CN110997905A

CN110997905A - 用于增殖噬菌体、特别是用于通过益生菌生物递送crispr-cas组分的增殖者细胞和方法

Info

Publication number: CN110997905A
Application number: CN201880051489.1A
Authority: CN
Inventors: J.克卢贝
Original assignee: SNIPR Technologies Ltd
Current assignee: SNIPR Technologies Ltd
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2020-04-10
Also published as: US20240117323A1; JP2020529853A; JP7335227B2; WO2019030257A1; GB201712733D0; US11891629B2; EP3665272A1; JP2023175695A; US20210230559A1

Abstract

本发明提供用于增殖噬菌体和转导颗粒的增殖者细胞和方法。

Description

用于增殖噬菌体、特别是用于通过益生菌生物递送CRISPR- CAS组分的增殖者细胞和方法

背景

噬菌体(bacteriophage) (噬菌体(phage))是感染细菌的病毒门，并且不同于动物和植物病毒。噬菌体可具有“溶菌性”生命周期、可潜在地变成溶菌性的“溶原性”生命周期或“非溶菌性”生命周期。通过溶菌性周期复制的噬菌体导致宿主靶细菌细胞的溶解，作为它们生命周期的正常部分。通过溶原性周期复制的噬菌体被称为温和噬菌体，可通过溶菌性生命周期复制和导致宿主细菌的溶解，或它们可将它们的DNA掺入宿主细菌DNA中并变成非感染性原噬菌体。噬菌体是仅感染它们的特定细菌宿主和在它们的特定细菌宿主内繁殖的细菌病毒。一般在菌株水平、物种水平上或更罕见地在属水平上发现宿主特异性。这种特异性允许使用噬菌体定向靶向危险细菌。除了几个罕见情况外在所有情况下，噬菌体吸附到宿主细胞上是感染过程开始的必要条件。

噬菌体感染和杀死细菌的自然能力，以及噬菌体-细菌相互作用的特异性，是建立噬菌体疗法的概念所依据的基本现象。因此，具有溶菌性生命周期的噬菌体是噬菌体疗法的合适的候选者。作为用于生物控制不需要的病原体、提高特别是新鲜和即食食品的安全性的新方法，在食品生产中使用噬菌体最近已成为食品工业的选择。

国际专利申请号WO 00/69269公开了使用某种噬菌体菌株来治疗由粪肠球菌(Enterococcus faecium)的万古霉素敏感性以及抗性菌株引起的感染，和国际专利申请号WO 01/93904公开了使用单独或与其它抗-微生物方式组合的噬菌体来预防或治疗与梭菌属(Clostridium)的物种有关的胃肠疾病。

美国专利申请号2001/0026795描述了用于生产噬菌体的方法，所述噬菌体经修饰以延迟被宿主防御系统灭活，因此增加噬菌体有效杀死细菌持续的时间。

美国专利申请号2002/0001590公开了使用噬菌体疗法来对抗多重耐药细菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，和国际专利申请号WO 02/07742公开了具有多宿主范围的噬菌体的开发。

使用噬菌体疗法来治疗特定的细菌感染性疾病公开于例如美国专利申请号2002/0044922；2002/0058027和国际专利申请号WO 01/93904。

然而，治疗用途的噬菌体组合物的商业规模生产仍有限。在当前的技术中，噬菌体组合物的滴度低，在实验室规模上通常在10⁹-10¹¹pfu/ml的范围内，和在商业规模上在10⁷-10⁹pfu/ml的范围内，而对于治疗用途通常需要的滴度仍有限。在当前的技术中，噬菌体组合物的滴度低，在实验室规模上通常在10⁹-10¹¹pfu/ml的范围内，和在商业规模上在10⁷-10⁹pfu/ml的范围内，而对于噬菌体疗法通常需要的滴度是10¹²pfu/ml。另外，为了达到需要的滴度，需要非常大体积的液体。

