CN111039270B - 一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途 - Google Patents

一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途，属于防腐材料技术领域。本发明通过利用2,4‑二羟基嘧啶‑5‑羧酸(异乳清酸)调控磷酸钠盐与锌盐反应，形成的纳米颗粒材料以沉淀形式从溶液中析出，经离心、去上清、洗涤、冷冻干燥制备获得制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。本发明制备的抑菌材料以其花状结构使得磷酸锌的比表面积增大，从而可以接触到更多的微生物菌体，达到更为显著的抑菌效果，对于包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和一些耐抗生素的菌株均有良好的抑制作用，同时，该材料具有低毒、副作用小、生物安全性良好等特性，且材料制备方法简单，可操作性高，具有良好的市场应用前景。

Description

一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于防腐材料技术领域，具体涉及一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途。
背景技术
在过去的几十年中，致病细菌引起的环境污染威胁着人类健康，对杀菌和抑菌研究提出了前所未有的挑战。因此，开发高效安全的杀菌和抑菌材料显得非常迫切。研究发现，一些纳米材料具有抑菌或杀菌性能，与其他抑菌剂不同，由于纳米材料具有较小的尺寸和较大的比表面，表现出较好的抑菌效果。
纳米锌颗粒材料(常见纳米氧化锌)已在农业，化学，医药和食品等多个领域得到应用。纳米锌颗粒作为一种新型无机抗菌材料，成为目前的研究热点，其具有高温不变色，不分解，价格低廉，资源丰富，悬液呈中性等优点，比其它金属氧化物具有更广泛的实用价值。而且，相比于微米级锌颗粒，纳米锌颗粒具有较高的表面势能和更大的比表面积以及更多数量的“表面晶界”，从而能释放较多锌离子，并提高了细菌与材料表面的接触面积，从而增加了材料的抗菌能力。目前，纳米锌颗粒的制备方法主要有水热法、溶胶-凝胶法和微波合成法等。但是这些方法需要控制复杂的制备条件。而且由于其制备方法、反应条件不同，制得的纳米锌颗粒粒径、形貌差异较大，进而抗菌性能也存在较大差异。因此，开发出简便高效、通用性强、形貌可控的纳米锌颗粒制备方法显得尤为重要。
2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)是一种嘧啶羧酸类化合物，具有抗真菌，促进植物生长调节作用，以及可作为杀虫剂、除草剂、杀菌剂和医药中间体而受到人们的关注。它具有很好的生理活性，具有抗肿瘤、抗病毒、抗高血压的特性，一直以来也是医药学和药理学关注的焦点。
中国专利CN 108823964 A公开了一种氧化锌-银复合抗菌棉织物的制备方法，但是制备时间较长，需加入银粉，成本较高，要求条件较高。中国专利CN 109440524 A公开了一种负载纳米氧化锌抗菌纸的制备方法，但是其反应温度较高，制备时间较长成为不可忽略的关注点。中国专利CN 104416986 A公开了纳米氧化锌抗菌复合材料，但是其制备方法较为复杂。中国专利CN 105494434 A公开了氧化锌抗菌复合材料的制备方法，其制备温度高达500℃，制备时间较长操作条件要求较高。中国专利CN 107252395 A公开了含磷酸锌组合物，其制备成分较为复杂。中国专利CN 107385548 A公开了一种磷酸锆抗菌纤维的制备方法，其制备温度高达700℃，制备条件苛刻。以上技术，都存在着制备条件苛刻，成本高等各种问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种安全可靠、生物性能良好、形态美观的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法与用途。
本发明实现目的所采用的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，步骤如下：
(1)制备浓度为1-10g/L的2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)溶液，溶剂为浓度为0.01-0.30mol/L的磷酸钠盐或磷酸钾盐水溶液；
(2)将所述步骤(1)混合溶液pH值调至7.0-11.0，备用；
(3)将所述步骤(2)配置溶液、超纯水、0.1-0.8mol/L锌盐溶液按照体积比(1-10)：(0.1-2)：(0.4-10)混合，静置1-4h，离心取沉淀，经洗涤后，冷冻干燥，获得磷酸锌纳米颗粒材料。
优选的，所述步骤(1)中，2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸浓度为2-8g/L。
更优选的，所述步骤(1)中，2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸浓度为2-4g/L。
