CN111004810A

CN111004810A - 包括419g>a突变的cyp2c9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用

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Publication number: CN111004810A
Application number: CN201911136485.6A
Authority: CN
Inventors: 蔡剑平; 周晓阳; 左明章; 赵思文
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Hospital
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN111004810B

Abstract

本发明属于生物学领域，涉及单碱基突变。更具体地，本发明涉及CYP2C9基因对应于SEQ ID NO.2的第419位的突变位点，所述位点由野生型的G突变为A，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及其应用。本发明还提供了检测所述突变位点的等位基因特异性寡核苷酸、试剂盒和检测方法。

Description

包括419G>A突变的CYP2C9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及单碱基突变；更具体地，本发明涉及CYP2C9 基因单碱基突变。

背景技术

CYP2C9是细胞色素P450酶大家族CYP2C亚家族中最重要的一员，约占人肝微粒体CYP酶总量的20％。有大约10～16％临床常用药物经由CYP2C9 氧化代谢，其中主要包括甲苯磺丁脲、S-华法林、苯妥英、格列吡嗪、格列苯脲、托拉噻咪、氯沙坦、厄贝沙坦和许多非甾体类抗炎药物(如:布洛芬、氯诺昔康、双氯芬酸和萘普生)等药物(参见参考文献1-5)。

CYP2C9基因具有高度多态性。根据目前的临床研究显示，CYP2C9基因的这种多态性是造成CYP2C9酶活性在个体之间极大不同的主要原因，因此在携带不同CYP2C9基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2C9基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供CYP2C9基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。

本发明的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第419位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第419位的核苷酸是A；或者为上述核酸片段的互补序列片段。

本发明的第二个方面，提供用于检测和/或分析单碱基突变的引物，所述单碱基突变对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQ ID NO.2的第419 位，所述引物能够扩增所述单碱基突变。

本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的引物。

本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段在制备用作检测CYP2C9 基因突变的检验标志物或制剂中的应用。

本发明的第五个方面是提供分析核酸的方法，包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第419位的核苷酸。

本发明的第六个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3 的第140位的天冬酰胺，并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。

本发明提供了包含新的单碱基突变的CYP2C9基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID NO.2的第419位核苷酸由G突变为A(419G>A)，从而引起其编码的氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，即对应于SEQ ID NO.3的第140 位的天冬酰胺。该突变的CYP2C9蛋白(命名为S140N)对药物的代谢活性比野生型上升。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。

附图说明

图1是实施例1中的对应于本发明的SEQ ID NO.1序列的第1001位核苷酸测序图谱；

图2是昆虫表达载体pFastBac-dual结构图；

图3是实施例2中的各微粒体表达蛋白的Western结果图；

图4是实施例3中的各微粒体代谢甲苯磺丁脲的数据图；

图5是实施例4中的各微粒体代谢氯沙坦的数据图。

具体实施方式

通过下述具体实施方式说明本发明，但本发明内容不限于此。

如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是 DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。

本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2C9基因中存在与野生型 CYP2C9基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或 SEQ ID NO.2所示序列中的第419位。

本发明内容涉及CYP2C9基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA 中表现，也可以在编码序列(即CDS，对应于mRNA序列)中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID NO.1是以本申请的突变位点为中心、前后各 1kb的基因组DNA序列，即SEQ ID NO.1的第1001位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID NO.2是具有所述突变位点的CYP2C9基因的cDNA序列，其中第 419位是本发明涉及的突变位点。本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQ ID NO.2的第419位位点和对应于SEQ ID NO.1的第1001位位点同义互用。

本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示组氨酸， I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示蛋氨酸，F表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示缬氨酸。

本发明的内容是基于CYP2C9基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2C9基因的编码区内，对应于SEQ ID NO.2的第419位，该位点由野生型的G突变为A(419G>A)；此外，由该突变的CYP2C9基因编码的蛋白的第140位由丝氨酸突变为天冬酰胺(S140N)。

在第一个方面，本发明提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第419位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第419位的核苷酸是A；或者为上述核酸片段的互补序列。

在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、101-200、 201-500或501-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、221-30、 31-40、41-50、51-60或61-100个核苷酸。

所述突变位点可以位于所述核酸片段的任何位置。

在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。

在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第二个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的引物，所述单碱基突变对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQ ID NO.2的第419 位，所述引物能够扩增所述单碱基突变。

在一种实施方式中，所述引物的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；在另一种实施方式中，所述引物的序列如SEQ ID NO:17所示。其中，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7是扩增引物，SEQ ID NO:17是测序引物。

