CN111019893B - 朗格汉斯前体细胞的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种朗格汉斯前体细胞的培养基，其中，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含基础培养基、GM‑CSF、TGF‑β、IL‑1β、IL‑3、IL‑6、SCF、EPO和IL‑4。本发明提供的朗格汉斯前体细胞的培养基，为大量获得朗格汉斯细胞提供了有效的培养条件，提高了朗格汉斯细胞的获得率，有效解决了由于朗格汉斯细胞不能在体外增殖和传代带来的种子细胞量的限制问题。

Description

朗格汉斯前体细胞的培养基
技术领域
本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种朗格汉斯前体细胞的培养基。
背景技术
皮肤不仅是机体抵御外界生物、物理及化学等因素损害的第一道防线，同时也是机体一个重要的免疫器官，参与免疫反应，使机体有一个稳定的内环境。表皮中除了含有约占80％的角质形成细胞外，还有黑素细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)。朗格汉斯细胞是定居于皮肤的树突状细胞亚群，是皮肤免疫反应中重要的抗原提呈细胞，在调控皮肤免疫应答中起着非常关键的作用，它的独特标志是胞浆中存在特异性的Berbeck颗粒，具有识别、摄取、处理和递呈外源性抗原能力，并迁移至局部淋巴结，刺激初始T细胞活化，启动皮肤免疫应答，在对抗侵入皮肤的病原微生物、监视癌变细胞中起重要作用。
目前认为朗格汉斯细胞是树突状细胞发育成熟过程中的一个中间阶段，处于非淋巴组织中的朗格汉斯细胞还未成熟，它们能摄取并加工处理某些抗原,在抗原和一些细胞因子的刺激下分化成成熟的树突状细胞,并迁移到引流的淋巴结T淋巴细胞区,递呈抗原并激活未活化的T淋巴细胞。
应用组织工程的技术，将正常人表皮细胞接种在适当的支持物上进行空气-液体界面培养，细胞分化并形成多层的复层组织，即重建表皮。目前几种技术比较成熟的重建皮肤模型，包括只含有角质形成细胞的表皮模型，含有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型，以及含有黑色素细胞的皮肤模型等。这些三维的皮肤模型不仅为研究表皮分化的复杂机制提供了有用的工具同时也为皮肤药理学和毒理学研究提供了有效的实验模型。然而，在这些模型中，缺乏朗格汉斯细胞，所以无法用于体外免疫学的研究。此外，由于缺乏朗格汉斯细胞这一构成皮肤的基本细胞成分，用这些模型进行的药理和/或毒理学研究也仅能反映出细胞间相互作用的一部分事实，所以构建含有朗格汉斯细胞的表皮模型对于研究皮肤免疫应答中各种细胞间的作用至关重要，但是由于朗格汉斯细胞不能在体外传代和增殖，所以将朗格汉斯细胞整合到重建人表皮中仍是一个难题。
针对上述问题，有文献试图将从新鲜皮肤样品中分离的朗格汉斯细胞添加到角质形成细胞和黑素细胞的培养物中进行皮肤的三维培养，但这种细胞的培养很难生长。实际上，从皮肤样品中纯化的朗格汉斯细胞是衍生自前体的细胞，这些前体已经分化成为CD1a+细胞，由于这些细胞不能繁殖，因此这些细胞的体外培养相当于仅是维持其存活状态。事实上，这些细胞在没有发挥其作用的情况下就停止生长并死亡了。将这些细胞引入重建的皮肤模型时，情况也是如此。因此，即使引入朗格汉斯细胞，但由于朗格汉斯细胞不能存活，因此获得的重建皮肤模型也不能令人满意。
因此，需要一种朗格汉斯前体细胞培养基，能够使得朗格汉斯前体细胞分化，提高CD34+造血祖细胞的扩增效率和CD1a+细胞的诱导率，有效解决由于朗格汉斯细胞不能在体外增殖和传代带来的种子细胞量的限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种朗格汉斯前体细胞培养基，能够提高CD34+造血祖细胞的扩增效率，并诱导朗格汉斯前体细胞分化，提高CD1a+细胞的诱导率，有效解决由于朗格汉斯细胞不能在体外增殖和传代带来的种子细胞量的限制问题。
为此，本发明提供了以下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种朗格汉斯前体细胞的培养基，其中，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4。
在优选的实施方式中，所述基础培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640。
在优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，例如，所述GM-CSF的含量为50、60、80、90、100、120、130、150、170、200、220、250、270、300、330、350、380、400、430、450、480或500ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为200ng/mL。
在优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，例如，所述TGF-β的含量为5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、41、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，例如，所述IL-1β的含量为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-3的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-3的含量为55ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-6的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-6的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述SCF的含量为1-50ng/mL，例如，所述SCF的含量为1、2、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、33、36、38、40、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述SCF的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述EPO的含量为1-10U/mL，例如，所述EPO的含量为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10U/mL。
在更优选的实施方式中，所述EPO的含量为6U/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-4的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-4的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-4的含量为60ng/mL。
第二方面，提供了本发明所述的朗格汉斯前体细胞的培养基在制备含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型中的用途。
第三方面，提供了含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型，其中，所述皮肤模型包含表皮层和真皮层，所述表皮层中含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞，所述真皮层中含有成纤维细胞，所述皮肤模型的制备包含使用本发明所述的朗格汉斯前体细胞的培养基的步骤。
