CN111035653A - 用于治疗多发性硬化症的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗多发性硬化症的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了金团簇用于治疗多发性硬化症患者的药物用途。金团簇包含金核和与金核键合的配体。

Description

用于治疗多发性硬化症的组合物和方法
技术领域
本发明涉及多发性硬化症技术领域，尤其涉及用于治疗多发性硬化症的组合物和方法。
背景技术
多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)的意思是“多个区域的瘢痕组织”，是一种自身免疫性疾病，其中免疫系统攻击包围并保护中枢神经系统(central nervalsystem,CNS)神经纤维的髓鞘，从而引起炎症。当髓鞘或神经纤维在多发性硬化症中受损或被破坏时，对中枢神经系统区域的损害可能会产生多种神经系统症状，这些症状在多发性硬化症患者中类型和严重程度各不相同。多发性硬化症有四种类型：临床孤立综合征(clinically isolated syndrome,CIS)，复发缓解多发性硬化症(relapse-remitting MS,RRMS)，原发进行性多发性硬化症(primary progressive MS,PPMS)和继发进行性多发性硬化症(secondary progressive MS,SPMS)。常见症状包括肌肉无力，麻木和刺痛，Lhermitte症状，膀胱问题，肠道问题，疲劳，头晕和眩晕，性功能障碍，痉挛和肌肉痉挛，震颤，视力问题，步态和活动性变化，情绪变化和沮丧，学习和记忆问题，以及疼痛。
多发性硬化症的病因尚不清楚，但据信涉及遗传易感性，免疫系统异常和环境因素共同引发该疾病。
虽然现有药物可通过改变免疫系统功能帮助减缓疾病进展或在患者经历症状恶化时帮助缓解症状，但仍然迫切需要新的药物和方法来治疗多发性硬化症。
发明内容
本发明的目的是提供用于治疗多发性硬化症的药物组合物和方法。
在一些实施方案中，用于治疗患有多发性硬化症的受试者的方法包括将有效量的药物组合物施用于患有多发性硬化症的受试者；其中所述药物组合物包含金团簇(AuC)；其中所述金团簇包含金核，和与金核键合的配体。
在该方法的一些实施方案中，金核的直径小于3nm。在一些实施方案中，金核的直径为0.5-2.6nm。
在该方法的一些实施方案中，配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇化合物中的一种。
在该方法的一些实施方案中，L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在该方法的一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽、含半胱氨酸的三肽或含半胱氨酸的四肽。
在该方法的一些实施方案中，含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
在该方法的一些实施方案中，含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)和L-谷胱甘肽(GSH)。
在该方法的一些实施方案中，含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
在该方法的一些实施方案中，其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸和十二烷基硫醇。
本发明的一些实施方案使用金团簇(AuC)来制备用于治疗受试者多发性硬化症的药物，其中所述金团簇包含金核，和与金核键合的配体。
在该用途的一些些实施方案中，金核的直径小于3nm。在一些实施方案中，金核的直径为0.5-2.6nm。
在该用途的一些些实施方案中，配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇化合物中的一种。
在该用途的一些些实施方案中，L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在该用途的一些些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽、含半胱氨酸的三肽或含半胱氨酸的四肽。
在该用途的一些些实施方案中，含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
在该用途的一些些实施方案中，含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)和L-谷胱甘肽(GSH)。
在该用途的一些些实施方案中，含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
在该用途的一些些实施方案中，其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸和十二烷基硫醇。
从以下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点将变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图描述根据本发明的优选实施例，其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1显示具有不同粒径的配体L-NIBC-修饰的金纳米粒子(L-NIBC-AuNPs)的紫外-可见(UV)光谱、透射电子显微镜(TEM)图像和粒度分布图。
图2显示具有不同粒径的配体L-NIBC-键合的金团簇(L-NIBC-AuCs)的紫外可见(UV)光谱、TEM图像和粒度分布图。
图3显示具有不同粒径的L-NIBC-AuCs的红外光谱。
