CN111041016B

CN111041016B - 一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN111041016B
Application number: CN201911275657.8A
Authority: CN
Inventors: 许波; 杨雁霞; 黄遵锡; 吴倩; 杨云娟; 李俊俊; 唐湘华
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN111041016A

Abstract

本发明公开了一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共545个氨基酸，理论分子量为65.21kDa。该耐盐六磷酸海藻糖水解酶最适作用pH为7.5，在pH 7.0～8.0范围内处理1h后，酶活剩余90％以上；最适作用温度为30℃，在37℃条件下耐受1h对酶活基本无影响。该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)。在0.5‑5M NaCl条件下处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5M NaCl条件下处理24h其酶活提高43倍，典型的耐盐酶，具有用做报告基因及在其它盐环境中应用的潜力。

Description

一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用。

背景技术

六磷酸海藻糖水解酶(EC3.2.1.93)能催化水解六磷酸海藻糖生成葡萄糖和六磷酸葡萄糖，并可通过糖酵解途径进一步代谢。海藻糖广泛存在于各种生物中，在应对高温及渗透压力方面起重要作用。当外部环境的渗透压低时，大肠杆菌吸收外源性海藻糖作为碳和能量来源，吸收的海藻糖通过特异性磷酸酶系统(PTS)磷酸化成六磷酸海藻糖(T6P)，而六磷酸海藻糖又可被六磷酸海藻糖水解酶水解。耐盐六磷酸海藻糖水解酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在研究耐盐菌株等方面用作报告基因有显著优势。此外，还可从耐盐六磷酸海藻糖水解酶的组成特性获得启发，对用于高盐废水处理及食品加工的生物酶人工修饰改造，提高酶在处理废水及食品加工方面的稳定性及利用率。因此开发适用于盐环境的六磷酸海藻糖水解酶具有重要意义。

近年来，报道的六磷酸海藻糖水解酶主要来源于Bacillus licheni formis(Chuang et al.，2012；Ong et al.，2014；Chen et al.，2015；L in et al.，2016)，Bacillus sp.GP16(Karelov et al.，2003)，Lactoba cillus acidophilus(Duong etal.，2006)，Klebsiella pneumoniae Strain(Wu et al.，2011)，Bacillus subtilis(Sniezko et al.，1998)，Escheric hia coli(Rimmele and Boos，1994)。但只有少数六磷酸海藻糖水解酶基因(Rimmele and Boos，1994；Karelov et al.，2003；Chuang et al.，2012；Ong et al.，2014；Chen et al.，2015)被克隆、表达并鉴定。其中，来源于B.licheniformis(Chuang et al.，2012)的六磷酸海藻糖水解酶(BlTreA)具有较好的耐盐性，酶活在100MM NaCl中增强3.1倍。

动物胃肠道内存在大量微生物，它们与动物机体生理功能密切相关，被认为是星球上最为密集的微生物生态系统。这些微生物区系之间及微生物与动物宿主之间形成了相互依存，相互作用的不可分割的整体。栖息于胃肠道的微生物面临着如酸、胆盐、渗透压等压力，研究表明相对高渗的胃肠道腔(相当于0.3Mol/L NaCl)及饮食的变化可导致胃肠道中渗透压力的产生，为适应外部环境压力的改变，微生物的某些基因可能被激活，从而产生适应压力环境的特殊蛋白。目前，利用纯培养技术研究者们已从嗜盐和耐盐微生物中获得了各类耐盐基因，然而所得的耐盐基因数量仍比分离获得的耐盐菌数量要少得多。随着后基因组时代的到来，宏基因组学技术的出现避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，为寻找和发现新的耐盐功能基因提供了新的研究策略。

