CN111004288B - 一种钌配合物及其制备方法和在检测5-甲酰胞嘧啶中的应用 - Google Patents

一种钌配合物及其制备方法和在检测5-甲酰胞嘧啶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型钌配合物及其制备方法和在检测5‑甲酰胞嘧啶中的应用。本发明提供了一种新型钌配合物及其制备方法。本发明还提供了一种用于检测5‑甲酰胞嘧啶的荧光分子探针。本发明还提供了一种采用所述新型钌配合物或所述制备方法制得的钌配合物或所述荧光分子探针检测5‑甲酰胞嘧啶的方法。所述钌配合物能独特地与DNA中的5fC结合，从而特异性识别双链DNA中的5fC，具有良好的荧光响应以及化学稳定性，热力学稳定性好，可以对双链DNA中的5fC实现实时检测并且在细胞内进行分布定位，成本低廉、设备要求低，无需对5‑甲酰胞嘧啶进行富集，可以直接进行检测，并且适用条件广，条件更为简单，温和，灵敏度高。

Description

一种钌配合物及其制备方法和在检测5-甲酰胞嘧啶中的应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域。更具体地，涉及一种钌配合物及其制备方法和在检测5-甲酰胞嘧啶中的应用，设计合成一类多联吡啶钌配合物，利用配合物上配体的特征官能团与5-甲酰胞嘧啶成键，从而实现对双链DNA中5-甲酰胞嘧啶的特异性检测。
背景技术
DNA是生命体中遗传信息的重要载体，它包含腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)以及胸腺嘧啶(T)四种含氮碱基。除了四种天然碱基之外，人们还发现了带有修饰基团的碱基，这些修饰位点分别位于腺嘌呤的2号碳，胞嘧啶的5号碳以及胸腺嘧啶的5号碳的甲基上，而且这些修饰基团是位于DNA双螺旋的大沟处。经定量分析，其中带修饰基团的胞嘧啶含量占比最多。5-甲酰胞嘧啶(5fC)是5-甲基胞嘧啶的氧化产物，主要出现在早期胚胎、胚胎干细胞、大脑皮层以及小鼠的主要器官(如脾脏、胰腺和肝脏)中。研究表明，5fC作为去甲基化的中间体，本身既是表观遗传信号，与转录调控存在着关联。也可以改变DNA双螺旋的结构，参与染色质的重塑(Raiber,E.-A.et al.5-Formylcytosine alters the structureof the DNA double helix.Nat.Struct.Mol.Biol.22,44–49(2015).)。
为了检测5fC，人们发展了一系列的检测方法，包括化学富集技术，抗体富集技术以及单碱基分辨技术。如化学富集技术中的醛基反应探针法(Aldehyde-reactive probe)(Iurlaro,M.ett al.In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specificrole for 5-formylcytosine.Genome Biol.17,141(2016).)，他们设计了一个探针可以在5fC的甲酰基处引入生物素，达到富集的作用。随后，探针中的含叠氮基团的半胺化醚在温和条件下可通过Staudinger还原发生定量裂解，使探针从底物上脱落。最后通过Solexa/Illumina DNA进行测序检测5fC。又如抗体富集技术中的5fC-DNA免疫沉淀法(5fC-DIP)(Shen,L.et al.Genome-wide analysis reveals TET-and TDG-dependent.5-methylcytosine oxidation dynamics.Cell 153,692–706(2013).)，是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲酰化检测技术，采用甲酰化DNA免疫共沉淀技术，通过5-甲酰胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲酰化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的甲酰化区域研究。再如单碱基分辨技术中的还原亚硫酸氢盐测序法(redBS-Seq)(Xia,B.et al.Bisulfite-free,base-resolution analysis of 5-formylcytosine at the genome scale.Nat.Methods 12,1047–1050(2015).)，一种基于亚硫酸氢盐处理后5fC选择性化学还原为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，以单碱基分辨出DNA中5fC的定量方法。
虽然这些技术可以准确检测，但操作繁琐，都需要高紧密仪器并且检测成本较高。基于醛基反应的化学富集技术，这种方法不仅可以标记5fC也可以标记abasic位点，这是内源性DNA修复过程的中间产物，也是DNA中最普遍的损伤之一。因此，需要开发适当的控制或化学阻断反应，以允许基于基于醛基反应的化学富集技术的化学标记方法区分5fC和abasic位点。基于抗体的DNA免疫沉淀和高通量测序(DIP-seq)是一种简单而有效的方法，用于分析胞嘧啶修饰(尤其适用于检测具有多个修饰碱基的区域)，但是这个方法需要高特异性抗体，为招募高特异性的抗体还存在着一定的困难，而且检测的分辨率受限。基于亚硫酸氢盐测序法的单碱基分辨技术，这个方法需要经过亚硫酸氢盐的处理，很容易导致DNA样品的降解，并且需要更深层的测序深度才能可靠地检测5fC。鉴于5fC在基因组中的表达水平很低，在全基因组范围和基本分辨率下绘制5fC图谱将是一项挑战。