图4显示配体CR-键合的金团簇(CR-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图5显示配体RC-键合的金团簇(RC-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图6显示配体1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(即Cap)键合的金团簇(Cap-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图7显示配体GSH-键合的金团簇(GSH-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图8显示配体D-NIBC-键合的金团簇(D-NIBC-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图9显示配体L-半胱氨酸-键合的金团簇(L-Cys-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图10显示EAE临床表现评分。
图11显示脊髓中(a)TNF-α、(b)IL-17和(c)IFN-γ的水平，其中1代表无处理组；2代表生理盐水组；3代表强的松组；4代表50mg/kg L-半胱氨酸键合金团簇组；5代表20mg/kgL-半胱氨酸键合金团簇；6代表5mg/kg L-半胱氨酸键合金团簇组。
图12显示(a)脊髓HE染色图片，显示免疫细胞渗入脊髓，和(b)条形图，显示炎症的组织学分级，其中1代表无处理组；2代表生理盐水组；3代表强的松组；4代表50mg/kg L-半胱氨酸键合金团簇组；5代表20mg/kg L-半胱氨酸键合金团簇；6代表5mg/kg L-半胱氨酸键合金团簇组。
具体实施方式
通过参考以下对本发明一些实施方案的详细描述，可以更容易地理解本发明。
在引用出版物的情况下，这些出版物的公开内容被整体引用到本申请中，以便更全面地描述本发明相关的现有技术。
金团簇(AuCs)是存在于金原子和金纳米粒子之间的一种金的特殊形式。金团簇的尺寸小于3nm，由仅仅几个到几百个金原子组成，导致金纳米粒子的面心立方堆叠结构的崩溃。因此，与金纳米粒子的连续或准连续能级不同，金团簇表现出具有不同HOMO-LUMO间隙的分子状离散电子结构。这导致常规金纳米粒子所具有的表面等离子体共振效应和相应的在紫外-可见光谱下等离子体共振吸收带(520±20nm)的消失。
本发明提供配体键合的金团簇。
在一些实施方案中，配体键合的金团簇包含配体和金核，其中配体与金核键合。在一些实施方案中，金核的直径为0.5-3nm。在一些实施方案中，金核的直径在0.5-2.6nm的范围内。
在一些实施方案中，配体键合的金团簇的配体是含硫醇的化合物或寡肽。在一些实施方案中，配体通过Au-S键与金核键合以形成配体键合的金团簇。
在一些实施方案中，配体是，但不限于，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在一些实施方案中，半胱氨酸衍生物是N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)或N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在一些实施方案中，配体是，但不限于，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的二肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的二肽是L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)或L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的三肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的三肽是甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)或L-谷胱甘肽(GSH)。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的四肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的四肽是甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)或甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
在一些实施方案中，配体是含硫醇的化合物。在一些实施方案中，含硫醇的化合物是1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸或十二烷基硫醇。
本发明提供用于治疗受试者的多发性硬化症的药物组合物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是宠物动物，例如狗。
在一些实施方案中，药物组合物包含如上公开的配体键合的金团簇和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂是磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。
本发明提供上述公开的配体键合的金团簇用于制造用于治疗受试者的多发性硬化症的药物的用途。
本发明提供了上述公开的配体键合的金团簇用于治疗受试者的多发性硬化症的用途或使用上述公开的配体键合的金团簇治疗受试者的多发性硬化症的方法。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用药学有效量的配体键合的金团簇。药学有效量可通过常规体内研究确定。
