其持续时间。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指增加患有疾病、障碍或病症的受试者的存活率。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指治愈受试者的疾病、障碍或病症。
根据特定实施方式，用于治疗癌症，感染性疾病、障碍或病症，免疫性疾病、障碍或病症，自身免疫性疾病、障碍或病症，代谢性疾病、障碍或病症，和/或炎症性疾病、障碍或病症的组合物可以与另一种疗法联合使用。对于癌症治疗，所述组合物可以联合使用的另一种治疗包括但不限于：化学疗法、抗CD20mAb、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3mAb、抗EGFR mAb、抗HER-2mAb、抗CD19 mAb、抗CD33 mAb、抗CD73 mAb、抗CD47 mAb、抗DLL-3mAb、抗爱帕琳肽(apelin)mAb、抗TIP-1mAb、抗CLDN18.2 mAb、抗FOLR1 mAb、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1疗法、其他免疫肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物偶联物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。
如本文所用，上下文中向受试者施用两种或更多种疗法的术语“联合”是指使用多于一种的疗法。使用的术语“联合”不限制向受试者施用的治疗的顺序。例如，向受试者施用第一种疗法(例如，本文所述的组合物)可以在施用第二种疗法之前(例如，提前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时，或之后(例如，延后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。
在另一个一般方面，本发明涉及一种测定受试者中TIM-3水平的方法，包括(a)从受试者获得样品；(b)使所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测定受试者中TIM-3的水平。在某些实施方式中，所述样品是组织或血液样品。所述组织样品可以例如是癌组织样品。所述血液样品可以例如包括癌细胞。
如本文所用，“样品”是指从受试者分离的生物样品，可以包括但不限于全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、活检组织(例如，癌组织、肝组织等)、淋巴液、腹水、组织液、骨髓、脑脊液、唾液、粘液、痰、汗液、尿液或任何其他分泌物、排泄物或其他体液。“血液样品”是指全血或其任何部分，包括血细胞、血清和血浆。“血液样品”可以例如包括癌细胞。
在某些实施方式中，可通过分析测定受试者中TIM-3的水平，所述分析选自但不限于蛋白质印迹分析、ELISA分析、FACS分析、和/或免疫组织化学(IHC)。可通过蛋白印迹分析、FACS分析和免疫组织化学(IHC)测定相对蛋白水平，可通过ELISA分析测定绝对蛋白水平。在测定TIM-3的相对水平时，可以测定至少两个样品之间的TIM-3水平，例如，来自同一受试者的不同时间点的样品之间、来自同一受试者的不同组织的样品之间和/或来自不同受试者的样品之间。可替代地，当例如通过ELISA分析测定TIM-3的绝对水平时，可以在检测样品之前建立ELISA分析标准，来测定样品中TIM-3的绝对水平。本领域技术人员将理解，利用本发明的抗体或其抗原结合片段，使用何种分析技术进行来自受试者的样品中TIM-3的水平的测定。
利用测定来自受试者的样品中TIM-3水平的方法，可以诊断疾病中TIM-3水平的异常(升高、降低或不足)，并做出适当的治疗决策。这样的疾病可以选自但不限于癌症，优选的癌症选自下组：肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤、炎症性疾病、感染性疾病、代谢性疾病、免疫性疾病、和/或自身免疫性疾病。
实施方式
本发明还提供以下非限制性实施方式。
实施方式1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其具有以下多肽序列：
(1)分别为SEQ ID NO：43、44、169、106、107和170；
(2)分别为SEQ ID NO：55、56、57、118、119和120；
(3)分别为SEQ ID NO：58、59、60、121、122和123；
(4)分别为SEQ ID NO：61、62、63、124、125和126；
(5)分别为SEQ ID NO：64、65、66、127、128和129；
(6)分别为SEQ ID NO：67、68、69、130、131和132；
(7)分别为SEQ ID NO：70、71、72、133、134和135；
(8)分别为SEQ ID NO：73、74、75、136、137和138；
(9)分别为SEQ ID NO：76、77、78、139、140和141；
(10)分别为SEQ ID NO：79、80、81、142、143和144；
(11)分别为SEQ ID NO：82、83、84、145、146和147；
(12)分别为SEQ ID NO：85、86、87、148、149和150；
(13)分别为SEQ ID NO：88、89、90、151、152和153；
(14)分别为SEQ ID NO：91、92、93、154、155和156；
(15)分别为SEQ ID NO：94、95、96、157、158和159；
(16)分别为SEQ ID NO：97、98、99、160、161和162；
(17)分别为SEQ ID NO：100、101、102、163、164和165；或
(18)分别为SEQ ID NO：103、104、105、166、167和168；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TIM-3，优选人TIM-3。
实施方式2是实施方式1所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41具有至少95％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42具有至少95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。
实施方式3是实施方式1或2所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：3的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：4的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：5的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：6的多肽序列的轻链可变区；
(d)具有SEQ ID NO：7的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：8的多肽序列的轻链可变区；
(e)具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10的多肽序列的轻链可变区；
(f)具有SEQ ID NO：11的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：12的多肽序列的轻链可变区；
(g)具有SEQ ID NO：13的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14的多肽序列的轻链可变区；
(h)具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：16的多肽序列的轻链可变区；
(i)具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的轻链可变区；
(j)具有SEQ ID NO：19的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：20的多肽序列的轻链可变区；
(k)具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：22的多肽序列的轻链可变区；
(l)具有SEQ ID NO：23的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24的多肽序列的轻链可变区；
(m)具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：26的多肽序列的轻链可变区；
(n)具有SEQ ID NO：27的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：28的多肽序列的轻链可变区；
(o)具有SEQ ID NO：29的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：30的多肽序列的轻链可变区；
(p)具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：32的多肽序列的轻链可变区；
(q)具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：34的多肽序列的轻链可变区；
(r)具有SEQ ID NO：35的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：36的多肽序列的轻链可变区；
(s)具有SEQ ID NO：37的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：38的多肽序列的轻链可变区；
(t)具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：40的多肽序列的轻链可变区；或
(u)具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：42的多肽序列的轻链可变区。