本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的引物。本领域技术人员能够根据实际需要配置试剂盒中其它试剂。

本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段在制备用作检测CYP2CP 基因突变的检验标志物或制剂中的应用。

本发明的第五个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第419位的核苷酸。

在一种实施方式中，所述方法可以是限制性片段长度多态性分析(RFLP)。本领域技术人员可以根据本发明内容设计实验以分析SEQ ID NO.1的序列的核酸中的第1001位的核苷酸或SEQ ID NO.2的序列的核酸中的第419位的核苷酸是否为A。

在另一种实施方式中，所述方法可以是测序法，包括分离并测定来自基因组DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中的对应于第419位的核苷酸是否为A。测序法可以是本领域已知的任何可用的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员的常识进行设计，如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物，以扩展包含该待测位点的片段，从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。

在另一种实施方式中，所述方法是利用探针杂交的方法，特异性地鉴定检测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQID NO.2的序列的核酸中对应于第419位的核苷酸是否为A；所述方法中采用的探针是本发明的寡核苷酸。例如，从待测样品中分离出核酸，在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触；可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现；例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟知的。

本发明中，所述样品可以是任何包含核酸的样品，如血液；优选所述样品来自于人。所述核酸可以是DNA或编码RNA，优选为基因组DNA。本发明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知，当以DNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQID NO.1 的序列设计；当以RNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ IDNO.2的序列的核酸中对应于第419位的核苷酸，所使用的探针或引物根据 SEQ ID NO.2的序列设计。

本发明的第六个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3 的第140位的天冬酰胺，且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，如10-20、21-50或51-100个氨基酸。

本发明突变的CYP2C9蛋白(命名为S140N)对药物的代谢活性比野生型上升，因而对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。本发明中所述的 CYP2C9代谢的药物包括：抗癌药物，如环磷酰胺、异环磷酰胺或紫杉醇；抗凝血药，如华法林、醋硝香豆素、抗惊厥药或美芬妥英；降糖药，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或罗格列酮；抗癫痫药，如苯妥英或唑尼沙胺；抗疟药/抗寄生虫药，如阿莫地喹、盐酸氯胍或奎宁；抗精神病药，如阿米替林、西酞普兰、丙咪嗪、哌罗匹隆、舍曲林、硫利达嗪或文拉法辛；降压药，如氯沙坦、厄贝沙坦或缬沙坦；非类固醇性抗炎药，如双氯酚酸、氨基比林、安替比林、塞来昔布、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、氯诺昔康、甲芬那酸、萘普生、吡罗昔康或替诺昔康；镇痛药，如、洛哌丁胺、美沙酮或吗啡；质子泵抑制剂，如兰索拉唑或奥美拉唑；镇静药，如、氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。

下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。

实施例

实施例1：人CYP2C9基因新的突变位点的鉴定

本实施例中，采集临床使用丙泊酚的病人血液样本，提取血液中的基因组 DNA，设计测序引物对CYP2C9基因的9个外显子进行序列扩增、测序，分析其CYP2C9基因是否存在突变位点。

1)提取DNA：

从被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本；然后按照普通盐析法和/或采用专门的DNA提取试剂盒(购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒)提取待测血样的基因组DNA。

2)PCR扩增：

设计扩增引物，对获得的基因组DNA样品中的CYP2C9基因的9个外显子序列进行扩增。所述扩增引物对序列见表1。

采用50μl PCR反应体系，包括：1×PCR缓冲液、1.5mM MgCl₂、100～ 150ng的基因组DNA、上下游引物均为0.2μM、dNTP为0.4mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1.5U。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性5分钟， 94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸2分30秒，30个循环后再延伸5分钟。退火温度与引物长度相关，具体温度见表1。

使用美国ABI公司的GeneAmp PCR System 9700扩增仪扩增。

表1：测序引物对及退火温度

3)纯化扩增产物：

取50μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，刀片切取目的条带。按照E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒(Omega公司)要求进行目的条带的DNA回收纯化。

4)测序：

以回收后的产物为模板，使用测序引物按照CEQ^TM DTCS-Quick Start Kit 测序试剂盒(美国Beckman公司)要求进行测序PCR反应，反应结束并纯化后，用美国Beckman公司的CEQ8000型基因测序仪进行分离以判读扩增产物的序列。测序引物见表2。