发明内容
本发明的首要目的是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种钌配合物。所述钌配合物具有良好的荧光响应以及化学稳定性，热力学稳定性好，具有独特的与DNA结合能力、激发态活性，可以对双链DNA中的5fC实现实时检测并且在细胞内进行分布定位，成本低廉、设备要求低，无需对5-甲酰胞嘧啶进行富集，可以直接进行检测，并且适用条件广，条件更为简单，温和，灵敏度高。
本发明的另一目的是提供上述钌配合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述钌配合物在检测5-甲酰胞嘧啶中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种钌配合物，具有如通式(I)所示的结构：
Figure GDA0002956851290000021
其中，R表示C1-C10烷基基团或C2-C12烷氧基基团。
本发明设计合成了一类在二-吡啶并吩嗪配体的7号碳上修饰羟氨基团的钌配合物。这类钌配合物从DNA的小沟插入，带羟氨基团这端伸向大沟，与在大沟处的胞嘧啶的5-甲酰基发生亲核加成脱去水分子形成西佛碱，能独特地与DNA中的5fC结合，从而特异性识别双链DNA中的5fC。所述钌配合物具有良好的荧光响应以及化学稳定性，热力学稳定性好，可以对双链DNA中的5fC实现实时检测并且在细胞内进行分布定位，成本低廉、设备要求低，无需对5-甲酰胞嘧啶进行富集，可以直接进行检测，并且适用条件广，条件更为简单，温和，灵敏度高。与已有的化学探针法使用的探针相比，合成步骤少，合成难度更小，稳定性高，而且物料更为廉价，可大为降低成本。
在其中一优选实施例中，R表示-CH2-、-OCH2CH2-、-OCH2CH2CH2CH2-或-OCH2CH2CH2CH2CH2CH2-基团。
本发明还涉及了所述钌配合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)、
Figure GDA0002956851290000022
溶于反应溶剂中，回流，冷却至室温，过滤后加入无机盐溶液，析出沉淀，真空干燥后，重结晶；其中A为具有1至10个碳原子的未取代的烷基醇基团或具有2至12个碳原子的卤代烷氧基基团；
S2.将重结晶后的产物溶于有机溶剂中，加入碳酸钠和N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌条件下反应后加入无机盐溶液，析出沉淀后溶于混合溶剂中，加入水合肼，室温搅拌条件下反应后加入无机盐溶液，离心，真空干燥后，重结晶，即得。
在其中一优选实施例中，当A为具有1至10个碳原子的未取代的烷基醇基团时，在进行步骤S2前，还要先进行溴化反应，即：向S1重结晶后的产物加入三溴化磷，室温搅拌条件下反应2～6h(优选4h)。
在其中一优选实施例中，所述回流为在氮气条件下回流，所述回流时间为0.5～5h，优选为2h。
在其中一优选实施例中，S2第一次所述室温搅拌条件下反应2～6h，优选为4h；第二次所述室温搅拌条件下过夜，优选8～12h。
在其中一优选实施例中，六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)与
Figure GDA0002956851290000031
的当量比为1：1～10，优选为1：1～3，更优选为1：1.5。
在其中一优选实施例中，所述A为-CH2OH、-OCH2CH2X、-OCH2CH2CH2CH2X或-OCH2CH2CH2CH2CH2CH2X基团；其中X为卤素。
在其中一优选实施例中，所述卤素为F、Cl、Br或I，更优选为Br。
在其中一优选实施例中，所述无机盐溶液为六氟磷酸钾溶液。
在其中一优选实施例中，所述无机盐溶液为饱和无机盐溶液。本发明中加入过量的饱和无机盐溶液和过量的水合肼。
在其中一优选实施例中，所述反应溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或几种；所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜；所述混合溶剂为乙腈乙醇混合溶剂；乙腈与乙醇的体积比为1：1～5。
本发明还涉及了一种用于检测5-甲酰胞嘧啶的荧光分子探针，包括：所述的钌配合物和/或所述制备方法制得的钌配合物。
所述的钌配合物或所述制备方法制得的钌配合物或所述的荧光分子探针在作为或制备5-甲酰胞嘧啶检测试剂中的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明还涉及了一种采用所述钌配合物或所述制备方法制得的钌配合物或所述荧光分子探针检测5-甲酰胞嘧啶的方法，包括：向缓冲溶液中加入所述钌配合物或荧光分子探针、以及含5-甲酰胞嘧啶的待测样品，在25～37℃下进行孵育处理，对孵育处理后的溶液进行荧光定量检测。
在其中一优选实施例中，所述缓冲溶液为N,N-二甲基乙二胺缓冲溶液，pH＝6.0～7.4。
所述待测样品为双链DNA。在其中一优选实施例中，所述钌配合物或荧光分子探针与含5-甲酰胞嘧啶的待测样品的浓度比为5～10：1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的钌配合物具有良好的荧光响应以及化学稳定性，热力学稳定性好，具有独特的与DNA结合能力、激发态活性，可以对双链DNA中的5fC实现实时检测并且在细胞内进行分布定位，成本低廉、设备要求低，无需对5-甲酰胞嘧啶进行富集，可以直接进行检测，并且适用条件广，条件更为简单，温和，灵敏度高。与已有的化学探针法使用的探针相比，合成步骤少，合成难度更小，稳定性高，而且物料更为廉价，可大为降低成本。