然而，目前对胃肠道微生物宏基因组来源耐盐基因及酶的研究较少。2012年以来，Culligan等从人肠道微生物宏基因组文库中筛选获得耐盐克隆，并相继得到mazG(Culligan et al.，2012)，stlA(Culligan et al.，2013)，sdtR(Culligan et al.，2014a)和brpA(Culligan et al.，2014b)等与耐盐性相关的基因。2018年，Verma等又从人粪便宏基因组文库中筛选获得TMSRP1、ABCTPP、TLSRP1等与其耐盐相关的基因。此外，Ilmbergeret al.(Ilmberger et al.，2012)从动物胃肠道宏基因组中获得耐盐的水解酶celA84，其在4M NaCl条件下处理34天保留50％的相对酶活。上述耐盐相关基因及酶的发现，证实了胃肠道微生物蕴含着丰富的耐盐基因及酶，并可通过宏基因组学技术进行挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动物粪便宏基因组来源的耐盐六磷酸海藻糖水解酶，同时还提供了该水解酶的构建方法，本发明耐盐六磷酸海藻糖水解酶具有良好的耐盐特性。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种动物粪便宏基因组来源的耐盐六磷酸海藻糖水解酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，共545个氨基酸，理论分子量为65.21kDa。

所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶最适作用pH为7.5，在pH7.0～8.0范围内处理1h后，酶活剩余90％以上；最适作用温度为30℃，在37℃条件下耐受1h对酶活无影响；该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)；在0.5-5MNaCl条件下处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5M NaCl条件下处理24h其酶活甚至提高到43倍。

所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶所具有的良好的耐盐特性，具有用做报告基因及在其它盐环境中的应用潜力。

所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶在盐环境中降解六磷酸海藻糖的应用也在本发明的保护范围之内。

在本发明的另一方面，提供了所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因大小为1638bp。

在本发明的另一方面提供了包含所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶编码基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体为pEasy-E2-tre_P2。

在本发明的另一方面，提供了包含所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶编码基因重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/tre_P2。

本发明通过PCR的方法克隆到六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2，将基因tre_P2与质粒pEasy-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。

在本发明的另一方面，提供了所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的制备方法，包括以下步骤：

1)从宏基因组文库中筛选耐盐克隆，并提取其fosmid质粒；

2)以所述fosmid质粒DNA为模板，以SEQ ID NO.3所示的引物tre_P2-F和SEQ IDNO.4所示的引物tre_P2-R进行PCR扩增，得到六磷酸海藻糖水解酶基因；

3)将六磷酸海藻糖水解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组六磷酸海藻糖水解酶表达；

4)回收并纯化所表达的六磷酸海藻糖水解酶，得到六磷酸海藻糖水解酶。

本发明的有益效果为：

本发明所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适pH为7.5；经pH 7.0～8.0的缓冲液处理1h后，酶活剩余90％以上；最适温度为30℃；在37℃条件下耐受1h，其仍保持100％酶活；45℃条件下耐受30min，酶活损失至约30％；在pH 7.5，温度30℃，100mM NaCl条件下，该酶的Km、和Kcat分别为15.63mM和10.04s^-1；GuHCl，KCl，NaCl，EDTA，β-巯基乙醇，DTT，EGTA，MgCl₂和MnSO₄对六磷酸海藻糖水解酶有增强作用，PbCl₂，CTAB，AgNO₃，CuSO₄，Hg Cl₂，ZnSO₄完全抑制其活性。该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)。在0.5-5M NaCl中处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5M NaCl条件下处理24h其酶活提高43倍。以上性质表明，本发明制备的耐盐六磷酸海藻糖水解酶在报告基因及其它高盐环境具有潜在的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组六磷酸海藻糖水解酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pEasy-E2载体的大肠杆菌诱导后的初酶；2：未纯化的重组六磷酸海藻糖水解酶；3：纯化的重组六磷酸海藻糖水解酶；

图2是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶的最适pH；

图3是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶的pH稳定性；

图4是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶的最适温度；

图5是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶的温度稳定性；

图6是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶NaCl的影响。

图7是本发明实施例提供的重组六磷酸海藻糖水解酶NaCl的耐受性；

图8是本发明实施例六磷酸海藻糖水解酶对葡萄糖、六磷酸葡萄糖、海藻糖和六磷酸海藻糖的分解；其中：1：葡萄糖；2：葡萄糖+TRE_P2；3：六磷酸葡萄糖；4：六磷酸葡萄糖+TRE_P2；5：海藻糖；6：海藻糖+TRE_P2；7：六磷酸海藻糖；8：六磷酸海藻糖+TRE_P2。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：菌株Escherichia coliEPI300和载体pCC1FOS购于EPICENTRE公司，E.coli BL21(DE3)购于Novagen公司，大肠杆菌表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。

