CN113943717B - Cyp2c9突变体、其对应的核酸片段及应用 - Google Patents

Cyp2c9突变体、其对应的核酸片段及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物学领域，涉及一种CYP2C9突变体。本发明的突变体具有SEQ ID NO.1所示的序列，该突变体对药物的代谢活性低于野生型，对个体化用药具有指导意义。本发明还提供对应于该突变体的核酸片段及其应用。

Description

CYP2C9突变体、其对应的核酸片段及应用
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种CYP2C9突变体。
背景技术
患者对药物治疗的反应存在较大的个体差异，只有约50％-75％的患者对药物治疗干预反应充分，而其他患者要么缺乏疗效，要么遭受不良反应事件。药物治疗结果可被多种因素影响，如环境因素(共同用药、饮食、吸烟等)、生理因素(性别、年龄、伴生疾病等)和遗传因素，其中遗传变异可解释约20-30％的不同治疗结局。根据临床药物基因组学实施联盟(CPIC)发布的指南，目前已有118种基因被认为具有药物遗传学活性，如HLA、CYP、VKORC1等。
细胞色素P450(Cytochrome P450 proteins,CYP)是人体内主要的药物代谢酶，它们能催化代谢多种内源、外源物质，通过结构中存在的亚铁离子传递电子氧化异源物，增强异源物的水溶性使其更易排出体外。CPIC发布的被认为具有药物遗传学活性的基因中，包含多个CYP的亚家族，如CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等，其中CYP2C9是CYP2亚家族中的重要成员，约占肝微粒体P450蛋白总量的20％，约有16％的临床药物经由CYP2C9代谢。已有研究表明，其编码基因CYP2C9的遗传多态性可显著改变CYP酶的药物代谢活性，进而影响药物的体内代谢情况，并导致可能的药物不良反应的发生，尤其是针对像华法林这类低治疗窗的药物时更为显著。
前期研究中，申请人针对中国汉族人群建立了国际范围内单一民族最大的CYP2C9等位基因遗传多态性数据库，共检测到14种已知等位基因，同时还发现了22种新的非同义突变，其中的21种被国际人类CYP等位基因命名委员会命名为新等位基因(CYP2C9*36-*56)。体外研究表明，这些新发现的变异体均会导致CYP2C9酶的药物代谢活性下降，提示携带这些等位基因的个体服用经由CYP2C9代谢的药物时，发生药物不良反应的概率可能会上升。然而这些仅是CYP2C9可能存在的变异体的一部分，前期针对大量人群的基因筛查研究表明，汉族人群中可能还存在许多未被发现的CYP2C9突变类型，因此，本领域需要发现并研究更多的CYP2C9突变体，为临床合理用药提供重要的科学依据。
发明内容
申请人对北京医院心内科513例京籍汉族住院患者开展了CYP2C9基因分型检测，发现了一种全新的CYP2C9突变类型，该突变体由单碱基突变引起。因此，本发明的目的是提供一种新的CYP2C9突变类型，并提供对应该突变体的核酸片段及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种CYP2C9突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。与野生型CYP2C9的氨基酸序列相比，该突变体存在Q214H突变。
第二个方面，提供对应于所述CYP2C9突变体的核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第501位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第501位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.3的第642位的突变位点，且是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第642位的核苷酸是T；或者为上述核酸片段的互补序列片段。
第三个方面，提供用于检测和/或分析单碱基突变的引物，所述单碱基突变对应于SEQ ID NO.2的第501位或对应于SEQ ID NO.3的第642位，所述引物能够扩增所述单碱基突变。
第四个方面，提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的引物。
第五个方面，提供本发明的核酸片段在制备用作检测CYP2CP基因突变的检验标志物或制剂中的应用。
本发明提供了新的CYP2C9突变体，该突变由单碱基突变引起。该突变体的编码基因在对应于SEQ ID NO.3的第642位核苷酸由G突变为T(642G>T)，从而引起其编码的氨基酸由谷氨酰胺突变为组氨酸，即对应于SEQ ID NO.1的第214位的组氨酸。该突变的CYP2C9蛋白(命名为Q214H)对药物的代谢活性比野生型低。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。
附图说明
图1是实施例1中的对应于本发明的SEQ ID NO.3序列的第642位核苷酸测序图谱(642G>T)以及野生型对应序列的测序图谱(WT)；
图2是昆虫表达载体pFastBac-dual结构图；
图3是实施例2中的各微粒体表达蛋白的Western结果图；
图4是实施例3中的各微粒体代谢甲苯磺丁脲的数据图；
图5是实施例4中的各微粒体代谢氯沙坦的数据图；
图6是实施例5中的各微粒体代谢双氯芬酸的数据图。
具体实施方式
通过下述具体实施方式说明本发明，但本发明内容不限于此。
如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。
本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2C9基因中存在与野生型CYP2C9基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID NO.2所示序列的第501位或SEQ ID NO.3所示序列中的第642位。