(2)采用本发明的钌配合物检测双链DNA中的5fC检测的方法简单方便、对设备要求低，可直接在体外于温和的缓冲溶液中进行定性和定量检测。与化学富集技术与抗体富集技术相比，本发明无需对5-甲酰胞嘧啶进行富集，可以直接进行检测；并且适用条件广，条件更为简单，温和；在室温下，pH＝6.0～7.4之间都有响应，响应范围广，灵敏度高。
(3)将本发明的钌配合物用于双链DNA中的5fC检测，可以发展到细胞层次上的检测；与亚硫酸氢盐测序法的单碱基分辨技术相比，无需亚硫酸氢盐处理样品，因而不会导致DNA的降解；而且成像方便，分辨率较高。
附图说明
图1为本发明制备的钌配合物Ru-1C的核磁共振氢谱图。
图2为本发明制备的钌配合物Ru-2C的核磁共振氢谱图。
图3为本发明制备的钌配合物Ru-4C的核磁共振氢谱图。
图4为本发明制备的钌配合物Ru-6C的核磁共振氢谱图。
图5为本发明制备的钌配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与dsDNA-5fC结合的凝胶电泳图。
图6为本发明制备的钌配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与dsDNA-5fC结合的荧光光谱图。
图7为本发明制备的钌配合物Ru-2C的细胞成像图。
图8为本发明制备的钌配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与双链DNA中5fC结合的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明的原料：六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)可以直接市购使用，也可按本发明以下方法制备得到：
(1)二氯双(2,2'-联吡啶)合钌(II)的合成
将水合三氯化钌(1equ)、2,2-联吡啶(2equ)和氯化锂(5equ)混合溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下加热回流8小时，冷却室温后加入丙酮，冷冻过夜；抽滤，沉淀用冰水，冷丙酮洗净，真空干燥后得紫黑色微晶，得到二氯双(2,2'-联吡啶)合钌(II)；
(2)六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)的合成
将上述二氯双(2,2’-联吡啶)合钌(II)(1equ)、1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮(1.2equ)溶于无水乙醇中，回流2小时；冷却后加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到黑褐色沉淀，用冰水洗净后真空干燥，即可得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)。
实施例1钌配合物Ru-1C的合成
(1)称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)溶于乙腈(MeCN)中，滴入几滴乙酸；将3,4-二氨基苯甲醇溶于乙腈后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，通过重结晶提纯得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)·(二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪-11-基甲醇)合钌(II)；
(2)将上述提纯后得到的固体六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)·(二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪-11-基甲醇)合钌(II)溶于乙腈中，并加入过量三溴化磷，室温搅拌4小时后加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶提纯得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)·(11-(溴甲基)-二吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)；
(3)将六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)·(11-(溴甲基)-二吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)溶解于DMF中，加入过量碳酸钠，再加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌过夜后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后溶于乙腈乙醇混合溶剂(乙腈与乙醇的体积比为1：2)中，加入过量水合肼(N2H4)，室温搅拌4小时后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后得到终产物钌配合物Ru-1C。