第四方面，提供了一种皮肤等同物，其中，所述皮肤等同物包含本发明所述的皮肤模型。
第五方面，提供了含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的构建方法，其中，所述方法包含朗格汉斯前体细胞培养的步骤，所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入。
在优选的实施方式中，所述基础培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640。
在优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，例如，所述GM-CSF的含量为50、60、80、90、100、120、130、150、170、200、220、250、270、300、330、350、380、400、430、450、480或500ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为200ng/mL。
在优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，例如，所述TGF-β的含量为5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、41、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，例如，所述IL-1β的含量为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-3的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-3的含量为55ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-6的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-6的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述SCF的含量为1-50ng/mL，例如，所述SCF的含量为1、2、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、33、36、38、40、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述SCF的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述EPO的含量为1-10U/mL，例如，所述EPO的含量为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10U/mL。
在更优选的实施方式中，所述EPO的含量为6U/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-4的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-4的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-4的含量为60ng/mL。
第六方面，本发明提供了含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的构建方法，其中，所述方法包含如下步骤：
S1.角质形成细胞分离和培养；
S2.黑色素细胞分离和培养；
S3.成纤维细胞分离和培养；
S4.朗格汉斯前体细胞培养；
S5.含成纤维细胞的真皮替代物构建；
S6.含黑色素细胞的表皮培养物构建；
S7.将朗格汉斯细胞导入表皮层；
S8.空气-液体界面进行气液面培养；
所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
从人脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将得到的CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于培养箱内培养。
在优选的实施方式中，所述基础培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640。
在优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，例如，所述GM-CSF的含量为50、60、80、90、100、120、130、150、170、200、220、250、270、300、330、350、380、400、430、450、480或500ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述GM-CSF的含量为200ng/mL。
在优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，例如，所述TGF-β的含量为5、6、7、8、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、41、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述TGF-β的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，例如，所述IL-1β的含量为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-1β的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-3的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-3的含量为55ng/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-6的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-6的含量为50ng/mL。
在优选的实施方式中，所述SCF的含量为1-50ng/mL，例如，所述SCF的含量为1、2、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、33、36、38、40、43、46或50ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述SCF的含量为25ng/mL。
在优选的实施方式中，所述EPO的含量为1-10U/mL，例如，所述EPO的含量为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10U/mL。
在更优选的实施方式中，所述EPO的含量为6U/mL。
在优选的实施方式中，所述IL-4的含量为10-100ng/mL，例如，所述IL-4的含量为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL。
在更优选的实施方式中，所述IL-4的含量为60ng/mL。
在优选的实施方式中，所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入。