本发明内容涉及CYP2C9基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA中表现，也可以在编码序列(即CDS，对应于mRNA序列)中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID NO.2是以本申请的突变位点为中心、前后各500nt的基因组DNA序列，即SEQ ID NO.2的第501位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID NO.3是具有所述突变位点的CYP2C9基因的cDNA序列的编码区，其中第642位是本发明涉及的突变位点。本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQ ID NO.2的第501位位点和对应于SEQ ID NO.3的第642位位点同义互用。
本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式。
本发明的内容是基于CYP2C9基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2C9基因的编码区内，对应于SEQ ID NO.3的第642位，该位点由野生型的G突变为T(642G>T)；此外，由该突变的CYP2C9基因编码的蛋白的第214位由谷氨酰胺突变为组氨酸(Q214H)。
在第一个方面，本发明提供CYP2C9突变体，所述突变体具有SEQ ID NO.1所示的序列。
在第二个方面，本发明提供对应于该突变体的核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第501位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第501位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.3的第642位的突变位点，且是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第642位的核苷酸是T；或者为上述核酸片段的互补序列片段。
在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、101-200、201-500或501-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60或61-100个核苷酸。
所述突变位点可以位于所述核酸片段的任何位置。
在另一种实施方式中，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO.2所示的序列。
在另一种实施方式中，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的引物，所述单碱基突变对应于SEQ ID NO.2的第501位或对应于SEQ ID NO.3的第642位，所述引物能够扩增所述单碱基突变。
在一种实施方式中，所述引物的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；在另一种实施方式中，所述引物的序列如SEQ ID NO:23所示。其中，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11是扩增引物，SEQ ID NO:23是测序引物。
本发明的第四个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的引物。本领域技术人员能够根据实际需要配置试剂盒中其它试剂。
本发明的第五个方面是提供本发明的核酸片段在制备用作检测CYP2C9基因突变的检验标志物或制剂中的应用。本领域技术人员可以根据本发明提供的核酸片段来检测CYP2C9基因是否存在642G>T突变，以此分析是否需要对阳性核酸片段提供者进行相关药物给药量调整。
本发明的CYP2C9突变体(命名为Q214H)对药物的代谢活性比野生型降低，因而对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。本发明中所述的CYP2C9代谢的药物包括：抗癌药物，如环磷酰胺、异环磷酰胺或紫杉醇；抗凝血药，如华法林、醋硝香豆素、抗惊厥药或美芬妥英；降糖药，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或罗格列酮；抗癫痫药，如苯妥英或唑尼沙胺；抗疟药/抗寄生虫药，如阿莫地喹、盐酸氯胍或奎宁；抗精神病药，如阿米替林、西酞普兰、丙咪嗪、哌罗匹隆、舍曲林、硫利达嗪或文拉法辛；降压药，如氯沙坦、厄贝沙坦或缬沙坦；非类固醇性抗炎药，如双氯酚酸、氨基比林、安替比林、塞来昔布、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、氯诺昔康、甲芬那酸、萘普生、吡罗昔康或替诺昔康；镇痛药，如、洛哌丁胺、美沙酮或吗啡；质子泵抑制剂，如兰索拉唑或奥美拉唑；镇静药，如、氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。
下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。
以下实施例中，如没有特别说明，使用的试剂或仪器都是商购的，可以通过普通商购途径获得；使用的实验方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例中的描述可以毫无疑义地确定如何实施实验并获得对应结果。
附图以及各实施例中，CYP2C9.1表示野生型CYP2C9，即1型；CYP2C9.3表示3型突变体；Q214H表示本发明的突变体。
实施例1：人CYP2C9基因新的突变位点的鉴定
1.材料
(1)主要试剂:FineQuick快速磁珠法血液基因组提取试剂盒(常州济凡生物科技有限公司)；2×Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；
(2)引物：PCR扩增及测序用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物具体序列信息详见表1和表2。
2.样本采集及基因组DNA提取