其合成路线如下：
Figure GDA0002956851290000051
图1为上述钌配合物Ru-1C的核磁共振氢谱图。
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ9.70(dd,J＝7.8,4.7Hz,2H),8.56(dd,J＝13.3,8.2Hz,4H),8.50–8.41(m,2H),8.24–8.10(m,5H),8.05(t,J＝7.9Hz,2H),7.98–7.85(m,4H),7.76(d,J＝5.5Hz,2H),7.53–7.46(m,2H),7.34–7.24(m,2H),5.88(s,2H),5.04(s,2H)。
实施例2钌配合物Ru-2C的合成
(1)称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)，溶于DMF中，滴入几滴乙酸；将2-(3,4-二氨基苯氧基)乙基溴(1.5equ)先溶于DMF后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶提纯得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴乙氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)；
(2)随后称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴乙氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)，溶解于DMF中，加入过量碳酸钠，再加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌过夜后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后溶于乙腈乙醇混合溶剂(乙腈与乙醇的体积比为1：2)中，加入过量水合肼，室温搅拌4小时后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后得到最终产物钌配合物Ru-2C。
图2为钌配合物Ru-2C的核磁共振氢谱图。
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ9.65(ddd,J＝11.1,8.3,1.3Hz,2H),8.56(dd,J＝13.4,8.2Hz,4H),8.38(d,J＝9.3Hz,1H),8.21–8.11(m,4H),8.07–8.01(m,2H),7.96–7.86(m,4H),7.84–7.76(m,2H),7.74(d,J＝5.7Hz,2H),7.52–7.46(m,2H),7.32–7.25(m,2H),5.76(s,2H),4.55–4.47(m,2H),4.13–4.06(m,2H)。
实施例3钌配合物Ru-4C的合成
(1)称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)，溶于DMF中，滴入几滴乙酸；将2-(3,4-二氨基苯氧基)丁基溴(1.5equ)先溶于DMF后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶提纯得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴丁氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)；
(2)随后称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴丁氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)，溶解于DMF中，加入过量碳酸钠，再加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌过夜后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后溶于乙腈乙醇混合溶剂(乙腈与乙醇的体积比为1：2)中，加入过量水合肼，室温搅拌4小时后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后得到最终产物钌配合物Ru-4C。
图3为钌配合物Ru-4C的核磁共振氢谱图。
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ9.47(dd,J＝21.6,7.4Hz,2H),8.61–8.48(m,4H),8.20–8.11(m,5H),8.05(t,J＝7.9Hz,2H),7.90(d,J＝5.6Hz,2H),7.84(ddd,J＝13.4,7.6,4.0Hz,2H),7.78(t,J＝6.1Hz,2H),7.62(dd,J＝9.3,2.7Hz,1H),7.51(dt,J＝12.6,6.3Hz,3H),7.32(dd,J＝12.0,5.5Hz,2H),5.45(d,J＝70.4Hz,2H),4.28–4.19(m,2H),3.83–3.55(m,2H),1.96–1.86(m,2H),1.84–1.73(m,2H)。
实施例4钌配合物Ru-6C的合成