在优选的实施方式中，所述黑色素细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，将分离后的表皮剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，用D-Hank's液反复离心洗涤黑色素细胞悬液3次，弃上清，将沉淀物用无血清的M-254黑素细胞培养液重新悬浮，按6×105/瓶接种到培养瓶中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，隔24-72h换一次液，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的黑色素细胞，用于表皮层构建中黑色素细胞的引入；
在优选的实施方式中，所述成纤维细胞分离和培养包含：
将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织剪成小块，置于含有100-500U/mL胶原酶、200-500U/mL透明质酸的DMEM培养液中，放置4℃过夜；再加入等体积的含有2.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL乙二胺四乙酸的消化液中，37℃消化30min，1000rpm离心10min收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，传代培养至第五代后用于进行双层皮肤模型中真皮层的构建。
在优选的实施方式中，所述将朗格汉斯细胞导入表皮层包含：
将步骤S4中得到的朗格汉斯前体细胞接种在步骤S6中所得到的含有黑色素细胞的表皮层上，接种浓度为5-10×105个/mL。
在优选的实施方式中，所述将朗格汉斯细胞导入表皮层包含：
将步骤S4中得到的朗格汉斯前体细胞接种在步骤S6中所得到的含有黑色素细胞的表皮层上，接种浓度为5-10×105个/mL，调整步骤S6使用的黑色素培养基中表皮生长因子的浓度为5ng/mL，并加入150ng/mL GM-CSF，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内浸没培养2天，在真皮层上形成含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的表皮层。
在优选的实施方式中，所述角质形成细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，加入含2-6mmol/L L-谷氨酰胺和35-70mg/L牛脑垂体提取物的角质无血清培养基K-SFM或DMEM/F12(3:1)的表皮细胞培养液进行培养，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的角质形成细胞，用于皮肤模型中表皮层的构建。
在优选的实施方式中，所述含成纤维细胞的真皮替代物构建包含：
称取从牛尾中提取的胶原置于0.1％醋酸溶液中搅拌均匀配制成4-8mg/mL的胶原溶液，待完全溶解后置于冰上，与含有10％新生牛血清的DEME培养液按1：9的比例混匀，加入碱溶液，调PH至7.2-7.4，取第5-10代成纤维细胞，与配置好的胶原溶液混匀，按照1-5×106个/mL接种到Transwell小室中，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养2-3小时，待胶原凝固后加入真皮培养基中培养5天，形成双层皮肤模型中的真皮层。
在更优选的实施方式中，所述真皮培养基为含有10ng/mL胰岛素、20μg/mL氢化可的松、50μg/mL腺嘌呤、12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL转铁蛋白、10ng/mL血管生长因子、50μg/mL维生素C、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基。
在优选的实施方式中，所述含黑色素细胞的表皮培养物构建包含：
将步骤S2中得到的黑色素细胞用黑色素培养基制成密度为1-5×105个/mL的细胞悬液，接种到真皮层上，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养中培养2天后，将步骤S1中得到的角质形成细胞按2-6×106个/mL接种到Transwell小室中，在添加了10-100μg/mL牛脑垂体提取物和0.1-10nmol/L三碘甲状腺原氨酸的黑色素培养基中进行浸没式培养，置于37±1℃，5±1％CO2培养箱内培养3天，于真皮层上构建出含有黑色素细胞的表皮层，此时表皮层还未分化出角质层。
在更优选的实施方式中，所述黑色素培养基为含有6mmol/L L-谷氨酰胺、2ng/mL表皮生长因子、15ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、0.5ng/mL 12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、1ng/mL β-成纤维细胞生长因子、3μg/mL转铁蛋白、0.06mmol/L氯化钙、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基。
在优选的实施方式中，所述空气-液体界面进行气液面培养包含：
将步骤S7中得到的双层皮肤培养物提升至空气-液体界面进行气液面培养，弃去步骤S7中使用的培养基中的三碘甲状腺原氨酸和转铁蛋白，再调整培养基中表皮生长因子浓度为10ng/mL、氯化钙浓度为2mmol/L，于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱8-16天，得到真皮层中含有成纤维细胞，表皮层中含有黑色素细胞和朗格汉斯细胞的重组双重皮肤模型。
本说明书中，GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，TGF-β为转录生长因子，IL-1β为白介素-1β，IL-3为白介素-3，IL-6为白介素-6，SCF为干细胞因子，EPO为促红细胞生成素，IL-4为白介素-4。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的朗格汉斯前体细胞的培养基包含GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4的因子组合，为大量获得朗格汉斯细胞提供了有效的培养条件，提高了朗格汉斯细胞的获得率，有效解决了由于朗格汉斯细胞不能在体外增殖和传代带来的种子细胞量的限制问题。
本发明提供的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型，有效解决了重组皮肤表皮中朗格汉斯细胞数量少，不迁移的问题，是一种在细胞组成上与天然皮肤更加接近，在功能行为上与体内更加相似的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型。
本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中添加了IL-1β、IL-3、IL-6、SCF和EPO因子的组合，可实现CD34+造血组细胞的高效扩增；同时本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中添加了GM-CSF、TGF-β和IL-4因子的组合，来诱导朗格汉斯前体细胞分化，极大地提高了CD1a+细胞的诱导率，将总细胞中CD1a+细胞的占比提高到60％，有效解决了由于朗格汉斯细胞不能在体外增殖和传代带来的种子细胞量的限制。
本发明为模拟朗格汉斯细胞在体内的生长微环境，在含有成纤维细胞的真皮基质上构建具有真表皮双层结构的皮肤模型，并引入了黑色素细胞，获得的重组双层皮肤模型在细胞组成和组织结构上与天然皮肤高度相似，保持朗格汉斯细胞在体外的行为与体内一致，这种由黑素细胞和朗格汉斯细胞以及含成纤维细胞的真皮基质组成的重组双层皮肤模型为研究表皮细胞间相互作用的复杂机制，特别是皮肤免疫应答中各种细胞的作用提供许多新的研究机会。