本发明随机收集2018年北京医院心内科京籍汉族患者的全血样本，所有纳入实验的研究对象均已签署知情同意书。取200μl EDTA抗凝全血样本，参照FineQuick快速磁珠法血液基因组提取试剂盒使用说明，利用全自动核酸提取纯化仪(常州济凡生物科技有限公司)提取基因组DNA。
3.PCR扩增
按照如下比例配制30μl PCR反应混合物：15μl 2×Taq Plus Master Mix，0.2μmol/l上下游扩增引物(表1)及30-50ng基因组DNA。PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性15s，50℃-61℃退火15s，72℃延伸30s-90s，共进行30个循环。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测合格后交由北京天一辉远生物科技有限公司开展Sanger测序。
表1 CYP2C9基因扩增引物列表
表2 CYP2C9基因测序引物列表
测序区域 引物(5’-3’)
启动子 AGAAGCCCTAGTTTCTCAAACCCTT(SEQ ID NO.20)
外显子1 ACATGCAAAGACCCAAATCTTTCT(SEQ ID NO.21)
外显子2+3 TATTTGAAGCCTGTGTGGCTGAA(SEQ ID NO.22)
外显子4 TATGAGCACGCTTTAGGG(SEQ ID NO.23)
外显子5 TGATTATCATCTGGTTAGAATTGAT(SEQ ID NO.24)
外显子6 AATCACCATTAGTTTGAAACAGATTACAGC(SEQ ID NO.25)
外显子7 CCTAAGAGTAGCCAAACCAAT(SEQ ID NO.26)
外显子8 GATTGCAGGGCACTTTA(SEQ ID NO.27)
外显子9 TCTGTCCTTATCATTTTGAGAACCAGCAT(SEQ ID NO.28)
4.测序结果分析
从The Pharmacogene Variation(PharmVar)Consortium网站(https://www.pharmvar.org/gene/CYP2C9)中下载CYP2C9的参考序列(NG_008385.1)，使用DNAStarLasergene(Version：7.1.0)软件的Seqman组件将获得的测序序列与参考序列进行比对分析，并参照PharmVar网站中列出的等位基因信息，对入组样本进行CYP2C9基因分型分析。
通过比对分析，发现其中一份样品的CYP2C9基因编码区的第642位的核苷酸由G变为T，该突变位于CYP2C9基因的第4外显子内(基因测序结果如图1所示)。据此推断该CYP2C9基因编码的蛋白质中，第214位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H)。该突变现还未被P450命名委员会命名，未对外公布。
本实施例中示例性地给出了鉴定新突变位点的方法。本领域技术人员根据上述内容可以清楚地得知特异性地检测待测样品中包含对应于SEQ ID NO.2的第501位核苷酸或对应于SEQ ID NO.3的第642位核苷酸的方法：分离样品中的核酸，在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应，引物使用引物对SEQ ID NO.10和11；用测序引物SEQ ID NO.23对扩增的产物进行测序；将测序结果与野生型结果比对，分析对应于SEQ ID NO.2的第501位核苷酸或对应于SEQ ID NO.3的第642位核苷酸。
实施例2：目标基因的表达
以连接有野生型CYP2C9.1的开放阅读框的质粒载体(由美国南佛罗里达大学的周树峰教授馈赠)为模板，利用定点诱变技术分别获得CYP2C9.3(1075A>C)和本发明的Q214H突变体的开放阅读框。定点诱变技术是本领域公知技术，本领域技术人员根据确定的模板和目标，可以毫无疑义地知道如何完成该步骤。
然后将CYP2C9.1基因和定点诱变的两个突变体基因的ORF克隆至连接有细胞色素P450氧化还原酶(OR)的载体pFastBac-dual中，使得CYP2C9基因及OR分别置于PH和p10启动子后，构建同时表达OR和CYP2C9(或其突变体)的双表达载体。pFastBac-dual载体结构图以及CYP2C9基因和OR的插入位点参见图2。表达载体经测序，与本实验预设的野生型和突变型序列一致。
按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒(购自美国Invitrogen公司，用于昆虫细胞中大量表达外源目的基因)的使用说明，利用构建好的双表达载体和对照载体分别包装P1代和P2代昆虫病毒，所获P2代病毒测定滴度后按照MOI(multiplicity-of-infection)为4的侵染量侵染sf21昆虫细胞。侵染72小时后离心收集细胞，使用超声破碎仪(美国SONIC公司)按照40％的能量超生破碎细胞，利用差速离心法提取昆虫细胞微粒体。用Western方法检测各微粒体中CYP2C9和OR的表达量。
Western结果如图3所示。第一行显示的是CYP2C9表达量，第二行显示的是OR表达量。由图可见，3个双表达载体均表达OR蛋白，并分别表达野生型、3型突变体和本发明的Q214H蛋白。
酶代谢活性分析
根据现有的研究结果，野生型(1型)对各种药物的代谢活性均比较高，而3型突变体的代谢活性比野生型的代谢活性有明显改变。因此，在本领域中已有这样一种共识：同一个基因型所表达的酶对特异性底物的代谢活性可以代表对其它底物药的代谢活性。从而，根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性(如，可以将该基因型所表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较)。
实施例3：利用获得的昆虫微粒体体外分析对甲苯磺丁脲的代谢特性：
1)色谱及质谱条件：采用液质联用方法进行分析。色谱柱为Waters Acquity UPLCBEH C18反相色谱柱(2.1*50mm,1.7μm，Waters Corp,美国)；流动相A为0.1％甲酸；流动相B为乙腈；柱温为40℃，流速为0.4ml/min，进行梯度洗脱：0-1.4min，A(60％-10％),1.4-2.6min，A(10％-60％)。电喷雾离子源(ESI):选择正离子模式扫描；离子源温度为500℃，信号采集方式为多级反应监测，代谢产物及内标的参数见下表：