2、基因工程操作酶类、试剂盒及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司，ZR BAC DNAM iniprep kit购自zymo research公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、LB培养基：Peptone10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ML，pH自然(约为7)。7％(w/v)NaCl LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 70g。固体培养基在以上基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2的获得

1)倭蜂猴粪便微生物宏基因组耐盐克隆的筛选

从已构建倭蜂猴粪便微生物fosmid文库(构建方法参照一种来自动物粪便宏基因组的α-淀粉酶及其基因，申请号：CN103290039A)转接1ml活化的菌液到20ml LB液体培养基(含7％NaCl和12.5μg/mL氯霉素)，37℃培养24h，再从中取1mL转接到新的20mL LB液体培养基(含12.5μg/mL氯霉素和7％NaCl)，37℃培养24h，如此重复3次后取150μL涂布于相同培养基的板上，37℃培养3天，长出的克隆即为耐盐克隆。将上述耐盐克隆进一步活化后利用酶标仪检测培养物OD₆₀₀的光密度值，挑选光密度值最高的10个克隆测序。

2)耐盐克隆的测序

采用试剂盒ZR BAC DNAMiniprep kit，按试剂盒说明书步骤提取上述耐盐克隆的fosmid质粒。利用Illumina Solexa Genome Analyzer对上述耐盐克隆进行测序。质粒测序得到的数据经去除原始测序序列两端质量低的碱基、含接头的序列、碱基平均质量低的序列、含多个N的序列和长度太短的序列后得到clean data，对其测序质量值、长度、GC等进行数据产量和质量评估。

利用SPAdes(v3.11.1)对所得clean data进行de novo拼接，获得高质量的Scaffold片段，过滤<300bp的片段。用megablast与NCBI plasmid数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plasmid/)进行比对，依据identity≥30％、mathlength≥200过滤比对结果，然后利用cBar(v1.2)和PlasmidFinder(v1.3)进行plasmid鉴定。

选取被cBar或PlasmidFinder鉴定为plasmid的scaffold片段进行基因预测，预测软件为Prodigal(v2.6.3)。针对编码基因序列进行NCBI-NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO、Pfam等数据库功能注释和分泌蛋白预测分析，比对软件选用blast(v2.7.1+)和diamond(v0.9.10)，根据identity、e-value和score值过滤掉可靠性低的比对结果，筛选最优结果作为该条基因的功能注释结果。从而得到六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3)六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2的克隆

以tre_P2-F:5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGAATTGATGAGTGAACAAGACTGG-3’和tre_P2-F，5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTCGCCGTTTCAACCACAATTGC-3’为引物对，用所述耐盐克隆测序结果中含六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2的fosmid质粒DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火15sec，72℃延伸1Min，35个循环后，72℃延伸10Min。PCR结果得到目的基因tre_P2。

实施例2六磷酸海藻糖水解酶TRE_P2的制备

将实施例1制备的六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2与质粒pEasy-E2连接得到重组表达载体pEasy-E2-tre_P2，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/tre_P2。取含有重组表达载体pEasy-E2-tre_P2的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/tre_P2，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mLAmp)培养液中，37℃180rpm过夜培养。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃180rpm培养约2～3h(OD₆₀₀达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.7MM的IPTG诱导，于20℃160rpm培养约20h。8000rpm离心8Min，收集菌体。用适量的结合缓冲液(0.5M NaCl，20MM咪唑，20MM Tris-HCl，pH8.0)悬浮菌体后，于高压细胞破碎仪破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12,000rpm，4℃离心10Min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白，得到耐盐六磷酸海藻糖水解酶TRE_P2。

对所述纯化目的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组六磷酸海藻糖水解酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pEasy-E2载体的大肠杆菌诱导后的初酶；2：未纯化的重组六磷酸海藻糖水解酶3：纯化的重组六磷酸海藻糖水解酶。由图1可知，重组六磷酸海藻糖水解酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3耐盐六磷酸海藻糖水解酶TRE_P2的性质测定