更优选的，所述步骤(1)中，2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸浓度为2g/L。
所述步骤(1)中，选择磷酸钠盐或磷酸钾盐的目的不仅使异乳清酸溶解在磷酸盐溶液中，而且为步骤(3)合成磷酸锌，同时利用异乳清酸与锌盐反应生成花状磷酸锌做基础。
优选地，所述步骤(1)中，磷酸钠盐为Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O中的一种。
所述磷酸钠盐为Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O时，使其最终形成的硝酸锌的花状结构更均匀，花型较完整。
优选的，所述步骤(1)中Na2HPO4·12H2O或者NaH2PO4·2H2O溶液中摩尔浓度为0.01-0.30mol/L。
所述步骤(1)中，Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O溶液摩尔浓度可以为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、0.09mol/L、0.10mol/L、0.11mol/L、0.12mol/L、0.13mol/L、0.0.14mol/L、015mol/L、0.16mol/L、0.17mol/L、0.18mol/L、0.19mol/L、0.20mol/L、0.21mol/L、0.22mol/L、0.23mol/L、0.24mol/L、0.25mol/L、0.26mol/L、0.27mol/L、0.28mol/L、0.29mol/L、0.30mol/L。
更优选的，所述步骤(2)中Na2HPO4·12H2O或者NaH2PO4·2H2O溶液摩尔浓度为0.01-0.10mol/L。
优选地，所述步骤(2)中，调节pH所用溶剂为2mol/L NaOH溶液。
所述步骤(2)中，pH值调至7.0-11.0更有利于异乳清酸溶解度的提高，从而更有效地使得异乳清酸调控硝酸锌形成更为均匀、完整的花状结构。
优选的，所述步骤(2)中pH值为7.0-9.0。
更优选的，所述步骤(2)中pH值为8.0。
优选地，所述步骤(3)中，锌盐可为Zn(NO3)2·6H2O、ZnSO4·7H2O、ZnCl2或Zn(CH3COO)2·2H2O中的一种。
更优选的，所述步骤(3)中锌盐为Zn(NO3)2·6H2O、ZnSO4·7H2O或ZnCl2中的一种。
本发明利用Zn(NO3)2·6H2O、ZnSO4·7H2O、ZnCl2相比于其他锌盐，在形成的纳米抑菌材料中，可以形成更为均匀稳定的花状结构，提高了比表面积，从而使得菌体更为亲和地接触抑菌剂，以至于实现更为显著的抑菌效果。
更优选的，所述步骤(3)中锌盐为Zn(NO3)2·6H2O。
所述步骤(3)中，锌盐溶液摩尔浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L。
优选的，所述步骤(3)中，锌盐溶液摩尔浓度为0.2-0.4mol/L。
更优选的，所述步骤(3)中，锌盐溶液摩尔浓度为0.3mol/L。
所述Zn(NO3)2·6H2O在优选的浓度下才更能形成稳定较多的的花状结构。
所述步骤(3)中，所述Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O、超纯水、Zn(NO3)2·6H2O溶液按照体积比为(1-10)：(0.1-2)：(0.4-10)。
所述Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O、超纯水、Zn(NO3)2·6H2O溶液按照体积比可以为10:1:4、10:1:5、10:1:6、10:1:7、10:1:8、10:1:9、10:1:10、10:1:4、10:2:5、10:2:6、10:2:7、10:2:8、10:2:9、10:2:10、10:3:4、10:3:5、10:3:6、10:3:7、10:3:8、10:3:9、10:3:10。
更优选的，所述步骤(3)中，所述Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O、超纯水、Zn(NO3)2·6H2O溶液的体积比为10:(1-2):(4-6)。
更优选的，所述步骤(3)中，所述Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O、超纯水、Zn(NO3)2·6H2O溶液的体积比为10:1:4
优选的，所述步骤(3)中，搅拌转速为8000-12000rpm，时间5-10min，在此离心条件下，离心彻底，易去除多余未参与反应物质。
优选的，所述步骤(3)中，搅拌的反应条件为20-30℃。
所述步骤(3)中，冷冻真空干燥温度为(-45)-(-60)℃、压强为1-10Pa。
时间为6-12h。
本发明的第二个目的是提供由上述制备方法制备获得的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
