CN111032853A - 用于体外暴露的细胞培养板、装置和方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种细胞培养板，所述细胞培养板包括至少两个按顺序布置的孔和适于流体在所述孔之间输送的通道，其中所述通道经由所述通道的每个端部处的开口连接或联接到第一泵，并且其中所述第一泵可操作以在所述至少两个孔之间循环流体。还公开了结合了所述细胞培养板的装置和系统，以及采用所述装置和系统的方法和用途。

Description

用于体外暴露的细胞培养板、装置和方法

技术领域

本发明涉及细胞培养板和细胞流体暴露采样装置。用于本公开的一种适当的细胞类型是3D器官型细胞或组织。可以将流体(诸如一种细胞培养基或多种细胞培养基的混合物)泵入或循环通过细胞培养板，这允许体外同时培养细胞或组织。可以将细胞暴露于一种或多种试剂(诸如气溶胶)中，以研究试剂对细胞的作用，并且选择在暴露期间对细胞培养基进行实时采样。

背景技术

使用2维细胞培养系统的毒理学研究已用于检验一种或多种试剂(例如，药物)对细胞存活和酶活性等的影响。虽然使细胞在塑料表面上呈平坦层生长是简明易懂的并且允许对细胞生理学和对刺激的反应的若干方面进行研究，但其未能反映出器官的实际结构和构造。在2维单层中，胞外基质、细胞与细胞和细胞与基质的相互作用消失，这些相互作用是分化、增殖和细胞功能必不可少的。

3维培养系统可以形成具有与体内观察到的特征相似的特征的功能组织。与二维培养系统相比，三维细胞培养允许细胞在所有三个维度上与其周围环境相互作用，并且是更生理学相关的。此类细胞可以在活力、增殖、分化、形态、对刺激的反应、药物代谢、基因表达和蛋白质合成等等方面显示出改善。三维细胞培养可以比传统二维细胞单层更生理学相关的方式产生特定的组织样结构，并模拟真实组织的功能和反应。

模拟人器官的几种三维组织是可商购获得的。举例而言，肺3维器官型组织可以使用在空气-液体界面(ALI)生长的原代人类细胞制备，在空气-液体界面中这些细胞将分化并形成功能组织。这些三维组织具有与人类支气管组织密切的形态相似性和代谢特征。也已经描述了其他的3维模型，包括3维肝脏球形模型。肝球状体可以由几种细胞类型组成，这些细胞类型最初用于2维培养，以确定治疗对肝细胞的作用。

已经开发了用于2维和3维细胞培养的不同技术。3维细胞培养方法包括使用悬滴板、磁悬浮或生物材料支架。然而，这些技术通常是昂贵的和/或耗时的，并且可能不适合于同时培养两种或更多种不同的细胞类型。它们使用起来也可能是复杂的，不能高压灭菌(这意味着它们不能被重复使用)，需要大量液体和流量来交换流体，不能与标准实验室设备一起使用，通常不能防水并且不能经受高通量或实时采样应用。本发明寻求提供关于细胞培养和细胞培养基取样的改进。

发明内容

在一方面，公开了一种细胞培养板，所述细胞培养板包括至少两个按顺序布置的孔和适于流体在孔之间输送的通道，其中所述通道经由所述通道的每个端部处的开口连接或联接到第一泵，并且其中所述第一泵可操作以在所述至少两个孔之间循环流体。还公开了一种细胞培养系统或细胞培养装置，包括：(i)细胞培养板，所述细胞培养板包括至少两个按顺序布置的孔和适于流体在孔之间输送的通道；以及(ii)第一泵，其中所述通道经由所述通道的每个端部处的开口连接或联接到第一泵，并且其中所述第一泵可操作以在所述至少两个孔之间循环流体。适当地，通道的直径为3毫米或更小，或者通道是微流体通道。

适当地，泵是蠕动泵。

适当地，泵包括具有编码器的步进电动机或无刷电动机。

每个电动机可由电动机控制器控制，该电动机控制器的操作和传感器可由微控制器控制。微控制器的操作可由无线控制器(诸如

控制器)控制，以便于与无线装置诸如平板电脑一起使用。

适当地，通道还被构造成使流体输送离开细胞培养板。

适当地，通道连接或联接到第二泵，其中第二泵可操作以将流体输送离开细胞培养板。

适当地，第一泵和/或第二泵的电动机容纳在防水盒中。

适当地，细胞培养板装配有盖子。

在某些实施方案中，使用四个泵。

适当地，具有可选的盖子的细胞培养板容纳在培养箱中。培养箱可被构造成在限定的固定温度(诸如约37℃)下进行培养。培养箱可被构造成在一段时间内(例如，在实验过程中)在不同温度下进行培养。

适当地，细胞培养板和一个或多个泵都被容纳在培养箱中。

适当地，在使用过程中，例如在实验过程中，培养箱内的温度波动不超过约0.5℃。

适当地，通道包括在通道的壁中的两个或更多个开口，其中通道的两个或更多个开口联接或连接到孔。

适当地，通道连接到孔的底部或顶部。

适当地，当肝球状体包含在孔中时，通道连接到孔的顶部。

适当地，通道被构造成形成环路，诸如U形弯头。

适当地，孔在板中形成线性布置的孔。

适当地，板包括1、2、3或4个或更多个通道，每个通道连接到能够在孔之间输送流体的至少一个泵。

适当地，泵位于板的孔的外部，适当地，其中泵邻近板的按顺序布置的孔定位。当位于外部时，泵可以经由连接器(诸如鲁尔连接器或鲁尔锁连接器或简单的管连接器)连接到板。

适当地，孔中的一个或多个包括用于培养细胞的插入物，所述插入物包括允许培养基在孔与插入物之间通过的可渗透膜。

适当地，孔中的一个或多个包括表面涂层。

适当地，可渗透膜位于插入物的底部。

适当地，孔包含流体，适当地，包含细胞培养基。

适当地，孔或插入物包含细胞。

适当地，孔是开放的而不是密封的。

适当地，细胞是2维或3维细胞培养物。

适当地，细胞培养基包含一种或多种试剂。

适当地，孔中的每一个中的细胞类型是相同的细胞类型或不同的细胞类型。

适当地，不同的细胞类型选自肾上腺、膀胱、血管、骨、骨髓、脑、软骨、宫颈、角膜、子宫内膜、食管、胃肠、免疫系统、肝、肺、淋巴、肌肉、神经、卵巢、胰腺、垂体、前列腺、肾、唾液、皮肤，腱、睾丸和甲状腺，适当地，其中细胞类型为肺细胞或肝细胞或神经元。

适当地，第一泵的流速为每分钟约10μl至每分钟约1000μl。适当地，第一泵的功能由计算机控制。适当地，细胞培养板的孔或细胞培养板由聚醚醚酮(PEEK)制成。PEEK是聚芳醚酮(PAEK)家族中的一种。

适当地，细胞培养板的孔或细胞培养板包含PEEK或由PEEK组成。适当地，通道与包括能够保持或储存流体的一个或多个贮存器的板流体连通。

适当地，孔的底部包括不连续表面，不连续表面适于减少或防止球状体的团聚。

适当地，孔的底部为大致圆形形状，适当地，其中底部的直径在约6mm±5％至约16mm±5％之间，适当地，其中底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％或约16mm±5％。

适当地，不连续表面包括多个凹槽，其中凹槽的深度和宽度对应于球状体的最大直径±10％。

适当地，多个凹槽的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约600至约1000μm之间。

适当地，凹槽在孔的底部上形成多个同心环。

适当地，不连续表面包括具有封闭的底部和开发的顶部的多个孔洞，所述孔洞的尺寸在深度和宽度上对应于球状体的最大直径约10％。

适当地，孔包含用于培养球状体的细胞培养基。

适当地，孔包含捕获在孔的不连续表面中的单个球状体。

适当地，球状体是肺球状体。

适当地，当孔中存在流体时，从孔的入口到出口的流体流量在约1至约500μL/min之间，适当地为约40μL/min。

适当地，孔中的剪切应力小于0.1达因/cm²。

适当地，孔中的至少一个的底部包括连续的平坦表面。

适当地，至少一个孔包括定位在孔的底部上方的插入物，适当地，其中所述插入物位于孔内部的可渗透膜的顶部，以形成能够在空气/液体界面处培养细胞的表面。

适当地，包括连续的平坦表面的至少一个孔的深度与包括不连续表面的至少一个孔的深度不同，适当地，其中包括连续的平坦表面的至少一个孔的深度小于包括不连续表面的至少一个孔的深度。

适当地，孔包含用于在空气-液体界面处培养细胞的细胞培养基。

适当地，孔包含定位在可渗透膜上的细胞，所述细胞能够在空气-液体界面处生长。

适当地，细胞是肺细胞。

适当地，通道与包括能够保持流体的一个或多个贮存器的板流体连通。在另一方面，公开了一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括容纳在培养箱内的根据本公开的细胞培养板。

在另一方面，公开了一种用于在两个或更多个按顺序布置的孔之间循环流体的方法，所述方法包括：(a)提供本文所述的细胞培养板或细胞培养装置；(b)使至少两个孔与流体接触；(c)使流体循环通过板的孔。

另一方面涉及一种用于确定试剂对细胞的作用的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文所述的细胞培养板或细胞培养装置；(b)使细胞培养板的至少两个孔与细胞和细胞培养基接触；(c)使细胞培养基循环通过板的孔；(d)使板的孔暴露于至少一种试剂；(e)将细胞培养基的样品从一个或多个孔中取出并对其进行测试；以及(f)确定在暴露于至少一种试剂之前和之后试剂对细胞的作用。

另一方面涉及一种细胞流体暴露采样装置，所述细胞流体暴露采样装置包括：(a)本文所述的细胞培养板；以及(b)包括用于储存多个样品的一个或多个孔的样品板，其中所述第二泵可操作以使流体从细胞培养板朝向样品板输送。

适当地，使用多头移液器将流体输送到样品板。

适当地，多头移液器上的移液管的数量对应于样品板的行中的孔的数量。

适当地，细胞流体暴露采样装置包括用于储存流体的贮存器，其中所述贮存器与细胞培养板的孔流体连通。

适当地，细胞流体暴露采样装置还包括至少一个另外的泵，所述至少一个另外的泵适于从贮存器输送培养基以重新填充细胞培养板的孔。

适当地，所述至少一个另外的泵适于用与在样品板的孔中收集的相同体积的培养基重新填充细胞培养板的孔。

适当地，采样装置还包括可操作以自动控制装置的操作的计算机控制器。

在另一方面，提供了一种用于对暴露于一种或多种试剂的包含细胞的细胞培养基进行采样的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供本文所述的细胞流体暴露采样装置；(b)使孔中的至少一个与包含细胞的细胞培养基接触；(c)使细胞培养基循环通过细胞培养板的孔；(d)使细胞培养板的孔暴露于至少一种试剂；(e)从细胞培养板中对细胞培养基进行采样，任选地，其中在暴露于试剂期间对细胞培养基进行实时采样。

适当地，在步骤(d)中，在多个时间点将细胞培养板的孔暴露于至少一种试剂。

适当地，在步骤(e)中采样的培养基的体积在约50ul至约200ul之间。

适当地，所述方法包括确定一种或多种试剂对细胞培养基中的所采样的细胞的作用的进一步步骤(f)。

适当地，所述方法还包括确定一种或多种试剂在暴露的细胞培养物中的动力学的进一步步骤(g)。

在另一方面，公开了如本文所述的细胞培养板用于在两个或更多个孔之间循环流体的用途。

在另一方面，公开了细胞流体暴露采样装置用于从细胞培养板的孔中对流体进行适当地实时采样的用途。

在另一方面，公开了一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成并且包含一种试剂，所述试剂包括：(i)烟草生物碱或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或其两种或更多种的组合。

公开了一种用于使细胞与一种或多种试剂接触的方法，所述方法包括：(i)使细胞与包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置接触；(ii)培养所述细胞；以及(iii)使所述细胞培养装置中包含的所述细胞与一种或多种试剂接触，所述一种或多种试剂包括：(i)烟草生物碱；或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或其两种或更多种的组合。

在另一方面，公开了一种用于用包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置降低或抑制试剂的吸收的方法，所述方法包括使所述细胞培养装置与一种或多种试剂接触，所述一种或多种试剂包括：(i)烟草生物碱；或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或其两种或更多种的组合。

在另一方面，公开了包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置用于降低或抑制试剂的吸收的用途，所述试剂包括：(i)烟草生物碱或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或其两种或更多种的组合。

适当地，烟草特有的亚硝胺为4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。

适当地，烟草生物碱选自：烟碱、新烟碱、降烟碱、新烟草碱、可替宁和麦斯明或其两种或更多种的组合。

附图说明

图1示出了用于本公开的插入物。

图2示出了本公开的细胞培养板的一个实施方案。

图3示出了本公开的细胞培养板的另一个实施方案。

图4是图3中所描绘的细胞培养板的3维图。

图5是如图4所描绘的构建的细胞培养板的照片。

图6示出了本公开的细胞培养板的另一个实施方案。

图7示出了本公开的细胞培养板的另一个实施方案，其中细胞培养板(其可以装配有可选的盖子)和一个或多个泵被容纳在培养箱中。

图8示出了结合有本公开的细胞培养板的采样装置。

图9(a)示出了本公开的细胞培养板的一个实施方案，该细胞培养板包括一个具有2个孔的通道和一个不具有允许流体回流的孔的通道。连接器用于连接管，以允许流体从具有2个孔的通道流到没有孔的通道，然后又流回单个泵。