名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能(eV)
4-羟基甲苯磺丁脲 287 74.02 15
咪达唑仑 326.1 291.1 30
2)孵育条件：
反应总体积200μL，其中包括：100mM Tris-HCl(pH 7.4)，1×NADPH辅酶生成系统，2pmol细胞色素b5及甲苯磺丁脲(购自美国Sigma公司，反应终浓度为50-2000μM)。37℃预孵育5min后，加入1pmol的实施例2构建的重组微粒体启动反应。37℃孵育40min后，加入200μL0.1M ACN和30μL 200ng/μL内标咪达唑仑(购自美国Sigma公司)并涡旋震荡2min,4℃下以10,000×g离心10min。取2μL于Waters XEVO TQD液相色谱-质谱联用仪检测。
本实施例的Michaelis-Menten数据分析结果如图4所示。进一步进行药物动力学分析，结果如表3所示：
表3：各微粒体代谢甲苯磺丁脲的药物动力学分析结果
*相对于野生型CYP2C9.1，P值<0.05；下同。
其中，Vmax代表最大反应速率(数值越大，表明催化效率越高)，Km为米氏常数(数值越大，表明催化效率越低)，Vmax/Km则反映了整体的药物清除速率，为综合考核指标，数值越低，表明突变体的整体酶学活性越低，药物代谢速率越低，携带这种突变型的个体对药物的需要量越低，否则容易出现药物中毒现象。
由图4及表3可知，本发明的Q214H的整体酶学活性明显低于野生型，略高于3型突变体。
实施例4：利用获得的昆虫微粒体体外分析对氯沙坦的代谢特性
1、色谱及质谱条件：采用液质联用方法进行分析。色谱柱为Waters Acquity UPLCBEH C18柱(2.1*50mm,1.7-μm,Waters Corp,美国)；流动相A为0.1％甲酸；流动相B为乙腈；柱温为40℃，流速为0.4ml/min，流动相为A:B＝25:75。电喷雾离子源(ESI):选择正离子模式扫描；离子源温度为500℃，信号采集方式为多级反应监测，代谢产物及内标的参数见下表：
名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能(eV)
氯沙坦羧酸(E-3174) 437.2 235.2 15
咪达唑仑 326.1 291.1 30
2、孵育条件：
反应总体积200μL，其中包括：100mM Tris-HCl(pH 7.4)，1×NADPH辅酶生成系统，2pmol细胞色素b5及氯沙坦(购自美国Sigma公司，反应终浓度为0.1-25μM)。37℃预孵育5min后，加入1pmol的实施例2构建的重组微粒体启动反应。37℃孵育40min后，加入200μL0.1M ACN和30μL 200ng/μL内标咪达唑仑(购自美国Sigma公司)并涡旋震荡2min,4℃下以10,000×g离心10min。取2μL于Waters XEVO TQD液相色谱-质谱联用仪检测。
本实施例的Michaelis-Menten数据分析结果如图5所示。进一步进行药物动力学分析，结果如表4所示：
表4：各微粒体代谢氯沙坦的药物动力学分析结果
由图5及表4可知，本发明的Q214H的整体酶学活性远低于野生型，略低于3型突变体。
实施例5：利用获得的昆虫微粒体体外分析对双氯芬酸的代谢特性
1)色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(2.1*150mm,5-Micron,Agilent,美国)；流动相为0.1％TFA:水:乙腈＝20:35:45；柱温为40℃；检测波长为：280nm。
2)孵育条件：
反应总体积200μL，其中包括：100mM Tris-HCl(pH 7.4)，1×NADPH辅酶生成系统(美国Promega公司)，2pmol细胞色素b5及双氯芬酸(购自美国Sigma公司，反应终浓度为1-100μM)。37℃预孵育5min后，加入2-5pmol的实施例2构建的重组微粒体以启动反应。37℃孵育20min后，加入100μL 0.1M HCl和10μL 20ng/μL内标卡马西平(购自美国Sigma公司)并涡旋震荡2min。加入800μL冰乙酸乙酯后涡旋震荡2min，4℃下10,000×g离心5min。小心转移有机层，氮吹仪下吹干，加入100μL流动相复溶并取20μL于Waters e2695型高效液相色谱仪检测。本实施例的Michaelis-Menten数据分析结果如图6所示。进一步进行药物动力学分析，结果如表5所示：
表5：各微粒体代谢双氯芬酸的药物动力学分析结果
由图6及表5可见，本发明的Q214H的整体酶学活性低于野生型，略高于3型突变体。
根据上述实施例可以看出，本发明的Q214H突变体酶代谢活性远远低于野生型CYP2C9。因此，在实践中，需要考虑对携带该基因型的个体在用药剂量上进行适当调节，如减少药物的使用量，以避免药物中毒。
序列：
SEQ ID NO.1：突变体氨基酸序列
MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIGIKDISKSLTNLSKVYGPVFTLYFGLKPIVVLHGYEAVKEALIDLGEEFSGRGIFPLAERANRGFGIVFSNGKKWKEIRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSIIFHKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIKILSSPWIHICNNFSPIIDYFPGTHNKLLKNVAFMKSYILEKVKEHQESMDMNNPQDFIDCFLMKMEKEKHNQPSEFTIESLENTAVDLFGAGTETTSTTLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVIGRNRSPCMQDRSHMPYTDAVVHEVQRYIDLLPTSLPHAVTCDIKFRNYLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFPNPEMFDPHHFLDEGGNFKKSKYFMPFSAGKRICVGEALAGMELFLFLTSILQNFNLKSLVDPKNLDTTPVVNGFASVPPFYQLCFIPV