本发明的第三个目的是提供上述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在抑菌领域中的用途。
优选地，所述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的浓度为1-15mg/mL，溶剂为PBS溶液或水。
优选地，所述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在抑制大肠杆菌中，浓度为1-15mg/mL,溶剂为PBS溶液或水，pH为5.0-6.0。
优选地，所述PBS溶液组成为：NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L、KH2PO4 0.24g，pH为5.0-7.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明首次提出了一种异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料及其制备方法。制备的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料，是2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)调控十二水磷酸氢二钠或二水磷酸二氢钠水溶液与六水硝酸锌反应，形成的纳米颗粒材料以沉淀形式从溶液中析出，经离心、去上清、洗涤、冷冻干燥制备而成。目前，应用较多的纳米抑菌材料多为氧化锌纳米颗粒抑菌材料。但是，氧化锌纳米材料其制备条件较为苛刻，本研究提出了一种异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料，其对比氧化锌纳米颗粒抑菌材料具有制备方法简单，可操作性高，具有较好的抑菌活性和稳定性。
2、这种异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料具有高效的抑菌效果。同时在电子显微镜下成一朵朵花状结构，形态美观，花瓣间具缝隙，后期可作为载体吸附各种活性物质。本发明，首次合成花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料，其花状结构使得磷酸锌的比表面积增大，从而可以接触到更多的微生物菌体，达到更为显著的抑菌效果，具有较广的抑菌谱，对于包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和一些耐抗生素的菌株都有抑制作用。同时，低毒、副作用小、生物安全性良好，其有望成为抗生素替代品或者安全高效的食品防腐剂。
3、2，4-二羟基嘧啶-5-羧酸，它有很好的生理活性，具有抗肿瘤、抗病毒、抗高血压的特性。其安全性能良好，同时可调控硝酸锌和磷酸盐形成花状结构的磷酸锌纳米颗粒，有利于作为医药和食品添加剂进行深入研究。
附图说明
图1为本发明实验例1中花状磷酸锌纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)图为对应实验组；
图2为本发明实验例1中花状磷酸锌纳米颗粒对沙门氏菌抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)图为对应实验组；
图3为本发明实验例1中花状磷酸锌纳米颗粒对大肠杆菌抑菌的抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)图为对应实验组；
图4为本发明实验例1中花状磷酸锌纳米颗粒对枯草芽孢杆菌的抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)图为对应实验组；
图5为本发明实验例2中花状磷酸锌纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)为实施例3中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组；(c)为实施例4中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组；
图6为本发明实验例2中花状磷酸锌纳米颗粒对大肠杆菌抑菌的抑菌性能测定图；其中(a)为空白对照组；(b)为实施例3中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组；(c)为实施例4中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组。
图7为花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在扫描电子显微镜下的微观形态图；其中(a)为本发明实施例1制备的花状磷酸锌纳米颗粒的扫描电镜图；(b)为本发明实施例2制备的花状磷酸锌纳米颗粒的扫描电镜图；
图8为本发明实验例3对照组1制备的磷酸锌盐晶体在电子显微镜下的微观形态图。
图9不同锌盐制备花状磷酸锌纳米颗粒在弱酸性条件下对大肠杆菌的抑菌效果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备