酶活性测定方法参照Chuang et al.(Chuang et al.，2012)：用p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(pNPG)作为底物。总体系1Ml中含5MM pNPG，100MM NaCl，50MMhepes-NaOH缓冲液(pH7.5)，并加入适当的酶于30℃反应10Min，煮沸5Min终止，离心后于A410处测量吸光度。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟催化底物生成1μmol相应产物所需的酶量。

1)耐盐六磷酸海藻糖水解酶TRE_P2的最适pH和pH稳定性的测定

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的耐盐六磷酸海藻糖水解酶TRE_P2在30℃，100MM NaCl和pH 3～pH 12的缓冲液中进行酶促反应。

酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH 3～pH 12的缓冲液中，在30℃下处理1h后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。

缓冲液为：柠檬酸-Na₂HPO₄(pH3-5)，hepes-NaOH(6.5-12)。以pNPG为底物，反应10Min，测定纯化的六磷酸海藻糖水解酶的酶学性质。

结果参见图2和图3，图2为本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶最适pH，图3为本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的pH稳定性。由图2和图3可知，本发明提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适pH为7.5；经pH 7.0～8.0的缓冲液处理1h后，酶活剩余90％以上。

2)耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适温度及温度稳定性测定

酶的最适温度测定：在pH 7.5，100MM NaCl中，于0～70℃下进行酶促反应。

酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度(37℃、45℃、50℃)中处理1h，每隔10分钟在pH 7.5及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。

结果参见图4、图5。图4是本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适温度，图5是本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的温度稳定。结果表明：耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适温度为30℃，在37℃条件下保持稳定。

3)耐盐六磷酸海藻糖水解酶的NaCl影响及NaCl耐受性测定

酶的NaCl影响测定：在30℃，pH 7.5，0.5～5M NaCl反应条件下进行酶促反应。

酶的NaCl稳定性测定：将同样酶量的酶液置于0.5～5M NaCl反应条件中处理1h和24h，在pH 7.5及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。

结果参见图6、图7。图6是本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的NaCl影响，图7是本发明实施例提供的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的NaCl耐受。结果表明：该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)。在0.5-5M NaCl条件下处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5M NaCl条件下处理24h其酶活提高43倍。

4)重组六磷酸海藻糖水解酶的动力学参数测定

动力学参数在pH 7.5、温度30℃和一级反应时间下以不同浓度的pNPG为底物(0.5-10MM)进行测定，根据Lineweaver-Burk法计算出Km、和Kcat值。经测定，在pH 7.5及温度30℃条件下该酶的Km和Kcat分别为15.63MM和10.04s^-1。

5)不同金属离子及化学试剂对重组六磷酸海藻糖活力影响测定

在酶促反应体系中加入化学试剂(终浓度为1MM)，研究其对酶活的影响。在30℃，pH 7.5，100mM NaCl条件下，测定酶活(同样条件下以未加金属离子及化学试剂的酶促反应作为对照)，结果参见表1。

表1表明，GuHCl，KCl，NaCl，EDTA，β-巯基乙醇，DTT，EGTA，MgCl₂和MnSO₄对六磷酸海藻糖水解酶有增强作用，PbCl₂，CTAB，AgNO₃，CuSO₄，HgCl₂，ZnSO₄完全抑制其活性。

表1化学试剂对重组六磷酸海藻糖水解酶的活力影响

6)重组六磷酸海藻糖对不同底物降解的测定

30℃，pH 7.5，100mM NaCl条件下，上述酶活性测定体系中加入相同浓度的不同底物(p-nitrophenyl-β-D-galacopyranoside,p-nitrop henyl-β-D-glucopyranoside,p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside,2-nitr ophenyl-β-D-glucopyranoside.)，测定酶活(以pNPG为底物的酶活作为对照)，结果表明重组六磷酸海藻水解酶均不分解以上底物。同时，将纯化后的重组六磷酸海藻糖水解酶分别置于0.5％(w/v)的葡萄糖，六磷酸葡萄糖，海藻糖和六磷酸海藻糖于pH7.5，30℃孵育2h，取2μl反应液进行硅胶薄层层析，展开2h，显色剂浸泡30sec，120℃显色15min。