表2：测序引物

区域	测序引物(5’-3’)
		外显子1	TACCTCTAGGGATACAC(SEQ ID NO.16)
外显子2&3	CTAACAACCAGGACTCATAAT(SEQ ID NO.17)
		外显子4	TTGCTGTTAAGGGAATTTGTAGGTAAGATA(SEQ ID NO.18)
外显子5	TAGTGGTCTATTTTGTTATTCATTCAT(SEQ ID NO.19)
		外显子6	TTCCAGTTTCTATGTTG(SEQ ID NO.20)
外显子7	ACCCGGTGATGGTAGAGGTT(SEQ ID NO.21)
		外显子8	ACGGGATTTCCTCATCTG(SEQ ID NO.22)
外显子9	CGATACACTGAACAGTTATTGC(SEQ ID NO.23)

5)数据分析：

将测得的序列与野生型CYP2C9*1序列(GenBank注册号NM_000771.3) 进行比对。

通过比对分析，发现CYP2C9基因编码区的第419位的核苷酸由G变为A (如图1所示，其中R表示G或A)，该突变位于CYP2C9基因的第3外显子内。据此推断该CYP2C9基因编码的蛋白质中，第140位氨基酸由丝氨酸(S) 突变为天冬酰胺(N)。该突变现还未递交P450命名委员会命名。

本实施例中示例性地给出了鉴定新突变位点的方法。本领域技术人员根据上述内容可以清楚地得知特异性地检测待测样品中包含对应于SEQ ID NO.1 的第1001位核苷酸的方法：分离样品中的核酸，在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应，引物使用引物对SEQ ID NO.6和7；用测序引物SEQ ID NO.17对扩增的产物进行测序；将测序结果与野生型结果比对，分析对应于 SEQ ID NO.1的第1001位位点的核苷酸。

实施例2：目标基因的表达

以连接有野生型CYP2C9*1的开放阅读框的质粒载体(由美国南佛罗里达大学的周树峰教授馈赠)为模板，利用定点诱变技术分别获得CYP2C9*2 (430C>T)、CYP2C9*3(1075A>C)和本发明的S140N突变体的开放阅读框。定点诱变技术是本领域公知技术，本领域技术人员根据确定的模板和目标，可以毫无疑义地知道如何完成该步骤。

然后将CYP2C9*1基因和定点诱变的三个突变体基因的ORF克隆至连接有细胞色素P450氧化还原酶(OR)的载体pFastBac-dual中，使得CYP2C9 基因及OR分别置于PH和p10启动子后，构建同时表达OR和CYP2C9(或其突变体)的双表达载体。pFastBac-dual载体结构图以及CYP2C9基因和OR 的插入位点参见图2。

按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒(购自美国Invitrogen公司，用于昆虫细胞中大量表达外源目的基因)的使用说明，利用构建好的双表达载体和对照载体分别包装P1代和P2代昆虫病毒，所获P2代病毒测定滴度后按照 MOI(multiplicity-of-infection)为4的侵染量侵染sf21昆虫细胞。侵染72小时后离心收集细胞，使用超声破碎仪(美国SONIC公司)按照40％的能量超生破碎细胞，利用差速离心法提取昆虫细胞微粒体。用Western方法检测各微粒体中CYP2C9和OR的表达量；用还原CO差异光谱检测法检测各微粒体中 CYP2C9的全酶浓度。

Western结果如图3所示。第一行显示的是CYP2C9表达量，第二行显示的是OR表达量。由图可见，4个双表达载体均表达OR蛋白，并分别表达*1、 *2、*3型CYP2C9和本发明的S140N蛋白。表达产物经测序，与本实验预设的野生型和突变型序列一致。

酶代谢活性分析

根据现有的研究结果，野生型(*1型)对各种药物的代谢活性均比较高，而*2和*3型的代谢活性比野生型的代谢活性有明显改变。因此，在本领域中已有这样一种共识：同一个基因型所表达的酶对特异性底物的代谢活性可以代表对其它底物药的代谢活性。从而，根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性(如，可以将该基因型所表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较)。

实施例3：利用获得的昆虫微粒体体外分析对甲苯磺丁脲的代谢特性：

1)色谱及质谱条件：采用液质联用方法进行分析。色谱柱为Waters Acquity UPLCBEH C18反相色谱柱(2.1*50mm,1.7μm，Waters Corp,美国)；流动相 A为0.1％甲酸；流动相B为乙腈；柱温为40℃，流速为0.4ml/min，进行梯度洗脱：0-1.4min，A(60％-10％),1.4-2.6min，A(10％-60％)。电喷雾离子源(ESI): 选择正离子模式扫描；离子源温度为500℃，信号采集方式为多级反应监测，代谢产物及内标的参数见下表：