本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中使用的IL-1β、IL-3、IL-6、SCF和EPO因子的组合，五种物质产生协同高效扩增CD34+造血组细胞的作用，将IL-1β的含量控制在1-100ng/mL的范围内、将IL-3的含量控制在10-100ng/mL的范围内、将IL-6的含量控制在10-100ng/mL的范围内、将SCF的含量控制在1-50ng/mL的范围内、将EPO的含量控制在1-10U/mL的范围内，能够更高效的扩增CD34+造血组细胞。
本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中使用的GM-CSF、TGF-β和IL-4因子的组合，三种物质协同诱导朗格汉斯前体细胞分化，将GM-CSF的含量控制在50-500ng/mL的范围内、将TGF-β的含量控制在5-50ng/mL的范围内、将IL-4的含量控制在10-100ng/mL的范围内，能够更好的诱导朗格汉斯前体细胞分化。
附图说明
图1为采用不同培养基培养CD34+造血祖细胞的增值率结果图；
图2为采用不同培养基诱导CD34+造血祖细胞中CD1a+细胞百分率结果图；
图3a为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的形态学结果图；
图3b为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型中黑色素细胞的形态学结果；
图3c为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型中朗格汉斯细胞的CD1a+免疫荧光染色结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚的呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例提供一种朗格汉斯前体细胞的培养基，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含：含10％胎牛血清的RPMI1640、50ng/mL GM-CSF、5ng/mL TGF-β、1ng/mL IL-1β、10ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、1ng/mL SCF、1U/mL EPO和10ng/mL IL-4。
本实施例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入50ng/mL GM-CSF、5ng/mL TGF-β、1ng/mL IL-1β、10ng/mL IL-3、10ng/LIL-6、1ng/mL SCF、1U/mL EPO和10ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
实施例2
本实施例提供一种朗格汉斯前体细胞的培养基，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含：含10％胎牛血清的RPMI1640、500ng/mL GM-CSF、50ng/mL TGF-β、100ng/mL IL-1β、100ng/mL IL-3、100ng/mL IL-6、50ng/mL SCF、10U/mL EPO和100ng/mL IL-4。
本实施例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入500ng/mL GM-CSF、50ng/mL TGF-β、100ng/mL IL-1β、100ng/mL IL-3、100ng/L IL-6、50ng/mL SCF、10U/mL EPO和100ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
实施例3
本实施例提供一种朗格汉斯前体细胞的培养基，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含：含10％胎牛血清的RPMI1640、200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4。
本实施例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
实施例4
本实施例提供一种含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型，所述皮肤模型包含表皮层和真皮层，所述表皮层中含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞，所述真皮层中含有成纤维细胞。
本实施例含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的制备方法如下：
S1.角质形成细胞分离和培养；
所述角质形成细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，加入含2mmol/L L-谷氨酰胺和35mg/L牛脑垂体提取物的角质无血清培养基K-SFM进行培养，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的角质形成细胞，用于皮肤模型中表皮层的构建；
S2.黑色素细胞分离和培养；
所述黑色素细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，将分离后的表皮剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，用D-Hank's液反复离心洗涤黑色素细胞悬液3次，弃上清，将沉淀物用无血清的M-254黑素细胞培养液重新悬浮，按6×105/瓶接种到培养瓶中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，隔24h换一次液，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的黑色素细胞，用于表皮层构建中黑色素细胞的引入；
S3.成纤维细胞分离和培养；
所述成纤维细胞分离和培养包含：
将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织剪成小块，置于含有100U/mL胶原酶、200U/mL透明质酸的DMEM培养液中，放置4℃过夜；再加入等体积的含有2.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL乙二胺四乙酸的消化液中，37℃消化30min，1000rpm离心10min收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，传代培养至第五代后用于进行双层皮肤模型中真皮层的构建；
S4.朗格汉斯前体细胞培养；
所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入；
S5.含成纤维细胞的真皮替代物构建；
所述含成纤维细胞的真皮替代物构建包含：
称取从牛尾中提取的胶原置于0.1％醋酸溶液中搅拌均匀配制成4-8mg/mL的胶原溶液，待完全溶解后置于冰上，与含有10％新生牛血清的DEME培养液按1：9的比例混匀，加入碱溶液，调PH至7.2-7.4，取第5代成纤维细胞，与配置好的胶原溶液混匀，按照1-5×106个/mL接种到Transwell小室中，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养2-3小时，待胶原凝固后加入真皮培养基中培养5天，形成双层皮肤模型中的真皮层；所述真皮培养基为含有10ng/mL胰岛素、20μg/mL氢化可的松、50μg/mL腺嘌呤、12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL转铁蛋白、10ng/mL血管生长因子、50μg/mL维生素C、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基；