(1)称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)，溶于DMF中，滴入几滴乙酸；将2-(3,4-二氨基苯氧基)己基溴(1.5equ)先溶于DMF后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶提纯得到六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴己氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)；
(2)随后称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(11-(2-溴己氧基)-二吡啶[3,2-a:2',3'-c]吩嗪)合钌(II)，溶解于DMF中，加入过量碳酸钠，再加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌过夜后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后溶于乙腈乙醇混合溶剂(乙腈与乙醇的体积比为1：2)中，加入过量水合肼，室温搅拌4小时后，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，重结晶后得到最终产物钌配合物Ru-6C。
图4为钌配合物Ru-6C的核磁共振氢谱图。
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ9.56–9.34(m,2H),8.69–8.48(m,4H),8.23–8.11(m,5H),8.10–8.02(m,2H),7.92–7.88(m,2H),7.88–7.82(m,2H),7.82–7.76(m,2H),7.61–7.55(m,1H),7.56–7.44(m,3H),7.39–7.22(m,2H),4.23–4.09(m,2H),3.73–3.52(m,2H),1.90–1.81(m,2H),1.67–1.39(m,6H)。
上述实施例2～4钌配合物Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C的合成路线如下：
Figure GDA0002956851290000071
实验例1配合物Ru-OCH3的合成
称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)，溶于乙腈中，滴入几滴乙酸；将4-甲氧基邻苯二胺溶于乙腈后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，通过重结晶提纯得到产物配合物Ru-OCH3。
其合成路线如下：
Figure GDA0002956851290000072
实验例2配合物Ru-dppz的合成
称取六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)(1equ)，溶于乙腈中，滴入几滴乙酸；将1,2-苯二胺溶于乙腈后滴入到前面体系中，回流2小时后冷却，加入过量饱和六氟磷酸钾溶液，离心得到橙红色沉淀，真空干燥后，通过重结晶提纯得到产物配合物Ru-dppz。
其合成路线如下：
Figure GDA0002956851290000081
实施例5体外实验
1.钌配合物与双链DNA(dsDNA-5fC)结合实验
实验分为dsDNA-5fC、Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C共6组。
每组加入50mM、pH＝6.0的N,N-二甲基乙二胺缓冲溶液和2μM dsDNA-5fC后，再向体系中各自加入100μM的钌配合物Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C；37℃过夜反应进行孵育处理，向各组反应体系溶液中加入10μL的100mM Na3PO4尿素饱和上样缓冲液，37℃水浴20分钟，再95℃处理3分钟，以15％变性聚丙烯酰胺进行凝胶电泳实验。
图5为钌配合物Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与dsDNA-5fC结合后的凝胶电泳图。实验结果表明与配合物Ru-OCH3相比，钌配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C都能很好的与双链DNA中5fC的位点结合。
2.钌配合物与双链DNA(dsDNA-5fC)结合荧光检测
实验分为dsDNA-5fC、Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C共6组。
每组加入加入50mM、pH＝6.0的N,N-二甲基乙二胺缓冲溶液和10μM dsDNA-5fC后，体系中各自加入100μM的钌配合物Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C。37℃PCR过夜反应进行孵育处理。然后加入1μL糖原、2μL的pH＝8.5的1M的Tris-Cl缓冲液以及无水乙醇后，冷却沉淀，13000r离心，以碱性的80％乙醇洗涤，烘干得固体后配置成溶液进行荧光检测。