图9(b)示出了多于2个孔彼此连接以允许更多的细胞或组织连接在一起的实施方案。因此，可以连接2、4、6或8个孔等。通道的每一端都连接到同一个泵。

图10示出了本公开的结合了细胞培养板和三个泵的采样装置的另一个实施方案。

图11是具有多个同心凹槽的孔的横截面，所述多个同心凹槽用于捕获单个球状体(在图14中标记为“查看细节B”)。尺寸单位为毫米。

图12是具有多个同心凹槽的孔的平面图，所述多个同心凹槽用于捕获单个球状体(在图14中标记为“查看细节B”)。尺寸单位为毫米。

图13是包含微流体通道的孔的平面图(在图4中标记为“查看细节C”)。尺寸单位为毫米。

图14是多孔板的平面图，该多孔板包含具有用于捕获单个球状体(标记为“查看细节B”)的多个同心凹槽的孔和包含插入物(标记为“查看细节C”)的孔。所述孔通过通道连接，使得第一孔(“查看细节B”)和第二孔(“查看细节C”)中的每一个彼此流体连通。尺寸单位为毫米。

图15是图14中的线C-C的剖视图。

图16是具有多个孔洞以实现捕获单个球状体(在图15中标记为“查看细节B”)的功能的孔的横截面。

图17是具有如图16所示用于捕获单个球状体的多个孔洞的单个孔的平面图。尺寸单位为毫米。

图18是多孔板的平面图，该多孔板包含具有用于捕获单个球状体(标记为“查看细节B”)的多个孔洞的孔和包含插入物(标记为“查看细节C”)的孔。所述孔通过通道连接，使得第一孔(“查看细节B”)和第二孔(“查看细节C”)中的每一个彼此流体连通。尺寸单位为毫米。

图19是图18中的线C-C的剖视图。

图20示出了如图所示为两个不同的孔中的每一个计算的剪切应力的结果以及用于计算剪切应力的参数。

图21(a)示出了团聚的球状体。图21(b)示出了根据本公开获得的个体化形式的非团聚球状体。

图22示出了在4℃下温育8小时后，PEEK板和PDMS板中残留的烟碱的量的比较图。

图23示出了连接到贮存器板的细胞培养板，该贮存器板可用于增加循环流体的体积。

一些优点

本公开可以使用标准细胞培养板，这简化了设计、降低了成本并且为实验提供了坚实的基础，同样地，标准细胞培养板在实验室中被广泛使用。例如，可以使用标准实验室设备对标准细胞培养板进行分析。适当地，标准细胞培养板包括两个或更多个或多个基本圆形形状的孔。适当地，孔的底部的直径在约6mm±5％至约16mm±5％之间，适当地，其中底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％或约16mm±5％。在一个实施方案中，孔的底部的直径在约6mm±5％(例如，约6.4mm)至约16mm±5％(例如，约15.5mm)之间。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置可与标准细胞培养插入物一起使用，这简化了设计并降低了细胞培养板的成本。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置可用于培养和研究3维细胞培养。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置克服了常规细胞培养技术的局限性。例如，它可以更紧密地模仿细胞的自然微环境。

可以在同一板上培养不同的3维细胞培养物，这允许将不同的细胞类型连接在一起，从而可以确定细胞之间的相互作用。

由于细胞培养板/细胞流体暴露采样装置是可高压灭菌的，因此可以降低污染的风险。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置可在不使用胶水的情况下制备，这可提高生物相容性。

细胞培养板和用于在孔之间循环流体的相应的一个或多个泵可以一起容纳在培养箱中。培养箱在使用过程中可以保持关闭，并且细胞可以保持不受干扰。由泵设定的流体的流速可以在不干扰细胞的情况下进行调节(例如，通过

)。由于培养箱在使用过程中可以保持关闭，因此培养箱内部的温度可以保持稳定，以最大程度地减少温度波动。由于细胞培养板和相应的一个或多个泵一起容纳在同一培养箱中，因此可以最大程度地减少在培养箱的内部与外部之间延伸的线，这可以改善培养箱的密封性并进一步减少温度波动。在培养箱外部通常只需要一根缆线将泵连接到电源，但是如果需要，可以使用电池驱动的泵。这可以简化包括细胞培养板和相应的一个或多个泵的培养箱的设计，这使得不那么麻烦并且易于使用。循环的流体(诸如细胞培养基)可以自动混合，这可以改善细胞/组织的培养。

细胞培养板的孔可以打开而不密封。在使用过程中，孔中的组织或细胞可暴露于培养箱中存在的环境空气中。这种系统允许培养基与培养箱中存在的空气保持平衡，将培养基的pH值保持在生理水平，并确保从培养基中除去组织释放的气体。当使用在空气-液体界面处生长的组织或细胞时，这种构型尤其理想，所述组织或细胞更依赖于环境空气湿度和气体浓度。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置允许同时培养两种或更多种细胞类型。这允许研究细胞之间的相互作用。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置允许技术人员研究来自第一细胞类型的代谢试剂如何影响第二细胞类型。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置允许技术人员研究来自第二细胞类型的代谢试剂如何影响第一细胞类型。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置允许研究来自不同细胞类型(包括不同细胞类型的组合)的代谢试剂的影响。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置可适用于高通量分析，诸如高通量采样或筛选分析。

细胞培养板/细胞流体暴露采样装置可适用于实时分析，诸如实时采样或筛选分析。

具体实施方式

除非另有说明，否则本公开的实践采用工程、微工程、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。这类技术在例如以下文献中充分解释：Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编，1984)；Methods in Molecular Biology，HumanaPress；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.CelMs编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Introduction to Cell and TissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，IB.Griffiths和D.G.Newell编，1993-8)J.Wiley andSons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)。除非另有说明，否则采用市售试剂盒和试剂的程序通常将根据制造商确定的方案使用。

本文中使用的技术术语和表达一般被赋予在分子生物学、微生物学、细胞生物学和生物化学的相关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本申请的整个内容。

如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”既包括单数指代物也包括复数指代物。

术语“和/或”意指(a)或(b)或者(a)和(b)两者。

如本文所用，术语“包括”与“包含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，且不排除其他未引述的成员、要素或方法步骤。

术语“由......组成”意指排除其他组分，并且仅具有所引述的要素且不具有其他要素。

通过端点进行的数值范围表述包括被纳入各自范围内的所有数字和分数，以及所引述的端点。

如本文所用，当提及诸如参数、量、时间持续期等等的可测量值时，术语“约”意味着涵盖指定值的和从指定值的变化，尤其是指定值的和从指定值的+/-10％或更少、优选地+/-5％或更少、更优选地+/-1％或更少、以及还更优选地+/-0.1％或更少的变化，只要这些变化适合于在本公开中实施即可。应当理解，修饰词“约”所指代的值本身也是明确地且优选地公开的。

尽管术语“一个或多个”，诸如一组成员中的一个或多个成员本身是明确的，但是通过进一步的例证，该术语尤其涵盖对所述成员中的任一者，或对所述成员中的任两者或多者，例如所述成员的任三者、四者、五者、六者或七者等，以及最多所有所述成员的提及。

细胞培养板

本公开中使用的细胞培养板可以以各种形式(诸如以24、48或96孔形式)制造，并且可以由技术人员基于要进行的实验的大小和选择来容易地选择。适当地，用于本公开的细胞培养板是24、48或96孔形式的细胞培养板。通常，细胞培养板经测量的长度为约12cm，宽度为约8cm。

细胞培养板通常将是包括多个孔的平板形式。一般来讲，整个板是矩形的。

适当地，孔的底部的直径在约6mm±5％至约16mm±5％之间，适当地，其中底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％或约16mm±5％。在一个实施方案中，孔的底部的直径在约6mm±5％(例如，约6.4mm)至约16mm±5％(例如，约15.5mm)之间。

每个孔的容量可以在约300μL至约3400μL之间，或在约350μL至约3400μL之间，或在约370μL至约3400μL之间。通常，在细胞培养板中循环的流体的体积将在约2.5mL至约12mL之间，诸如约8mL。细胞培养板被构造成包含至少两个按顺序布置的孔。细胞培养板可被构造成包含至少两个线性布置的孔。

通常，细胞培养板中的孔将按行和列布置。例如，24孔板可被构造成6个线性行，每行4个相邻的孔。又如，48孔板可被构造成8个线性行，每行6个相邻的孔。又如，96孔板可被构造成12个线性行，每行8个相邻的孔。如果需要，细胞培养板甚至可以制造或定制，以在板中提供所需数量的孔。

不一定要使用板中的每个孔。如果在细胞培养板中使用至少两个按顺序布置的孔，则这将足以进行根据本公开的实验。

细胞培养板的孔通常是开放的而不是密封的，这可以帮助细胞的培养/维持和气溶胶的循环。

细胞培养板在板的顶部可以装配有盖子，这有助于降低孔中污染的风险。盖子优选地不密封到板上，使得空气可以在板内部循环，这也可以帮助细胞的培养/维持和气溶胶的循环。

细胞培养板可以由聚四氟乙烯(PTFE)、不锈钢(例如，316L/1.4435)、PEEK、聚丙烯或聚砜或其两种或更多种的组合制成。可以将涂层(诸如聚对二甲苯涂层)施涂到PTFE、不锈钢(例如，316L/1.4435)、PEEK、聚丙烯或聚砜材料中的任一种上。

在某些实施方案中，优选使用PEEK，因为其具有不吸收烟碱和NNK的优点，如本文所述。

如果需要，细胞培养板可以通过计算机辅助设计(CAD)来设计，或者可以通过商业途径获得。CAD板可以使用本领域所熟知的方法通过微机械加工来生产。

适当地，细胞培养板是单片细胞培养板。作为单片，细胞培养板没有层。作为单片，细胞培养板没有胶水。作为单片，细胞培养板没有层和胶水。这可以有助于细胞培养板的灭菌，因为细胞培养板可以完全高压灭菌。

在一个实施方案中，细胞培养板是一种在本领域中广泛可用的微流体细胞培养板。例如，M04S微流体细胞培养板可从Cellasic (Califomia，USA)获得，并且包含4个独立的孔，每个孔的直径为约2.8mm，高度为120微米。该板的尺寸为约8.5cm宽，约12.7cm长和约1.4cm高。

在某些实施方案中，细胞培养板的长度为约10cm或更大，或约11cm或大，或大于约12cm。在某些实施方案中，细胞培养板的长度小于约10cm，诸如约9em，约8cm，约7cm，约6cm或约5cm。

细胞培养板适于允许流体在至少两个按顺序布置的孔之间输送。这可以通过在细胞培养板的每个孔中形成至少一个孔洞，然后经由一个或多个孔洞将每个孔连接到通道(例如，导管或管道)来实现。在一个实施方案中，一个或多个通道被直接加工或嵌入细胞培养板内部以将至少两个孔连接在一起。适当地，一个或多个通道在细胞培养板的孔下面延伸。一个或多个通道可以根据需要连接到孔的底部或顶部。通道的直径可以为约3mm，约1.6mm或约1mm或更小。通道可具有圆形直径以减少气泡的形成。通道可以是微流体通道，其直径小于1mm。微流体通道的使用是本领域技术人员所熟知的。

通道的两端都包含开口。通常，开口的每一端都连接到同一个泵。因此，开口的每一端都将终止于同一个泵。

可以使用多种连接器将通道连接到第一泵。一个实例是鲁尔连接器(诸如鲁尔锁接头)或简单的管连接器。鲁尔连接器的使用是有利的，因为它们容易获得，易于安装并且可以提供改善的无菌性和密封性。

朝向或远离第一泵输送流体的通道的一部分在本文中被称为“流体传输通道”。流体传输通道的壁通常除了在一端处的开口以外均被密封，该开口可以连接或联接到第一泵。换句话说，通道的该部分的壁将没有任何开口。通道的另一部分在本文中被称为“孔输送通道”，因为它经由通道的壁中的开口将流体输送到每个孔。孔输送通道的壁中的开口的数量将取决于流体将被输送到的孔的数量。通常，孔输送通道的壁中的开口将位于孔输送通道的上部部分。孔输送通道通常将连接到孔的底部或顶部。在某些实施方案中，优选的是，当肝脏球状体包含在孔中时，孔输送通道连接到孔的顶部。孔输送通道可以使流体朝向或远离泵输送。流体传输通道和孔输送通道通常将被构造成基本线性的布置，并且可以被布置成彼此大致平行。