US20160333348描述了使用噬菌体作为载体递送至宿主靶细菌细胞的CRISPR/Cas系统的用途。原则上，噬菌体可使用标准细菌培养技术和设备以一定体积在同源的宿主细胞中生长。然而，这样的噬菌体或溶菌性噬菌体在靶宿主细胞中的生长可受通过常驻噬菌体经由溶解和/或经由CRISPR/Cas靶向宿主DNA进行的宿主细胞杀死，或受由噬菌体核酸编码并且在宿主细胞中有活性的任何其它抗宿主机制或试剂阻碍。

随着噬菌体在工业应用中的使用日益增加，对鉴定的噬菌体的商业数量存在需要。因此，对生产噬菌体的方法存在需要，该方法提供良好的收率滴度和/或减少制造体积。

发明简述

本发明通过提供增殖者细胞来增殖噬菌体，提供了解决方案。为此，本发明提供：

在第一配置中

生产噬菌体群的方法，其中噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述方法包括

(a) 提供在其表面上包含所述受体的第二细胞群，其中所述第二细胞是第二物种或菌株的细胞，其中所述第二物种或菌株不同于第一物种或菌株；

(b) 用所述第一类型的噬菌体感染第二细胞；

(c) 增殖所述第二细胞中的噬菌体，从而生产所述噬菌体群；和

(d) 任选地分离所述群的噬菌体。

在第二配置中

用于增殖噬菌体的细胞(增殖者细胞)，其中所述噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，增殖者细胞在其表面上包含所述受体，其中增殖者细胞是第二物种或菌株的细胞，其中第二物种或菌株不同于第一物种或菌株，由此增殖者细胞能够被所述第一类型的噬菌体感染，以增殖其中的噬菌体。

在第三配置中

根据本发明的增殖者细胞的群，其任选地包含在发酵容器中，以培养增殖者细胞和增殖所述第一类型的噬菌体。

附图简述

图1：图1. 细菌生产菌株(1)经改造以表达被辅助噬菌体识别的受体(2) (行X)，而不含受体的细胞(行Y)用作对照。然后两行均用CGV转化和用辅助噬菌体感染以产生CGC-PLP(3)。仅在携带辅助噬菌体受体的行X中，生产CGV-PLP (4)，其可用于递送DNA至表达噬菌体受体的靶细胞群。

图2. 递送CGV至均表达被CGV-PLP识别的受体的靶细胞ATCC43888 (获自ATCC)或EMG-2 (获自Coli Genetic Stock Center, CGSC)。在携带辅助噬菌体的受体的生产菌株(实心条)或在没有受体的对照菌株(空心条)上生产用于感染的溶解产物。仅其中辅助噬菌体能够感染和产生CGV-PLP的具有受体的生产菌株能够产生能够感染靶细胞群的CGV-PLP溶解产物。

详细描述

本发明认识到人工改变由细菌细胞表达的受体(或根据天然表达的受体的特征选择细胞)的益处，例如在使用可以一定规模培养并且可用于以一定规模(例如商业规模)增殖和生长有用的噬菌体群的细胞方面。这样的噬菌体例如可编码如US20160333348中所述的HM-crRNA或gRNA，所述噬菌体可用于杀死由人类、动物、植物、食品、饮料、化妆品、环境(例如土壤、水道、水库或油回收环境)包含的宿主细菌细胞，例如US20160333348中描述的那些应用，其公开内容通过引用并入本文。

蛋白性受体主要是外膜蛋白；糖部分包括构成细胞壁、菌膜、磷壁酸和LTA的那些。本发明的受体例如选自这些的任何一种。

噬菌体吸附起始感染过程。通过噬菌体的结合蛋白和细菌细胞表面上的受体之间的一系列相互作用，病毒识别潜在敏感的宿主，然后定位自身以进行DNA射出。因此，噬菌体吸附不仅是感染过程的关键步骤，而且还代表了病毒和宿主之间接触的起始点并规定了宿主范围特异性。