S6.含黑色素细胞的表皮培养物构建；
所述含黑色素细胞的表皮培养物构建包含：
将步骤S2中得到的黑色素细胞用黑色素培养基制成密度为1-5×105个/mL的细胞悬液，接种到真皮层上，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养中培养2天后，将步骤S1中得到的角质形成细胞按2-6×106个/mL接种到Transwell小室中，在添加了10μg/mL牛脑垂体提取物和1nmol/L三碘甲状腺原氨酸的黑色素培养基中进行浸没式培养，置于37±1℃，5±1％CO2培养箱内培养3天，于真皮层上构建出含有黑色素细胞的表皮层，此时表皮层还未分化出角质层；所述黑色素培养基为含有6mmol/L L-谷氨酰胺、2ng/mL表皮生长因子、15ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、0.5ng/mL 12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、1ng/mLβ-成纤维细胞生长因子、3μg/mL转铁蛋白、0.06mmol/L氯化钙、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基。
S7.将朗格汉斯细胞导入表皮层；
所述将朗格汉斯细胞导入表皮层包含：
将步骤S4中得到的朗格汉斯前体细胞接种在步骤S6中所得到的含有黑色素细胞的表皮层上，接种浓度为5-10×105个/mL，调整步骤S6使用的黑色素培养基中表皮生长因子的浓度为5ng/mL，并加入150ng/mL GM-CSF，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内浸没培养2天，在真皮层上形成含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的表皮层；
S8.空气-液体界面进行气液面培养；
所述空气-液体界面进行气液面培养包含：
将步骤S7中得到的双层皮肤培养物提升至空气-液体界面进行气液面培养，弃去步骤S7中使用的培养基中的三碘甲状腺原氨酸和转铁蛋白，再调整培养基中表皮生长因子浓度为10ng/mL、氯化钙浓度为2mmol/L，于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱8-16天，得到真皮层中含有成纤维细胞，表皮层中含有黑色素细胞和朗格汉斯细胞的重组双重皮肤模型。
实施例5
本实施例提供一种含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的构建方法，所述方法包含如下步骤：
S1.角质形成细胞分离和培养；
所述角质形成细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，加入含2mmol/L L-谷氨酰胺和35mg/L牛脑垂体提取物的角质无血清培养基K-SFM进行培养，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的角质形成细胞，用于皮肤模型中表皮层的构建；
S2.黑色素细胞分离和培养；
所述黑色素细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，将分离后的表皮剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，用D-Hank's液反复离心洗涤黑色素细胞悬液3次，弃上清，将沉淀物用无血清的M-254黑素细胞培养液重新悬浮，按6×105/瓶接种到培养瓶中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，隔24h换一次液，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的黑色素细胞，用于表皮层构建中黑色素细胞的引入；
S3.成纤维细胞分离和培养；
所述成纤维细胞分离和培养包含：
将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织剪成小块，置于含有100U/mL胶原酶、200U/mL透明质酸的DMEM培养液中，放置4℃过夜；再加入等体积的含有2.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL乙二胺四乙酸的消化液中，37℃消化30min，1000rpm离心10min收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，传代培养至第五代后用于进行双层皮肤模型中真皮层的构建；
S4.朗格汉斯前体细胞培养；
所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入；
S5.含成纤维细胞的真皮替代物构建；
所述含成纤维细胞的真皮替代物构建包含：
称取从牛尾中提取的胶原置于0.1％醋酸溶液中搅拌均匀配制成4-8mg/mL的胶原溶液，待完全溶解后置于冰上，与含有10％新生牛血清的DEME培养液按1：9的比例混匀，加入碱溶液，调PH至7.2-7.4，取第5代成纤维细胞，与配置好的胶原溶液混匀，按照1-5×106个/mL接种到Transwell小室中，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养2-3小时，待胶原凝固后加入真皮培养基中培养5天，形成双层皮肤模型中的真皮层；所述真皮培养基为含有10ng/mL胰岛素、20μg/mL氢化可的松、50μg/mL腺嘌呤、12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL转铁蛋白、10ng/mL血管生长因子、50μg/mL维生素C、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基；
S6.含黑色素细胞的表皮培养物构建；
所述含黑色素细胞的表皮培养物构建包含：
将步骤S2中得到的黑色素细胞用黑色素培养基制成密度为1-5×105个/mL的细胞悬液，接种到真皮层上，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养中培养2天后，将步骤S1中得到的角质形成细胞按2-6×106个/mL接种到Transwell小室中，在添加了10μg/mL牛脑垂体提取物和1nmol/L三碘甲状腺原氨酸的黑色素培养基中进行浸没式培养，置于37±1℃，5±1％CO2培养箱内培养3天，于真皮层上构建出含有黑色素细胞的表皮层，此时表皮层还未分化出角质层；所述黑色素培养基为含有6mmol/L L-谷氨酰胺、2ng/mL表皮生长因子、15ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、0.5ng/mL 12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、1ng/mLβ-成纤维细胞生长因子、3μg/mL转铁蛋白、0.06mmol/L氯化钙、10％胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基。
S7.将朗格汉斯细胞导入表皮层；
所述将朗格汉斯细胞导入表皮层包含：
