CN111039909A - 用于检测醛类物质的荧光衍生试剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及六种脂肪醛的检测,尤其涉及一种用于检测醛类物质的荧光衍生试剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前,生活中的醛类来源于食品加工、水消毒副产物、装修和家具制造、有机燃料的不完全燃烧与工业排放。醛类是重要的污染物,它们具有分子量小、挥发性强、极性强等性质,因此极易进入环境中与人体接触造成一系列负面影响。环境中的醛类有许多危害:首先是致癌性,许多醛类能够降解肿瘤抑制蛋白,破坏DNA损伤修复机制,国际癌症研究机构(IARC)更是直接将甲醛等认定为人类致癌物;其次是强刺激性,例如甲醛对呼吸道黏膜有刺激作用,长期慢性刺激可引起黏膜充血,诱发呼吸道炎症;最后是致敏性,皮肤接触醛类可引起过敏性皮炎、色斑、皮肤坏死等症状。因此,对于醛类的及时精确的检测和防护势在必行。
由于实际样品中基质环境较为复杂,且醛类化合物含量较低,直接对其进行检测较为困难,所以通常需要采取一系列前处理方法(包括萃取、衍生等)将醛类化合物从复杂样品中分离出来。醛类化合物亲水性好,极性较大,稳定性较差,而且大部分醛类化合物本身不具备生色团或者荧光团,所以不能采用光学检测器对其进行检测,需要使用合适的衍生化处理方法对其进行处理,使其能够被合适的检测仪器检测。
目前,国内外常用的醛类的检测方法是2,4二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生-HPLC/PDA进行检测,但是基于PDA检测器灵敏度的限制,其检测限均处于一个较高数值的水平,对于样品中较低浓度的醛的检测与监控无法达到,而荧光检测器(FLD)灵敏度要比PDA检测器高,但荧光检测器对衍生化试剂的选择有较高的要求,需要其自身能发出荧光或者产物能发出荧光,因此,寻找合适的衍生化试剂是实现荧光检测醛类化合物的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷,提供了一种用于检测醛类物质的荧光衍生试剂及其制备方法与应用,本发明开发出一种具有荧光性的新型羟胺类衍生试剂HAMC其自身能发出荧光,该用于检测醛类物质的荧光衍生试剂与醛类化合物标准样品、检测用缓冲溶液一起制成的检测试剂盒在高效液相色谱-荧光检测器下检测能检测到较低浓度的醛,检测高效、准确。
本发明是这样实现的:
本发明目的之一在于提供一种用于检测醛类物质的荧光衍生试剂,所述检测试剂包括4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素,其为具有如下结构式的化合物:
本发明目的之二在于提供所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:将4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟溶解于甲醇,搅拌,加入NaCNBH3,然后调节反应液pH 2~3至反应完全即得。
优选地,所述4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟与NaCNBH3的摩尔比为0.5~1:5~6。
优选地,所述4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟的制备步骤包括:
S1、制备化合物6:将TMSCl(三甲基氯硅烷)和锌粉加入到无水乙醚中,室温搅拌加热至回流,在上述回流体系中滴加环戊酮和溴乙酸乙酯的混合溶液反应制得化合物6;
S2、制备化合物7:将化合物6和K2CO3加入到CHCl3中搅拌,滴加液溴到上述反应体系中反应制得化合物7;
S3、制备化合物8:将化合物7加入到饱和氯化铵溶液中搅拌,然后将铜锌合金粉末加入到上述反应体系中反应制得化合物8;
S4、制备化合物9:将间甲氧基苯酚加入到浓H2SO4中冰水浴,将化合物8滴加到上述反应体系中反应制得化合物9;
S5、制备化合物10:将化合物9加入到水中110~120℃反应制得化合物10;
S6、制备化合物11:依次将化合物10、PCC(氯铬酸吡啶盐)以及乙酸钠、硅藻土加入到丙酮中,60~70℃下回流反应制得化合物11;
S7、制备化合物12:将化合物11加入到THF溶剂中,加入盐酸羟胺,然后调节反应液pH至3.5~4.5,室温反应经后处理即得化合物12,即该4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟。
更为优选地,所述S1中,TMSCl、锌粉、环戊酮、溴乙酸乙酯的摩尔比为12:8:10:12;
所述S2中,化合物6、K2CO3、液溴的摩尔比为1:6:5;
所述S3中,化合物7、铜锌合金粉末的质量比为4~5:12~13;
所述S4中,化合物8、间甲氧基苯酚的摩尔比为1~2:2;
所述S6中,化合物10、PCC、乙酸钠的摩尔比为1~2:5~6:3~4:12;硅藻土与所述化合物10的质量比为17~18:9~10;
所述S7中,化合物11与盐酸羟胺的摩尔比为1~2:4~5。