噬菌体吸附通常由三个步骤组成：起始接触、可逆结合和不可逆附着(Duckworth1987)。第一步骤包括由布朗运动、分散、扩散或流动引起的噬菌体和宿主之间的随机碰撞(Kokjohn和Miller 1992)。在可逆步骤中，与细菌表面组分的结合不是不可更改的，和噬菌体可从宿主释放。该过程，首次由Garen和Puck (1951)通过洗脱后噬菌体分离的实验观察鉴定，可用于保持噬菌体靠近细胞表面，因为它搜寻特定受体(Kokjohn和Miller 1992)。细菌受体和噬菌体-结合结构域之间的特定联系有时通过酶促裂解介导。该步骤触发其它噬菌体分子的构象重排，其允许插入遗传物质到宿主中(对关于噬菌体基因组射出的机制的进一步的细节，参见Molineux和Panja (2013)的综述)。

大量综述研究突显了在吸附期间噬菌体靶向的广泛范围的宿主相关受体(蛋白、糖和细胞表面结构) (Lindberg 1977; Schwartz 1980; Wright, McConnell和Kanegasaki 1980; Heller 1992; Frost 1993; Henning和Hashemolhosseini 1994;Vinga et al. 2006; Rakhuba et al. 2010; Chaturongakul和Ounjai 2014)。噬菌体识别的宿主细胞受体的性质和位置根据噬菌体和宿主而非常不同。它们从肽序列到多糖部分变化。事实上，已经表明噬菌体结合位于革兰氏阳性(Xia et al. 2011)和革兰氏阴性细菌(Marti et al. 2013)二者的壁中、细菌荚膜或粘液层(Fehmel et al. 1975)中和附属器[例如菌毛(Guerrero-Ferreira et al. 2011)和鞭毛(Shin et al. 2012)]中的受体。涉及的受体和结构的这种多样性显示了噬菌体和宿主为克服它们的配对物采用的进化策略而发展的多种机制。考虑到估计定殖在地球的不同环境的噬菌体的多样性和惊人数量，遇到如此多的可能性不是无法预料的(Clokie et al. 2011)。然而，在所有情况下，迄今为止已表明吸附涉及细菌细胞壁的成分或突出结构。因此在一个实施方案中，本发明中的受体可以是在本段落中或本公开内容他处提及的任何这样的受体。

任选地，受体包含脂多糖(LPS)、庚糖部分、宿主的糖基化细胞壁磷壁酸(WTA)、YueB或由噬菌体的尾丝蛋白或噬菌体的gp21识别的受体。

革兰氏阳性细菌的细胞壁中的受体

肽聚糖或胞壁质是细菌细胞壁的重要组分和通常参与噬菌体吸附。它是一种聚合物，由氨基酸和糖衍生物—N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的多个单元构成。这些糖成分通过糖苷键连接，形成聚糖四肽片，其通过氨基酸的交联连接在一起。交联通过二氨基庚二酸(氨基酸类似物)和D-丙氨酸之间的肽键或通过短的肽间桥发生。这些间桥在革兰氏阳性细菌中数量更多，导致它们的特征性更厚细胞壁。

可参与噬菌体吸附的革兰氏阳性细菌的细胞壁的另一种主要组分是磷壁酸—由甘油磷酸酯或核糖醇磷酸酯和氨基酸构成的多糖。它们与肽聚糖的胞壁酸键合。当磷壁酸与质膜的脂质键合时，它们称为脂磷壁酸(LTA)。细菌的细胞壁的组成的进一步细节可见于Tortora, Funke和Case (2007), Willey, Sherwood和Woolverton (2008), Pommerville(2010)和Madigan et al. (2012)。

迄今为止鉴定的大多数受体与肽聚糖或磷壁酸结构相关(表1)。在表1报告的靶向革兰氏阳性细菌的30种噬菌体中，仅10种利用其它结构进行吸附。在这10种噬菌体中，9种显示与磷壁酸(噬菌体SPP1)或肽聚糖(噬菌体5、13、c2、h、ml3、kh、L和p2)的残基相互作用进行可逆结合。这突出了这些结构在噬菌体吸附到革兰氏阳性细菌方面可起到的重要作用。