通道可以是管的形式，诸如挠性管。因此，通道可以由管材制成，诸如挠性管材或硅管材或Pharmed管材。环路或U形弯头连接流体传输通道和孔输送通道。环路被构造成使流体输送离开泵，然后使流体朝向泵返回。

环路可以位于细胞培养板的内部或外部。当环路位于细胞培养板的外部时，可以使用连接器(诸如鲁尔连接器或鲁尔锁连接器或简单的管连接器)将环路密封并接合到细胞培养板上。

管材可用于将不同的通道连接在一起，诸如硅管材或Pharmed管材。

当流体在通道中传送时，可以将其从泵中传送出来，然后再返回到泵中。流体可以根据需要以顺时针或逆时针方式循环通过孔。第一泵通常被构造成取向在细胞培养板的与环路相对的一侧上，这使流体返回通过流体传输通道或孔输送通道。第一泵和环路可以以基本线性的布置布置在细胞培养板的相对两侧上。同时在某些实施方案中，流体从第一泵输送到流体传输通道并经由环路输送到孔输送通道，然后返回到第一泵(参见图2)，还设想流体从第一泵输送到孔输送通道并经由环路输送到流体传输通道，然后返回到第一泵(例如，参见图3c和图9a)。还设想流体从第一泵输送到第一流体传输通道，然后经由第一环路输送到第一孔输送通道，然后经由第二环输送到第二流体传输通道，并经由第三环路输送到第二孔输送通道(例如，参见图9b)，然后返回到第一泵。

包括至少两个按顺序布置的孔和适于流体在孔之间输送的通道的细胞培养板可以形成用于在至少两个孔之间循环流体的回路，所述通道经由通道的每个端部处的开口连接或联接到第一泵。流体可以经由通道和泵在孔之间循环。在某些实施方案中，板由1、2、3或4或更多个回路组成。每个回路可包含2或4或6或8或更多个孔。一个或多个孔可以设计成特别允许在孔中放置插入物，诸如Transwell^TM插入物。根据需要，板可以具有各种尺寸，诸如标准的24孔或96孔板。适当地，标准板包括两个或更多个或多个基本圆形形状的孔。

每个回路的2或4或6或8个孔可以通过沿其底部延伸的通道(诸如微通道)互连。在每个回路的一侧上，可以存在两个连接器，用于将每个回路连接到蠕动泵。一旦回路充满培养基并连接到泵，板的设计就能确保循环培养基的水平足以与第一孔中的插入物接触并覆盖第二孔中存在的球状体。

两个回路也可以连接在一起(通过将一个回路的输出连接器连接到第二个回路的输入连接器)以互连多达4个组织。

还可以改变培养基在回路中循环的方式：回路可以是培养基再循环的闭合环形式或培养基穿过每个孔一次的开放环形式。在后一种情况下，第一管可以在第一极端上连接到装有培养基的贮存器，在第二侧连接到回路的输入连接器。然后，最后一条回路的输出连接器将连接到穿过泵并排除收集器内的培养基的管。

细胞培养板可以打开，以确保板内的组织与培养箱中存在的空气之间的最佳气体交换。在某些实施方案中，细胞板装配有盖子或覆盖物，其允许与标准细胞培养板相同的空气循环。

转到附图，更详细地描述了细胞培养板的具体非限制性实施方案。

图2示出了细胞培养板20的一个实施方案，该细胞培养板包含被构造成6行且每行包含4个线性布置的孔17的24个孔17。每行的4个孔被构造成允许流体在4个线性布置的孔17中的每一个之间经由通道23输送。示出了流体传输通道23a和孔输送通道23b。通道可包括允许流体输送进入细胞培养板20的入口开口26和允许流体输送离开细胞培养板20并回到泵17的出口开口25。孔17中的至少两个将各自包含至少一个开口，以允许孔输送通道23b连接到所述至少一个开口。通道23可被构造成在其一端处形成回路24。回路24可包含在细胞培养板20的内部或细胞培养板20的外部，如图3所例示的，该图示出了位于外部的回路39。当定位在外部时，回路24将经由将回路连接到细胞培养板20的连接器连接到细胞培养板20。回到图2，通道23在一端处经由通道23在每端处的开口25、26连接到至少一个泵29，以在孔17之间泵送流体。开口25、26的端部经由连接器28连接到泵29，如图3可见。当使用两个或更多个泵29时，它们可以方便地以交错构型构造在细胞培养板20的相对两侧上。

图3示出了细胞培养板20的另一个实施方案。图3a示出了穿过图3c所示的孔17的横截面A-A，其中示出了板中的孔17和插入物10的构型。图3b示出了穿过包含在图3d所示的细胞培养板20中的通道23的横截面B-B和C-C。图3c示出了流体在包含在通道23中时的循环流动方向。流体从泵输送到孔输送通道23b并经由回路输送到流体传输通道23a，然后返回到泵(未示出)。防水壳体34可用于容纳细胞培养板20。防水壳体可包含盖子38。在所示的实施方案中，连接器28和通道23的环路39容纳在防水壳体的外部。图3d示出了流体传输通道23a的线性构型。

图4是图3中所描绘的细胞培养板的3维图。图5是如图4所描绘的构建的细胞培养板的照片。

图6示出了细胞培养板40的另一个实施方案。图6(a)示出了细胞培养板40，该细胞培养板包含被构造成8行且每行包含6个线性布置的孔47的48个孔。每行被构造成允许流体在6个线性布置的孔47中的每一个之间经由通道43输送。在该图中可见的通道是流体传输通道。通道可包括允许流体输送进入孔47的入口开口45和允许流体输送离开孔47的出口开口46。图6(b)是穿过图6(a)所示的板的横截面。图6(c)是图6(a)所示的板的平面图。

图7示出了细胞培养板50的另一个实施方案，该细胞培养板包含总共8个孔57，所述孔被构造成4行，每行包含2个线性布置的孔57。每行连接到包括电动机54的单独的泵59。每个泵可具有不同的泵送参数。示出了流体连接器52。一个或多个泵的电动机可以容纳在可以防水的密封盒56中。密封盒56可包括盖子。细胞培养板可以放置在板支架55上。每个电动机54可由电动机控制器控制，该电动机控制器的操作可由微控制器控制。微控制器的操作可由无线控制器(诸如

控制器)控制，以便于与无线装置诸如平板电脑一起使用。细胞培养板和一个或多个泵可以一起容纳在培养箱51中。

在某些实施方案中，通过孔的流体流量为约1至约100μL/min。

在某些实施方案中，通过孔的流体流量为约1至约500μL/min。

在某些实施方案中，通过孔的流体流量为约10至约400μL/min或约10至250μL/min或约10至100μL/min。

在某些实施方案中，通过孔的流体流量为约40μL/min。

当使用多于一个泵时，一个或多个不同的泵可具有不同的流量。当使用多于一个泵时，每个不同的泵可具有不同的流量。因此，每个回路中的流速可以相同或不同。

如本领域技术人员将理解的，当流体在固体边界上方流动时，将在该边界上产生剪切应力，这可能引起暴露于剪切应力的细胞的扰动。在本公开的上下文中，当流体移动通过孔时，将产生剪切应力。理想的是，孔中的剪切应力小于约0.1达因/cm²(诸如约0.08达因/cm²或更小或0.04达因/cm²或更小)，因为这不会引起暴露于剪切应力的细胞的扰动。在不同的孔中，剪切应力可以不同。例如，具有不连续表面的孔可具有约0.04达因/cm²的剪切应力。例如，具有平坦且连续表面的孔可具有约0.08达因/cm²的剪切应力。适当地，具有不连续表面的孔中的剪切应力低于具有平坦且连续表面的孔中的剪切应力。

为了可以使用光学分析进行筛选，孔的底部可以由具有70％或80％或90％或更高的总透光率的材料制成。

横跨细胞培养板的多个孔的深度不必相同，并且设想，孔可具有不同的深度。连接至少两个孔的通道可以处于相同的高度，使得通道位于距至少两个孔的底部不同距离处。这种构型确保了流入孔中的流体不会扰动或干扰球状体，同时确保了流体仍可以穿过插入物的可渗透膜。在一个实施方案中，用于培养球状体的一个或多个孔具有最大的深度。在一个实施方案中，用于培养球状体的一个或多个孔的深度大于用于培养除球状体之外的细胞的一个或多个孔的深度。在一个实施方案中，用于培养球状体的一个或多个孔的深度大于包含插入物的一个或多个孔的深度。

如果需要，可以将细胞培养板与贮存器板261一起使用，如图23所示。贮存器板包括一个或多个流体贮存器269。一个或多个流体贮存器269可被构造成容纳流体。该图示出了细胞培养板20的一个实施方案，该细胞培养板包含被构造成4行且每行包含2个线性布置的孔17的8个孔17，但是应当理解，可以容易地使用其他构型的孔。通道23不是在细胞培养板上或邻近细胞培养板形成环路，而是进入贮存器板261的一个或多个流体贮存器269中。通道在贮存器板261上或邻近所述贮存器板形成回路。流体从一个或多个流体贮存器269输送到细胞培养板并循环。贮存器板261可用于增加流体的体积。通常，在该构型中使用的流体的体积将在约8mL至约12mL之间。

样品板

本公开中使用的样品板可以以各种形式(诸如以24、48或96孔形式)制造，并且可以由技术人员基于要进行的实验的大小和选择来容易地选择。

样品板还被构造成包含至少两个按顺序布置的孔。样品板可被构造成包含至少两个线性布置的孔。

通常，样品板中的孔将按行和列布置。例如，8孔板可被构造成4个线性行，每行2个相邻的孔。在这种构型中，每行可使用单独的泵。每个泵可具有不同的泵送参数。

又如，24孔板可被构造成6个线性行，每行4个相邻的孔。

又如，48孔板可被构造成8个线性行，每行6个相邻的孔。在该构型中，单个泵可用于所有行，使得在所有行中使用相同的泵送参数。在另一种构型中，使用3个泵。可以在所有行中使用相同的泵送参数。

又如，96孔板可被构造成12个线性行，每行8个相邻的孔。如果需要，样品板甚至可以制造或定制，以在样品板中提供所需数量的孔。

如果样品板包括至少两个按顺序布置的孔，则可以根据本公开使用该样品板，但是优选使用较大的板，以便可以进行更多的实验。不一定要使用样品板中的每个孔。如果在样品板中使用至少两个按顺序布置的孔，则这将足以进行根据本公开的实验。

样品板在板的顶部可以装配有盖子，这有助于降低污染的风险。

样品板可以由聚四氟乙烯(PTFE)、不锈钢(例如，316L/1.4435)、聚醚醚酮(PEEK)、聚丙烯、聚砜或PTFE或其两种或更多种的组合制成，可选地具有聚对二甲苯涂层。

在某些实施方案中，优选使用PEEK，因为其具有不吸收烟碱和NNK的优点，如本文所述。

如果需要，样品板可以通过计算机辅助设计(CAD)来设计，或者可以通过商业途径获得。CAD板可以使用本领域所熟知的方法通过微机械加工来生产。

在一个实施方案中，样品板是一种在本领域中广泛可用的微流体细胞培养板。例如，M04S微流体细胞培养板可从Cellasic(California，USA)获得，并且包含4个独立的孔，每个孔的直径为约2.8mm，高度为约120微米。

与细胞培养板不同，样品板通常在样品板中没有通道，因为流体可以经由移液器(诸如自动移液器)输送到样品板的孔中。另外，由于不需要用通道输送流体，因此样品板的侧壁和孔的底部通常将被密封。

细胞培养板和样品板可具有相同数量的行的孔，或者样品板可具有较大数量的行的孔，如下所述。

泵

在一个实施方案中，用于本公开的一个或多个泵是可操作以使流体循环的容积泵，诸如蠕动泵。如本领域中所理解的，蠕动泵是用于移动流体的泵。流体容纳在本文所述的通道内，该通道可以是装配在泵壳内部的挠性管。替代地，如果将通道直接加工(例如，嵌入)到板上，则可以使用适配器将加工或嵌入的通道连接到泵。附接在泵的外圆周上的转子压缩挠性管或通道。当转子转动时，管或通道的处于压缩下的部分被挤压闭合，以迫使流体通过管或通道。

第一(循环)泵可用于控制细胞培养板中的流体流量。可以使用第二(样品)泵将流体从细胞培养板移动到样品板。

在一个实施方案中，第一泵的流速在每分钟约10μl至每分钟约1000μ1之间。

在一个实施方案中，第二泵的流速在每分钟约10μl至每分钟2000μl之间。第二泵的流速可以高于第一泵的流速。这可以帮助在采样之前进行混合。第二个泵的示例性较高流速为每分钟550ul至每分钟2000ul。

在一个实施方案中，一个或多个泵包括具有编码器的步进电动机或无刷电动机。

每个电动机可由电动机控制器控制，该电动机控制器的操作和传感器可由微控制器控制。微控制器的操作可由无线控制器(诸如

控制器)控制，以便于与无线装置诸如平板电脑一起使用。在另一个实施方案中，第一泵位于细胞培养板的内部或外部。适当地，位于外部的第一泵邻近细胞培养板的按顺序布置的孔定位。当多个第一泵与单个细胞培养板一起使用时，第一泵可以全部位于细胞培养板的同一侧上，如图5所例示的。替代地，由于空间限制，可能需要将第一泵以交错的形式适当地定位在细胞培养板的相对两侧上，如图2所例示的。