将步骤S4中得到的朗格汉斯前体细胞接种在步骤S6中所得到的含有黑色素细胞的表皮层上，接种浓度为5-10×105个/mL，调整步骤S6使用的黑色素培养基中表皮生长因子的浓度为5ng/mL，并加入150ng/mL GM-CSF，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内浸没培养2天，在真皮层上形成含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的表皮层；
S8.空气-液体界面进行气液面培养；
所述空气-液体界面进行气液面培养包含：
将步骤S7中得到的双层皮肤培养物提升至空气-液体界面进行气液面培养，弃去步骤S7中使用的培养基中的三碘甲状腺原氨酸和转铁蛋白，再调整培养基中表皮生长因子浓度为10ng/mL、氯化钙浓度为2mmol/L，于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱8-16天，得到真皮层中含有成纤维细胞，表皮层中含有黑色素细胞和朗格汉斯细胞的重组双重皮肤模型。
对比例1
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例1，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-1β。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、55ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mLSCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例2
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例2，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-1β、IL-3。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/L IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例3
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例3，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-1β、IL-3、IL-6。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mLIL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例4
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例4，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-1β、IL-3、IL-6、SCF。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例5
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例5，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例6
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例6，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为0.5ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、0.5ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例7
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例7，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为0.5ng/mL，IL-3的含量调整为8ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、0.5ng/mL IL-1β、8ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例8
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例8，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为0.5ng/mL，IL-3的含量调整为8ng/mL，IL-6的含量调整为7ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、0.5ng/mL IL-1β、8ng/mL IL-3、7ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例9
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例9，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为0.5ng/mL，IL-3的含量调整为8ng/mL，IL-6的含量调整为7ng/mL，SCF的含量调整为0.5ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、0.5ng/mL IL-1β、8ng/mL IL-3、7ng/LIL-6、0.5ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例10
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例10，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为0.5ng/mL，IL-3的含量调整为8ng/mL，IL-6的含量调整为7ng/mL，SCF的含量调整为0.5ng/mL，EPO的含量调整为0.5U/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、0.5ng/mL IL-1β、8ng/mL IL-3、7ng/LIL-6、0.5ng/mL SCF、0.5U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例11
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例11，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为130ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、130ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例12
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例12，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为130ng/mL，IL-3的含量调整为130ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、130ng/mL IL-1β、130ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例13