实施方式4是实施方式1至3中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
实施方式5是实施方式1至4中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的或人源的。
实施方式6是实施方式5的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有SEQ ID NO：171的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(b)具有SEQ ID NO：172的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
(c)具有SEQ ID NO：173的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区；或
(d)具有SEQ ID NO：174的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区。
实施方式7是实施方式1至6中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段能够阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)、TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)、和/或TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的结合。
实施方式8是编码实施方式1至7中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的分离的核酸。
实施方式9是包含实施方式8的分离的核酸的载体。
实施方式10是包含实施方式9的载体的宿主细胞。
实施方式11是一种药物组合物，其包含实施方式1至7中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
实施方式12是一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的方法，其包括向所述受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式13是一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与半乳凝素-9(Gal-9)结合的方法，其包括向所述受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式14是一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)结合的方法，其包括向所述受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式15是一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)结合的方法，其包括向所述受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式16是治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式17是治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式18是治疗有需要的受试者的炎症性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式19是治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式20是治疗有需要的受试者的代谢性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式11的药物组合物。
实施方式21是一种制备实施方式1至7中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生所述单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
实施方式22是一种制备包含实施方式1至7中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体结合，以获得所述药物组合物。
实施方式23是一种测定受试者中TIM-3水平的方法，包括(a)从受试者获得样品；(b)使所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测定受试者中TIM-3的水平。
实施方式24是实施方式23的方法，其中所述样品是组织样品。
实施方式25是实施方式24的方法，其中所述组织样品是癌组织样品。
实施方式26是实施方式23的方法，其中所述样品是血液样品。
实施例
实施例1：抗TIM-3单克隆抗体的鉴定
用带有Fc标签的人和食蟹猴TIM-3胞外域(ECD)蛋白和佐剂对小鼠进行免疫。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆滴度。安乐死后，收集脾脏和淋巴结以产生杂交瘤。杂交瘤在384孔组织培养板中生长，并通过ELISA对各个孔的上清液进行筛选，以鉴定人和食蟹猴TIM-3ECD蛋白的阳性结合物。此外，在表达TIM-3的HEK293细胞上进行FACS分析，检测磷脂酰丝氨酸与TIM-3重组蛋白的结合以及与天然TIM-3蛋白的结合，进行阳性上清液的筛选。分离阳性克隆并测序。
表1和表2提供了抗TIM-3单克隆抗体的重链和轻链可变区的序列，表3和表4提供了抗TIM-3单克隆抗体的CDR区。使用IMGT方法确定抗TIM-3单克隆抗体的CDR区。
表1：抗TIM-3单克隆抗体(mAbs)的重链可变区序列
Figure BDA0002379622370000341
Figure BDA0002379622370000351
VH：重链可变区
表2：抗TIM-3单抗的轻链可变区序列
Figure BDA0002379622370000352
Figure BDA0002379622370000361
VL：轻链可变区
表3：抗TIM-3mAb的重链CDR区1-3
Figure BDA0002379622370000362
Figure BDA0002379622370000371
HC：重链；CDR：互补决定区
使用IMGT方法确定了抗TIM-3mAb的HC CDR(Lefranc，M.-P.等，核酸研究.1999；27：209-212)。
表4：抗TIM-3mAb的轻链CDR区1-3
Figure BDA0002379622370000372
LC：轻链；CDR：互补决定区
使用IMGT方法确定了抗TIM-3mAb的LC CDR(Lefranc，M.-P.等，核酸研究.1999；27：209-212)。
实施例2：利用ELISA进行的TIM-3和PtdSer结合分析
为了测定抗TIM-3抗体对TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)相互作用的影响，在室温下用PtdSer或磷脂酰胆碱(PtdChol)包被384孔ELISA板。使用补充有0.1％吐温-20的PBS对孔进行洗涤，然后使用补充有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS进行封闭。对板进行洗涤，随后，在补充有CaCl2的封闭缓冲液中，与包含纯化的抗体(0、0.03、0.08、0.25、0.74、2.22、6.67或20g/mL mAb)和TIM3(ECD)-huFc的预平衡混合物、包含人TIM-3的胞外域(ECD)和人Fc(huFc)的融合蛋白一起孵育。对板进行洗涤，然后与HRP偶联的抗-huFc二抗一起孵育。对板进行洗涤，与HRP底物一起温育，并使用POLARstar Omega微板(BMG LABTECH)读取。该测定重复三次。设置测定窗口，将TIM-3与PtdSer结合的信号定义为100％信号，TIM-3与PtChol结合的信号定义为零(背景)。通过ELISA测定证实的抗TIM-3单克隆抗体(mAb)抑制人TIM-3与PtdSer的结合的结果如图1A-1F所示。
实施例3：纯化抗体的FACS结合分析
制备表达人TIM-3的质粒，并将其瞬时转染到HEK293T细胞中。大约48小时后，将细胞转移至384孔V型底平板。用冰冷的FACS缓冲液(补充有1％BSA的PBS)洗涤细胞，并在4℃的缓慢搅拌下与纯化的mAb一起孵育45分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，并与抗小鼠二抗AlexaFluor488一起孵育。洗涤细胞并通过FACS分析。抗TIM-3mAb的FACS结合分析结果如图2所示。
实施例4：解离常数(KD)分析
在25℃下，在OCTET Red96上进行结合实验。将抗体加载到抗小鼠Fc(AMC)生物传感器上。将加载的传感器浸入抗原的系列稀释液中。使用一价(1：1)模型计算动力学常数。分析缓冲液是补充有0.1％BSA、500mM NaCl、0.02％吐温-20的pH 7.2的PBS。确定了抗TIM-3单克隆抗体的抗体-抗原结合解离常数，如下表5所示。
表5：抗TIM-3单抗的KD值
Figure BDA0002379622370000381
Figure BDA0002379622370000391
实施例5：抗TIM-3单抗的人源化
对小鼠抗TIM-3mAb 16-K5-A进行人源化，从而降低用于人类患者时的免疫原性。将重链和轻链可变区(VH和VL)的序列与蛋白质数据库(PDB)中的人抗体序列进行比较，并通过应用SWISS模型建立同源性模型。将小鼠mAb的重链和轻链中的CDR移植到人的最有可能维持抗原结合所需的合适结构的框架中。在必要时设计从人残基向小鼠残基的回复突变。表6显示了人源化VH和VL区的序列。人源化的VH和VL区分别与人IgG4重链和κ轻链的恒定区融合。将对应于mAb序列的构建物用于293E细胞的瞬时转染。所得抗体通过蛋白A亲和柱进行纯化。
表6：人源化抗TIM-3单抗的重链和轻链可变区序列