第二泵通常将位于样品板的外部。适当地，位于外部的第二泵邻近细胞培养板定位，从而可以将流体从细胞培养板输送到样品板。适当地，第二泵位于细胞培养板的与第一泵相对的一侧上。

用于本公开的可商购获得的第二泵的一个实例是WPM蠕动泵(Welco Co，Ltd，Japan)或Boxer蠕动6KP系列泵(Boxer GmbH，Germany)。

在某些实施方案中，可以使用三个或更多个泵。至少一个泵可用于采样，至少一个泵可用于重新填充流体，并且至少一个泵可用于使流体循环通过板(例如，参见图10)。

至少一个泵可以容纳在壳体诸如密封盒中。密封盒可以防水。当使用多于一个泵时，可以根据需要将泵容纳在同一壳体或单独的壳体中。

至少一个泵可以容纳在培养箱中。

当至少一个泵容纳在壳体中时，壳体中的泵可以进一步容纳在培养箱中。在图7中例示了该实施方案，其中每个电动机56容纳在密封盒56中并且容纳在培养箱51中。

细胞培养

细胞培养一般是指在人造环境中生长前从组织移出细胞。可以直接从含有待培养的细胞的组织移出待培养的细胞，并且任选地在培养前用酶或机械方式处理。作为替代，待培养的细胞可以来源于先前建立的细胞株系或细胞系。如本文所述的细胞培养板可提供用于从孔中对流体(诸如细胞培养基)进行采样的系统或装置。如本文所述的细胞培养板可以提供用于任选地实时研究细胞的各个方面的系统或装置，所述各个方面包括：生理学；生物化学；试剂(包括气溶胶)的作用；试剂的筛选和开发或优化；试剂功效的研究；试剂吸收的研究；毒性筛选；毒理学；目标发现；药代动力学；药效学；以及再生医学。

细胞培养板可用于生物学终点检测，诸如指示总体细胞健康的基于细胞的检测(例如，CellTiter-

3D细胞活力检测和ApoTox-

Triplex检测)。它可用于研究细胞形态和表型(例如，组织学和免疫组织化学)。它可用于研究代谢能力(例如，P450-

检测)。它可用于研究细胞功能(例如ROS-

H₂O₂检测或GSH/GSSG-

检测)。

一般来讲，细胞培养板可用于研究例如毒理学，研究试剂的毒理学，研究代谢试剂的毒理学，以及研究试剂对一种或多种细胞的作用。

插入物和孔

用于本公开的某些细胞可以在容纳于细胞培养板的孔中的插入物中培养。某些细胞可以在插入物中包含的可渗透膜上生长。一般来讲，细胞将在可渗透膜的顶部生长。将插入物放置在细胞培养板的孔中。当细胞培养板的孔中充满流体(诸如细胞培养基)时，流体将穿过可渗透膜并与细胞接触，从而可以在插入物中培养细胞。流体只能接触插入物的底部部分。不同类型的细胞可以在插入物中培养，如本文所述。在使用插入物的情况下，培养的细胞类型的一个实例是肺细胞。

用于本公开的其他细胞类型可以在不使用插入物的情况下培养，并且可以替代地在包含表面涂层的细胞培养板的孔中培养。例如，球状体可以使用具有附着表面涂层的

球状体微孔板来生长，该附着表面涂层是亲水性的、生物惰性的且不可降解的，并且共价地附着到孔底的内表面。孔底的设计使得3D细胞球状体培养物的生长能够高度可重复。在不使用插入物的情况下，培养的细胞类型的一个实例是肝细胞。

在某些实施方案中，至少两个孔具有不同的深度。例如，当使用肺细胞和肝细胞时，包含肝细胞的孔将更深，因为流体需要覆盖肺球状体，而在包含肺细胞的孔中，流体仅需要到达插入物的底部部分。

在某些实施方案中，所述至少两个孔中的液位具有不同的深度。

图1示出了一个实施方案，其中插入物10包括在插入物10的底部的可渗透膜12。组织/细胞14可容纳在插入物10的底部。插入物可包括在插入物10的顶部上的可选的盖子19，以降低污染的风险。插入物10可容纳在孔17中。孔17可容纳流体。多个孔17可以用如本文所述的通道(诸如微流体通道)连接在一起。

有利地，插入物是商业上可获得的，这有助于简化细胞培养板的设计和构造。例如，可以使用ThinCert^TM可渗透细胞培养插入物(USA Scientific，Florida，USA)。这些插入物可具有各种尺寸和光洁度，并且可以由技术人员容易地选择以用于本公开。每个插入物可具有自动定位的悬挂器，其通过将插入物定位成稍微偏离中心来消除毛细效应并使移液器最大程度地进入孔。ThinCert^TM细胞培养插入物与标准多孔板兼容。又如，可以使用

HTS

-可渗透支架(Sigma Aldrich，Dorset，United Kingdom)。

HTS

-可渗透支架具有24或96孔阵列，所述孔具有通过刚性托盘连接的可渗透插入物。

不连续表面

本发明的发明人已观察到，在3维细胞培养过程中，球状体可能会在同一位置团聚在一起，形成单个大组织。在不希望受理论束缚的情况下，他们已观察到，与朝向球状体外侧定位的细胞相比，球状体中间的细胞较少触及营养物，使得朝向球状体中间的细胞倾向于死亡。当球状体团聚时(这可能在细胞培养5小时后发生)，这将成为问题，因为球状体中的细胞数量越多，触及营养物的机会就越少。这也进一步增加了球状体内死细胞的数量。这可能由于许多原因而成为问题，包括：(1)从死细胞释放的分子可能对球状体中的其他细胞产生负面影响；(2)死细胞不具有代谢活性，因此球状体的代谢活性将会降低；(3)许多检测要求使用单个球状体。本发明的发明人试图解决在3维细胞培养中球状体团聚的问题。他们令人惊讶地发现，可以通过在孔的底部(诸如多孔板的孔)上形成不连续表面，使得不连续表面上的球状体捕获在不连续表面中，从而很好地解决该问题。这有效地减少了球状体的团聚程度或防止了球状体的团聚。有利的是，发明人发现球状体可以保持为个体化的单个球状体。

在某些实施方案中，一个或多个孔的底部(诸如多孔板的一个或多个孔的底部)可包括不连续表面，该不连续表面适于减少或防止球状体的团聚。应当理解，不是每个孔都需要包括不连续的表面，因为不是所有孔都可以用于球状体的培养。例如，一些孔可用于培养其他细胞类型，而无需使用不连续表面。例如，一些孔可用于培养其他细胞类型，其需要使用插入物来形成空气-液体界面。

适当地，不连续表面捕获球状体以减少或防止球状体的团聚。适当地，不连续表面捕获单个球状体以减少或防止球状体的团聚。

在某些实施方案中，不连续表面由一个或多个凹槽形成。凹槽可以起到捕获球状体的作用，以减少或防止球状体的团聚。一个或多个凹槽的尺寸通常将对应于球状体的最大直径±10％，使得球状体可以被捕获或保持在一个或多个凹槽中。适当地，一个或多个凹槽将覆盖孔的底部的大部分，因为孔的底部上平坦表面的存在可能导致球状体团聚，这可能导致不期望的大细胞团聚体的形成。在某些实施方案中，孔的底部的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％将包含不连续表面，诸如一个或多个凹槽。

适当地，在孔的底部中的不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度在约200μm至约1000μm之间，适当地，在约600μm至约1000μm之间。实际的深度和宽度将由打算在孔中使用并捕获的球状体的尺寸确定。因此，例如，一些球状体的最大直径为约600μm，在这种情况下，不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度将为约600μm±10％。在一些实施方案中，期望不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度大于球状体的最大直径，诸如球状体的最大直径的20％、30％、40％、50％或60或更大。在一个实施方案中，球状体的最大直径为600μm，并且不连续表面(诸如多个凹槽)的高度为约1mm，宽度为约1mm或约2mm。

一般来讲，凹槽的形状可以是呈一定形状的平坦底部，U形、V形或V形的平坦底部等。在一个实施方案中，凹槽具有V形的平坦底部。在一个实施方案中，凹槽的开口的最大宽度为约2.4mm，凹槽的深度为约1mm，并且在凹槽的底部上的平坦底部的宽度为约400μm。根据该实施方案的凹槽的相对两侧的角度为约90度。

转到图11，示出了包括孔112的细胞培养板110，该孔在其底部上具有多个凹槽116，所述多个凹槽包含V形凹槽，每个V形凹槽都具有平坦底部。凹槽中的开口的最大宽度为约2.4mm，凹槽的深度为约1mm，并且在凹槽的底部上的平坦底部的宽度为约400μm。凹槽的相对两侧的角度为约90度。尽管多个凹槽被示出为具有相同的形状，但是设想可以使用不同形状的凹槽。例如，孔的底部可包括多个凹槽，其中凹槽中的一个或多个的形状不同。因此，孔的底部可包括包含两种或更多种呈一定形状的平坦底部的多个凹槽，所述多个凹槽具有U形、V形或V形的平坦底部等。

在某些实施方案中，凹槽在孔的底部上形成多个同心环。在一个实施方案中，同心环的半径为约1.05mm、约3.45和约5.85mm。转到图12，示出了具有由凹槽116形成的多个同心环117的细胞培养板112的底部，同心环的半径为约1.05mm、约3.45和约5.85mm。

现在转到图14，示出了多孔板形式的细胞培养板110的平面图。细胞培养板110包含多个孔112，这些孔包含多个同心凹槽117或包含微流体通道118。孔线性布置成行。行可被构造成包含至少一个孔，所述至少一个孔包含同心凹槽117。行可被构造成包含至少一个包含同心凹槽117的孔和至少一个包含微流体通道118的孔，如图4所示。

通道119连接包含多个同心凹槽117的孔和包含微流体通道118的孔。每个孔包含入口和出口，用于使流体输送进入每个孔和输送离开每个孔。尽管图14示出了细胞培养板110中包含同心凹槽117或包含微流体通道118的每个细胞孔112，但是技术人员将理解，没有必要使每个孔112都以这种方式构造，并且孔12中的一个或多个可以不包含同心凹槽117和/或不包含微流体通道118。根据需要，一些孔112可以是空的并且可以不被使用。

在某些实施方案中，不连续表面由一个或多个凹槽形成，所述一个或多个凹槽被成形为横跨孔的底部的波浪形。

在某些实施方案中，不连续表面包括多个孔洞。孔洞通常具有封闭的底部和开放的顶部。孔洞起到捕获单个球状体的作用，以减少或防止球状体的团聚。孔洞的尺寸通常将对应于球状体的最大直径±10％，使得球状体可以被捕获或保持在孔洞中。不连续表面可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或更多个横跨孔的底部分布的孔洞。不连续表面可包含横跨孔的底部分布的130至160个孔洞。不连续表面可包含横跨孔的底部分布的130至150个孔洞。不连续表面可包含横跨孔的底部分布的130至140个孔洞。一般来讲，孔洞的形状可包括呈一定形状的平坦底部，U形、V形或V形的平坦底部等。孔洞的形状没有特别限制，只要孔洞能够容纳球状体的最大直径±10％以捕获单个球状体即可。在某些实施方案中，孔洞的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约600至约1000μm之间。在某些实施方案中，孔的底部的至少70％、80％或90％或更多将被孔洞填充。

转到图16，示出了包括孔122的细胞培养板120，该孔在其底部上具有多个孔洞126。孔洞具有封闭的底部和开放的顶部。每个孔洞的最大宽度为约0.8mm，凹槽的深度为约0.5mm。孔洞的相对两侧的角度为约118度。尽管多个孔洞被示出为具有相同的形状，但是设想可以使用不同形状的孔洞。例如，孔的底部可包括多个孔洞，其中孔洞中的一个或多个的形状不同。因此，孔的底部可包括包含两种或更多种呈一定形状的平坦底部的多个孔洞，所述多个孔洞具有U形、V形或V形的平坦底部等。

图17示出了图16所示的细胞培养板120的平面图。细胞培养板120的半径为约8mm。包含多个孔洞126的孔122的底部的半径为约5.8mm。每个孔洞26的半径为约0.4mm。

现在转到图18，示出了多孔板形式的细胞培养板121的平面图。细胞培养板121包含多个孔122，这些孔包含多个孔洞127或包含微流体通道128。孔122线性布置成行。行可被构造成包含至少一个孔，所述至少一个孔包含多个孔洞127。行可被构造成包含至少一个包含多个孔洞127的孔和至少一个包含微流体通道128的孔，如图14所示。通道129连接包含多个孔洞127的孔和包含微流体通道128的孔。每个孔包含入口和出口，用于使流体输送进入每个孔和输送离开每个孔。

