CN112999243A - 金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用，属于生物医药技术领域。金络合物具有很好的生物安全性，能够在免疫细胞内抑制促炎细胞因子受体相关酪氨酸激酶JAK1的活性，调节幼稚CD4+T细胞向Th17细胞分化，抑制炎性因子的表达水平，实现预防和治疗多发性硬化症。金络合分子能预防或治疗小鼠EAE发生，预防效果高达2/3，显示了显著的治疗小鼠EAE效果。金络合物分子通过活体代谢能够进入到EAE小鼠的中枢神经系统的免疫细胞中，通过抑制细胞JAK1的活性，抑制幼稚CD4+T细胞向Th17细胞的分化和IL‑17炎性因子分泌，但不影响免疫细胞活性。

Description

金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

背景技术

多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)是世界上最普遍的神经系统疾病之一，会引起年轻人的非创伤性残疾。目前，用于改善多发性硬化症的药物是抑制免疫细胞活化，降低活化免疫细胞浸润和破坏神经元髓鞘细胞。尽管一线广谱免疫抑制药物如特氟米特(Teriflunomide)会降低免疫细胞活性并降低MS复发频率，但它通常会伴有副作用，如导致流感样症状和恶性肿瘤高发生率提高。

发明内容

本发明的目的在于提供金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用，金络合物具有很好的生物安全性，能够有效预防多发性硬化症和有效治疗多发性硬化症引起的功能障碍。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

优选的，所述金络合物包括金诺芬、硫代葡萄糖金或金-有机纳米团簇。

优选的，所述金-有机纳米团簇的化学组成为Au_xPeptide_y；所述Peptide表示肽和/或蛋白分子；所述x表示金原子个数，所述x的数值范围为3～200；所述y表示肽和/或蛋白分子的个数，所述y的的数值范围为2～220。

优选的，所述金-有机纳米团簇包括Au₂₉GS₂₇、Au₂₈GS₁₆、Au₂₄C₈或Au₂₅H₁；其中，GS代表谷胱甘肽分子，C代表氨基酸序列为CCY的小肽分子，H代表血清蛋白分子。

优选的，所述药物的剂型包括注射剂、呼吸道雾化剂或透皮剂。

优选的，所述药物中金络合物的给药剂量为1～20mg/kg·bw。

本发明提供了金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。金络合物具有很好的生物安全性，能够在免疫细胞内抑制促炎细胞因子受体相关酪氨酸激酶JAK1的活性，调节幼稚CD4+T细胞向Th17细胞分化，并抑制炎性因子的表达水平，实现预防和治疗多发性硬化症。金络合分子能预防小鼠EAE发生，预防效果高达2/3，接受金络合物预防治疗后的EAE小鼠，其体重恢复效果比Teriflunomide更好。此外，金络合物分子通过活体代谢能够进入到EAE小鼠的中枢神经系统的免疫细胞中，通过抑制细胞JAK1的活性，抑制幼稚CD4+ T细胞向Th17细胞的分化和IL-17炎性因子分泌，但不影响免疫细胞活性。

附图说明

图1为实施例1中用GA(Au29GS27)或特氟米特治疗后，小鼠EAE的预防效果；其中a表示GA在EAE预防模型中降低了疾病严重程度，特氟米特和GA的预防性治疗EAE临床评分，二者处于同一水平(n＝18，均值和标准误差)；b表示疾病发生率，特氟米特和GA二者处于同一水平；c表示EAE模型小鼠的体重变化，GA优于特氟米特；d表示luxol快蓝(LFB)染色和TEM观察结果，通过脊髓病变区域的代表性电子显微照片，比例尺：LFB中为250μm(左数第一幅)；LFB(第二幅)为100μm，TEM为5μm(第三幅)，H&E中为50μm(第四幅底部)；

图2为用GA或特氟米特治疗后，小鼠EAE的治疗效果，其中a表示GA和特氟米特治疗小鼠EAE的效果对比，在第18天开始治疗(n＝9，平均值和标准误差，未配对t检验，*p<0.05)；b表示通过percoll分离EAE小鼠CNS的单核细胞中Au信号检测结果；c表示CNS的受损髓鞘组织的不同染色结果(n＝3，平均值±SD)，比例尺：LFB中为250μm(C中的第一行图)；LFB中的100μm(C中的第二行图)；抗MBP标记的部分50μm(C中的第三行图)；TEM中的5μm(C中的第四行图)；H&E的50μm(C中的第五行图)；50％的抗IBA1标记部分(C中的第六行图)；