Figure BDA0002379622370000392
H1、H2、H5和H7是人源化的VH序列；L1和L5是人源化的VL序列。H1L1、H2L1、H5L5和H7L5是指使用特定VH(例如H1)和特定VL(例如L1)的组合(产生H1L1)构建的人源化单克隆抗体。
实施例6：嵌合和人源化抗TIM-3单克隆抗体的ELISA结合分析
在碳酸盐包被缓冲液中，用重组人TIM-3(ECD)-6His包被ELISA板，并在4℃下过夜。对嵌合和人源化形式的抗TIM-3mAb(H1L1、H2L1、H5L5和H7L5)进行洗涤并在室温下孵育1小时后，以不同的浓度添加到板上。对板进行洗涤，通过添加偶联了辣根过氧化物酶(hIgG-HRP)(赛默飞世尔，Cat#：31410)的抗人IgG并孵育60分钟，进行抗体结合的检测。洗涤后，使用一步检测溶液(One-step Detection Solution,赛默飞世尔，Cat#：34028)进行ELISA，测定其在450nm处的吸光度。结果如图3A和3B所示。
本领域技术人员将意识到，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施例，而是旨在涵盖在本说明书所限定的本发明的精神和范围内的修改。
序列表
<110> 凡恩世生物医药有限公司
<120> 抗TIM-3抗体及其用途
<130> P2019-2255
<150> US 62/538,277
<151> 2017-07-28
<160> 177
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Tyr Trp Phe Phe Gly Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Glu Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Ser Gly Asn His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ile Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Glu Asn Phe Asp Tyr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Asn Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Arg Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Gly Arg Trp Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Phe
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Tyr Tyr Gly Tyr Val Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn His Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Arg Asp Ala Met Asp Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
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1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Ala Arg Asp Leu Glu Asp Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
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1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Arg Asp Leu Met Asp Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ala Arg Ser Ser Asp Tyr Asp Asp Gly His Trp Tyr Phe Asp Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
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1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
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1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
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<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Ala Asn Asp His Glu Gly Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ile Asp Pro Asn Tyr Asp Ser Thr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Ala Arg Gly Gly His Tyr Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Ile Asp Pro Asn Tyr Asp Ile Thr
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Ala Arg Gly Gly His Tyr Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Ser Arg Ser Tyr Tyr Arg Tyr Thr Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Val Thr
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Ala Ser Tyr Ser Leu Thr Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Phe Ala Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Ala Arg Arg Gly Asp Phe Asp Arg Pro Glu Phe Ala Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Ala Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Tyr Trp Phe Phe Gly Val
1 5 10
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
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1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Gly Tyr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Ile Asn Pro Ile Thr Gly Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Ala Arg Gly Val Glu Asn Phe Asp Tyr Leu Tyr Ala Met Asp Tyr
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<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Ala Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Ala Arg Trp Gly Arg Trp Ala Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Phe Gly
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 105
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Tyr Val Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Lys Val Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Lys Val Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Trp Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Lys Val Ser
1
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 116
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Lys Val Ser
1
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Ser Gln Ser Ile His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Trp Ala Ser
1
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Glu Ser Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Val Ala Ser
1