SEQ ID NO.2：基因组DNA序列
gccttgctgtctactgactttgcagactgatgtgattccctctgaaacatgaattattaggtttttagaaaatgcctttttgttctttccaaagtaaaagacaaataggctgggaatgtaaatttagcatttgaacaaccattatttaaccagctaggttgtaatggtcaactcaggattaatgtaaaagtgaagtgttgattttatgcatgccgaactcttttttgctgttaagggaatttgtaggtaagataatttctaaactactattatctgttaacaaatacagtgttttatatctaaagtttaatagtattttaaattgtttctaattatttagcctcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccataaacgttttgattataaagatcagcaatttcttaacttaatggaaaagttgaatgaaaacatcaagattttgagcagcccctggatccatgtaaggccaagatttttgcttcctgagaaaccacttattctcttttttttctgacaaatccaaaattctacatggatcaagctctgaagtgcatttttgaatactacagtcttgcccagacagccttggggtgaatatctgggaaagacggccaagccctttattttatgcatgggaaataaatgcctcaatataggcctgatttctaagcccattagctccctcatcaatgttttttctgctaaactccaaagccctgtttctgtaaagtactttgttgacagccctaaagcgtgctcatagcactccatggatatccaggcactttggaggctcccattactcacaagacttgtccttcaattaacactttgtcgtattatgtggcagaaatatcctaatttaaaagacattatctccttctagtagggagaatatttgggaccatagaagctgccaagaaacactgaatagggcaggggtgtttgatatctcagttg
SEQ ID NO.3：cDNA序列
atggattctcttgtggtccttgtgctctgtctctcatgtttgcttctcctttcactctggagacagagctctgggagaggaaaactccctcctggccccactcctctcccagtgattggaaatatcctacagataggtattaaggacatcagcaaatccttaaccaatctctcaaaggtctatggccctgtgttcactctgtattttggcctgaaacccatagtggtgctgcatggatatgaagcagtgaaggaagccctgattgatcttggagaggagttttctggaagaggcattttcccactggctgaaagagctaacagaggatttggaattgttttcagcaatggaaagaaatggaaggagatccggcgtttctccctcatgacgctgcggaattttgggatggggaagaggagcattgaggaccgtgttcaagaggaagcccgctgccttgtggaggagttgagaaaaaccaaggcctcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccataaacgttttgattataaagatcagcaatttcttaacttaatggaaaagttgaatgaaaacatcaagattttgagcagcccctggatccatatctgcaataatttttctcctatcattgattacttcccgggaactcacaacaaattacttaaaaacgttgcttttatgaaaagttatattttggaaaaagtaaaagaacaccaagaatcaatggacatgaacaaccctcaggactttattgattgcttcctgatgaaaatggagaaggaaaagcacaaccaaccatctgaatttactattgaaagcttggaaaacactgcagttgacttgtttggagctgggacagagacgacaagcacaaccctgagatatgctctccttctcctgctgaagcacccagaggtcacagctaaagtccaggaagagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagccacatgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagatacattgaccttctccccaccagcctgccccatgcagtgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaagggcacaaccatattaatttccctgacttctgtgctacatgacaacaaagaatttcccaacccagagatgtttgaccctcatcactttctggatgaaggtggcaattttaagaaaagtaaatacttcatgcctttctcagcaggaaaacggatttgtgtgggagaagccctggccggcatggagctgtttttattcctgacctccattttacagaactttaacctgaaatctctggttgacccaaagaaccttgacaccactccagttgtcaatggatttgcctctgtgccgcccttctaccagctgtgcttcattcctgtctga
序列表
<110> 北京医院
<120> CYP2C9突变体、其对应的核酸片段及应用
<130> DSP1F213192YJ