任选地，本发明的受体是肽聚糖、胞壁质、磷壁酸或脂磷壁酸(LTA)。任选地，噬菌体是表1所列的科的噬菌体(并且任选地，宿主是用于表1所列的噬菌体的宿主和/或受体是用于表1所列的噬菌体的受体)。任选地，噬菌体是表1所列的噬菌体(并且任选地，宿主是对于表1所列的噬菌体的宿主和/或受体是对于表1所列的噬菌体的受体)。在实施方案中，宿主和第二细胞是革兰氏阳性细胞。任选地，宿主和/或第二细胞是表1所列的物种或菌株的细胞(其中宿主和第二细胞物种或菌株是不同的)。优选地当宿主是革兰氏阳性细菌时，受体是肽聚糖。或者，优选地当宿主是革兰氏阳性细菌时，受体是磷壁酸。

表1:

a - Monteville, Ardestani和Geller (1994)注意到，因为噬菌体还可结合细胞壁中的葡萄糖和半乳糖部分，这些可能在较小程度上参与吸附机制；b - 菌膜是覆盖乳酸乳球菌的细胞表面的保护性多糖层(Chapot-Chartier et al. 2010)。

革兰氏阴性细菌的细胞壁中的受体

在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖层相对薄，和位于外膜(细胞壁的主要组分)的内侧。这两个层通过Braun脂蛋白连接。外膜是一种复杂结构，由装饰有蛋白、多糖和脂质的脂质双层构成；多糖和脂质两种分子形成LPS层。LPS是由三个部分组成的复合物：脂质A、核心多糖和O-多糖。脂质A通常由连接至葡糖胺磷酸酯二糖的脂肪酸构成。核心多糖通过酮脱氧辛酸酯接头连接至脂质A。核心多糖和O-多糖(O-链或O-抗原)含有向外延伸至外膜的数个糖残基单元。含有LPS的所有三种组分的细胞称为光滑(S)型，和缺少O-多糖部分的那些被区分为粗糙(R)型。一般而言，包含O-抗原的糖是高度可变的，和核心多糖的那些在物种中更保守。因此，当与能够吸附至R-型细胞的那些比较时，仅对S-型菌株特异性的噬菌体趋于靶向O-多糖，并因此通常具有更窄的宿主范围(Rakhuba et al. 2010)。

表2(a)汇编了与噬菌体受体-结合蛋白(RBP)相互作用的位于细胞壁中的革兰氏阴性细菌受体。引人关注的是，在大肠杆菌噬菌体中，对于蛋白性或多糖受体没有偏好：一些噬菌体吸附到细胞壁蛋白上，一些吸附到糖部分上和其它要求两种结构进行吸附。在沙门氏菌属(Salmonella)噬菌体的情况下，情景也是如此：一些使用蛋白，一些使用糖部分和一些使用两种类型的受体。另一方面，假单胞菌属(Pseudomonas)噬菌体通常吸附到多糖受体上。尽管从这样小的样品规模不能得出最终结论，但应该注意，假单胞菌属可具有两个LPS部分，即称为A带的短链LPS和较长的B带LPS (Beveridge和Graham 1991)。

任选地，受体是宿主细胞壁蛋白。任选地，受体是糖。任选地，受体包含O-抗原、LPS脂质A或LPS核心多糖。在一个实例中，受体是光滑LPS或粗糙LPS。任选地，宿主细胞是S-型细菌和受体包含宿主的O-抗原。任选地，宿主细胞是R-型细菌和受体包含宿主的LPS脂质A。