提供以下实施例仅用于说明本发明的原理；它们决不是要限制本发明的范围。
实施例
1.制备配体键合的金团簇
1.1将HAuCl4溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇或乙酸乙酯中，得到溶液A，其中HAuCl4的浓度为0.01～0.03M；
1.2将配体溶解在溶剂中得到溶液B，其中配体的浓度为0.01～0.18M；配体包括，但不限于，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸和其他半胱氨酸衍生物，如N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物，包括，但不限于，二肽，三肽，四肽和其他含有半胱氨酸的肽，例如L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)，L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)，L-半胱氨酸L-组氨酸(CH)，甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)，L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)，L-谷胱甘肽(GSH)，甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)，和其他含巯基化合物，如1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸，巯基乙酸，巯基乙醇，苯硫酚，D-3-巯基缬氨酸和十二烷基硫醇中的一种或多种；溶剂是甲醇，乙酸乙酯，水，乙醇，正丙醇，戊烷，甲酸，乙酸，乙醚，丙酮，苯甲醚，1-丙醇，2-丙醇，1-丁醇，2-丁醇，戊醇，乙酸丁酯，三丁基甲基醚，乙酸异丙酯，二甲基亚砜，甲酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸甲酯，2-甲基-1-丙醇和乙酸丙酯中的一种或多种；
1.3将溶液A和溶液B混合，使HAuCl4与配体的摩尔比为1：(0.01～100)，在冰浴中搅拌0.1～48h，加入0.025～0.8M NaBH4水、乙醇或甲醇溶液，继续在冰水浴中搅拌反应0.1～12h。NaBH4与配体的摩尔比为1：(0.01～100)；
1.4反应结束后，用MWCO 3K～30K超滤管以8000～175r/min的速度离心反应液10～100min，得到不同平均粒径的配体键合的金团簇沉淀。不同MWCO的超滤管的过滤膜的孔直接决定了可以通过膜的配体键合的金团簇的尺寸。可以任选地省略该步骤；
1.5将在步骤(1.4)中得到的不同平均粒径的配体键合的金团簇沉淀溶于水中，置于透析袋中，室温下在水中透析1～7天；
1.6透析后冷冻干燥配体键合的金团簇12～24h，得到粉末状或絮凝剂物质，即配体键合的金团簇。
如所检测的，通过前述方法获得的粉末状或絮凝剂物质的粒度小于3nm(通常分布在0.5-2.6nm)。在520nm处没有明显的吸收峰。确定所获得的粉末或絮凝物是配体键合的金团簇。
2.制备和鉴定用不同配体键合的金团簇
2.1制备L-NIBC-键合的金团簇，即L-NIBC-AuCs
以配体L-NIBC为例，详细描述了制备和鉴定配体L-NIBC键合的金团簇。
2.1.1称取1.00g HAuCl4，将其溶于100mL甲醇中，得到0.03M溶液A；
2.1.2称取0.57g L-NIBC，将其溶于100mL冰醋酸(乙酸)中，得到0.03M溶液B；
2.1.3量取1mL溶液A，分别与0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、或5mL溶液B混合(即HAuCl4与L-NIBC之间的摩尔比分别为1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)，在冰浴中搅拌反应2h，当溶液从亮黄色变为无色时，快速加入1mL新制备的0.03M(称取11.3mg NaBH4并溶于10mL乙醇中)NaBH4乙醇溶液，在溶液变为深棕色后继续反应30分钟，并加入10mL丙酮终止反应。
2.1.4反应后，将反应溶液进行梯度离心，得到不同粒径的L-NIBC-AuCs粉末。具体方法：反应完成后，将反应液转移至MWCO为30K，体积为50mL的超滤管中，以10000r/min离心20min，将内管中的保留物溶于超纯水中。获得粒径约为2.6nm的粉末。然后，将外管中的混合溶液转移至体积为50mL，MWCO为10K的超滤管中，并以13,000r/min离心30分钟。将内管中的保留物溶解在超纯水中，得到粒径约为1.8nm的粉末。然后将外管中的混合溶液转移至体积为50mL，MWCO为3K的超滤管中，并以17,500r/min离心40分钟。将内管中的保留物溶解在超纯水中，得到粒径约为1.1nm的粉末。
2.1.5沉淀通过梯度离心得到的三种不同粒径的粉末，分别除去溶剂，用N2吹干粗产物，溶于5mL超纯水中，放入透析袋(MWCO为3KDa)，将透析袋放入2L超纯水中，每隔一天换水，透析7天，冷冻干燥后备用。
2.2鉴定L-NIBC-AuCs
对上面得到的粉末(L-NIBC-AuCs)进行鉴定实验。同时，配体L-NIBC修饰的金纳米粒子(L-NIBC-AuNP)用作对照。配体为L-NIBC的金纳米粒子的制备方法参考文献(W.Yan,L.Xu,C.Xu,W.Ma,H.Kuang,L.Wang and N.A.Kotov,Journal of the American ChemicalSociety 2012,134,15114；X.Yuan,B.Zhang,Z.Luo,Q.Yao,D.T.Leong,N.Yan and J.Xie,Angewandte Chemie International Edition 2014,53,4623)。