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例13，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为130ng/mL，IL-3的含量调整为130ng/mL，IL-6的含量调整为130ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、130ng/mL IL-1β、130ng/mL IL-3、130ng/L IL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例14
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例14，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为130ng/mL，IL-3的含量调整为130ng/mL，IL-6的含量调整为130ng/mL，SCF的含量调整为60ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、130ng/mL IL-1β、130ng/mL IL-3、130ng/L IL-6、60ng/mL SCF、6U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例15
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例15，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-1β的含量调整为130ng/mL，IL-3的含量调整为130ng/mL，IL-6的含量调整为130ng/mL，SCF的含量调整为60ng/mL，EPO的含量调整为15U/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、130ng/mL IL-1β、130ng/mL IL-3、130ng/L IL-6、60ng/mL SCF、15U/mL EPO和60ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例16
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例16，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-4。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF和6U/mL EPO，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例17
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例17，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-4、TGF-β。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mLSCF和6U/mL EPO，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例18
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例18，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：不添加IL-4、TGF-β、GM-CSF。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/L IL-6、25ng/mL SCF和6U/mL EPO，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例19
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例19，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为6ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和6ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例20
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例20，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为6ng/mL，TGF-β的含量调整为3ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、3ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和6ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例21
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例21，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为6ng/mL，TGF-β的含量调整为3ng/mL，GM-CSF的含量调整为45ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入45ng/mL GM-CSF、3ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和6ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例22
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例22，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为110ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、25ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和110ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例23
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例23，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为110ng/mL，TGF-β的含量调整为60ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入200ng/mL GM-CSF、60ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和110ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
对比例24
为了进一步说明本发明的有益效果，提供对比例24，和实施例3相比，该对比例1的区别在于：将本发明朗格汉斯前体细胞的培养基中IL-4的含量调整为110ng/mL，TGF-β的含量调整为60ng/mL，GM-CSF的含量调整为550ng/mL。
该对比例朗格汉斯前体细胞的培养基的制备方法如下：