在一个实例中，宿主是大肠杆菌和噬菌体是大肠杆菌噬菌体，其中受体是多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，第二细胞经改造以表达大肠杆菌多糖受体和/或大肠杆菌细胞壁蛋白受体，其中大肠杆菌任选地是与宿主细胞相同菌株的大肠杆菌。

在一个实例中，宿主是沙门氏菌属，其中受体是多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，第二细胞经改造以表达沙门氏菌属多糖受体和/或沙门氏菌属细胞壁蛋白受体，其中沙门氏菌属任选地是与宿主细胞相同菌株的沙门氏菌。

在一个实例中，宿主是假单胞菌属，其中受体是多糖受体。在一个实例中，第二细胞经改造以表达假单胞菌属多糖受体，其中假单胞菌属任选地是与宿主细胞相同菌株的假单胞菌属。

任选地，噬菌体是表2所列的科的噬菌体(并且任选地，宿主是用于表2所列的噬菌体的宿主和/或受体是用于表2所列的噬菌体的受体)。任选地，噬菌体是表2所列的噬菌体(并且任选地，宿主是用于表2所列的噬菌体的宿主和/或受体是用于表2所列的噬菌体的受体)。

在实施方案中，宿主和第二细胞是革兰氏阴性细胞。优选地，第二细胞是大肠杆菌细胞。任选地，宿主和/或第二细胞是表2所列的物种或菌株的细胞(其中宿主和第二细胞物种或菌株是不同的)。

在一个实例中，宿主是沙门氏菌属，其中受体是多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，第二细胞经改造以表达沙门氏菌属多糖受体和/或沙门氏菌属细胞壁蛋白受体，其中沙门氏菌属任选地是与宿主细胞相同菌株的沙门氏菌属。

表2(b)报告了噬菌体不仅吸附到细菌表面上，而且还酶促降解O-链结构中的糖部分的情况。应该注意，所有这些噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。

表2

革兰氏阴性细菌的细胞壁中的受体。宿主名称按字母顺序排序。

a - Sukupolvi (1984)表明LPS也是噬菌体Ox2吸附到大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)上所需要的，尽管研究证实分离的OmpA足以失活噬菌体和添加LPS至蛋白不增加结合。

b – 根据Rakhuba et al. (2010)，TonB不是受体本身，而是作为电化学电位传递的介质；Vinga et al. (2006)描述TonB是基因组进入所需的膜蛋白；Letellier et al.(2004)解释了TonB是参与从细胞质膜中的电子转移链到外膜受体的能量转导的蛋白复合物的一部分，并推测其通过其与FhuA的相互作用对于基因组注入可能是关键的。

c - Rhakuba et al. (2010)提及蛋白FhuA和TonB作为T7的受体；Molineux(2001)报道了被描述为革兰氏阴性细菌的细胞质膜和外被膜之间的附着位点的‘Bayer斑块(patch)’是提议的T7受体。

d – 在2010年，同一小组表明，噬菌体吸附到宿主的糖部分上是初始的相互作用，和真受体是蛋白分子或蛋白复合物(Cvirkaite-Krupovic 2010)。

e - Kdo, 2-酮-3-脱氧-辛酮糖酸；Ko, D-甘油-D-塔罗(talo)-辛-2-酮糖酸；Hep, 庚酮糖(酮庚糖)；Glc, 葡萄糖；Gal, 半乳糖；GlcNAc, N-乙酰基葡糖胺(来自Filippov et al. 2011)。

革兰氏阴性细菌的其它结构中的受体

在此章节中讨论了细胞壁部分以外的细菌结构，其也用作噬菌体的受体。这些包括结构例如鞭毛、菌毛和荚膜。它们可见于来自两种革兰氏菌株的物种。例如参见表3。

任选地，本发明的受体是鞭毛、菌毛或荚膜组分(例如，在所列的物种中在表3中所列的组分，或在具有与所列不同的物种的宿主中发现的组分)。任选地，噬菌体是表3所列的科的噬菌体(并且任选地，宿主是用于表3所列的噬菌体的宿主和/或受体是用于表3所列的噬菌体的受体)。任选地，噬菌体是表3所列的噬菌体(并且任选地，宿主是用于表3所列的噬菌体的宿主和/或受体是用于表3所列的噬菌体的受体)。