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Ser Leu Val Val Leu Val Leu Cys Leu Ser Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Trp Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Lys Leu Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Thr Pro Leu Pro Val Ile Gly Asn Ile Leu Gln Ile Gly Ile Lys
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Ser Leu Thr Asn Leu Ser Lys Val Tyr Gly Pro Val
50 55 60
Phe Thr Leu Tyr Phe Gly Leu Lys Pro Ile Val Val Leu His Gly Tyr
65 70 75 80
Glu Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Asp Leu Gly Glu Glu Phe Ser Gly
85 90 95
Arg Gly Ile Phe Pro Leu Ala Glu Arg Ala Asn Arg Gly Phe Gly Ile
100 105 110
Val Phe Ser Asn Gly Lys Lys Trp Lys Glu Ile Arg Arg Phe Ser Leu
115 120 125
Met Thr Leu Arg Asn Phe Gly Met Gly Lys Arg Ser Ile Glu Asp Arg
130 135 140
Val Gln Glu Glu Ala Arg Cys Leu Val Glu Glu Leu Arg Lys Thr Lys
145 150 155 160
Ala Ser Pro Cys Asp Pro Thr Phe Ile Leu Gly Cys Ala Pro Cys Asn
165 170 175
Val Ile Cys Ser Ile Ile Phe His Lys Arg Phe Asp Tyr Lys Asp Gln
180 185 190
Gln Phe Leu Asn Leu Met Glu Lys Leu Asn Glu Asn Ile Lys Ile Leu
195 200 205
Ser Ser Pro Trp Ile His Ile Cys Asn Asn Phe Ser Pro Ile Ile Asp
210 215 220
Tyr Phe Pro Gly Thr His Asn Lys Leu Leu Lys Asn Val Ala Phe Met
225 230 235 240
Lys Ser Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Glu His Gln Glu Ser Met Asp
245 250 255
Met Asn Asn Pro Gln Asp Phe Ile Asp Cys Phe Leu Met Lys Met Glu
260 265 270
Lys Glu Lys His Asn Gln Pro Ser Glu Phe Thr Ile Glu Ser Leu Glu
275 280 285
Asn Thr Ala Val Asp Leu Phe Gly Ala Gly Thr Glu Thr Thr Ser Thr
290 295 300
Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Lys His Pro Glu Val Thr
305 310 315 320
Ala Lys Val Gln Glu Glu Ile Glu Arg Val Ile Gly Arg Asn Arg Ser
325 330 335
Pro Cys Met Gln Asp Arg Ser His Met Pro Tyr Thr Asp Ala Val Val
340 345 350
His Glu Val Gln Arg Tyr Ile Asp Leu Leu Pro Thr Ser Leu Pro His
355 360 365
Ala Val Thr Cys Asp Ile Lys Phe Arg Asn Tyr Leu Ile Pro Lys Gly
370 375 380
Thr Thr Ile Leu Ile Ser Leu Thr Ser Val Leu His Asp Asn Lys Glu
385 390 395 400
Phe Pro Asn Pro Glu Met Phe Asp Pro His His Phe Leu Asp Glu Gly
405 410 415
Gly Asn Phe Lys Lys Ser Lys Tyr Phe Met Pro Phe Ser Ala Gly Lys
420 425 430
Arg Ile Cys Val Gly Glu Ala Leu Ala Gly Met Glu Leu Phe Leu Phe
435 440 445
Leu Thr Ser Ile Leu Gln Asn Phe Asn Leu Lys Ser Leu Val Asp Pro
450 455 460
Lys Asn Leu Asp Thr Thr Pro Val Val Asn Gly Phe Ala Ser Val Pro
465 470 475 480
Pro Phe Tyr Gln Leu Cys Phe Ile Pro Val
485 490
<210> 2
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttgctgt ctactgactt tgcagactga tgtgattccc tctgaaacat gaattattag 60
gtttttagaa aatgcctttt tgttctttcc aaagtaaaag acaaataggc tgggaatgta 120