在无菌超净工作台中，按1:9的体积比例，将胎牛血清与RPM1640培养基混合均匀，然后向其中加入550ng/mL GM-CSF、60ng/mL TGF-β、50ng/mL IL-1β、55ng/mL IL-3、50ng/LIL-6、25ng/mL SCF、6U/mL EPO和110ng/mL IL-4，吹打混匀，采用0.22μm孔径的微孔滤膜正压过滤除菌。
效果验证：
图1为采用不同培养基培养CD34+造血祖细胞的增值率结果图，由图1可以看出：本发明的三种培养基，可显著提高细胞倍增数量，培养12天后总细胞数量远远超过未使用本发明配方体系的培养基，通过进一步筛选本发明培养基中的组分及调整本发明培养基中各组分的含量，本发明培养基培养CD34+造血祖细胞的增值率有了更显著的提高，说明本发明培养基优于未使用本发明配方体系的培养基，本发明培养基对CD34+造血祖细胞的增值率有显著提升作用。
图2为采用不同培养基诱导CD34+造血祖细胞中CD1a+细胞百分率结果图，由图2可以看出：本发明的三种培养基，可显著提高诱导细胞中朗格汉斯前体细胞的百分率，诱导培养12天后总细胞中CD1a+细胞所占的百分率为60％以上，远大于未使用本发明配方体系的培养基，通过进一步筛选本发明培养基中的组分及调整本发明培养基中各组分的含量，本发明培养基诱导培养12天后总细胞中CD1a+细胞所占的百分率为70％以上，说明本发明培养基优于未使用本发明配方体系的培养基，本发明培养基对朗格汉斯前体细胞诱导率有明显提升作用。
图3a为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑素细胞的重组双层皮肤模型的形态学结果。
图3b为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑素细胞的重组双层皮肤模型的HE染色结果，结果显示本发明含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型表皮层中含有黑色素细胞，其中，箭头所示为黑色素细胞。
图3c为本发明实施例4、实施例5制备的含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型中朗格汉斯细胞的CD1a+免疫荧光染色结果图。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (8)

1.朗格汉斯前体细胞的培养基，其中，所述朗格汉斯前体细胞的培养基包含基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4；所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，所述SCF的含量为1-50ng/mL，所述EPO的含量为1-10U/mL，所述IL-4的含量为10-100ng/mL。
2.权利要求1所述的朗格汉斯前体细胞的培养基在制备含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型中的用途。
3.含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的构建方法，其中，所述方法包含朗格汉斯前体细胞培养的步骤，所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入；所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，所述SCF的含量为1-50ng/mL，所述EPO的含量为1-10U/mL，所述IL-4的含量为10-100ng/mL。
4.含有朗格汉斯细胞和黑色素细胞的重组双层皮肤模型的构建方法，其中，所述方法包含如下步骤：
S1.角质形成细胞分离和培养；
S2.黑色素细胞分离和培养；
S3.成纤维细胞分离和培养；
S4.朗格汉斯前体细胞培养；
S5.含成纤维细胞的真皮替代物构建；
S6.含黑色素细胞的表皮培养物构建；
S7.将朗格汉斯细胞导入表皮层；
S8.空气-液体界面进行气液面培养；
所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
从人脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将得到的CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于培养箱内培养；所述GM-CSF的含量为50-500ng/mL，所述TGF-β的含量为5-50ng/mL，所述IL-1β的含量为1-100ng/mL，所述IL-3的含量为10-100ng/mL，所述IL-6的含量为10-100ng/mL，所述SCF的含量为1-50ng/mL，所述EPO的含量为1-10U/mL，所述IL-4的含量为10-100ng/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述朗格汉斯前体细胞培养包含：
采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单核细胞，通过免疫磁珠分选法从脐带血中分选出CD34+造血祖细胞，将磁珠分选所得CD34+造血祖细胞接种于培养瓶中，加入基础培养基、GM-CSF、TGF-β、IL-1β、IL-3、IL-6、SCF、EPO和IL-4，置于37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱内培养，每3天更换，培养6-20天进行实验，用于表皮层构建中朗格汉斯细胞的引入。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述黑色素细胞分离和培养包含：
将人体皮肤组织置于培养皿中，清洗干净血污，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，将组织块切成0.2cm×0.2cm的大小，加入10mg/mL Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，将分离后的表皮剪为碎块，再加入0.25mg/mL EDTA-胰酶消化液，用D-Hank's液反复离心洗涤黑色素细胞悬液3次，弃上清，将沉淀物用无血清的M-254黑素细胞培养液重新悬浮，按6×105/瓶接种到培养瓶中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，隔24-72h换一次液，直至第三次传代，得到纯度达95％以上的黑色素细胞，用于表皮层构建中黑色素细胞的引入。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述成纤维细胞分离和培养包含：
将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织剪成小块，置于含有100-500U/mL胶原酶、200-500U/mL透明质酸的DMEM培养液中，放置4℃过夜；再加入等体积的含有2.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL乙二胺四乙酸的消化液中，37℃消化30min，1000rpm离心10min收集细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37±0.1℃，5±0.1％CO2培养箱培养，传代培养至第五代后用于进行双层皮肤模型中真皮层的构建。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述将朗格汉斯细胞导入表皮层包含：
将步骤S4中得到的朗格汉斯前体细胞接种在步骤S6中得到的含黑色素细胞的表皮层上，接种浓度为5-10×105个/mL。
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