尽管图18示出了细胞培养板121中包含孔洞127或包含微流体通道128的每个孔122，但是技术人员将理解，没有必要使每个孔122都以这种方式构造，并且孔122中的一个或多个可以不包含孔洞127和/或不包含微流体通道128。根据需要，一些孔122可以是空的并且可以不被使用。

当根据本公开使用时，横跨细胞培养板的多个孔的深度无需相同，并且设想，孔可具有不同的深度。在一个实施方案中，包括不连续表面或孔洞的孔的深度大于包括插入物的孔的深度。连接至少两个孔的通道可以处于相同的高度，使得通道位于距至少两个细胞孔的底部不同距离处。这种构型确保了流入孔中的流体不会扰动或干扰捕获在不连续表面上的球状体，同时确保了流体仍可以穿过插入物的可渗透膜。

图15中描绘了这种构型，其中示出了包括第一孔112a和第二孔112b的细胞培养板110，所述第一孔在其底部上具有多个凹槽116，所述第二孔在其中具有微流体通道118。第一孔112a的深度大于第二孔112b的深度。第一孔112a的深度为约20mm，第二细胞孔112b的深度为约18.3mm。通道119与孔112a和112b中的每一个流体连通。通道119位于距与第二孔112b相比更远的第一孔112a的底部位置。

图19中也描绘了这种构型，其中示出了包括第一孔122a和第-二孔122b的细胞培养板120，所述第一孔在其底部上具有多个孔洞126，所述第二孔在其中具有微流体通道128。第一孔122a的深度大于第二孔122b的深度。第一孔122a的深度为约20mm，第二孔112b的深度为约18.3mm。通道129与孔122a和122b中的每一个流体连通。通道129位于距与第二孔122b相比更远的第一孔122a的底部位置。

细胞来源

本公开利用了多种细胞来源。在一个实施方案中，本公开排除了从受试者分离或获得细胞样品的步骤。细胞可以冷冻保存。细胞可以在三维培养物中。细胞可以是球状体的形式。细胞可以活跃地分裂。细胞可以在细胞培养基(例如，包含营养物(例如，蛋白质、肽、氨基酸)、能量(例如，碳水化合物)、必需金属和矿物质(例如，钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐)、缓冲剂(例如，磷酸盐、乙酸盐)、pH变化指示剂(例如，酚红、溴甲酚紫)、选择剂(例如，化学品、抗微生物剂)等)中培养。单种细胞培养基可用于生长相同或不同类型的细胞。不同的细胞培养基可用于生长不同类型的细胞。由于细胞培养基根据本公开进行循环，因此将发生不同细胞培养基的混合。

在一些实施方案中，一种或多种试剂包括在一种细胞培养基或多种细胞培养基中。可以使用本领域所熟知的方法从组织或流体中分离细胞。细胞可以从干细胞分化(诸如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)或直接从体细胞分化。细胞可以是天然细胞或变异细胞(例如，包含一种或多种非天然基因变异的细胞)。细胞可以是疾病细胞或疾病模型细胞。例如，细胞可以是癌细胞或可以被诱导为过度增殖状态的细胞(例如，转化细胞)。

细胞可以是或可以来源于人或动物受试者，或来源于人或动物细胞，包括许多哺乳动物物种中的任一种，适当地是人，但包括大鼠、小鼠、猪、兔和非人灵长类动物等。细胞和细胞系可以从商业来源获得。细胞可以来自或来源于任何期望的组织或器官类型，包括但不限于肾上腺、膀胱、血管、骨、骨髓、脑、软骨、宫颈、角膜、子宫内膜、食管、胃肠、免疫系统(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞和树突细胞)、肝、肺、淋巴、肌肉(例如，心肌)、神经、卵巢、胰腺(例如，胰岛细胞)、垂体、前列腺、肾、唾液、皮肤、腱、睾丸和甲状腺。

肺细胞(包括肺上皮细胞)是一种特别令人感兴趣的细胞类型。支气管和/或气道上皮细胞尤其用于本公开中。可以通过在支气管镜检查程序期间刷拭供体肺来收集人类支气管上皮细胞。在一个实施方案中，肺细胞是正常人类支气管上皮(Normal HumanBronchial Epithelial，NHBE)细胞。肺上皮细胞可以被培养成单层未分化细胞，或在空气-液体界面处进一步发育成器官型肺上皮细胞状组织。可以从具有不同病变的人或动物受试者，包括被归类为吸烟者或非吸烟者的受试者，获得肺上皮细胞。

肝细胞是另一种特别令人感兴趣的细胞类型。在一个实施方案中，所用细胞是肝细胞。肝细胞是肝的细胞，其构成肝脏细胞质质量的70％-85％。肝细胞的功能性高度取决于其形成极性表型的能力，极性表型只在3维培养中建立。肝细胞的一种来源是原代肝细胞，其是广泛用于研究肝脏生理学和病理学的许多方面的体外模型。用于分离人类肝细胞的技术可以基于捐赠肝的两步胶原蛋白酶灌注。然而，这些细胞表达代谢酶不超过5天。另一限制是其短存活力。这些缺点可以通过使用替代的、寿命长的肝细胞系(诸如人或动物肝祖细胞系)来克服。人肝祖细胞系的一个这样的实例是HepaRG细胞系(，ThermoFisherScientific)。HepaRG细胞保留了原代人肝细胞的许多特征。与原代肝细胞相比，它们具有更高的肝脏特异性和代谢基因表达，并且具有更长的寿命。3维球状体中HepaRG细胞的重组进一步延长了寿命并提高了代谢能力，这表明球状体可能为毒性测试提供更好的体外肝脏模型。还可以用原代肝细胞与肝星形细胞或原代肝细胞与脂肪组织衍生干细胞的混合物创造肝球状体。

在一个实施方案中，肺细胞是肺上皮细胞，诸如支气管和/或气道上皮细胞。

在一个实施方案中，肝细胞是HepaRG细胞，适当地，是球状HepaRG细胞。

细胞组合

设想了本文所述的任何细胞的组合的使用。设想了在细胞培养板中或在包括细胞培养板的系统或装置中的本文所述的任何细胞的组合的使用。细胞的一种示例性组合是肝细胞和肺细胞的组合。设想了将肺上皮细胞(诸如支气管和/或气道上皮细胞)和肝细胞(诸如HepaRG细胞，适当地，球状HepaRG细胞)的组合。如果需要，可以将其他细胞与该组合一起使用。

该组合的不同细胞通常将在单独的孔中培养。

在包括至少两个孔或至少两个插入物的细胞培养板中，孔或插入物中的每一个可包含相同或不同的细胞类型。适当地，至少两个孔或插入物中的每一个包含不同的细胞类型。不同的细胞类型可以是不同的细胞系。不同的细胞类型可以是不同的细胞或组织。在一个示例性实施方案中，细胞培养板中的不同细胞类型是肺和肝细胞。

本公开的一个优点是，当来自第一细胞类型的流体在其循环通过本文所述的细胞培养板时到达第二细胞类型时，可以任选地实时研究第一细胞类型对第二细胞类型的影响。

本公开的另一个优点是，当来自第二细胞类型的流体在其循环通过本文所述的细胞培养板时到达第一细胞类型时，可以任选地实时研究第二细胞类型对第一细胞类型的影响。

本公开的另一个优点是，可以任选地实时研究来自第一细胞类型的代谢试剂对第二细胞类型的影响。

本公开的另一个优点是，可以任选地实时研究来自第二细胞类型的代谢试剂对第一细胞类型的影响。

本公开的另一个优点是，可以任选地实时研究来自第一细胞类型的代谢试剂和来自第二细胞类型的代谢试剂对第三细胞类型的影响等等。

本公开的另一个优点是，可以任选地实时研究来自细胞类型的组合的代谢试剂的影响。

本公开的另一个优点是，可以任选地实时研究两种或更多种细胞类型暴露于试剂的影响。

3维细胞培养

本公开结合了“3维细胞培养”的使用，其包括在使用或不使用培养基或支架(诸如插入物中的可渗透膜)的情况下提供细胞在3维中培养的任何方法。已经开发了许多不同的3维细胞培养方法，包括球状体培养和器官型培养。3维细胞可以在本文所述的细胞培养板中生长和/或维持。

术语“球状体”采用如所述领域中通常所了解的含义，其是在三维上分裂成细胞球的单细胞，或在三维上多个细胞的聚集体，在球状体内的三维细胞生长中使用或不使用基质或支架进行支撑。三维球状体可以是黏附球状体或悬浮生长的球状体。

在一些实施方案中，球状体包含单种细胞类型。在一些实施方案中，球状体包含多于一种细胞类型。在一些实施方案中，当生长多于一个球状体时，每个球状体是相同类型的，而在其他实施方案中，生长两种或更多种不同类型的球状体。

根据细胞通讯和细胞外基质的发展，三维球状体更紧密地类似体内组织。这些基质帮助细胞在球状体内移动，类似于细胞在活组织中移动的方式。因此，球状体是有很大改良的用于分化、存活、细胞迁移、细胞极化、基因表达和生长的模型。

球状体可以使用所属领域中众所周知的各种方法收获和研究，所述方法包括用板式读取器测量的比色、荧光和发光分析法，或它们可以容易地通过显微法来观测。其他技术包括Western、Northern或Southern印迹、组织学技术(例如，免疫组织化学、原位杂交、免疫荧光)等。还设想了使用光学成像方法，诸如反向明场显微镜、荧光显微术、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、正电子发射形貌(PET)、磁共振成像(MRI)和切伦科夫发光成像(CLI)技术。

使用3维球状体的应用包括在更接近体内环境的环境中体外细胞和组织增殖的研究、化合物或试剂的筛选、毒理学检测、细胞治疗、细胞递送、试剂递送、生物化学替代、生物活性分子的产生、组织工程、生物材料和临床试验等。

球状体在三维细胞培养中的使用一般在Expert Opin.Drug Discov.(2015)10，519-540中进行综述。

3维器官培养系统可用于本公开中，并且它们允许研究器官如何起作用。可以研究对某些刺激的反应、对一种或多种试剂的反应以及此类试剂的药代动力学行为。微型3维细胞培养系统允许对细胞组或器官组进行组合研究。这允许不同组织之间相互作用的复杂性得以再现。3维器官培养物可以是器官型的，这意味着其试图再现器官或器官系统的主要功能。还设想了使孔互连的微型流体系统。

细胞培养板可以具有至少一种组织类型的至少一种生理功能，或更适当地具有至少两种不同组织类型的至少一种生理功能。

基于肝脏的3维培养

肝脏在解毒、碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢以及内源性和外源性物质的生物转化中发挥重要作用。肝功能性与由所谓肺叶组成的复杂3维结构内所包埋的高度专业化细胞(大部分是肝细胞)的装配紧密关联。化合物的生物转化通常会产生无毒且更易溶的代谢物，然而，偶尔会形成更多的毒性代谢物，从而引起肝毒性。

肝细胞可以经由各种方法变成3维，包括使用夹心式培养、固体支架材料-例如聚苯乙烯支架、水凝胶-例如I型胶原蛋白或肝细胞自组装成球状体。

虽然新鲜分离的原代人肝细胞的使用有限，可能是优选的肺细胞类型，但它们的可用性有限。人类肝细胞系的其他选择包括HepG2和Hep2/C3A。一种尤其合适的细胞来源是HepaRG细胞系。人类肝细胞的其他来源是人类胚胎干细胞(hESC)来源的肝细胞和来源于诱导多能干细胞(iPSC)的肝细胞。

在一个实施方案中，球状体是或来源于肝细胞以形成3维肝球状体。此类肝球状体可以使用本领域已知的和描述于例如ALTEX(2014)31，441-477和Toxicol.Sci.Off.J.Soc.Toxicol.(2013)133，67-78中的多种方法来制备。

基于肺的3维培养

因为呼吸道的形态从上呼吸道变成下呼吸道，所以已经使用原代细胞或细胞系建立许多不同的细胞培养模型并且涵盖其用于本公开中。确切使用哪些细胞或细胞系的选择将取决于用于所给出研究的呼吸道的关注区域。

由于肺表面暴露于空气，因此可以在空气-液体界面处培养细胞模型，以更真实地模拟肺。

在一个实施方案中，球状体是或来源于肺细胞以形成3维肺球状体。此类肺球状体可以使用本领域已知的多种方法(诸如描述于ALTEX(2014)31，441-477和Toxicol.Sci.Off.J.Soc.Toxicol.(2013)133，67-78中的那些)来制备。

细胞流体暴露采样装置

细胞培养板可以是较大装置(诸如采样装置，适当地是细胞流体暴露采样装置)的部件。与来自至少两个孔的细胞接触的流体可以循环通过装置或系统，并根据需要被采样和任选地测量和/或分析。为了将流体的样品从细胞培养板递送到样品板，可以使用第二(采样)泵将流体从细胞培养板输送到样品板。以上描述了第二泵。一般来讲，该装置可以包含三个或更多个泵。至少一个泵可用于采样，至少一个泵可用于重新填充流体，并且至少一个泵可用于使流体循环通过板(例如，参见图10)。有利的是，采样装置是自动采样装置，其最大程度地减少了手动交互，以提高通量并降低污染的风险。在某些实施方案中，采样装置是高通量采样装置。在某些实施方案中，采样装置被配置用于实时采样。在某些实施方案中，采样装置被配置用于实时高通量采样。