aatttagcat ttgaacaacc attatttaac cagctaggtt gtaatggtca actcaggatt 180
aatgtaaaag tgaagtgttg attttatgca tgccgaactc ttttttgctg ttaagggaat 240
ttgtaggtaa gataatttct aaactactat tatctgttaa caaatacagt gttttatatc 300
taaagtttaa tagtatttta aattgtttct aattatttag cctcaccctg tgatcccact 360
ttcatcctgg gctgtgctcc ctgcaatgtg atctgctcca ttattttcca taaacgtttt 420
gattataaag atcagcaatt tcttaactta atggaaaagt tgaatgaaaa catcaagatt 480
ttgagcagcc cctggatcca tgtaaggcca agatttttgc ttcctgagaa accacttatt 540
ctcttttttt tctgacaaat ccaaaattct acatggatca agctctgaag tgcatttttg 600
aatactacag tcttgcccag acagccttgg ggtgaatatc tgggaaagac ggccaagccc 660
tttattttat gcatgggaaa taaatgcctc aatataggcc tgatttctaa gcccattagc 720
tccctcatca atgttttttc tgctaaactc caaagccctg tttctgtaaa gtactttgtt 780
gacagcccta aagcgtgctc atagcactcc atggatatcc aggcactttg gaggctccca 840
ttactcacaa gacttgtcct tcaattaaca ctttgtcgta ttatgtggca gaaatatcct 900
aatttaaaag acattatctc cttctagtag ggagaatatt tgggaccata gaagctgcca 960
agaaacactg aatagggcag gggtgtttga tatctcagtt g 1001
<210> 3
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggattctc ttgtggtcct tgtgctctgt ctctcatgtt tgcttctcct ttcactctgg 60
agacagagct ctgggagagg aaaactccct cctggcccca ctcctctccc agtgattgga 120
aatatcctac agataggtat taaggacatc agcaaatcct taaccaatct ctcaaaggtc 180
tatggccctg tgttcactct gtattttggc ctgaaaccca tagtggtgct gcatggatat 240
gaagcagtga aggaagccct gattgatctt ggagaggagt tttctggaag aggcattttc 300
ccactggctg aaagagctaa cagaggattt ggaattgttt tcagcaatgg aaagaaatgg 360
aaggagatcc ggcgtttctc cctcatgacg ctgcggaatt ttgggatggg gaagaggagc 420
attgaggacc gtgttcaaga ggaagcccgc tgccttgtgg aggagttgag aaaaaccaag 480
gcctcaccct gtgatcccac tttcatcctg ggctgtgctc cctgcaatgt gatctgctcc 540
attattttcc ataaacgttt tgattataaa gatcagcaat ttcttaactt aatggaaaag 600
ttgaatgaaa acatcaagat tttgagcagc ccctggatcc atatctgcaa taatttttct 660
cctatcattg attacttccc gggaactcac aacaaattac ttaaaaacgt tgcttttatg 720
aaaagttata ttttggaaaa agtaaaagaa caccaagaat caatggacat gaacaaccct 780
caggacttta ttgattgctt cctgatgaaa atggagaagg aaaagcacaa ccaaccatct 840
gaatttacta ttgaaagctt ggaaaacact gcagttgact tgtttggagc tgggacagag 900
acgacaagca caaccctgag atatgctctc cttctcctgc tgaagcaccc agaggtcaca 960
gctaaagtcc aggaagagat tgaacgtgtg attggcagaa accggagccc ctgcatgcaa 1020
gacaggagcc acatgcccta cacagatgct gtggtgcacg aggtccagag atacattgac 1080
cttctcccca ccagcctgcc ccatgcagtg acctgtgaca ttaaattcag aaactatctc 1140
attcccaagg gcacaaccat attaatttcc ctgacttctg tgctacatga caacaaagaa 1200
tttcccaacc cagagatgtt tgaccctcat cactttctgg atgaaggtgg caattttaag 1260
aaaagtaaat acttcatgcc tttctcagca ggaaaacgga tttgtgtggg agaagccctg 1320
gccggcatgg agctgttttt attcctgacc tccattttac agaactttaa cctgaaatct 1380
ctggttgacc caaagaacct tgacaccact ccagttgtca atggatttgc ctctgtgccg 1440