2)孵育条件：

反应总体积200μL，其中包括：100mM Tris-HCl(pH 7.4)，1×NADPH 辅酶生成系统，2pmol细胞色素b5及甲苯磺丁脲(购自美国Sigma公司，反应终浓度为50-2000μM)。37℃预孵育5min后，加入1pmol的实施例2构建的重组微粒体启动反应。37℃孵育40min后，37℃孵育40min后，加入200 μL 0.1M ACN和30μL 200ng/μL内标咪达唑仑(购自美国Sigma公司)并涡旋震荡2min,4℃下以10,000×g离心10min。取2μL于Waters XEVO TQD 液相色谱-质谱联用仪检测。

本实施例的Michaelis-Menten数据分析结果如图4所示。进一步进行药物动力学分析，结果如表3所示：

表3：各微粒体代谢甲苯磺丁脲的药物动力学分析结果

由图4及表3可知，本发明的S140N的整体酶学活性高于野生型*1型和突变型*3型，但是低于突变型*2型。

实施例4：利用获得的昆虫微粒体体外分析对氯沙坦的代谢特性

1、色谱及质谱条件：采用液质联用方法进行分析。色谱柱为Waters Acquity UPLCBEH C18柱(2.1*50mm,1.7-μm,Waters Corp,美国)；流动相A为0.1％甲酸；流动相B为乙腈；柱温为40℃，流速为0.4ml/min，流动相为A:B＝25:75。电喷雾离子源(ESI):选择正离子模式扫描；离子源温度为500℃，信号采集方式为多级反应监测，代谢产物及内参的参数见下表：

名称	母离子(m/z)	子离子(m/z)	碰撞能(eV)
				氯沙坦羧酸(E-3174)	437.2	235.2	15
内标	326.1	291.1	30

2、孵育条件：

反应总体积200μL，其中包括：100mM Tris-HCl(pH 7.4)，1×NADPH 辅酶生成系统，2pmol细胞色素b5及氯沙坦(购自美国Sigma公司，反应终浓度为0.1-25μM)。37℃预孵育5min后，加入1pmol的实施例2构建的重组微粒体启动反应。37℃孵育40min后，加入200μL0.1M ACN和30μL 200 ng/μL内标咪达唑仑(购自美国Sigma公司)并涡旋震荡2min,4℃下以10,000 ×g离心10min。取2μL于Waters XEVO TQD液相色谱-质谱联用仪检测。

本实施例的Michaelis-Menten数据分析结果如图5所示。进一步进行药物动力学分析，结果如表4所示：

表4：各微粒体代谢氯沙坦的药物动力学分析结果

由图5及表4可知，本发明的S140N的整体酶学活性近似于野生型*1型，也高于突变型*3型。

根据上述实施例可以看出，本发明的S140N突变酶代谢活性针对甲苯磺丁脲远高于野生型*1型，而针对氯沙坦近似于野生型*1型。因此，在实践中，需要考虑对携带该基因型的个体在用某些药的剂量上进行适当调节，如增加药物的使用量。这种通过基因导向的药物调整对于快代谢的药物更为重要。