在一些实施方案中，采样装置包括多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)细胞培养板和多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)样品板。

在一些实施方案中，采样装置包括用于容纳细胞培养板以将其维持在最佳培养条件(例如，温度、大气环境和湿度)的培养箱。

在一些实施方案中，采样装置容纳在培养箱内。

在一些实施方案中，采样装置包括用于向一个或多个细胞培养板供应或重新供应流体的一个或多个泵或其他部件。

在一些实施方案中，采样装置包括用于使对培养装置的处理、使用和/或分析自动化的一个或多个机器人部件(例如，移液管、臂、板移动器等)。

在一些实施方案中，采样装置包括用于向采样装置供应或补充(新鲜的或未使用的)流体的一个或多个贮存器。

在一些实施方案中，采样装置包括用于向该装置供应清洁流体的一个或多个清洁贮存器。

采样装置可以完全或部分自动化。

采样装置包括本文所述的细胞培养板。为了允许流体在细胞培养板与样品板之间输送，可以使用第二泵将流体从细胞培养板朝向样品板输送。第二泵可以通过将通道调整为附加地延伸到第二泵来与细胞培养板连通。替代地，第二通道可以连接或联接到细胞培养板中的(第一)通道，如图8中附图标号64所示。第二通道可以连接或联接到第二泵，该第二泵可操作以将流体远离细胞培养板中的孔输送并朝向样品板输送。

采样装置还可包括用于在装置中储存流体的贮存器，其中所述贮存器与孔流体连通。

在某些实施方案中，它还可包括至少一个另外的泵，所述至少一个另外的泵适于从贮存器输送流体以重新填充细胞培养板和/或样品收集板的孔。在某些实施方案中，所述至少一个另外的泵适于用与在样品收集板的孔中收集的相同体积的流体重新填充细胞培养板的孔。在某些实施方案中，它还包括适于将流体转移到样品收集板的孔中的移液器。可以在一个或多个不同时间点对细胞培养板中按顺序布置的孔的一个或多个样品进行采样以进行分析。

在某些实施方案中，采样装置可包括可操作以自动控制装置的操作的计算机控制器。在某些实施方案中，它可包括检测装置中的液位的装置。

现在将更详细地描述可以结合细胞培养板和样品板的采样装置的具体非限制性实例。图8示出了结合了本公开的细胞培养板构型和样品板的细胞流体暴露采样装置60。细胞流体暴露采样装置60包括第一贮存器61，该第一贮存器容纳流体，用于将流体提供到采样装置以在其中循环。第二贮存器75可以经由连接器65连接到泵66a，诸如蠕动泵。在连接器65与泵66a之间，可以使用入口阀68a(诸如电动阀)来选择要使用的贮存器。在泵66a与细胞培养板62之间，可以包括出口阀68b，以控制流体从泵66a到细胞培养板62的流量。这种构型允许精确地控制递送到细胞培养板62的流体的流量和量。流体循环通过细胞培养板62，如本文所述。为了将流体的样品从细胞培养板62递送到样品板63，第二通道64可以连接或联接到细胞培养板中的第一通道23。可以使用第二泵66b将流体从细胞培养板62泵送到样品板63。可以使用移液器67(诸如多头移液器)将流体传送到样品板63。如果需要，移液器67可用于将流体输送离开采样装置以进行进一步分析。移液器67可以是自动移液器，该自动移液器任选地包括一个或多个传感器72和任选的一个或多个电动机74以控制其操作。移液器67可以具有水平运动，使得可以将流体传送到样品板63中按顺序布置的孔中。示出了连接器77。还示出了废液处理器78。在某些实施方案中，流速对于所有通道可以是相同的。所使用的不同泵可以各自具有自己的泵送参数。图10示出了可以结合细胞培养板和样品板的采样装置的具体非限制性实例，并且现在将对其进行更详细地描述。在该实例中，示出了三个泵。泵1用于重新填充贮存器。泵2用于使流体循环通过板。泵3用于采样。

细胞培养板62和样品板63可具有相同数量的行的孔，或者样品板63可具有较小或更大数量的行的孔。样品被从细胞培养板62的所有包含流体的孔的行中取出，并被递送到样品板63的一个或多个孔中。同一样品的多个等分试样可被分配到样品板63的多个孔中，所述多个孔适当地全部位于同一行中。或者多个样品可在不同时间点或在暴露于不同试剂后被从细胞培养板62的包含流体的孔的行中取出，然后被递送到样品板63中。通常，从细胞培养板62的包含流体的孔的行中取出的样品将被递送到样品板63的对应行中，因此可以在样品板63中跟踪来自细胞培养板62的样品。例如，从细胞培养板62的第1行的包含流体的孔中取出的样品将被递送到样品板63的第1行的一个或多个孔中。又如，从细胞培养板62的第2行的包含流体的孔中取出的样品将被递送到样品板63的第2行的一个或多个孔中，等等。

可以根据需要在开始实验之前在用户界面中定义样品收集参数。

该装置可用于本文所述的多种应用。例如，该装置可用于研究实时暴露期间一种或多种试剂的作用。又如，该装置可用于研究实时暴露期间一种或多种试剂的暴露动力学。

一方面，提供了一种用于对暴露于一种或多种试剂的细胞培养基进行采样的方法(诸如完全或部分自动化的方法)，所述方法包括以下步骤：(a)提供本文所述的细胞流体暴露采样装置；(b)使孔中的至少一个与包含细胞的细胞培养基接触；(c)使细胞培养基循环通过细胞培养板的孔；(d)使细胞培养板的孔暴露于至少一种试剂；(e)从细胞培养板中对细胞培养基进行采样，任选地，其中在暴露于试剂期间对细胞培养基进行实时采样。在步骤(d)中，可以在多个时间点将多孔板的孔暴露于至少一种试剂。在步骤(e)中采样的细胞培养基的体积可以在约50至约200μl之间。该方法可包括确定一种或多种试剂对所采样的细胞的作用的进一步步骤(f)。

还公开了使用细胞流体暴露采样装置来从细胞培养板的一个或多个孔中对细胞进行采样。

还公开了使用细胞流体暴露采样装置来从细胞培养板的一个或多个孔中对暴露于一种或多种试剂的细胞培养基进行采样并筛选细胞培养基中的细胞以确定一种或多种试剂对细胞的作用。

筛选

细胞培养板或采样装置可任选地用于实时采样或筛选。可以任选地实时确定一种或多种试剂对细胞培养板或装置中包含的细胞的作用。细胞培养板和/或采样装置可用于例如试剂/药物发现、试剂/药物表征、功效测试和毒性测试等。此类测试包括但不限于药理作用评估、致癌性评估、医学显像剂特性评估、半衰期评估、辐射安全性评估、基因毒性测试、免疫毒性测试、生殖和发育测试、药物/试剂相互作用评估、剂量评估、吸附评估、处置评估、代谢评估、消除研究等。特定的细胞类型可用于特定的测试(例如，肝细胞用于肝毒性，肾近端小管上皮细胞用于肾毒性，血管内皮细胞用于血管毒性，神经元和神经胶质细胞用于神经毒性，心肌细胞用于心脏毒性)。

一方面，描述了一种用于评估细胞或组织对试剂的反应的体外方法，所述方法包括：(i)使本文所述的细胞培养板或采样装置中包含的细胞或组织与至少一种试剂接触；(ii)在与至少一种试剂接触后测量一种或多种反应；其中与至少一种试剂接触之前和之后的一种或多种反应的差异表明所述试剂调节了细胞或组织的反应。

另一方面，描述了一种用于评估两种或更多种细胞、组织或器官对试剂的反应的体外方法，所述方法包括：(i)使本文所述的细胞、组织或器官中的至少一者与至少一种试剂接触；(ii)在与至少一种试剂接触后测量一种或多种细胞、组织或器官中的一种或多种反应；其中在与至少一种试剂接触之前和之后的一种或多种细胞中的一种或多种反应的差异表明所述试剂调节了至少一种细胞、组织或器官的反应。

适当地，测量或确定至少一种试剂进入细胞或组织中的作用或渗透。适当地，测量或确定细胞或组织中至少一种试剂的生物活化。适当地，测量或确定细胞或组织对至少一种试剂的代谢。这些步骤可以同时或彼此相继进行。

一种或多种试剂对试剂(诸如气溶胶)渗透到一种或多种细胞、组织或器官中以及其被另一种细胞或组织进一步生物激活或代谢的作用可以使用本文所述的方法来确定。

可以将试剂添加到本文所述的细胞培养板的一个或多个孔中和/或可以将其添加到细胞培养板的通道中，并且可以监测或确定其对培养的细胞或组织的作用。也可以根据需要将试剂添加到一个或多个贮存器中。可以测量的作用的实例包括氧气的消耗、二氧化碳的产生、细胞活力、蛋白质的表达、酶的活性、渗透、渗透屏障功能、表面活性剂产生、对细胞因子的反应、转运体功能、细胞色素P450表达、白蛋白分泌等等。

可以将细胞培养板的一个或多个孔暴露于气溶胶中，并且可以监测或确定所述气溶胶对培养的细胞或组织的作用。可以测量的作用的实例包括氧气的消耗、二氧化碳的产生、细胞活力、蛋白质的表达、酶的活性、渗透、渗透屏障功能、表面活性剂产生、对细胞因子的反应、转运体功能、细胞色素P450表达、白蛋白分泌等等。

可以与不同浓度的试剂平行进行多种分析法，以获得对多种浓度的差异反应。如本领域中已知，测定试剂的有效浓度的方法通常使用由1∶10或其他对数标度稀释产生的一系列浓度。必要时，浓度可以用第二连续稀释进一步细化。通常，这些浓度之一充当阴性对照。

试剂

试剂可以是任何感兴趣的化合物，包括小的有机化合物、多肽、肽、较高分子量的碳水化合物、多核苷酸、脂肪酸和脂质、纳米颗粒气溶胶或气溶胶的一种或多种组分等、药物、毒素、病原体、抗原、抗体和小分子等。试剂可以单独筛选，或者在化合物组或化合物组合文库中筛选。试剂可从包括合成或天然化合物的文库的多种来源获得。可以使用呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。天然或以合成方式产生的文库和通过常规化学、物理和生物化学手段修饰的化合物可以用于产生组合文库。已知的药剂可以进行定向或随机的化学改性，例如酰化、烷基化、酯化、酸化以产生结构类似物以供筛选。当使用组合文库进行筛选时，可以筛选化学上相似或不同的试剂的大文库。在组合筛选中，发现的命中数与测试的试剂数成比例。可以筛选大量化合物，每天能测试数千种化合物，其中可以应用实验室自动化和机器人技术。可以在所属领域中发现用于合成分子文库的方法的许多实例。小的有机化合物包括分子量低于约5000、通常低于约2500、通常低于约2000、更通常低于约1500、宜约100到约1000的化合物。小的有机化合物可以是生物或合成有机化合物。小的有机化合物中存在的原子一般是在包含碳、氢、氧和氮的群组中，并且如果呈药物学上可接受的形式，那么可以包括卤素、硼、磷、硒和硫。一般来说，氧、氮、硫或磷如果存在的话，那么结合于碳或彼此一或多种或结合于氢，从而形成多种官能团，例如羧酸、醇、硫醇、羧酰胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、酰胺、醚、硫醚、硫酯、磷酸酯、膦酸酯、烯烃、酮、胺、醛等。本文所用的术语“有机小化合物”还包括分子量小于约5000的小肽、小寡核苷酸、小多糖、脂肪酸、脂质等。药物试剂的实例描述于The Pharmacological Basis of Therapeutics，Goodman和Gilman，McGraw-Hill，New York，N.Y.，(1996)，第九版中。试剂可以是毒素。

可以分析溶液中的试剂和可以溶解在适当溶剂中的固体样品。气态形式的试剂也可以通过将样品暴露在气体中一段时间来进行分析。所关注的样品包括环境样品、生物样品、制造样品、化合物文库以及合成和天然存在的化合物。

可以筛选具有至少约5,000、更通常至少约10,000的分子量的多肽。测试多肽一般将具有约5,000到约5,000,000或更大分子量，更通常约20,000到约1,000,000分子量。可以考虑各种多肽，例如具有类似结构特征的多肽家族、具有特定生物功能的多肽、与特定微生物、尤其是致病微生物相关的多肽。这类多肽包括细胞因子或白细胞介素、酶、鱼精蛋白、组蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、硬多肽、磷酸化多肽、粘多肽、紫色多肽、脂质多肽、糖多肽、T细胞受体、蛋白多糖、促生长素、促乳素、胰岛素、胃蛋白酶、在人类血浆中发现的多肽、凝血因子、血型因子、多肽激素、癌症抗原、组织特异性抗原、肽激素、营养标记物、组织特异性抗原和合成肽，这些可以糖化或不糖化。