图3表示实施例3从中枢神经系统脑和脊髓中分离出浸润的单核细胞，其中a表示流式细胞测定结果，用GA处理小鼠EAE，CNS中的Th 1和Th17的分化数量显著下降(n＝6，不配对t检验，*p<0.05，***p<0.001)；b表示对CNS分离并衍生的单核细胞进行ELISPOT分析的结果，GA处理的小鼠CNS中Th 17和Th1细胞数量显著降低(n＝5，未配对t检验，***p<0.001)；c表示CNS中单核细胞的炎性细胞因子表达量测定结果(n＝3，平均值±SD，未配对t检验，*p<0.05)；

图4为实施例4中GA是否抑制CD4+ T细胞的增殖的验证结果，其中a和b，表示将小鼠的

CD4+ T细胞在体外诱导分化成Th1或Th17细胞，测定GA对其分化增殖的影响(a，b)GA降低了

CD4+ T细胞向Th17或Th1细胞的分化(n＝3，平均值±SD，未配对t检验，*p<0.05)；c表示Th17或Th1细胞上清液中IL-17和IFN-γ的测定结果(n＝3，平均值±SD，未配对t检验，*p<0.05)；d表示CD4+幼稚T细胞的细胞活性受GA的影响结果(n＝3，平均值±SD)；e表示高浓度GA抑制脾脏分离的CD4+ T细胞的增殖情况；f表示RORγt的表达和STAT3的磷酸化程度；g表示GA处理导致刺激后1小时，JAK1磷酸化程度。

具体实施方式

本发明提供了金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

在本发明中，所述金络合物包括金诺芬、硫代葡萄糖金或金-有机纳米团簇。

在本发明中，所述金诺芬的化学式为C₂₀H₃₆AuO₉PS；所述金诺芬来源于常规市售。

在本发明中，所述硫代葡萄糖金的化学式为C₆H₁₁AuO₅S；所述硫代葡萄糖金来源于常规市售。

在本发明中，所述金-有机纳米团簇的化学组成为Au_xPeptide_y；所述Peptide表示肽和/或蛋白分子；所述x表示金原子个数，所述x的数值范围为3～200；所述y表示肽和/或蛋白分子的个数，所述y的的数值范围为2～220。

在本发明中，所述金-有机纳米团簇优选的包括Au₂₉GS₂₇、Au₂₈GS₁₆、Au₂₄C₈或Au₂₅H₁；其中，GS代表谷胱甘肽分子，C代表氨基酸序列为CCY的小肽分子，H代表血清蛋白分子。

在本发明中，所述药物的剂型优选的包括注射剂、呼吸道雾化剂或透皮剂。

在本发明中，用于预防和/或治疗多发性硬化症时，所述药物优选的以注射的方式给药；所述注射优选的包括腹腔注射；所述药物中金络合物的给药剂量优选为1～20mg/kg.bw，进一步优选为5～10mg/kg.bw。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的金诺芬(AF)来源于常规市售，金-有机纳米团簇Au₂₉GS₂₇(GA)来源于人工合成，合成方法参见(Advanced Science,6(7),1801671,2019)。