序列：

SEQ ID NO.1：基因组DNA序列

TTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTACTCTGTAGCTCAGGCTGGAGTGCAGT GGTACAATCTTGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCCAGGTCCCCATTCAAGAAATTCTCC TGCCTCAGTCCCCCAAGTAGCTAGCATTACAGGCATGCACCACCATGCTCAGCTAATTT TTGTATTTTTAGTAGAGACGTGGTATCACCTTGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTG ACCTTGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATTACAGGCAGGAGCCAC CACACCTGGCCGTTTGTTTAAAATAGAGTAAATAGACCTGCTGAATATGTTGATGTGAG TATTAATTGTAATCTGCATAGCAATTGTCTGACCATTGCCTTGAACATCACAGGCCATCT GAGTGGCAAGTATAATCATCATCATGTTTCTATTTAAAATTCAGAAATATTTGAAGCCTG TGTGGCTGAATAAAAGCATACAAATACAATGAAAATATCATGCTAAATCAGGCTTAGCA AATGGACAAAATAGTAACTTCGTTTGCTGTTATCTCTGTCTACTTTCCTAGCTCTCAAA GGTCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGAAACCCATAGTGGTGCTGCATG GATATGAAGCAGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAG GCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGTAGGTGTGCATGTGCCTG TTTCAGCATCTGTCTTGGGGATGGGGAGGATGGAAAACAGAGACTTACAGAGCTCCT CGGGCAGAGCTTGGCCCATCCACATGGCTGCCCAGTGTCAGCTTCCTCTTTCTTGCCT GGGATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAA GAAATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGG AAGAGGAACATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTT GAGAAAAACCAAGGGTGGGTGACCCTACTCCATATCACTGACCTTACTGGACTACTAT CTTCTCTACTGACATTCTTGGAAACATTTCAGGGGTGGCCATATCTTTCATTATGAGTCC TGGTTGTTAGCTCATGTGAAGCGGGGGTTTGAAGCTGAGAGCCAAGGGAATTTGCAC ATATTTGTGCTGTGTGTGTACAGGCATGATTGTGCGTACAGTGTGGGTATAAAAGGTTC ATTTAATCCCATGTTCTCCTGAACTTTGCTTTTTTGCTTTCAAATAAGAAATGATGAATA TAGATTTTGAGTTCATTTTTTGAAAGAGTTAAAGAGCAGTGTTTTTCCCATTACCTATT CCAGAACATGTCACCAGAGAATACTTGACAAGTCAACATGGTGGGAATGGCCCTATCA TACCCATATGGAGCATGAACCAAATGGCATGTGCTTTTATTTAATTGGACTGTGTTTGTA TGGTCAGCCTCACTGACTTCTCTGGGGTTTCTTTTAGGCCCGTGCTTGCCATTCTGGCC AGTAATGACATTCTACAGTTTTTATTGCTTAGGCATATCTTAGTGCAGTTCTCATCAATT ATTATTTCTCTGTAAACACAGCATTATTTTAAAAATAGTATTAATTATTTCTTGTTACTGT ATTGATTTATATATTTTCAGTAAATACATCCTGTAGCATAATTCTGTGAAATACCCAAATG TCAATTTATAAAATGATTTATTTAACAAGATTTTACTTATTAGTAATAACTCTGTAATCTG CATTCCCTATGTATGATTTGGCTCTGTTTCAGTTTTGCTTATCTCTTTCCAACCATATTTA TGAAATTTTGGCTTAGAAATTTATGTTAATTATTTTTTTTCCATGGCCAACTCTACTCATC TATGAAGTTTTACAATGAATCTGTTTATCAGCTTGGATACCAAATTACCTTGTTTTT

SEQ ID NO.2：编码序列

ATGGATTCTCTTGTGGTCCTTGTGCTCTGTCTCTCATGTTTGCTTCTCCTTTCACTC TGGAGACAGAGCTCTGGGAGAGGAAAACTCCCTCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTG ATTGGAAATATCCTACAGATAGGTATTAAGGACATCAGCAAATCCTTAACCAATCTCTC AAAGGTCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGAAACCCATAGTGGTGCTGC ATGGATATGAAGCAGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGCAAG AGGCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGAATTGTTTTCAGCAAT GGAAAGAAATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGG ATGGGGAAGAGGAACATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGA GGAGTTGAGAAAAACCAAGGCCTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCT CCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCATAAACGTTTTGATTATAAAGATCAGCAA TTTCTTAACTTAATGGAAAAGTTGAATGAAAACATCAAGATTTTGAGCAGCCCCTGGA TCCAGATCTGCAATAATTTTTCTCCTATCATTGATTACTTCCCGGGAACTCACAACAAAT TACTTAAAAACGTTGCTTTTATGAAAAGTTATATTTTGGAAAAAGTAAAAGAACACCA AGAATCAATGGACATGAACAACCCTCAGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATGAAAATG GAGAAGGAAAAGCACAACCAACCATCTGAATTTACTATTGAAAGCTTGGAAAACACT GCAGTTGACTTGTTTGGAGCTGGGACAGAGACGACAAGCACAACCCTGAGATATGCT CTCCTTCTCCTGCTGAAGCACCCAGAGGTCACAGCTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAA CGTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTAC ACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGC CCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGGCACAAC CATATTAATTTCCCTGACTTCTGTGCTACATGACAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGA TGTTTGACCCTCATCACTTTCTGGATGAAGGTGGCAATTTTAAGAAAAGTAAATACTTC ATGCCTTTCTCAGCAGGAAAACGGATTTGTGTGGGAGAAGCCCTGGCCGGCATGGAG CTGTTTTTATTCCTGACCTCCATTTTACAGAACTTTAACCTGAAATCTCTGGTTGACCC AAAGAACCTTGACACCACTCCAGTTGTCAATGGATTTGCCTCTGTGCCGCCCTTCTAC CAGCTGTGCTTCATTCCTGTCTGA