可以筛选多核苷酸。测试多核苷酸可以是天然化合物或合成化合物。多核苷酸包括寡核苷酸并且由例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸等天然核苷酸和其衍生物构成，不过还涵盖非天然核苷酸模拟物，例如2′修饰的核苷、肽核酸和寡聚核苷膦酸酯。更高分子量多核苷酸可以具有约20到约5,000,000个或更多个核苷酸。

试剂可以是小的疏水分子(诸如分子量在146g/mol至207g/mol之间或在146g/mol至176g/mol之间的疏水分子)或有机溶剂(条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃)。在一个实施方案中，试剂包括烟草生物碱或由烟草生物碱组成。在另一个实施方案中，试剂包括：由化学式1：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

或更适当地，由化学式2：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

其中：

z为0或1；

R₁表示H或C₁-C₇烷基；

R₂表示H、＝O或C₁-C₇烷基；

R₃表示H、卤素或C₁-C₇烷基；

并且虚线表示

(a)单键；

(b)一个碳/碳双键或碳/氮双键和其余的单键；或者

(c)独立地选自碳/氮双键和碳/碳双键的两个共轭双键和其余的单键。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或

或其药学上可接受的盐或其混合物。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或

或其药学上可接受的盐或其混合物。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟草生物碱。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟碱、新烟碱、降烟碱、新烟草碱、可替宁、麦斯明或其药学上可接受的盐或其混合物。

“C₁-C₇烷基”是指通常具有1至7个碳原子的直链和支链饱和烃基；更适当地是C₁-C₆烷基；更适当地是C₁-C₃烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊-1-基、戊-2-基、戊-3-基、3-甲基丁-1-基、3-甲基丁-2-基、2-甲基丁-2-基、2，2，2-三甲基乙-1-基、正己基、正庚基等。适当地，烷基是甲基。

“卤素”是指F、Cl、Br或I。适当地，卤素是Cl。

″药学上可接受的盐"是指在合理的医学判断范围内的盐，其适用于与受试者的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏性反应等，与合理的利益与风险比相称，并且对于其预期用途有效。这些盐包括无毒的酸加成盐(包括二酸)和碱式盐。如果化合物或试剂是阳离子的或具有可以是阳离子的官能团(例如-NH₂可以是-NH₃ ⁺)，则可以与适当的阴离子形成酸加成盐。适当的无机阴离子的实例包括但不限于来源于以下无机酸的那些：盐酸、硝酸、亚硝酸、磷酸、硫酸、亚硫酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸、磷酸和亚磷酸。适当的有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘羧酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。适当的聚合有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下聚合酸的那些：丹宁酸、羧甲基纤维素。此类盐包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环己磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、苯甲酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基磺酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、蔗糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和昔萘酸盐(xinofoate salt)。例如，如果化合物是阴离子的或具有可以是阴离子的官能团(例如-COOH可以是-COO-或-SO₂H可以是-SO₂)，则可以与适当的阳离子形成碱式盐。适当的无机阳离子的实例包括但不限于金属阳离子，诸如碱金属或碱土金属阳离子、铵和取代铵阳离子，以及胺。适当的金属阳离子的实例包括钠(Na⁺)、钾(K⁺)、镁(Mg²⁺)、钙(Ca²⁺)、锌(Zn²⁺)和铝(Al³⁺)。适当的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4⁺)和取代铵离子(例如NH₃R⁺、NH₂R₂ ⁺、NHR₃ ⁺、NR₄ ⁺)。一些适当的取代铵离子的实例是来源于以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH₃)₄ ⁺。适当的胺的实例包括精氨酸、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、甘氨酸、赖氨酸、N-甲基葡糖胺、乙醇胺、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇和普鲁卡因。有关有用的酸加成盐和碱式盐的讨论，参见S.M.Berge等人，J.Pharm.Sci.(1977)66：1-19；还参见Stahl和Wermuth，Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use(2011)。药学上可接受的盐可以使用多种方法来制备。例如，可以使化合物或试剂与适当的酸或碱反应以得到所需的盐。还可以使化合物或试剂的前体与酸或碱反应以除去对酸或碱不稳定的保护基或打开前体的内酯或内酰胺基。另外，可以通过用适当的酸或碱处理或通过与离子交换树脂接触，将化合物或试剂的盐转化为另一种盐。反应后，如果盐从溶液中沉淀，则可通过过滤分离盐，或通过蒸发回收盐。盐的离子化程度可以从完全离子化到几乎未离子化变化。

在另一个实施方案中，所述试剂是烟草特有的亚硝胺(TSNA)，其是由包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和新烟碱的烟草生物碱的仲胺和叔胺的亚硝化形成的化学品。TSNA存在于一些烟草和烟草产品中。适当地，TSNA是N-亚硝基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟碱(NAB)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)、或4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)或其药学上可接受的盐或其混合物。更适当地，TSNA是4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，所述试剂是选自以下的有机溶剂：饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)；芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)；脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)；醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1，2-二甲氧基-乙烷、1，2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1，4-二噁烷)；酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)；酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)；含氮溶剂(例如，甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)；含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1，1-二氧化物)；以及含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。

在一个实施方案中，有机溶剂是饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)；

在一个实施方案中，有机溶剂是醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1，2-二甲氧基-乙烷、1，2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1，4-二噁烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含氮溶剂(例如，甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1，1-二氧化物)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。在一个实施方案中，所述试剂是烟碱或NNK或其组合。

可以测量的一个或多个变量包括细胞、亚细胞物质、亚细胞组分或细胞产物的可定量元素，特别是可以在高通量分析系统或装置中精确测量的元素。输出可以是任何细胞、细胞组分或细胞产物的特征、条件、状态或功能，包括存活力、呼吸、代谢、细胞表面决定子、受体、蛋白质或其构形或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、DNA、RNA等等或来源于这类细胞组分的部分。虽然变量可以提供定量读数，但在一些情况下，可以获得半定量或定性结果。读出变量可包括例如单个值、平均值、中值或其方差。

可以使用多种方法来测量一个或多个变量以确定细胞、组织或器官对试剂的反应。为了测量存在的试剂的量，一种方法是用可检测部分标记试剂，所述可检测部分可以是荧光的、发光的、放射性的、酶活性的等。荧光和发光部分可用于标记生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分可以不仅结合于特定蛋白质，而且还结合特定构象、裂解产物或如磷酸化等位点改性。个别肽和蛋白质可以被工程化成自动发荧光。可以使用免疫分析技术，例如免疫组织化学、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)和相关非酶技术。这些技术利用特异性抗体作为报告分子，这些特异性抗体由于高度特异性地连接到单分子标靶而尤其适用。基于细胞的ELISA或相关非酶或基于荧光的方法能够测量细胞表面参数。

可以将筛选分析的结果与从参考化合物、浓度曲线、对照等获得的结果进行比较。试剂可以是气溶胶，例如烟雾，或来源于烟雾的气溶胶。

气溶胶

本发明的实施方案可用于研究气溶胶对细胞、器官或组织的作用或气溶胶向细胞、器官或组织中的渗透。气溶胶可以由气溶胶形成装置获得或产生。吸烟制品和可抽吸制品是气溶胶形成装置的类型。吸烟制品或可抽吸制品的实例包含但不限于香烟、小雪茄和雪茄。在某些气溶胶形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气溶胶形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气溶胶。在另一类型的被加热的气溶胶形成装置中，通过将热量从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气溶胶形成材料来产生气溶胶，所述气溶胶形成材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。通常在被加热的吸烟制品中，通过将热量从热源转移到物理上分开的气溶胶形成基材或材料来生成气溶胶，所述气溶胶形成基材或材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。在抽吸期间，挥发性化合物通过来自热源的热转移从气溶胶形成材料释放，并且夹带在被抽吸穿过吸烟制品的空气中。随着所释放的化合物冷却，化合物凝结以形成由使用者吸入的气溶胶。如本文中使用的术语“气溶胶形成材料”用于描述能够在加热挥发性化合物时释放的材料，其可以形成气溶胶。气溶胶形成材料可以是基于植物的。气溶胶形成材料的实例包括但不限于烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、烘烤的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。替代地，所述气溶胶形成材料可以包含非植物类材料。

气溶胶可以呈烟雾形式。如本文所用，术语“烟雾”用于描述由燃烧产生(诸如由吸烟或通过燃烧气溶胶形成材料而产生)的一种类型的气溶胶。烟雾包括多种试剂，其可以在需要时作为单独的化合物提供以进行研究。此类试剂的实例包括不含烟碱的干燥颗粒物质、一氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、甲基乙基酮、丁醛、苯并[a]芘、苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、1，3-丁二烯、异戊二烯、丙烯腈、苯、甲苯、吡啶、喹啉、苯乙烯、N′-亚硝基降烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)、N′-亚硝基新烟碱(NAB)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、一氧化氮(NO)、氧化亚氮(NOx)、氢氰酸、氨、砷、镉、铬、铅、镍、硒和汞。

本文所述的细胞培养板可以暴露于烟雾不同的时间量。可以使用Vitrocell暴露模块来递送烟雾(参见Chem Cent J.(2014)8(1)：62)。可以使用限定的每支香烟的喷烟次数和限定的每分钟暴露的喷烟次数，并且香烟的数量可以变化以适应暴露时间。参考香烟(诸如参考香烟3R4F)可以用作烟雾来源，并在基本符合国际标准化组织吸烟制度(ISO2000)的吸烟机器人上抽烟。

计算

本文所述的技术和装置可以用任何适当的硬件(包括已编程的计算系统)来实现。类似地，系统或装置的控制可以由已编程的计算装置来控制。本公开可运用于许多其他通用或专用计算系统环境或配置。本文可适用的熟知的计算系统、环境和/或配置的例子可以包括但不限于个人计算机、服务器计算机、手持或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程消费电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、包括上述系统或装置中的任一者的分布式计算环境或基于云的计算环境等等。所述计算环境可以执行计算机可执行指令，诸如程序模块。一般来讲，程序模块包括执行具体任务或实施具体抽象数据类型的例程、程序、对象、部件、数据结构等。本公开也可以在分布式计算环境中实施，其中由通过通讯网络连接的远程处理装置来执行任务。在分布式计算环境中，程序模块可以位于本地和远程计算机存储介质(包括内存存储装置)两者中。

用于本公开的计算机的部件可以包括但不限于处理单元、系统内存以及偶联各种系统部件(包括处理单元的系统内存)的系统总线。系统总线可以是若干类型总线结构中的任一者，包括内存总线或内存控制器、外围总线和使用许多总线架构中的任一者的本地总线。例如但不限于，此类构造包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线、增强型ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)本地总线和外围组件互连(PCI)总线(也称为夹层总线)。

计算机通常包括多种计算机可读介质。计算机可读介质可以是计算机可以访问的任何可用介质，并且包括易失性和非易失性介质、可移动和不可移动介质。

计算机可以在使用到一台或多台远程计算机(诸如一台远程计算机)的逻辑连接的网络化环境中操作。远程计算机可以是个人计算机、服务器、路由器、网络PC、对等装置或某些其他常见的网络节点，并且通常包括以上相对于计算机描述的许多或所有元件。

PEEK

如本文所述，发明人惊奇地发现PEEK具有不被小的疏水分子(诸如分子量在146g/mol至207g/mol之间或在146g/mol至176g/mol之间的疏水分子)或有机溶剂(条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃)吸收的优点。PEEK对小的疏水分子或有机溶剂的吸收具有抵抗力，这对于防止或抑制这种材料对这些分子的捕获很重要。因此，由包含PEEK或由PEEK组成的聚合物制造的用于培养细胞的细胞培养板和其他此类装置特别适用于测试药物或试剂对容纳在板或其他此类装置内的细胞或组织的作用，以避免或减轻药物或试剂浓度(或其代谢物)被材料改变的风险。

因此，公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置。

因此，还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养装置。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养板。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养板。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养板的孔。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养板的孔。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的多孔细胞培养板。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的多孔细胞培养板。

适当地，细胞培养装置、细胞培养板、孔或多孔细胞培养板包含一种或多种小的疏水分子，诸如一种或多种小的疏水试剂。在一个实施方案中，试剂包括烟草生物碱或由烟草生物碱组成。

在一个实施方案中，试剂包括：由化学式1：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

或更适当地，由化学式2：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

其中：

z为0或1；

R₁表示H或C₁-C₇烷基；

R₂表示H、＝O或C₁-C₇烷基；

R₃表示H、卤素或C₁-C₇烷基；

并且虚线表示

(a)单键；

(b)一个碳/碳双键或碳/氮双键和其余的单键；或者

(c)独立地选自碳/氮双键和碳/碳双键的两个共轭双键和其余的单键。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或

或其药学上可接受的盐或其混合物。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或

或其药学上可接受的盐或其混合物。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟草生物碱。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟碱、新烟碱、降烟碱、新烟草碱、可替宁、麦斯明或其药学上可接受的盐或其混合物。