实施例1

将小鼠麻醉后，每只小鼠背部注射200μl的含有Mog35-55肽抗原和完全佛氏佐剂(CFA)的乳化液，随之注射250ng的百日咳毒素(PTX)，并在48h后进行第二次注射250ng百日咳毒素。在造模后的第10～12天，老鼠开始出现尾部无力现象，发病高峰期18天出现后肢瘫痪现象。在给小鼠48h的二次免疫后马上给药，得到MS(Multiple sclerosis，多发硬化症)的预防小鼠EAE模型(见图1)，预防组模型分为以下几组：造模组(只免疫造模，无治疗干预，vehicle)，GA高浓度组(10mg/kg.bw)，GA低浓度组(5mg/kg.bw)，阳性药组(Teriflunomide，10mg/kg.bw)，配体对照组(GSH，10mg/kg.bw)；二次免疫后的第18天后给药，得到MS的治疗EAE模型(见图2)，治疗组模型分为以下几组：造模组(只免疫造模，无治疗干预，vehicle)，GA高浓度组(10mg/kg.bw)，GA低浓度组(5mg/kg.bw)，阳性药组(Teriflunomide，10mg/kg.bw)。二次免疫后，三组EAE小鼠，分别每日腹膜内注射两种不同浓度(5mg/kg.bw和10mg/kg.bw)的GA(Au₂₉GS₂₇)的预防性治疗，每日灌胃Teriflunomide作为阳性药对照。一组EAE造模给小鼠分别注射GSH(10mg/kg)作为阴性对照。免疫造模后，33天监测各鼠EAE临床评分。(图1中的a，图1中的b)，用GSH治疗的小鼠的临床评分在2.5～3.5之间保持相对恒定，而接受GA的小鼠的临床评分显着改善。(图1中的b)中，10mg/Kg(以Au质量计算剂量)的GA剂量可以提供更好的效果，与Teriflunomide(10mg/kg)治疗的小鼠预防治疗的效果相同，经10mg/kg GA治疗的小鼠的MS疾病发生率降低至38.9％。(图1中的c)中，与Teriflunomide治疗的小鼠相比，10mg/kg和5mg/kg的GA治疗可更好的恢复小鼠体重。

小鼠EAE模型中，炎症和脱髓鞘主要发生在脊髓上，从EAE小鼠的病理组织学上分析GA对脊髓的保护效果，分析结果参见图1中的d。GA明显改善中枢神经组织受损状况，可明显促进髓鞘形成，在苏木精和曙红(H&E)中，免疫细胞浸润的减少是明显的。使用未免疫的正常小鼠脊髓作为正常对照来评估GA的治疗效果。在接受阴性对照处理(GSH)的EAE小鼠中，luxol快蓝染色(LFB)显示免疫后33天脊髓的白质发生病理变化区域很大。在同一时期接受GA治疗的小鼠中，发生病理性变化区域明显减少，大多数白质较为正常。在用GSH处理的EAE小鼠病变区域中，大多数轴突没有髓鞘，而在GA处理的小鼠病变区域中，大多数轴突具有髓鞘。苏木精和曙红染色的病理观察显示，GA处理降低了白质区域浸润免疫细胞的密度。综上所述，GA在小鼠EAE模型中的预防治疗功效是由于降低了浸润免疫细胞的密度和抑制了白质脱髓鞘。

实施例2

将小鼠麻醉后，每只小鼠背部注射200ul的含有Mog35-55肽抗原和完全佛氏佐剂(CFA)的乳化液，随之注射250ng的百日咳毒素(PTX)，并在48h后进行第二次注射250ng百日咳毒素。在免疫后第18天，小鼠EAE成模(EAE疾病评分达到3)。给小鼠EAE腹膜内注射GA5mg/kg.bw和10mg/kg.bw或灌胃给予特氟米特10mg/kg.bw，连续给药18天。在第36天，小鼠处死。GA和特氟米特都使EAE疾病评分平均下降至2.3，见(图2中的a)。此外，luxol快蓝染色和MBP免疫染色显示GA治疗改善了白质的病理(图2中的c)。透射显微镜观察到了GA治疗组的脊髓轴突周围的新的稀薄的髓鞘。在GA治疗的小鼠中，g值显着低于(P<0.05)在GSH治疗的小鼠，见图2中的c。此外，苏木精和曙红的HE染色表明，GA处理的小鼠免疫细胞浸润较少，见图2中的c。离子钙结合适配器分子1(IBA1)的免疫染色显示GA抑制了脊髓小胶质细胞的数量，见图2c。为了研究药效成分(金元素)是否穿透血脑屏障进入CNS，在将器官从体内取出之前先用冷PBS灌注全身以排除血液因素。与对照相比，在CNS的全脑和脊髓通过percoll分离的单核细胞中检测到Au信号(图2中的b)。