展开剂配方：冰醋酸：2ml，双蒸水：2ml，正丁醇：4ml。

显色剂配方：1g二苯胺溶于50ml丙酮中，溶解后加入1ml苯胺，5ml85％的正磷酸。

结果参见图8，重组六磷酸海藻糖水解酶能有效降解六磷酸海藻糖，但不能降解葡萄糖，六磷酸葡萄糖和海藻糖。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 耐盐六磷酸海藻糖水解酶基因(tre_P2)

<400> 1

atgagtgaac aagactggag aaaatcagtt gtttatcaaa tatatcccaa atcatttaat 60

gatacgacag gcaatggtga gggtgattta aaaggtatta ttgagaaact agattattta 120

cattttctag gcgtagatta catatggtta acgccaattt atgaatcgcc tatgaacgat 180

aatgggtatg atattagtaa ttatcttact attaatgaac aatttggtac tttagaagat 240

tttaaagttt tagtgaaaga agctcatcga cgagatatta aagtaatgat ggatattgtg 300

attaaccata catcaacaga acatcaatgg tttaaggaag ccattcaatc taaagatagt 360

ccttatcgag actattattt ctttagacat tcggaggatg gaccggccac aaattgggaa 420

tccaaattcg gaggtaatgc atggcaatat gatgaaaaaa gtgatgacta ttatttacac 480

ttatttgatg ttactcaagc agatttaaat tgggataatc cagaagttag acaagccctt 540

tatcaaattg tcaattattg gattgatttt ggtgtggatg gtttccggtt tgatgtgatc 600

aatcttattt ccaaaggtga atttaaggac tctgacaaaa tcggaaaaga gttttatacg 660

gatggaccca aagtgcatga gtatttacat gaattgaatc aacatacatt tggtaataag 720

aatatgatga ctgtcggtga aatgtcgtct actaccattg atcactgtat taaatattct 780

aatccagaaa gaaaagaatt gagtagtgta tttaatttcc atcatttaaa agtagattat 840

cctgacggtg aaaaatgggc taagggtagt atggattttc aacaacttaa aaaaatattg 900

atggattggc aattaggtat atatgaaggt ggtggctgga atgcgatatt ctggtgtaat 960

cacgaccaac cacgtgtagt ttcacgcttc ggggatgata gttctgaatc tttacgtcaa 1020

gcaagcgcta aaacattagc catctcacta cacatgctac aagggacacc atatatttat 1080

caaggcgaag aaattggtat gaccaaccct catttcaatt caatagatgc ttatagagat 1140

gtagaatcat taaatgctta tgattatttg aaaaaacagg gatacaacga gcaagacatt 1200

ttagaaatat tagatcaaaa atcacgtgac aactctcgta cgccaatgca atggaatgca 1260

acaaatcatg caggttttac aactggagaa ccttggattt ctattcctca gaactatcac 1320

catattaatg tggaacaagc aatgaaagat tctgagtcta ttttacacac atataaaaca 1380

ttgatttcat taagacatca tcacgatata ataacttatg gtaatattga accgatgtat 1440

atggaacacg aacaattatt tgtatatcgt cgtcattatc gcaatcaaac ttggttggtt 1500

attgctaatt tctctaaaga acctgtatta ttacctgaag atttagatgt ctcaggtgat 1560

gtaattattc aaaatggaat attagagcaa cgtcaaatgt caggctttgg tgcaattgtg 1620

gttgaaacgg cgaagtaa 1638

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> 耐盐六磷酸海藻糖水解酶(TRE_P2)

<400> 2

Met Ser Glu Gln Asp Trp Arg Lys Ser Val Val Tyr Gln Ile Tyr Pro

1 5 10 15

Lys Ser Phe Asn Asp Thr Thr Gly Asn Gly Glu Gly Asp Leu Lys Gly

20 25 30

Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu His Phe Leu Gly Val Asp Tyr Ile