按照如下步骤制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料：
(1)将50mg 2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)溶于25mL浓度为0.01mol/LNa2HPO4·12H2O溶液中，制成复合溶液；
(2)将上述溶液用2mol/L NaOH将pH值调至8.0，至其完全溶解，备用；
(3)取上述溶液8mL加入50mL离心管中，加入0.8mL超纯水，再加入0.3mol/L的Zn(NO3)2·6H2O溶液3.2mL，静置2h，经离心10000rpm，时间5min、去上清，并用超纯水洗涤。
(4)将步骤(3)得到的沉淀放置于-45℃、压强为5Pa的冷冻真空干燥机中，冷冻干燥时间为8h，花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
其中由本实施例制备的花状磷酸锌纳米颗粒在扫描电子显微镜下的微观形态图参照附图7(a)。
实施例2异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备
按照如下步骤制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料：
(1)将50mg 2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)溶于25mL浓度为0.01mol/LNaH2PO4·2H2O溶液中，制成复合溶液；
(2)将上述溶液用2mol/L NaOH将pH值调至8.0，至其完全溶解，备用；
(3)取上述溶液8mL加入50mL离心管中，加入0.8mL超纯水，再加入0.3mol/L的Zn(NO3)2·6H2O溶液3.2mL，静置2h，经离心10000rpm，时间5min、去上清，并用超纯水洗涤。
(4)将步骤(3)得到的沉淀放置于-45℃、压强为1-10Pa的冷冻真空干燥机中，冷冻干燥时间为6-12h，花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
其中由本实施例制备的花状磷酸锌纳米颗粒在扫描电子显微镜下的微观形态图参照附图7(b)。
实施例3异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备
按照如下步骤制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料：
(1)将50mg 2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)溶于25mL浓度为0.1mol/LNa2HPO4·12H2O溶液中，制成复合溶液；
(2)将上述溶液用2mol/L NaOH将pH值调至8.5，至其完全溶解，备用；
(3)取上述溶液8mL加入50mL离心管中，加入0.8mL超纯水，再加入0.4mol/L的Zn(NO3)2·6H2O溶液3.2mL，静置2h，经离心10000rpm，时间5min、去上清，并用超纯水洗涤。
(4)将步骤(3)得到的沉淀放置于-45℃、压强为1-10Pa的冷冻真空干燥机中，冷冻干燥时间为6-12h，花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
实施例4异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备
按照如下步骤制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料：
(1)将50mg 2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸(异乳清酸)溶于25mL浓度为0.1mol/LNa2HPO4·12H2O溶液中，制成复合溶液；
(2)将上述溶液用2mol/L NaOH将pH值调至9.5，至其完全溶解，备用；
(3)取上述溶液8mL加入50mL离心管中，加入0.8mL超纯水，再加入0.8mol/L的Zn(NO3)2·6H2O溶液3.2mL，静置2h，经离心10000rpm，时间5min、去上清，并用超纯水洗涤。
(4)将步骤(3)得到的沉淀放置于-45℃、压强为1-10Pa的冷冻真空干燥机中，冷冻干燥时间为6-12h，花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
实验例1异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料抑菌性能
为了测定实施例1中花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的抑菌活性，进行了一系列抑菌试验：