实施例3

在小鼠EAE模型中，进入到综中枢神经系统(CNS)中的反应性免疫细胞，通过自身抗原呈递APC重新激活的自身反应性CD4+ T细胞，并将单核细胞募集到CNS中，导致更严重的MS炎症。Th1和Th17细胞是与MS有关的主要CD4+ T细胞亚型，它们在CNS的多发硬化的早期阶段被检测到。为了确定GA是否会抑制Th1或Th17细胞，本实施例检测了EAE小鼠中枢神经系统中Th1和Th17细胞相对于CD4+ T细胞的比例，GA处理的小鼠在CNS中的CD4+IL-17+ T细胞和CD4+IFN-γ+ T细胞浸润明显少于GSH处理的MOG35-55免疫小鼠，Th17细胞比Th1细胞更容易受到GA的抑制(图3中的a)。对CNS衍生的单核细胞酶联免疫斑点法(ELISPOT)分析证实了以上结果，GA处理导致CNS中产生促炎细胞因子(IFN-γ，IL-17)的细胞减少(图3中的b)。然后本实施例检测EAE小鼠中枢神经系统中，单核细胞促炎细胞因子IL-17，IFN-γ，TNF-α和IL-2的相对表达水平，GA处理小鼠EAE的促炎细胞因子的水平有显著性降低(图3中的c)。综上可以看出，当GA给药时，小鼠EAE中枢神经系统中单核促炎细胞因子水平的降低，而且Th1和Th17细胞数量的降低，实现了小鼠EAE治疗效果。

实施例4

首先，本实施例评估了GA是否抑制CD4+ T细胞的增殖，在提前孵育的CD3抗体和可溶性CD28抗体刺激的情况下，用6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记了淋巴细胞。在200μM的Au浓度下，CD4+ T细胞的增殖受到明显抑制，但是Au不能在CNS或免疫器官中积累到200μM的浓度来抑制CD4+ T细胞增殖(图4中的e)。因此接下来的实验最高浓度用到100μM。然后本实施例评估了GA对CD4+ T细胞分化的抑制作用，在一定条件下细胞因子刺激下，幼稚CD4+ T细胞分化为Th1细胞和Th17细胞。GA可抑制幼稚CD4+ T细胞分化为Th17细胞和Th1细胞，见(图4中的a，4中的b)，并且Th17细胞上清液分泌的IL-17和Th1细胞分泌IFN-γ水平显着降低(图4中的c)。此外，200μM的Au浓度下，GA不影响幼稚CD4+T细胞的存活(图4中的d)。

RORγt是Th17细胞的特征性转录调节因子，该细胞表达IL-17因子需要RORγt和STAT3参入。Western印迹分析表明，GA处理显着降低了RORγt转录因子的表达，见(图4中的f)。Th17特异性细胞因子IL-17表达受p-STAT3调控。蛋白质印迹分析表明，在Th17诱导环境下，50μM的Au显着降低了STAT3的磷酸化，见(图4中的f)。在用50μM的Au处理后半小时，仅用IL-6刺激CD4+幼稚T细胞，然后检测JAK1的磷酸化水平。IL-6刺激后1小时后，GA处理降低了JAK1的磷酸化。IL-6刺激后16小时后，GA处理降低了STAT3的磷酸化，(图4中的g)。这些结果表明：GA可能通过JAK1-STAT3途径抑制幼稚CD4+T细胞向Th17细胞的分化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.金络合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金络合物包括金诺芬、硫代葡萄糖金或金-有机纳米团簇。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述金-有机纳米团簇的化学组成为Au_xPeptide_y；所述Peptide表示肽和/或蛋白分子；所述x表示金原子个数，所述x的数值范围为3～200；所述y表示肽和/或蛋白分子的个数，所述y的的数值范围为2～220。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金-有机纳米团簇包括Au₂₉GS₂₇、Au₂₈GS₁₆、Au₂₄C₈或Au₂₅H₁；其中，GS代表谷胱甘肽分子，C代表氨基酸序列为CCY的小肽分子，H代表血清蛋白分子。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、呼吸道雾化剂或透皮剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中金络合物的给药剂量为1～20mg/kg·bw。

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