2.2.1通过透射电子显微镜(TEM)观察形态
将测试粉末(L-NIBC-AuCs样品和L-NIBC-AuNPs样品)溶解在超纯水中至2mg/L作为样品，然后通过悬滴法制备测试样品。更具体地，将5μL样品滴在超薄碳膜上，自然挥发直至水滴消失，然后通过JEM-2100F STEM/EDS场发射高分辨率TEM观察样品的形态。
L-NIBC-AuNP的四个TEM图像显示在图1的B幅，E幅，H幅和K幅中；L-NIBC-AuCs的三个TEM图像显示在图2的B幅，E幅和H幅中。
图2中的图像表明每个L-NIBC-AuCs样品具有均匀的粒径和良好的分散性，并且L-NIBC-AuCs的平均直径(指金核的直径)分别为1.1nm、1.8nm和2.6nm，与图2的C幅，F幅和I幅中的结果完全一致。相比之下，L-NIBC-AuNPs样品具有更大的粒径。它们的平均直径(指金核的直径)分别为3.6nm、6.0nm、10.1nm和18.2nm，与图1的C幅，F幅，I幅和L幅中的结果有很好地一致。
2.2.2紫外(UV)-可见(vis)吸收光谱
将测试粉末(L-NIBC-AuCs样品和L-NIBC-AuNPs样品)溶解在超纯水中直至浓度为10mg·L-1，并在室温下测量UV-vis吸收光谱。扫描范围为190-1100nm，样品池是标准石英比色皿，光程为1cm，参比池内充满超纯水。
具有不同尺寸的四种L-NIBC-AuNP样品的UV-vis吸收光谱示于图1的A幅，D幅，G幅和J幅中，并且粒度的统计分布示于图1的C幅，F幅，I幅和L幅中；具有不同尺寸的三种L-NIBC-AuCs样品的UV-vis吸收光谱示于图2的A幅，D幅和G幅中，并且粒度的统计分布示于图2的C幅，F幅和I幅中。
图1表明，由于表面等离子体效应，L-NIBC-AuNP在约520nm处具有吸收峰。吸收峰的位置与粒径有关。当粒径为3.6nm时，UV吸收峰出现在516nm处；当粒径为6.0nm时，UV吸收峰出现在517nm处；当粒径为10.1nm时，UV吸收峰出现在520nm处，当粒径为18.2nm时，吸收峰出现在523nm处。四个样品中没有一个在560nm以上具有任何吸收峰。
图2表明，在三种不同粒径的L-NIBC键合的金团簇样品的紫外吸收光谱中，520nm处的表面等离子体效应吸收峰消失，在560nm以上出现两个明显的吸收峰，吸收峰的位置不同与金团簇的粒径略有差异。这是因为由于面心立方结构的坍塌，金团簇表现出类分子的性质，这导致金团簇的状态密度的不连续性、能级分裂、等离子共振效应的消失和在长波方向新的吸收峰的出现。可以得出结论，上面获得的三种不同粒径的粉末样品都是配体键合的金团簇。
2.2.3傅里叶变换红外光谱
红外光谱在Bruker制造的VERTEX80V型傅立叶变换红外光谱仪上采用固体粉末高真空全反射模式测定，扫描范围为4000-400cm-1，扫描64次。以L-NIBC键合的金团簇样品为例，测试样品为三种粒径不同的L-NIBC键合的金团簇干粉，对照样品纯净L-NIBC粉末。结果见图3。
图3为具有不同粒径的L-NIBC键合的金团簇的红外光谱。与纯L-NIBC(底部曲线)相比，不同粒径的L-NIBC键合的金团簇在2500-2600cm-1之间的S-H伸缩振动均完全消失，而仍观察到L-NIBC的其他特征峰。证明L-NIBC分子通过金硫键成功键合到金团簇表面。该图还显示配体键合的金团簇的红外光谱与其尺寸无关。
用上述类似的方法制备由其它配体键合的金团簇，只是溶液B的溶剂、HAuCl4与配体之间的进料比、反应时间和加入的NaBH4的量稍作调整，例如：当使用L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)或N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)作为配体时，选择乙酸作为溶剂；当使用二肽CR、二肽RC或1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸作为配体时，选择水作为溶剂，依此类推；其他步骤类似，因此这里不再提供进一步的细节。
本发明通过上述方法制备并获得了一系列配体键合的金团簇。配体和制备方法的参数如表1所示。
表1.本发明不同配体键合的金团簇的制备参数
Figure BDA0002341629900000081
Figure BDA0002341629900000091
表1中列出的样品通过前述方法确认。五种不同配体键合的金团簇的特征示于图4(CR-AuCs)，图5(RC-AuCs)，图6(Cap-AuCs)(Cap表示1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸)图7(GSH-AuCs)和图8(D-NIBC-AuCs)。图4-图8显示UV光谱(A幅)，红外光谱(B幅)，TEM图像(C幅)和粒度分布(D幅)。
结果表明，用表1得到的不同配体键合的金团簇的直径均小于3nm。紫外光谱还显示在520±20nm处峰的消失，并且在其他位置出现吸收峰，该吸收峰的位置随配体和粒径以及结构的不同而有所变化，有的情况并不出现特殊的吸收峰，这主要是由于多种尺寸不同和结构不同的金团簇形成混合物或者某些特殊金团簇使吸收峰的位置在常规紫外可见吸收光谱测定范围之外。同时，傅里叶变换红外光谱也显示配体的硫醇红外吸收峰消失(图4-8中B幅的虚线之间)，而其他红外特征峰都保留，表明配体分子已成功与金原子键合形成了配体键合的金团簇，表明本发明成功地获得了用表1中列出的配体键合的金团簇。
3.动物研究
3.1材料和动物
3.1.1测试样品
测试样品为金核平均直径尺寸范围为0.5-1.5nm(1.0±0.5nm)的L-半胱氨酸键合的金团簇；制备方法参照前述方法，略有改动。图9显示配体L-半胱氨酸键合的金团簇(L-Cys-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