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Trp Thr
1 5 10
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn
1 5
<210> 125
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Gly Thr Ser
1
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
1 5
<210> 128
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
Arg Ala Asp
1
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
1 5 10
<210> 131
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
Ala Ala Ser
1
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
His Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Gln Gly Ile Ser Ser Asn
1 5
<210> 134
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
His Gly Thr
1
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Phe
1 5 10
<210> 137
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
Tyr Ala Ser
1
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 140
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
Ala Ala Ser
1
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
Lys Ser Val Ser Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 143
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
Leu Ala Ser
1
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 146
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
Leu Ala Ser
1
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 149
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
Ala Ala Ser
1
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
1 5 10
<210> 152
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
Ala Glu Ser
1
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 154
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
1 5
<210> 155
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
Tyr Thr Ser
1
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Phe Thr
1 5
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
Ser Ser Ile Ser Tyr
1 5
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
Asp Thr Ser
1
<210> 159
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
His Gln Arg Ser Ser Tyr Arg Thr
1 5
<210> 160
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 161
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
Trp Ala Ser
1
<210> 162
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr
1 5
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 164
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
Ala Ala Ser
1
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr
1 5
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 167
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
Trp Ala Ser
1
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
Lys Gln Ser Tyr Asn His Met Tyr Thr
1 5
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
Ala Arg Asp Xaa Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
Ser Gln Xaa Xaa His Val Pro Xaa Thr
1 5
<210> 171
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Gln Ala Thr Leu Ser Thr Asp Lys Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 172
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Gln Ala Thr Leu Ser Thr Asp Leu Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 173
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ala Thr Leu Ser Thr Asp Lys Ser Lys Asn Gln Ala Ser
65 70 75 80
Leu Asn Leu Asp Ser Val Ser Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 174
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ala Thr Leu Ser Thr Asp Lys Ser Lys Asn Gln Ala Ser
65 70 75 80
Leu Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 175
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asp Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asp Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 177
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300

Claims (26)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其具有以下多肽序列：
(1)分别为SEQ ID NO：43、44、169、106、107和170；
(2)分别为SEQ ID NO：55、56、57、118、119和120；
(3)分别为SEQ ID NO：58、59、60、121、122和123；
(4)分别为SEQ ID NO：61、62、63、124、125和126；
(5)分别为SEQ ID NO：64、65、66、127、128和129；
(6)分别为SEQ ID NO：67、68、69、130、131和132；
(7)分别为SEQ ID NO：70、71、72、133、134和135；
(8)分别为SEQ ID NO：73、74、75、136、137和138；
(9)分别为SEQ ID NO：76、77、78、139、140和141；
(10)分别为SEQ ID NO：79、80、81、142、143和144；
(11)分别为SEQ ID NO：82、83、84、145、146和147；
(12)分别为SEQ ID NO：85、86、87、148、149和150；
(13)分别为SEQ ID NO：88、89、90、151、152和153；
(14)分别为SEQ ID NO：91、92、93、154、155和156；
(15)分别为SEQ ID NO：94、95、96、157、158和159；
(16)分别为SEQ ID NO：97、98、99、160、161和162；
(17)分别为SEQ ID NO：100、101、102、163、164和165；或
(18)分别为SEQ ID NO：103、104、105、166、167和168；