35 40 45

Trp Leu Thr Pro Ile Tyr Glu Ser Pro Met Asn Asp Asn Gly Tyr Asp

50 55 60

Ile Ser Asn Tyr Leu Thr Ile Asn Glu Gln Phe Gly Thr Leu Glu Asp

65 70 75 80

Phe Lys Val Leu Val Lys Glu Ala His Arg Arg Asp Ile Lys Val Met

85 90 95

Met Asp Ile Val Ile Asn His Thr Ser Thr Glu His Gln Trp Phe Lys

100 105 110

Glu Ala Ile Gln Ser Lys Asp Ser Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Phe

115 120 125

Arg His Ser Glu Asp Gly Pro Ala Thr Asn Trp Glu Ser Lys Phe Gly

130 135 140

Gly Asn Ala Trp Gln Tyr Asp Glu Lys Ser Asp Asp Tyr Tyr Leu His

145 150 155 160

Leu Phe Asp Val Thr Gln Ala Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Glu Val

165 170 175

Arg Gln Ala Leu Tyr Gln Ile Val Asn Tyr Trp Ile Asp Phe Gly Val

180 185 190

Asp Gly Phe Arg Phe Asp Val Ile Asn Leu Ile Ser Lys Gly Glu Phe

195 200 205

Lys Asp Ser Asp Lys Ile Gly Lys Glu Phe Tyr Thr Asp Gly Pro Lys

210 215 220

Val His Glu Tyr Leu His Glu Leu Asn Gln His Thr Phe Gly Asn Lys

225 230 235 240

Asn Met Met Thr Val Gly Glu Met Ser Ser Thr Thr Ile Asp His Cys

245 250 255

Ile Lys Tyr Ser Asn Pro Glu Arg Lys Glu Leu Ser Ser Val Phe Asn

260 265 270

Phe His His Leu Lys Val Asp Tyr Pro Asp Gly Glu Lys Trp Ala Lys

275 280 285

Gly Ser Met Asp Phe Gln Gln Leu Lys Lys Ile Leu Met Asp Trp Gln

290 295 300

Leu Gly Ile Tyr Glu Gly Gly Gly Trp Asn Ala Ile Phe Trp Cys Asn

305 310 315 320

His Asp Gln Pro Arg Val Val Ser Arg Phe Gly Asp Asp Ser Ser Glu

325 330 335

Ser Leu Arg Gln Ala Ser Ala Lys Thr Leu Ala Ile Ser Leu His Met

340 345 350

Leu Gln Gly Thr Pro Tyr Ile Tyr Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr

355 360 365

Asn Pro His Phe Asn Ser Ile Asp Ala Tyr Arg Asp Val Glu Ser Leu

370 375 380

Asn Ala Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Gln Gly Tyr Asn Glu Gln Asp Ile

385 390 395 400

Leu Glu Ile Leu Asp Gln Lys Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met

405 410 415

Gln Trp Asn Ala Thr Asn His Ala Gly Phe Thr Thr Gly Glu Pro Trp

420 425 430

Ile Ser Ile Pro Gln Asn Tyr His His Ile Asn Val Glu Gln Ala Met

435 440 445

Lys Asp Ser Glu Ser Ile Leu His Thr Tyr Lys Thr Leu Ile Ser Leu

450 455 460

Arg His His His Asp Ile Ile Thr Tyr Gly Asn Ile Glu Pro Met Tyr

465 470 475 480

Met Glu His Glu Gln Leu Phe Val Tyr Arg Arg His Tyr Arg Asn Gln

485 490 495

Thr Trp Leu Val Ile Ala Asn Phe Ser Lys Glu Pro Val Leu Leu Pro

500 505 510

Glu Asp Leu Asp Val Ser Gly Asp Val Ile Ile Gln Asn Gly Ile Leu

515 520 525

Glu Gln Arg Gln Met Ser Gly Phe Gly Ala Ile Val Val Glu Thr Ala

530 535 540

Lys

545

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagaaggag atatacatat ggaattgatg agtgaacaag actgg 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gcttcgccgt ttcaaccaca attgc 45

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的耐盐六磷酸海藻糖水解酶在盐环境中降解六磷酸海藻糖的应用，其特征在于，盐环境为100mM NaCl。