3.1.2阳性对照样品
强的松(Prednisone)(上海源叶生物技术有限公司)。
3.1.3剂型
称取所需用量的强的松，并加入适量的生理盐水，轻轻搅拌配方，以确保混匀。称取L-半胱氨酸键合的金团簇，加入适量生理盐水，旋涡使其充分混合。所有化合物均每日新鲜制备。
3.1.4试验用动物
试验使用的动物为7-9星期龄的雌性C57BL/6N小鼠，按照规定饲养和维护。
3.1.5试验分组和剂量
Figure BDA0002341629900000101
Figure BDA0002341629900000111
注：EAE为实验性自身免疫性脑脊髓炎；p.o.为通过os途径；i.p.为腹腔注射。
3.1.6试验操作
第0天，按体重随机分组，然后将200μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelinoligodendrocyte glycoprotein,MOG)肽和完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)皮下注射到左右两侧，每个部位100μl。在免疫接种后0小时和48小时，由腹腔注射百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)。根据表2，从第1天到第28天给予化合物。每天对动物(n＝10)进行EAE临床症状评分。实验结束时，用脊髓作HE染色(n＝5)，Elisa试剂盒检测TNF-α、IL-17、IFN-γ。
3.2试验结果
根据EAE临床评分标准(表3)，每天对动物进行EAE临床症状评分。如图10所示，50mg/kg(50mpK)、20mg/kg(20mpK)和5mg/kg(5mpK)的L-半胱氨酸键合的金团簇从第17天起可预防EAE小鼠瘫痪；强的松为阳性对照，从第13天起可显著降低EAE的临床症状。
表1.EAE临床评分标准
评分 临床表现
1 尾部张力丧失
2 轻度后肢无力
3 部分后肢瘫痪
4 完全性后肢麻痹
5 完全性后肢瘫痪伴前肢无力或奄奄一息
ELISA法测定脊髓组织中TNF-α、IL-17和IFN-γ的含量。TNF-α、IL-17和IFN-γ是炎症的指标。50mg/kg、20mg/kg和5mg/kg的L-半胱氨酸键合的金团簇显著降低EAE小鼠体内这些炎症因子的产生(图11)。
脊髓HE染色观察免疫细胞在脊髓内的浸润情况。在EAE诱导过程中，单个核炎性细胞浸润脊髓，导致EAE小鼠瘫痪，HE染色显示EAE小鼠炎症细胞显著增加，50mg/kg、20mg/kg和5mg/kg的L-半胱氨酸键合的金团簇降低免疫细胞浸润(图12(a))，明显降低炎症组织学分级(图12(b))。
具有不同尺寸的L-半胱氨酸键合的金团簇以及其他配体键合的不同尺寸的金团簇也具有EAE抑制的效果，他们的效果会有所差别。这里不再详细描述它们。
工业实用性
配体键合的金团簇可用于治疗多发性硬化症。它们适用于工业应用。

Claims (20)

1.一种治疗多发性硬化症患者的方法，其特征在于，所述方法包括：
将药物组合物以有效量给予多发性硬化症患者；
其中所述药物组合物包含金团簇(AuC)；其中所述金团簇包括：
金核；和
与金核键合的配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金核的直径小于3nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金核的直径为0.5-2.6nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物和其它含硫醇化合物中的一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，含半胱氨酸的三肽或含半胱氨酸的四肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)和L-谷胱甘肽(GSH)。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸和十二烷基硫醇。
11.金团簇(AuC)在制备用于治疗多发性硬化症患者的药物中的用途，其特征在于，所述金团簇包含：
金核；和
与金核键合的配体。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述金核的直径小于3nm。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述金核的直径为0.5-2.6nm。
14.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物和其它含硫醇化合物中的一种。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，含半胱氨酸的三肽或含半胱氨酸的四肽。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述含半胱氨酸的二肽选自L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)和L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)。
18.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)和L-谷胱甘肽(GSH)。
19.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。
20.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸和十二烷基硫醇。
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