①将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌作为抑菌实验菌种。首先在摇瓶中过夜培养以上菌种，其中，金黄色葡萄球菌用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养14-16h；大肠杆菌用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养8-10h；枯草芽孢杆菌，用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养8-10h；沙门氏菌，用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养8-10h。将上述菌体发酵液分别用PBS溶液(pH＝7.4)连续稀释，选择菌浓(1.0-9.0)×108CFU/mL(OD600＝0.4-0.5)的菌液备用(以下空白对照组和实验组均使用该菌浓的细菌液)。
②将总共900μL稀释的细菌培养物与100μL PBS溶液或者终浓度为10mg/mL的磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用同一PBS溶液配制)，在37℃下，恒温震荡摇床下，共孵育5小时后，取100μL培养后的上述混合菌液，用灭过菌的PBS缓冲液进行梯度浓度稀释，选择合适稀释浓度的菌液100μL涂布在LB固体琼脂培养基上。
③在37℃下，培养24小时。计数并比较菌落形成单位(CFU)，并用与对照样品相比的％变化表示抑菌率。
将实验分为八组，其中：
四组空白对照组，分别为：
空白对照组1：向金黄色葡萄球菌900μL稀释的细菌培养物(菌体浓度同实验组)中加入100μL PBS溶液；
空白对照组2：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物(菌体浓度同实验组)中加入100μL PBS溶液；
空白对照组3：向枯草芽孢杆菌900μL稀释的细菌培养物中(菌体浓度同实验组)加入100μL PBS溶液；
空白对照组4：向沙门氏菌900μL稀释的细菌培养物中(菌体浓度同实验组)分别加入100μL PBS溶液；
实验组1：向金黄色葡萄球菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实验例1中磷酸锌纳米颗粒混合(用PBS溶液配制)；
实验组2：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实验例1中磷酸锌纳米颗粒混合(用PBS溶液配制)；
实验组3：向枯草芽孢杆菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实验例1中磷酸锌纳米颗粒混合(用PBS溶液配制)；
实验组4：向沙门氏菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实验例1中磷酸锌纳米颗粒混合(用PBS溶液配制)；
其中，本实验例中所用到的PBS组成为NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L、KH2PO4 0.24g，pH为7.4。
表1花状磷酸锌纳米颗粒对不同菌种的抑菌效果
分组 菌种 抑菌率
空白对照组1 金黄色葡萄球菌 0％
实验组1 金黄色葡萄球菌 99％
空白对照组2 大肠杆菌 0％
实验组2 大肠杆菌 5％
空白对照组3 枯草芽孢杆菌 0％
实验组3 枯草芽孢杆菌 90％
空白对照组4 沙门氏菌 0％
实验组4 沙门氏菌 75％
其中花状磷酸锌纳米颗粒分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌性能分别参照图1、2、3、4，图中显示的是平板中单菌落，其中图1、2、3、4中的(a)为空白对照组；(b)为对应实验组。
结合说明书附图1、2、3、4以及参照表1，实验结果表示，实施例1中花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果极为显著，其与相应空白对照组相比，抑菌率可达99％；对于枯草芽孢杆菌有抑制作用，其与空白对照组相比较，抑菌率可达90％；对于沙门氏菌有有抑制作用，其与空白对照组相比较，抑菌率可达75％；然而从对于大肠杆菌的抑菌试验结果来看，其对于大肠杆菌的抑菌作用较为微弱。深究其原因，推断为革兰氏阴性菌细胞壁膜特性复杂，在抑菌环境在中性或偏碱性的环境下，无法对其产生破坏，以至于抑菌效果不如革兰氏阳性菌强，甚至有些对于有些菌基本无抑制作用。但对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌具有较好的抑菌性能。
实验例2异乳清酸调控的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料抑菌性能
为了测定实施例3、4中花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的抑菌活性，进行了抑菌试验：