需要说明的是采用上述比例范围内反应均能得到该用于检测醛类物质的荧光衍生试剂,其表征性能同实施例1。
本发明的目的之三在于提供所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂在检测醛类物质中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种用于检测醛类物质的试剂盒,包括所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂。
所述用于检测醛类物质的试剂盒还包括醛类化合物标准样品、检测用缓冲溶液。优选地,所述醛类化合物标准样品包括甲醛标准浓度样品、乙醛标准浓度样品、丙醛标准浓度样品、丁醛标准浓度样品、戊醛标准浓度样品、己醛标准浓度样品;所述检测用缓冲溶液包括乙酸-乙酸钠缓冲液。更为优选地,所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂浓度为0.5mmol/L;所述醛类化合物标准样品的浓度均为1mmol/L;乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH 4.5。
本发明的目的之五在于提供一种醛类物质检测方法,所述方法包括如下步骤:
步骤1、试剂的配制:准备醛类化合物标准样品、检测用缓冲溶液以及权利要求1所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂;
步骤2、检测分析:将所述准备好的试剂混合均匀后在水浴锅中反应,将反应后的溶液送入高效液相色谱-荧光检测器检测。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和效果:
本发明的技术方案首次选用HAMC作为醛类化合物的转化试剂,使醛类化合物转化成可用于高效液相色谱标记,且能被荧光检测器检测的化合物,实现了醛类化合物的荧光检测,具有操作简单,灵敏度高,检出限低等特点,为低含量醛类化合物的检测提供方法依据。
附图说明
图1为实施例1提供的4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素荧光光谱图。
图2为实施例1提供的4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的核磁氢谱图。
图3为实施例1提供的4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的核磁碳谱图。
图4为实施例1提供的4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的质谱图。
图5为衍生试剂4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素与醛类反应原理图。
图6为橙汁样品与HAMC衍生产物色谱图;
图7为衍生试剂检测醛类物质的稳定性检测结果。
具体实施方式
下面将结合实例对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件,均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
实施例1 4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的制备与表征
一、4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的制备
1、Ethyl 2-(1-hydroxycyclopentyl)acetate(化合物6)的合成
TMSCl(0.9mL,72mmol)和锌粉(6.3g,96mmol)加入到150mL无水乙醚中,室温搅拌15min。加热至回流(40℃),在上述回流体系中滴加环戊酮(5g,60mmol)和溴乙酸乙酯(12.0g,72mmol)的混合溶液,加料完毕后,回流反应20min,然后继续反应1h,TLC监控至原料消失。反应结束后,待反应体系冷却后,加入300mL 2N盐酸,搅拌15min。分离有机相,水相用乙醚(2×50mL)萃取,合并有机相,用5%NaHCO3溶液洗涤有机相,有机相用K2CO3干燥。旋蒸掉乙醚,并用硅胶柱分离(PE:EA=30:1,V/V),得到无色澄清液体6,9.66g,产率为93.6%。
2、Ethyl 2,2,7-tribromo-3-oxoheptanoate(化合物7)的合成
将化合物6(5.16g,30mmol)和K2CO3(24.8g,180mmol)加入到100mL CHCl3中,0℃下搅拌10min,慢慢滴加液液溴(24g,150mmol)到上述反应体系中,0℃下继续反应10h,TLC点板至原料消失,停止反应。慢慢加饱和Na2S2O3到反应瓶中,至反应液颜色由红棕色变浅淡黄色,分液,有机相继续用饱和Na2S2O3洗涤一至两次。用Na2SO4干燥有机相,旋蒸除去CHCl3,得到黄色油状液体,硅胶柱分离(PE:EA=30:1,V/V),得到黄色油状液体7,11.66g,产率为95.8%。