SEQ ID NO.3：蛋白质序列

MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIGIKDISKSLTNLSK VYGPVFTLYFGLKPIVVLHGYEAVKEALIDLGEEFSARGIFPLAERANRGFGIVFSNGKKW KEIRRFSLMTLRNFGMGKRNIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSII FHKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIKILSSPWIQICNNFSPIIDYFPGTHNKLLKNVAFMKSYI LEKVKEHQESMDMNNPQDFIDCFLMKMEKEKHNQPSEFTIESLENTAVDLFGAGTETTST TLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVIGRNRSPCMQDRSHMPYTDAVVHEVQRYIDLLPT SLPHAVTCDIKFRNYLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFPNPEMFDPHHFLDEGGNFKKSKYF MPFSAGKRICVGEALAGMELFLFLTSILQNFNLKSLVDPKNLDTTPVVNGFASVPPFYQLC FIPV

参考文献：

1.Aquilante CA.Sulfonylurea pharmacogenomics in Type 2diabetes:theinfluence of drug target and diabetes risk polymorphisms.Expert RevCardiovasc Ther.2010；8(3): 359–372.

2.Xu HM,Murray M,Mclachlan AJ.Influence of genetic polymorphisms onthe pharmacokinetics and pharmacodynamics of sulfonylurea drugs.Current DrugMetabolism. 2009；10(6):643-658.

3.Wang B,Wang J,Huang SQ,et al.Genetic polymorphism of the humancytochrome P450 2C9 gene and its clinical significance.Current DrugMetabolism.2009；10(7):781-834。

4.李智,王果,周宏灏.CYP2C9基因多态性及其功能意义研究进展.中国临床药理学与治疗学2008；13(6):601-609。

5.Zhou Sh.F,Liu J.P.Chowbay B.Polymorphism of human cytochrome P450enzymes and its clinical impact.Drug Metab Rev.2009；41(2):89-295。