①将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作为抑菌实验菌种。其中，金黄色葡萄球菌用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养14-16h；大肠杆菌用LB培养基，于37℃，180rpm震荡培养8-10h；将上述菌体发酵液分别用PBS溶液(pH＝7.4)连续稀释，选择菌浓(1.0-9.0)×108CFU/mL(OD600＝0.4-0.5)的菌液备用(以下空白对照组和实验组均使用该菌浓的细菌液)；
②将总共900μL稀释的细菌培养物与100μL PBS溶液(详见空白对照组1-2)或终浓度为10mg/mL的磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用同一PBS溶液配制，详见以下实验组1-4)，在37℃下，恒温震荡摇床下，共孵育5小时后，取100μL培养后的上述混合菌液，用灭过菌的PBS缓冲液进行梯度浓度稀释，选择合适稀释浓度的菌液100μL涂布在LB固体琼脂培养基上。
③在37℃下，培养24小时。计数并比较菌落形成单位(CFU)，并用与对照样品相比的％变化表示抑菌率。
将实验分为6组，其中：
空白对照组1为：向金黄色葡萄球菌900μL稀释的细菌培养物中加入100μLPBS溶液；
空白对照组2为：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL PBS溶液；
实验组1：向金黄色葡萄球菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实施例3中磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用PBS溶液配制)；
实验组2：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实施例3中磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用PBS溶液配制)；
实验组3：向金黄色葡萄球菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实施例4中磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用PBS溶液配制)；
实验组4：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物中分别加入100μL终浓度为10mg/mL的实施例4中磷酸锌纳米颗粒溶液混合(用PBS溶液配制)；
其中，本实验例中所用到的PBS组成为NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L、KH2PO4 0.24g，pH为7.4。
表2不同硝酸锌浓度制备花状磷酸锌纳米颗粒的抑菌效果
分组 菌种 抑菌率
空白对照组1 金黄色葡萄球菌 0％
空白对照组2 大肠杆菌 0％
实验组1 金黄色葡萄球菌 94％
实验组2 大肠杆菌 30％
实验组3 金黄色葡萄球菌 99.8％
实验组4 大肠杆菌 5％
其中，实施例3、4中花状磷酸锌纳米颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌性能测定参照附图5、6；其中(a)为空白对照组；(b)为实施例3中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组；(c)为实施例4中制备花状磷酸锌纳米颗粒实验组。
实验结果表明，实施例3中花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料对金黄色葡萄球菌具有较高的抑菌性能，其与对照组相比，抑菌率可达94％；然而同实验例1结果相同，对于大肠杆菌的抑菌性能不佳，其与对照组相比，抑菌率为30％。实施例4中花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料对金黄色葡萄球菌也同样具有较高的抑菌性能，其与对照组相比，抑菌率可达99.8％；然而同实验例1结果相同，对于大肠杆菌的抑菌性能不佳，其对于大肠杆菌的抑菌作用较微弱。
实验例3异乳清酸调控不同锌盐花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备
为说明不同锌盐对于制备的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在抑菌性能，特别是在酸性条件下，对大肠杆菌的有效抑制性能，进行以下实验：
将本实验例分为7组，其中：
空白对照组：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物(pH＝5.0±0.1)加入相同pH值的100μL PBS溶液，备用。
对照组1-2以及实验组1-4：向大肠杆菌900μL稀释的细菌培养物(pH＝5.0±0.1)中分别加入100μL以下不同分组制备的样品，具体如下：
对照组1：不含异乳清酸用Zn(NO3)2·6H2O制备的磷酸锌盐；具体制备步骤如下：
(1)制备浓度为0.01mol/L Na2HPO4·12H2O溶液；