3、Ethyl 7-bromo-3-oxoheptanoate(化合物8)的合成
将化合物7(4.8g,12mmol)加入到60mL饱和氯化铵溶液中,搅拌,维持反应温度在10~15℃。然后将铜锌合金粉末(12.3g,300目)慢慢加入到上述反应体系中,维持上述反应温度搅拌反应1.5h,TLC点板至原料消失。反应结束后,普通过滤,用Na2SO4干燥有机相,然后旋蒸除去大部分溶剂,硅胶柱分离(PE:EA=30:1,V/V)得到红棕色液体8,1.94g,产率65%。
4、4-(4-Bromobutyl)-7-methoxy-2H-chromen-2-one(化合物9)的合成
将间甲氧基苯酚(3.12g,25mmol)加入到20mL浓H2SO4中,冰水浴。慢慢将化合物8(6.2g,24.8mmol)滴加到上述反应体系中(5min滴加完毕)。滴加完毕后,撤掉冰浴,室温反应,TLC点板跟踪至化合物8消失。反应结束后,将反应液倾入150mL碎冰中,搅拌、静置,用乙酸乙酯萃取(3×50mL),合并有机相,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去溶剂,硅胶柱分离(PE:EA=3:1,V/V)得到白色固体9,1.83g,产率为23.7%。
5、4-(4-hydroxybutyl)-7-methoxy-2H-chromen-2-one(化合物10)的合成
将化合物9(1.87g,6.20mmol)加入到100mL水中,115℃过夜。TLC点板至原料消失,反应结束后趁热过滤不容物,随后将反应体系冷却至室温,有白色针状晶体析出,待结晶完全后,普通过滤,真空干燥,得部分产物,滤液用乙酸乙酯萃取,然后硅胶柱分离(PE:EA=5:1,V/V),即得到白色针状固体化合物10,0.842g,产率56.5%。
6、4-(7-Methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)butanal(化合物11)的合成
依次将化合物10(470mg,1.89mmol)、PCC(612mg,2.84mmol)以及乙酸钠(468mg,3.42mmol)、硅藻土(882mg)加入到40mL丙酮中,65℃下回流反应2h,补加PCC(612mg,2.84mmol),继续反应2h,TLC点板至原料基本消失,停止反应。反应液用硅胶柱预过滤,除去多余PCC和其它固体沉淀,浓缩滤液,硅胶柱分离(PE:EA=1:1,V/V),得到白色粉末化合物11,285.5mg,产率为61.2%。
7、4-(7-Methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)butanal oxime(化合物12)的合成
将化合物11(292mg,1.19mmol)加入到6mL混合溶剂(THF:H2O=1:1)中,加入盐酸羟胺(306mg,4.90mmol),然后用2M NaOH溶液调节反应液pH=4,室温反应,TLC跟踪至原料消失。反应结束后,旋蒸除去溶剂,硅胶柱分离(PE:EA=1:1,V/V)得到白色粉末化合物12,249.4mg,产率为80.45%。
8、4-(4-(Hydroxyamino)butyl)-7-methoxy-2H-chromen-2-one(化合物HAMC)的合成
将化合物12(231mg,0.89mmol)溶解于2mL甲醇,搅拌使得固体几乎全部溶解,分批加入NaCNBH3(331.8mg,5.27mmol),然后用氯化氢饱和甲醇溶液调节反应液pH 2~3。TLC监控至原料消失。反应结束后,加入少量水使得反应瓶中固体全部溶解,随后使用HPLC分离,得到化合物13,即本发明的4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素(HAMC)162.9mg,白色透明固体,产率为69.8%。
二、4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的表征
1、化合物(HAMC)的表征数据
4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素的核磁氢谱图、核磁碳谱图、质谱图分别如图2、图3、图4所示。
新合成物质表征数据如下:1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ11.40(s,1H),10.84(s,1H),7.76(d,J=8.9Hz,1H),6.95-6.99(m,2H),6.20(s,1H),3.86(s,3H),3.12-3.17(m,2H),2.79-2.82(m,2H),1.64-1.78(m,4H);13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ162.78,160.72,156.89,155.52,126.78,112.64,110.77,101.41,56.40,50.17,30.75,25.21,23.21.ESI-MS,m/z:264[M+H]+,286[M+Na]+.