图6为钌配合物Ru-OCH3、Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与dsDNA-5fC结合后的荧光光谱图。图6表明，体系中只有dsDNA-5fC时，只有微弱的荧光；与dsDNA-5fC组相比，配合物Ru-OCH3与双链DNA结合后，荧光强度变化不大；而配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与双链DNA结合后，荧光强度大大增强。荧光强度为Ru-4C>Ru-2C>Ru-6C>Ru-1C＞＞Ru-OCH3或dsDNA-5fC。说明配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C能与双链DNA中5fC进行特异性结合。
上述配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C与双链DNA中5fC结合的示意图如图8所示。
实施例6细胞验证实验
实验分为Ru-dppz、Ru-2C共2组：
(1)向每组的多孔培养板内的玻璃盖玻片上长细胞；
(2)在含有1mM CaCl2的PBS中清洗细胞两次(每次5分钟)，以去除培养基；通过抽吸去除溶液；在室温下执行以下步骤时，不要让细胞干燥；
(3)在每个盖玻片中加入200μL 4％PFA于PBS中10分钟以固定细胞；取出固定液，在200μL PBS中冲洗细胞两次(每次5分钟)；
(4)向每个盖玻片中加入200μL 0.4％Triton X-100PBS，持续15分钟，使细胞渗透；取出渗透液，用PBS冲洗细胞两次(每次10分钟)；
(5)向每份盖玻片中加入200μL 4M HCl，持续10分钟，使DNA变性；用pH＝8.5的100mM的Tris–HCl缓冲溶液中和；取出溶液，在200μL pH＝6.4/7.0缓冲液(50M，储存浓度1M)中冲洗细胞三次(每次5分钟)；
(6)各自加入1mL 10μM的Ru-dppz、Ru-2C进行37℃孵育过夜，随后用40％的DMSO洗涤3次，每次洗涤30分钟。
(7)在细胞层次上验证其结合效果，分片后利用共聚焦显微成像技术进行定位检测。
图7为钌配合物Ru-dppz、Ru-2C的细胞成像图(其中Ru-1C、Ru-4C、Ru-6C的细胞成像图未显示)。结果表明，配合物Ru-dppz在成像图里没有荧光信号，说明Ru-dppz不能进入到细胞内，或者不能有效进入细胞，无法较好地对5fC的分布做定位；而与配合物Ru-dppz相比，本发明合成的钌配合物Ru-1C、Ru-2C、Ru-4C、Ru-6C可以成功进入细胞并且与5fC结合，另外能较好地对5fC的分布做定位，实现了在细胞层次内的5fC的分布定位，而且成像方便，分辨率较高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明权利要求书所限定技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种钌配合物，其特征在于，具有如通式(I)所示的结构：
Figure FDA0002947867860000011
其中，R表示-CH2-、-OCH2CH2-、-OCH2CH2CH2CH2-或-OCH2CH2CH2CH2CH2CH2-基团。
2.权利要求1所述钌配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将六氟磷酸二-(2,2'-联吡啶)(1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮)合钌(II)、
Figure FDA0002947867860000012
溶于反应溶剂中，回流，冷却至室温，过滤后加入无机盐溶液，析出沉淀，真空干燥后，重结晶；所述A为-CH2OH、-OCH2CH2X、-OCH2CH2CH2CH2X或-OCH2CH2CH2CH2CH2CH2X基团；其中X为卤素；
S2.将重结晶后的产物溶于有机溶剂中，加入碳酸钠和N-羟基邻苯二甲酰亚胺，室温搅拌条件下反应后加入无机盐溶液，析出沉淀后溶于混合溶剂中，加入水合肼，室温搅拌条件下反应后加入无机盐溶液，离心，真空干燥后，重结晶，即得。
3.根据权利要求2所述钌配合物的制备方法，其特征在于，当A为具有1至10个碳原子的未取代的羟烷基时，在进行步骤S2前，还要先进行溴化反应，即：向S1重结晶后的产物加入三溴化磷，室温搅拌条件下反应2～6h。
4.根据权利要求2所述钌配合物的制备方法，其特征在于，所述无机盐溶液为六氟磷酸钾溶液。
5.根据权利要求2所述钌配合物的制备方法，其特征在于，所述反应溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或几种；所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜；所述混合溶剂为乙腈乙醇混合溶剂；乙腈与乙醇的体积比为1：1～5。
6.一种荧光分子探针，其特征在于，包括：权利要求1所述的钌配合物或权利要求2～5任意一项所述制备方法制得的钌配合物。
7.如权利要求1所述的钌配合物或权利要求2～5任意一项所述制备方法制得的钌配合物或权利要求6所述的荧光分子探针在制备5-甲酰胞嘧啶检测试剂中的应用。
8.一种采用权利要求1所述的钌配合物或权利要求2～5任意一项所述制备方法制得的钌配合物或权利要求6所述荧光分子探针检测5-甲酰胞嘧啶的方法，其特征在于，包括：向缓冲溶液中加入所述钌配合物或荧光分子探针、以及含5-甲酰胞嘧啶的待测样品，在25～37℃下进行孵育处理，对孵育处理后的溶液进行荧光定量检测。
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