序列表

<110> 蔡剑平

<120> 包括419G>A突变的CYP2C9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用

<130> DSP1F192375YJ

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

tttttttttt tttttgagac agagtcttac tctgtagctc aggctggagt gcagtggtac 60

aatcttggct cactgcaacc tccatctccc aggtccccat tcaagaaatt ctcctgcctc 120

agtcccccaa gtagctagca ttacaggcat gcaccaccat gctcagctaa tttttgtatt 180

tttagtagag acgtggtatc accttgttgg ccaggctggt cttgaactcc tgaccttgtg 240

atccacctgc cttggcctcc caaagtgttg ggattacagg caggagccac cacacctggc 300

cgtttgttta aaatagagta aatagacctg ctgaatatgt tgatgtgagt attaattgta 360

atctgcatag caattgtctg accattgcct tgaacatcac aggccatctg agtggcaagt 420

ataatcatca tcatgtttct atttaaaatt cagaaatatt tgaagcctgt gtggctgaat 480

aaaagcatac aaatacaatg aaaatatcat gctaaatcag gcttagcaaa tggacaaaat 540

agtaacttcg tttgctgtta tctctgtcta ctttcctagc tctcaaaggt ctatggccct 600

gtgttcactc tgtattttgg cctgaaaccc atagtggtgc tgcatggata tgaagcagtg 660

aaggaagccc tgattgatct tggagaggag ttttctggaa gaggcatttt cccactggct 720

gaaagagcta acagaggatt tggtaggtgt gcatgtgcct gtttcagcat ctgtcttggg 780

gatggggagg atggaaaaca gagacttaca gagctcctcg ggcagagctt ggcccatcca 840

catggctgcc cagtgtcagc ttcctctttc ttgcctggga tctccctcct agtttcgttt 900

ctcttcctgt taggaattgt tttcagcaat ggaaagaaat ggaaggagat ccggcgtttc 960

tccctcatga cgctgcggaa ttttgggatg gggaagagga acattgagga ccgtgttcaa 1020

gaggaagccc gctgccttgt ggaggagttg agaaaaacca agggtgggtg accctactcc 1080

atatcactga ccttactgga ctactatctt ctctactgac attcttggaa acatttcagg 1140

ggtggccata tctttcatta tgagtcctgg ttgttagctc atgtgaagcg ggggtttgaa 1200

gctgagagcc aagggaattt gcacatattt gtgctgtgtg tgtacaggca tgattgtgcg 1260

tacagtgtgg gtataaaagg ttcatttaat cccatgttct cctgaacttt gcttttttgc 1320

tttcaaataa gaaatgatga atatagattt tgagttcatt ttttgaaaga gttaaagagc 1380

agtgtttttc ccattaccta ttccagaaca tgtcaccaga gaatacttga caagtcaaca 1440

tggtgggaat ggccctatca tacccatatg gagcatgaac caaatggcat gtgcttttat 1500

ttaattggac tgtgtttgta tggtcagcct cactgacttc tctggggttt cttttaggcc 1560

cgtgcttgcc attctggcca gtaatgacat tctacagttt ttattgctta ggcatatctt 1620

agtgcagttc tcatcaatta ttatttctct gtaaacacag cattatttta aaaatagtat 1680

taattatttc ttgttactgt attgatttat atattttcag taaatacatc ctgtagcata 1740

attctgtgaa atacccaaat gtcaatttat aaaatgattt atttaacaag attttactta 1800

ttagtaataa ctctgtaatc tgcattccct atgtatgatt tggctctgtt tcagttttgc 1860

ttatctcttt ccaaccatat ttatgaaatt ttggcttaga aatttatgtt aattattttt 1920

tttccatggc caactctact catctatgaa gttttacaat gaatctgttt atcagcttgg 1980

ataccaaatt accttgtttt t 2001

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atggattctc ttgtggtcct tgtgctctgt ctctcatgtt tgcttctcct ttcactctgg 60

agacagagct ctgggagagg aaaactccct cctggcccca ctcctctccc agtgattgga 120

aatatcctac agataggtat taaggacatc agcaaatcct taaccaatct ctcaaaggtc 180

tatggccctg tgttcactct gtattttggc ctgaaaccca tagtggtgct gcatggatat 240

gaagcagtga aggaagccct gattgatctt ggagaggagt tttctgcaag aggcattttc 300

ccactggctg aaagagctaa cagaggattt ggaattgttt tcagcaatgg aaagaaatgg 360

aaggagatcc ggcgtttctc cctcatgacg ctgcggaatt ttgggatggg gaagaggaac 420

attgaggacc gtgttcaaga ggaagcccgc tgccttgtgg aggagttgag aaaaaccaag 480

gcctcaccct gtgatcccac tttcatcctg ggctgtgctc cctgcaatgt gatctgctcc 540

attattttcc ataaacgttt tgattataaa gatcagcaat ttcttaactt aatggaaaag 600

ttgaatgaaa acatcaagat tttgagcagc ccctggatcc agatctgcaa taatttttct 660

cctatcattg attacttccc gggaactcac aacaaattac ttaaaaacgt tgcttttatg 720

aaaagttata ttttggaaaa agtaaaagaa caccaagaat caatggacat gaacaaccct 780

caggacttta ttgattgctt cctgatgaaa atggagaagg aaaagcacaa ccaaccatct 840

gaatttacta ttgaaagctt ggaaaacact gcagttgact tgtttggagc tgggacagag 900

acgacaagca caaccctgag atatgctctc cttctcctgc tgaagcaccc agaggtcaca 960

gctaaagtcc aggaagagat tgaacgtgtg attggcagaa accggagccc ctgcatgcaa 1020

gacaggagcc acatgcccta cacagatgct gtggtgcacg aggtccagag atacattgac 1080

cttctcccca ccagcctgcc ccatgcagtg acctgtgaca ttaaattcag aaactatctc 1140

attcccaagg gcacaaccat attaatttcc ctgacttctg tgctacatga caacaaagaa 1200

tttcccaacc cagagatgtt tgaccctcat cactttctgg atgaaggtgg caattttaag 1260

aaaagtaaat acttcatgcc tttctcagca ggaaaacgga tttgtgtggg agaagccctg 1320

gccggcatgg agctgttttt attcctgacc tccattttac agaactttaa cctgaaatct 1380

ctggttgacc caaagaacct tgacaccact ccagttgtca atggatttgc ctctgtgccg 1440

cccttctacc agctgtgctt cattcctgtc tga 1473

<210> 3

<211> 490

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Asp Ser Leu Val Val Leu Val Leu Cys Leu Ser Cys Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Trp Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Lys Leu Pro Pro Gly

20 25 30

Pro Thr Pro Leu Pro Val Ile Gly Asn Ile Leu Gln Ile Gly Ile Lys

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Ser Leu Thr Asn Leu Ser Lys Val Tyr Gly Pro Val

50 55 60

Phe Thr Leu Tyr Phe Gly Leu Lys Pro Ile Val Val Leu His Gly Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Asp Leu Gly Glu Glu Phe Ser Ala