综上可知,本发明成功制备得到了4-羟胺基丁基-7-甲氨基-香豆素。
2、HAMC的荧光性质
为了验证设计合成的HAMC探针的荧光性质,我们对化合物HAMC进行了荧光光谱以及量子产率的测定。
(1)标准物质的荧光光谱测定:选取硫酸奎宁作为标准物质,以0.1M的硫酸溶液为溶剂,配制浓度为2μM的硫酸奎宁溶液,HAMC溶液用乙腈-水(v/v,1:9)稀释到2μΜ。待测溶液HAMC和标准溶液硫酸奎宁的紫外吸收光谱由紫外分光光度计进行测量。测量硫酸奎宁的荧光光谱图时,将其激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别设为10nm和15nm。然后再将其激发波长固定为355nm,测量该标准溶液的发射光谱图。
(2)荧光试剂激发和发射光谱的测定方法:称取2.63mg HAMC溶于1mL的纯甲醇溶液中,得到10mM的HAMC溶液。再用乙腈-水溶液(v/v,1:9)将该溶液稀释到2μM,利用荧光光谱仪RF-5301对该试剂的激发发射进行测定。进行测量时,首先设定狭缝宽度,其激发狭缝设定为10nm,发射狭缝设定为15nm。测发射波长时,将激发波长设定在300nm,发射波长的扫描范围为300-500nm;测激发波长时,将发射波长设定在390nm,激发波长的扫描范围为200-450nm。最后得到HAMC的激发发射波长分别为320nm和390nm。荧光量子产率测定:在对一种新型荧光试剂进行评价时,量子产率是其中的一个最基本的性质,因此,其数值的测定是一个相当重要的工作。荧光量子产率的计算公式如式
其中,Φ1、Φ2分别是待测溶液和标准溶液的荧光量子产率,F1、F2分别为待测溶液和标准溶液的荧光光谱峰积分面积,A1、A2分别为待测溶液和标准溶液的吸光度,η1、η2分别为待测溶液和标准溶液的折光率。
(3)化合物HAMC的荧光光谱以及量子产率的结果如表1所示。
表1
由表1可知,阿贝折光仪测得HAMC的溶剂10%乙腈溶液的折射率为1.3351,标准溶液硫酸奎宁的溶剂0.1M硫酸溶液的折射率为1.3352。通过以上公式计算得出,该新型荧光探针的荧光量子产率为0.72,说明这种荧光物质具有较强的荧光强度。
实施例2用于检测醛类物质的试剂盒及检测方法
1、检测试剂盒的组成
(1)醛类化合物标准样品:包括有以下成分(按摩尔浓度计)
每瓶2mL甲醛标准浓度样品(1mmol/L)。
每瓶2mL乙醛标准浓度样品(1mmol/L)。
每瓶2mL丙醛标准浓度样品(1mmol/L)。
每瓶2mL丁醛标准浓度样品(1mmol/L)。
每瓶2mL戊醛标准浓度样品(1mmol/L)。
每瓶2mL己醛标准浓度样品(1mmol/L)。
(2)每瓶2mL HAMC醛检测试剂(0.5mmol/L)。
(3)检测用缓冲溶液中包括有以下成分(按摩尔浓度计):每瓶2mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH4.5)。
2、检测方法
本发明试剂盒使用时,首先取出六种醛标准样品,配制混合醛标准溶液,取出10μL混合醛标准溶液,加入20μL检测试剂HAMC和10μL缓冲溶液(0.1mol/L,pH4.5)混合均匀后在40℃的水浴锅中反应30min,将反应后的溶液送入高效液相色谱-荧光检测器检测,即得色谱图。
记录各峰对应保留时间和峰面积,多次调整混合醛标准溶液浓度,重复后续衍生步骤,得到不同浓度不同种类的醛标准溶液对应的峰面积,即可绘制各种醛类对应的浓度-峰面积拟合曲线。对照各种标准醛色谱峰对应的保留时间,即可判断待测样中醛的种类,将待测样色谱图中各峰面积与各种标准醛浓度-峰面积拟合曲线进行对照即可得到待测样品溶液中各醛的浓度。
实施例3试剂盒的性能测定
1、线性回归方程:选取一系列不同浓度(从LOD到8000nM)的C1-C6脂肪醛标准溶液进行分析,以衍生前样品浓度为横坐标(X),衍生产物的峰面积为纵坐标(Y),得到标准曲线。
2、检测限:不断降低反应物浓度,直到产物峰S/N=3时,对应脂肪醛浓度即检测限。
3、精密度:平行做6个相同的反应样(同一天),分别进样,以评估日内RSD;每日平行做6个相同的反应样,连续做三日,分别进样,以评估日间RSD。
甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、已醛标准物质的线性范围、回归方程、检测限及精密度结果结果如表2所示
表2
Y=峰面积(V·min),X=样品浓度(nM).