(2)将上述溶液用2mol/L NaOH将pH值调至8.0，至其完全溶解，备用；
(3)制备步骤同实施例1步骤(3)；
(4)制备步骤同实施例1步骤(4)，制备得到磷酸锌盐，用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为10mg/mL的溶液，备用；
其中该溶液经过干燥后，其溶质颗粒在电子显微镜下的微观形态图参照附图8；
对照组2：含磷酸钠盐及异乳清酸不加锌盐制备的钠盐异乳清酸溶液；具体制备步骤如下：
(1)制备步骤同实施例1步骤(1)；
(2)制备步骤同实施例1步骤(2)；
(3)取上述溶液8mL加入50mL离心管中，加入0.8mL超纯水，静置2h，得到含磷酸钠盐及异乳清酸不加锌盐制备的钠盐异乳清酸溶液，调节pH至5.00±0.05，备用。
实验组1：Zn(NO3)2·6H2O制备的花状磷酸锌纳米颗粒，制备方法同实施例1，唯一不同的是，锌盐的选择为Zn(NO3)2·6H2O，花状锌纳米颗粒用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为10mg/mL的溶液，备用；
实验组2：ZnSO4·7H2O制备的花状磷酸锌纳米颗粒，制备方法同实施例1，唯一不同的是，锌盐的选择为ZnSO4·7H2O，花状锌纳米颗粒用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为10mg/mL的溶液，备用；
实验组3：ZnCl2制备的花状磷酸锌纳米颗粒，制备方法同实施例1，唯一不同的是，锌盐的选择为ZnCl2，用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为10mg/mL的溶液，备用；
实验组4：Zn(CH3COO)2·2H2O制备的花状磷酸锌纳米颗粒，制备方法同实施例1，唯一不同的是，锌盐的选择为Zn(CH3COO)2·2H2O，花状锌纳米颗粒用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为10mg/mL的溶液，备用；
实验方法：
1)菌液的制备：
将其同实验例1方法进行抑菌试验。(孵育PBS缓冲液pH值为5.00±0.05的条件下进行对大肠杆菌的抑菌试验)
(1)将大肠杆菌作为抑菌实验菌种：
其中，大肠杆菌用LB培养基，在37℃下，180rpm震荡培养8-10h；将菌体发酵液用PBS溶液(pH＝5.00±0.05)连续稀释，选择菌浓(1.0-9.0)×108CFU/mL(OD600＝0.4-0.5)的菌液备用(以上空白对照组和实验组均使用该菌浓的细菌液)。
(2)将总共900μL稀释的细菌培养物与100μL空白对照组的PBS溶液或者对照组1-2样品溶液或实验组1-4的样品溶液，在37℃下，恒温震荡摇床下，共孵育5小时后，取100μL培养后的上述混合菌液，用灭过菌的PBS缓冲液进行梯度浓度稀释，选择合适稀释浓度的菌液100μL涂布在LB固体琼脂培养基上。
(3)在37℃下，培养24小时。计数并比较菌落形成单位(CFU)，并用与对照样品相比的％变化表示抑菌率，详见表3和附图9。
其中，本实施例中所用到的PBS组成为NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L、KH2PO4 0.24g，pH为5.0±0.05。
表3异乳清酸调控不同锌盐制备的纳米颗粒对于大肠杆菌抑菌性能的影响
分组 大肠杆菌抑菌率(％)
空白对照组 0
对照组1 85.86
对照组2 74.42
实验组1 99.81
实验组2 99.26
实验组3 90.14
实验组4 89.95
实验例4硝酸锌与氧化锌在制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料抑菌性能上的比较
为了说明硝酸锌与氧化锌在制备花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料抑菌性能上的区别，将本实验例进行以下分组：
空白对照组：PBS(pH＝5.00±0.05)溶液，备用。
对照组1：终浓度为4mg/mL的花状氧化锌纳米颗粒混合(用pH＝5.00±0.05的PBS溶液配制)，其中花状氧化锌纳米颗粒的制备方法如下：
(1)配置混合溶液，混合溶液中，Zn(CH3COO)2·2H2O的终浓度为0.035mol/L、NaOH的终浓度为0.5mol/L，备用；
(2)上述反应体系为40mL，在高温高压反应釜中，70℃，反应24h；
(3)取所述步骤(2)的反应溶液经离心10000rpm，时间5min、去上清，并用超纯水洗涤。
(4)将步骤(3)得到的沉淀放置于-45℃、压强为1-10Pa的冷冻真空干燥机中，冷冻干燥时间为6-12h，得到花状氧化锌纳米颗粒抑菌材料，将颗粒用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为4mg/mL的溶液，备用。
详细步骤参考文献《New insight into biological effects of zinc oxidenanoflowers on bacteria:Why morphology matters》“EXPERIMENTAL SECTION”部分。