85 90 95

Arg Gly Ile Phe Pro Leu Ala Glu Arg Ala Asn Arg Gly Phe Gly Ile

100 105 110

Val Phe Ser Asn Gly Lys Lys Trp Lys Glu Ile Arg Arg Phe Ser Leu

115 120 125

Met Thr Leu Arg Asn Phe Gly Met Gly Lys Arg Asn Ile Glu Asp Arg

130 135 140

Val Gln Glu Glu Ala Arg Cys Leu Val Glu Glu Leu Arg Lys Thr Lys

145 150 155 160

Ala Ser Pro Cys Asp Pro Thr Phe Ile Leu Gly Cys Ala Pro Cys Asn

165 170 175

Val Ile Cys Ser Ile Ile Phe His Lys Arg Phe Asp Tyr Lys Asp Gln

180 185 190

Gln Phe Leu Asn Leu Met Glu Lys Leu Asn Glu Asn Ile Lys Ile Leu

195 200 205

Ser Ser Pro Trp Ile Gln Ile Cys Asn Asn Phe Ser Pro Ile Ile Asp

210 215 220

Tyr Phe Pro Gly Thr His Asn Lys Leu Leu Lys Asn Val Ala Phe Met

225 230 235 240

Lys Ser Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Glu His Gln Glu Ser Met Asp

245 250 255

Met Asn Asn Pro Gln Asp Phe Ile Asp Cys Phe Leu Met Lys Met Glu

260 265 270

Lys Glu Lys His Asn Gln Pro Ser Glu Phe Thr Ile Glu Ser Leu Glu

275 280 285

Asn Thr Ala Val Asp Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr

290 295 300

Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Lys His Pro Glu Val Thr

305 310 315 320

Ala Lys Val Gln Glu Glu Ile Glu Arg Val Ile Gly Arg Asn Arg Ser

325 330 335

Pro Cys Met Gln Asp Arg Ser His Met Pro Tyr Thr Asp Ala Val Val

340 345 350

His Glu Val Gln Arg Tyr Ile Asp Leu Leu Pro Thr Ser Leu Pro His

355 360 365

Ala Val Thr Cys Asp Ile Lys Phe Arg Asn Tyr Leu Ile Pro Lys Gly

370 375 380

Thr Thr Ile Leu Ile Ser Leu Thr Ser Val Leu His Asp Asn Lys Glu

385 390 395 400

Phe Pro Asn Pro Glu Met Phe Asp Pro His His Phe Leu Asp Glu Gly

405 410 415

Gly Asn Phe Lys Lys Ser Lys Tyr Phe Met Pro Phe Ser Ala Gly Lys

420 425 430

Arg Ile Cys Val Gly Glu Ala Leu Ala Gly Met Glu Leu Phe Leu Phe

435 440 445

Leu Thr Ser Ile Leu Gln Asn Phe Asn Leu Lys Ser Leu Val Asp Pro

450 455 460

Lys Asn Leu Asp Thr Thr Pro Val Val Asn Gly Phe Ala Ser Val Pro

465 470 475 480

Pro Phe Tyr Gln Leu Cys Phe Ile Pro Val

485 490

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacaatggaa cgaaggagaa caagaccaaa ggac 34

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtttcattc cactatttct gacactgaca 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacaaataca atgaaaatat catg 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaacaacca ggactcataa t 21

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctattcttgc cctttccatc tcagtgcctt g 31

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttgttattg gtctattcag ggatttgact 30

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taggcaagca tggaataagg gagtagg 27

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatcaccatt agtttgaaac agattacagc 30

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccctgaatt gctacaacaa a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acccggtgat ggtagaggtt 20

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttctttgga acgggatttc ctcatctgc 29

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctgtcctta tcattttgag aaccagcat 29

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tacctctagg gatacac 17

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctaacaacca ggactcataa t 21

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgctgttaa gggaatttgt aggtaagata 30

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tagtggtcta ttttgttatt cattcat 27

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttccagtttc tatgttg 17

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acccggtgat ggtagaggtt 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgggatttc ctcatctg 18

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgatacactg aacagttatt gc 22

Claims

1.核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的突变位点，且是SEQID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第419位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第419位的核苷酸是A；或者为所述核酸片段的互补序列片段。

2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-100、101-200、201-500或501-1000个核苷酸。

3.根据权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60或61-100个核苷酸。

4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的序列如SEQID NO.1或2所示。

5.用于检测和/或分析单碱基突变的引物，所述单碱基突变对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQ ID NO.2的第419位，所述引物能够扩增所述单碱基突变。

6.根据权利要求5所述的引物，其序列如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7和/或SEQ IDNO.17所示。

7.用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，包括权利要求5或6所述的引物。

8.权利要求1～4任一项所述的核酸片段在制备用于检测CYP2C9基因突变的检验标志物或制剂中的应用。

9.一种分析核酸的方法，包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第419位的核苷酸。

10.CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第140位的天冬酰胺，并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。