由表2可知,在混合醛的浓度范围为0.2-8000nM中,具有良好的线性,其相关系数R值为0.9927到0.9997。所有混合醛的检测限为0.2-0.8nM,显示出该方法具有较高的灵敏性。日内RSD和日间RSD的范围分别为0.8-4.1%和2.5-5.1%,说明我们所建立的方法具有很高的准确度。
4、稳定性测定
为了探讨衍生产物的稳定性,将混合醛与HAMC用上述反应条件进行衍生后,将反应样在室温条件下避光保存24h,48h,96h后,按照上述的色谱条件进行分析,其结果如图7所示,图7中C1-C6分别为甲、乙、丙、丁、戊、已醛。图7结果表明衍生产物的峰面积随着储存时间的增加并没有明显的变化(RSD≤4.3%),这也正说明了衍生产物具有稳定性好的特征。
实施例4橙汁样品溶液中醛类物质的测定
1、采用实施例2所述的方法对橙汁中醛类物质进行测定,图6为橙汁与HAMC衍生产物色谱图。图6中出现C1-C3三个特征峰,表明橙汁中存在甲醛、乙醛、丙醛,且这三种产物峰具有较好的分离度,没有受到复杂基质的影响。
表3
2、实际样品的分析中准确性和重复性测定
在实际样品的分析中,为了验证方法的准确性和重复性,我们将不同浓度(低,中)C1-C3脂肪醛标准溶液加到橙汁样品计算其回收率和精密度RSD。其中每个样品平行测定3次。实验结果如表4所示。
表4
由表4的实验结果可知,回收率为95.9-103.1%(n=3),日内RSD范围为0.64%-6.62%,日间RSD范围为1.72%-5.26%,表明此方法具有准确性和高重复性。
所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
2.一种权利要求1所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:将4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟溶解于甲醇,搅拌,加入NaCNBH3,然后调节反应液pH 2~3至反应完全即得。
3.如权利要求2所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂的制备方法,其特征在于,所述4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟与NaCNBH3的摩尔比为0.5~1:5~6。
4.如权利要求2所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂的制备方法,其特征在于,所述4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟的制备步骤包括:
S1、制备化合物6:将TMSCl和锌粉加入到无水乙醚中,室温搅拌加热至回流,在上述回流体系中滴加环戊酮和溴乙酸乙酯的混合溶液反应制得化合物6;
S2、制备化合物7:将化合物6和K2CO3加入到CHCl3中搅拌,滴加液溴到上述反应体系中反应制得化合物7;
S3、制备化合物8:将化合物7加入到饱和氯化铵溶液中搅拌,然后将铜锌合金粉末加入到上述反应体系中反应制得化合物8;
S4、制备化合物9:将间甲氧基苯酚加入到浓H2SO4中冰水浴,将化合物8滴加到上述反应体系中反应制得化合物9;
S5、制备化合物10:将化合物9加入到水中110~120℃反应制得化合物10;
S6、制备化合物11:依次将化合物10、PCC以及乙酸钠、硅藻土加入到丙酮中,60~70℃下回流反应制得化合物11;
S7、制备化合物12:将化合物11加入到THF溶剂中,加入盐酸羟胺,然后调节反应液pH至3.5~4.5,室温反应经后处理即得化合物12,即该4-(7-甲氧基-2-酮基-2H-苯并吡喃-4-基)丁醛肟。
5.如权利要求4所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂的制备方法,其特征在于,
所述S1中,TMSCl、锌粉、环戊酮、溴乙酸乙酯的摩尔比为12:8:10:12;
所述S2中,化合物6、K2CO3、液溴的摩尔比为1:6:5;
所述S3中,化合物7、铜锌合金粉末的质量比为4~5:12~13;
所述S4中,化合物8、间甲氧基苯酚的摩尔比为1~2:2;
所述S6中,化合物10、PCC、乙酸钠的摩尔比为1~2:5~6:3~4:12;硅藻土与所述化合物10的质量比为17~18:9~10;
所述S7中,化合物11与盐酸羟胺的摩尔比为1~2:4~5。
6.权利要求1所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂在检测醛类物质中的应用。
7.一种用于检测醛类物质的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂。
8.如权利要求7所述的用于检测醛类物质的试剂盒,其特征在于,还包括醛类化合物标准样品、检测用缓冲溶液。
9.如权利要求8所述的用于检测醛类物质的试剂盒,其特征在于,所述醛类化合物标准样品包括甲醛标准浓度样品、乙醛标准浓度样品、丙醛标准浓度样品、丁醛标准浓度样品、戊醛标准浓度样品、己醛标准浓度样品;所述检测用缓冲溶液包括乙酸-乙酸钠缓冲液。
10.一种醛类物质检测方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
步骤1、试剂的配制:准备醛类化合物标准样品、检测用缓冲溶液以及权利要求1所述的用于检测醛类物质的荧光衍生试剂;
步骤2、检测分析:将所述准备好的试剂混合均匀后在水浴锅中反应,将反应后的溶液送入高效液相色谱-荧光检测器检测。
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