cccttctacc agctgtgctt cattcctgtc tga 1473
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaagcccta gtttctcaaa ccctt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctactcaca aaatacatgg tttca 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggctccaac caagtacagt gaaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acatgcaaag acccaaatct ttct 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcatcagtgt ttgaataagc gga 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgcttcac atgagctaac 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccagctaggt tgtaatggtc aact 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcacaagcag tcacataact aagc 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggcaagtt ggtctacagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acatgcaatc ccaggccaat 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtgccattt ttctcctttt ccatc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctaaacaa tatgaagaag gccag 25
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gattgcaggg cacttta 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggaggagtt cttgggt 17
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acactgaaca gttattgcat attct 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtccattcc accctttgac t 21
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agaagcccta gtttctcaaa ccctt 25
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acatgcaaag acccaaatct ttct 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tatttgaagc ctgtgtggct gaa 23
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatgagcacg ctttaggg 18
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgattatcat ctggttagaa ttgat 25
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aatcaccatt agtttgaaac agattacagc 30
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctaagagta gccaaaccaa t 21
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gattgcaggg cacttta 17
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tctgtcctta tcattttgag aaccagcat 29

Claims (3)

1.CYP2C9突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.核酸片段，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。
3.权利要求2所述的核酸片段在制备用作检测CYP2C9基因突变的检验标志物或制剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111004811A (zh) * 2019-11-19 2020-04-14 蔡剑平 包括637a>g突变的cyp2c9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用
CN111004810A (zh) * 2019-11-19 2020-04-14 蔡剑平 包括419g>a突变的cyp2c9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification and drug metabolic characterization of four new CYP2C9 variants CYP2C9*72-*75 in the Chinese Han population;Fang-Ling Zhao等;《Frontiers in Pharmacology》;第1-13页 *

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