实验组1：将由本发明实施例1制备的纳米颗粒用PBS(pH＝5.00±0.05)溶液配置成浓度为4mg/mL的溶液，备用。其中花状磷酸锌纳米颗粒为本发明实施例1制备的纳米颗粒，
实验方法：
(1)将大肠杆菌作为抑菌实验菌种：
其中，大肠杆菌用LB培养基，在37℃下，180rpm震荡培养8-10h；将菌体发酵液用PBS溶液(pH＝5.00±0.05)连续稀释，选择菌浓(1.0-9.0)×108CFU/mL(OD600＝0.4-0.5)的菌液备用。
(2)取900μL稀释的细菌培养物(pH＝5.0±0.1)分别与100μL上述分组(空白对照组、对照组、实验组)的样品溶液混合(即900μL稀释的细菌培养物+100μL空白对照组样品溶液；900μL稀释的细菌培养物+100μL对照组样品溶液；900μL稀释的细菌培养物+100μL实验组样品溶液)，在37℃下，恒温震荡摇床下，共孵育5小时后，取100μL培养后的上述混合菌液，用灭过菌的PBS缓冲液进行梯度浓度稀释，选择合适稀释浓度的菌液100μL涂布在LB固体琼脂培养基上。
(3)在37℃下，培养24小时。计数并比较菌落形成单位(CFU)，并用与对照样品相比的％变化表示抑菌率，详见表4。
其中，本实施例中所用到的PBS组成为NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L、KH2PO4 0.24g，pH为5.0±0.05。
表4大肠杆菌抑菌率
分组 大肠杆菌抑菌率(％)
空白对照组 0
对照组1 75.91
实验组1 85.15
实验结果表明：花状磷酸锌纳米颗粒抑菌率与空白对照组相比较可达85.15％；花状氧化锌纳米颗粒的抑菌率75.91％。花状磷酸锌纳米颗粒在酸性条件下(pH＝5.00±0.1)抑菌效果比花状氧化锌纳米颗粒的抑菌效果好。
在酸性条件下，花状磷酸锌纳米颗粒释放出较多的锌离子，同时其花状结构，比表面积大，在酸性条件下提高了花状磷酸锌纳米颗粒对大肠杆菌的抑菌效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)制备浓度为1-10g/L的2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸溶液，溶剂为浓度为0.01-0.30mol/L的磷酸钠盐或磷酸钾盐水溶液；
(2)将所述步骤(1)混合溶液pH值调至7.0-11.0，备用；
(3)将所述步骤(2)配置溶液、超纯水、0.1-0.8mol/L锌盐溶液按照体积比(1-10)：(0.1-2)：(0.4-10)混合，静置1-4h，离心取沉淀，经洗涤后，冷冻干燥，获得磷酸锌纳米颗粒材料。
2.如权利要求1所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中2,4-二羟基嘧啶-5-羧酸浓度为2-8g/L。
3.如权利要求1所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，磷酸钠盐为Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O。
4.如权利要求3所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，Na2HPO4·12H2O或者NaH2PO4·2H2O溶液浓度为0.01-0.10mol/L。
5.如权利要求1所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，锌盐可为Zn(NO3)2·6H2O、ZnSO4·7H2O、ZnCl2或Zn(CH3COO)2·2H2O中的一种。
6.如权利要求3所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，Na2HPO4·12H2O或NaH2PO4·2H2O、超纯水、Zn(NO3)2·6H2O溶液按照体积比为(1-10)：(0.1-2)：(0.4-10)。
7.如权利要求1所述一种花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，冷冻真空干燥温度为(-45)℃-(-60)℃、压强为1-10Pa，时间为6-12h。
8.权利要求1-7任一所述制备方法制备获得的花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料。
9.权利要求8所述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在抑菌领域中的用途。
10.如权利要求9所述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料在抑菌领域中的用途，其特征在于：所述花状磷酸锌纳米颗粒抑菌材料的浓度为1-15mg/mL,溶剂为PBS溶液或水。
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