其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TIM-3，优选人TIM-3。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含含有与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41具有至少95％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42具有至少95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：3的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：4的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：5的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：6的多肽序列的轻链可变区；
d.具有SEQ ID NO：7的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：8的多肽序列的轻链可变区；
e.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：10的多肽序列的轻链可变区；
f.具有SEQ ID NO：11的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：12的多肽序列的轻链可变区；
g.具有SEQ ID NO：13的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：14的多肽序列的轻链可变区；
h.具有SEQ ID NO：15的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：16的多肽序列的轻链可变区；
i.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：18的多肽序列的轻链可变区；
j.具有SEQ ID NO：19的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：20的多肽序列的轻链可变区；
k.具有SEQ ID NO：21的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：22的多肽序列的轻链可变区；
l.具有SEQ ID NO：23的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：24的多肽序列的轻链可变区；
m.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：26的多肽序列的轻链可变区；
n.具有SEQ ID NO：27的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：28的多肽序列的轻链可变区；
o.具有SEQ ID NO：29的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：30的多肽序列的轻链可变区；
p.具有SEQ ID NO：31的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：32的多肽序列的轻链可变区；
q.具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：34的多肽序列的轻链可变区；
r.具有SEQ ID NO：35的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：36的多肽序列的轻链可变区；
s.具有SEQ ID NO：37的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：38的多肽序列的轻链可变区；
t.具有SEQ ID NO：39的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：40的多肽序列的轻链可变区；或
u.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：42的多肽序列的轻链可变区。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段是人的或人源的。
6.如权利要求5所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段包含：
a.具有SEQ ID NO：171的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
b.具有SEQ ID NO：172的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：175的多肽序列的轻链可变区；
c.具有SEQ ID NO：173的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区；或
d.具有SEQ ID NO：174的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：176的多肽序列的轻链可变区。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段能够阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、TIM-3与半乳凝素9(Gal-9)、TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)、和/或TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的结合。
8.一种编码权利要求1至7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的分离的核酸。
9.一种包含权利要求8所述的分离的核酸的载体。
10.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求9所述的载体。
11.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至7中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
12.一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
13.一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与半乳凝素-9(Gal-9)结合的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
14.一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)结合的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
15.一种在有需要的受试者中阻断TIM-3与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)结合的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
16.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其特征在于，包括向受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
17.一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，其特征在于，包括向受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
18.一种治疗有需要的受试者的炎症性疾病的方法，其特征在于，包括向受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
19.一种治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，其特征在于，包括向受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
20.一种治疗有需要的受试者的代谢性疾病的方法，其特征在于，包括向受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
21.一种制备权利要求1至7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的方法，其特征在于，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生所述单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
22.一种制备包含权利要求1至7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，其特征在于，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体结合，以获得所述药物组合物。
23.一种测定受试者中TIM-3水平的方法，其特征在于，包括(a)从受试者获得样品；(b)使样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测定受试者中TIM-3的水平。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述组织样品是癌组织样品。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述样品是血液样品。
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