“烟草生物碱”是指来自或可来源于烟草植物的生物碱，并且可包括合成的烟草生物碱。“烟草植物”是指属于烟草属(Nicotiana)的植物，包括黄花烟草(N.rustica)和烟草(N.tabacum)(例如LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N.acaulis)、尖叶烟草(N.acuminata)、非洲烟草(N.africana)、花叶烟草(N.alata)、阿米基诺氏烟草(N.ameghinoi)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、阿姆布吉烟草(N.azambuiae)、贝纳莫特氏烟草(N.benavidesii)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、郎氏烟草(N.Iangsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.Iongiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctifIora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆维烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.pettmioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草(N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setehelIii)、拟似烟草(N.simulans)、前叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.x sanderae)。适当地，烟草植物是烟草。

“C₁-C₇烷基”是指通常具有1至7个碳原子的直链和支链饱和烃基；更适当地是C₁-C₆烷基；更适当地是C₁-C₃烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊-1-基、戊-2-基、戊-3-基、3-甲基丁-1-基、3-甲基丁-2-基、2-甲基丁-2-基、2，2，2-三甲基乙-1-基、正己基、正庚基等。适当地，烷基是甲基。

“卤素”是指F、Cl、Br或I。适当地，卤素是Cl。

在另一个实施方案中，所述试剂是烟草特有的亚硝胺(TSNA)，其是由包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和新烟碱的烟草生物碱的仲胺和叔胺的亚硝化形成的化学品。TSNA存在于一些烟草和烟草产品中。适当地，TSNA是N-亚硝基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟碱(NAB)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)、或4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)或其药学上可接受的盐或其混合物。更适当地，TSNA是4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)或其药学上可接受的盐。

适当地，有机溶剂选自：饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)；芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)；脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)；醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1，2-二甲氧基-乙烷、1，2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1，4-二噁烷)；酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)；酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)；含氮溶剂(例如，甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)；含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1，1-二氧化物)；以及含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。

在一个实施方案中，有机溶剂是饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)。

在一个实施方案中，有机溶剂是醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1，2-二甲氧基-乙烷、1，2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1，4-二噁烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含氮溶剂(例如，甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1，1-二氧化物)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。

在一个实施方案中，有机溶剂不是石油醚。

在一个实施方案中，有机溶剂不是甲苯。

在一个实施方案中，有机溶剂不是丙酮。

在一个实施方案中，有机溶剂不是乙醇。在一个实施方案中，试剂是烟碱或NNK或其组合。

还公开了一种用于培养细胞的方法，所述方法包括使用包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置，诸如细胞培养板或多孔细胞培养板。

还公开了一种用于培养细胞的方法，所述方法包括使用包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置，诸如细胞培养板或多孔细胞培养板。

还公开了一种用于培养细胞的方法，所述方法包括使用由PEEK制造(专门地)的细胞培养装置，诸如细胞培养板或多孔细胞培养板。

还公开了一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：(i)使细胞与包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板)接触；(ii)培养细胞。

还公开了一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：(i)使细胞与由PEEK制造(专门地)的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板)接触；(ii)培养细胞。

适当地，上文所讨论的方法包括使细胞培养装置中的细胞与如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂接触的附加步骤。

适当地，细胞培养装置可包括包含在细胞培养基中的细胞和任选地如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂。

还公开了一种用于确定一种或多种试剂对细胞的作用(例如，暴露反应)的方法，所述方法包括：(i)使细胞与包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板)接触；(ii)使细胞暴露于如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂；以及(iii)确定一种或多种试剂对细胞的作用。

还公开了一种用于确定一种或多种试剂对细胞的作用(例如，暴露反应)的方法，所述方法包括：(i)使细胞与由PEEK制造(专门地)的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板)接触；(ii)使细胞暴露于如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂；以及(iii)确定如上文所讨论的小的疏水分子或有机溶剂对细胞的作用。

还公开了一种用于降低或抑制如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂在细胞培养装置中的吸收的方法，所述方法包括使试剂与包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置接触。

还公开了包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置用于降低或抑制如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂在细胞培养装置中的吸收的用途。

还在以下实施例中描述了本发明，提供所述实施例以更详细地描述本发明。这些实施例阐述目前设想用于进行本发明的优选模式，意图说明而不是限制本发明。

实施例

实施例1

已经研究了用于制造板的多种材料。用于板的一种材料PEEK是一种耐磨的强塑性聚合物。PEEK在药物测试中是有利的，因为它是不吸收的，这与例如通常使用的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)相反，已知后者保留会小的疏水性分子。已惊奇地发现，PEEK不会保留生物碱(诸如烟碱)或烟草特有的亚硝胺(诸如NNK)。因此，所述板适用于测试这些试剂对板内容纳的组织的作用，以避免或减轻试剂浓度被材料改变的风险。

PEEK板的生物相容性用器官型肺模型和肝模型进行测试。

肺模型由接种在TranswellTM插入物上并进一步在气-液界面培养以确保细胞分化成杯状细胞和纤毛细胞的正常人支气管上皮(NHBE)细胞组成。使用这些组织，我们可以证明肺组织可以在PEEK板上存活4周，如由以下所证明的：

·纤毛细胞和杯状细胞的存在与在24孔聚碳酸酯板中维持相同持续时间的对照组织(来自同一批次、)中观察到的比例相似。

·完整的形态。在板中维持的组织和在24孔板中维持4周的组织的组织学分析证实了相似的形态。在这两种条件下维持的组织之间，杯状细胞、基底细胞和纤毛细胞的上皮厚度、分化状态和比例是相似的。

·稳定的ATP含量。ATP用于细胞中的多个过程，所有代谢活性细胞都含有ATP，这使ATP含量测量成为组织健康的良好指标。与对照组织相比，在板中维持4周的组织具有相似的ATP含量(ATP减少约10％)。

·活跃的纤毛细胞跳动。纤毛细胞不仅仍以与对照组织中相同的比例存在，而且还仍以与对照组织中观察到的频率相似的频率活跃地跳动。

·较高的跨上皮电阻(TEER)。TEER测量上皮组织紧密中连接的完整性，因此是屏障完整性的有力指标。维持在PEEK板中的组织的TEER值比对照组织高50％。

·保留了代谢能力。通过将组织暴露于特定的CYP酶诱导剂来测试细胞色素P450(CYP)诱导性(代谢能力的标志)。在暴露48小时后，发现CYP 1A1活性增加了100倍，证明保持在板内的组织保留了代谢诱导性。

作为肝模型，使用由HepaRG^TM细胞组成的球状体。在PEEK板内培养4周后，用这些肝球状体获得的第一结果证明：

·循环培养基内白蛋白的稳定分泌。白蛋白是肝功能的关键标记物。发现碎片内的白蛋白在4周内保持稳定，并且与对照组织中观察到的浓度相似。

保留了代谢能力。通过将组织暴露于特定的CYP酶诱导剂来测试细胞色素P450(CYP)诱导性(代谢能力的标志)。在暴露48小时后，发现CYP 1A1活性与对照组织中观察到的诱导性相似。

测试了PEEK对烟碱和NNK的吸收，发现分子没有被材料捕获。图22示出了在4℃下温育8小时后，比较PEEK板和PDMS板中残留烟碱的量的图的结果。可以看出，与PDMS板中约35％的烟碱相比，约100％的烟碱残留在PEEK板中。因此，使用PDMS的用于可商购获得的材料将捕获小的疏水分子。

实施例2

为了避免球状体的团聚，设计用于肝球状体的孔被适配为在孔的底部包含同心凹槽。这些凹槽的目的是在组织之间形成空间隔离，以防止它们团聚或融合在一起。为了证明凹槽的功能，将40个球状体(每个球状体由约25,000个细胞组成)放置在距有凹槽的孔中或具有平坦表面的孔(即，没有凹槽)中。5天后，存在于具有平坦表面的孔中的球状体开始团聚在一起(见图21A)，形成聚集体。在具有凹槽的孔中未观察到这一现象(见图21B)。图21A中所示的组织(3个球状体团聚或融合形成一个单元)不能用于通常对球状体进行的进一步实验(诸如测量ATP含量)，因为几个球状体的团聚或融合会对获得的结果产生不利影响。图21B中培养的组织没有团聚或融合，被用于进一步的实验。

在本文中引用的或描述的任何出版物都提供了在本申请的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施方案来描述本发明，但应理解，如所要求的本发明不应不恰当地限于此类特定实施方案。实际上，工程、细胞生物学和分子生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求书的范围内。

Claims (23)

1.一种细胞培养板，包括至少两个按顺序布置的孔和适于流体在所述孔之间输送的通道，其中所述通道经由所述通道的每个端部处的开口连接或联接到第一泵，并且其中所述第一泵可操作以在所述至少两个孔之间循环流体。

2.根据权利要求1所述的细胞培养板，其中所述通道的直径为3毫米或更小。

3.根据权利要求1所述的细胞培养板，其中所述通道是微流体通道。

4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述泵适当地是蠕动泵，其中所述蠕动泵包括具有编码器的步进电动机或无刷电动机。

5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述通道还被构造成使流体输送离开所述细胞培养板。

6.根据权利要求5所述的细胞培养板，其中所述通道连接或联接到第二泵，其中所述第二泵可操作以将流体输送离开所述细胞培养板。

7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述第一泵和/或所述第二泵的所述电动机容纳在防水盒中。

8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述细胞培养板装配有盖子。

9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述细胞培养板容纳在培养箱中和/或其中所述细胞培养板由聚醚醚酮(PEEK)制成。

10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中所述通道与板流体连通，所述板包括能够保持流体的一个或多个贮存器。

11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中每个孔的圆形直径在约6mm至约16mm之间。

12.一种细胞培养装置，包括容纳在培养箱内的根据权利要求1至11中任一项所述的细胞培养板。

13.一种用于在两个或更多个按顺序布置的孔之间循环流体的方法，包括：

(a)提供根据权利要求1至11中任一项所述的细胞培养板或根据权利要求12所述的细胞培养装置；

(b)使所述至少两个孔与流体接触；以及

(c)使所述流体循环通过所述细胞培养板的所述孔。

14.一种用于确定试剂对细胞的作用的方法，包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求1至11中任一项所述的细胞培养板或根据权利要求12所述的细胞培养装置；

(b)使所述细胞培养板的至少两个孔与细胞和细胞培养基接触；

(c)使所述细胞培养基循环通过所述细胞培养板的所述孔；

(d)使所述细胞培养板的所述孔暴露于至少一种试剂；

(e)将细胞培养基的样品从所述按顺序布置的孔中取出并对其进行测试；以及

(f)确定在暴露于所述至少一种试剂之前和之后所述试剂对所述细胞的作用。

15.一种细胞流体暴露采样装置，包括：

(a)根据权利要求6至11中任一项所述的细胞培养板；以及

(b)包括用于储存多个样品的一个或多个孔的样品板，

其中所述第二泵可操作以使流体从所述细胞培养板朝向所述样品板输送。

16.根据权利要求15所述的细胞流体暴露采样装置，其中使用多头移液器将所述流体输送到所述样品板。

17.一种用于对暴露于一种或多种试剂的细胞培养基进行采样的方法，包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求15或权利要求16所述的细胞流体暴露采样装置；

(b)使所述孔中的至少两个与包含细胞的细胞培养基接触；

(c)使所述细胞培养基循环通过所述细胞培养板的所述孔；

(d)使所述细胞培养板的所述孔暴露于至少一种试剂；以及

(e)从所述细胞培养板对所述细胞培养基进行采样，任选地，其中在暴露于所述试剂期间对所述细胞培养基进行一次或多次实时采样。

18.一种细胞培养装置，包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成并且包含一种试剂，所述试剂包括：(i)烟草生物碱或(ii.)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或(i)、(ii)和(iii)中的两种或更多种的组合。

19.一种用于使细胞与一种或多种试剂接触的方法，包括：(i)使细胞与包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置接触；(ii)培养所述细胞；以及(iii)使所述细胞培养装置中包含的所述细胞与一种或多种试剂接触，所述一种或多种试剂包括：(i)烟草生物碱；或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或(i)、(ii)和(iii)中的两种或更多种的组合。

20.一种用于用包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置降低或抑制试剂的吸收的方法，包括使所述细胞培养装置与一种或多种试剂接触，所述一种或多种试剂包括：(i)烟草生物碱；或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或(i)、(ii)和(iii)中的两种或更多种的组合。

21.包含聚醚醚酮或由聚醚醚酮组成的细胞培养装置用于降低或抑制试剂的吸收的用途，所述试剂包括：(i)烟草生物碱；或(ii)烟草特有的亚硝胺；或(iii)有机溶剂，条件是所述有机溶剂不是卤代有机溶剂或二甲基亚砜或四氢呋喃；或(i)、(ii)和(iii)中的两种或更多种的组合。

22.根据权利要求18所述的细胞培养装置或根据权利要求19或权利要求20所述的方法或根据权利要求21所述的用途，其中所述烟草特有的亚硝胺为4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。

23.根据权利要求22所述的细胞培养装置或方法或用途，其中所述烟草生物碱选自：烟碱、新烟碱、降烟碱、新烟草碱、可替宁和麦斯明或其两种或更多种的组合。

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