鞭毛是长且薄的螺旋结构，其赋予细胞运动性。它们由基体、鞭毛钩和鞭毛丝构成，鞭毛丝由鞭毛蛋白的亚基构成(Willey, Sherwood和Woolverton 2008)。表3(a)报告了连接至鞭毛的蛋白的噬菌体。噬菌体附着至丝结构通常是可逆的，和鞭毛的螺旋移动导致噬菌体沿其表面移动，直到它们到达细菌壁。不可逆的吸附然后在鞭毛的基部附近，在位于细菌表面上的受体上发生(Schade, Adler和Ris 1967; Lindberg 1973; Guerrero-Ferreira et al. 2011)。引人关注的是，观察到一些噬菌体(ϕCbK和ϕCb13)含有从它们的衣壳突出的丝，其负责可逆结合到宿主的鞭毛上；不可逆吸附仅当噬菌体的尾与细胞极上的菌毛孔相互作用时发生(Guerrero-Ferreira et al.2011)。因为对于这些噬菌体，即使它们与鞭毛相互作用，不可逆吸附也在菌毛上发生，因此在表3(b)中报告它们，表3(b)关注与菌毛和配对形成结构中的受体相互作用的噬菌体。

菌毛是用于细菌接合的棒形丝状附属器(Lindberg 1973)。它们从供者细胞延伸和连接至受者细胞的壁上的受体。菌毛的去多聚化导致其缩回，使两个细胞彼此更靠近。通过它们表面上的结合蛋白，实现细胞的进一步附着；遗传物质通过这种接合连接而转移(Madigan et al. 2012)。迄今为止，吸附至菌毛结构与属于与有尾噬菌体目(Caudovirales)不同的目的噬菌体相关(表3b)。事实上，根据Frost (1993)，囊状噬菌体科(Cystoviridae)和丝状噬菌体科(Inoviridae)构成了吸附至菌毛结构上的大部分噬菌体。引人关注的是，噬菌体可以对菌毛的某些部分具有选择性。对于F-型噬菌体是这种情况，其吸附仅在菌毛尖端发生(Click和Webster 1998)。在其它噬菌体(例如ϕ6)中，附着发生在该结构的侧面(柄) (Daugelavicius et al. 2005)。

表3

细胞壁结构以外的细菌复合物中的受体。宿主名称按字母顺序排序。

荚膜是柔性的胶粘物质，其从细胞壁径向延伸。它们用作细菌之间和/或细胞和基质之间的结合剂(Beveridge和Graham 1991)。粘液层类似于荚膜，但更容易变形。二者均由细菌释放的粘性物质制成，并且它们的常见组分是多糖或蛋白(Madigan et al. 2012)。噬菌体吸附至荚膜或粘液层通过酶促裂解构成该层的胞外多糖介导。该层的水解是可逆步骤，而不可逆结合通过噬菌体与细胞壁上的受体结合实现(Rakhuba et al. 2010)。如表3(c)可见的，经鉴定具有识别胞外多糖的RBP的几个噬菌体主要具有短尾噬菌体科形态学。

在一个实例中，宿主是沙门氏菌属(例如，肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变种(S enterica Serovar Typhimurium))和受体选自鞭毛、维生素B₁₂摄取外膜蛋白、BtuB和脂多糖相关O-抗原。在一个实例中，受体是鞭毛或BtuB和噬菌体是长尾噬菌体科(Siphoviridae)噬菌体。在一个实例中，受体是LPS的O-抗原和噬菌体是短尾噬菌体科噬菌体。任选地，受体是FliC宿主受体或FljB受体。

任选地，宿主是肠道沙门氏菌(S enterica)或铜绿假单胞菌(P aeruginosa)。任选地，受体是表4所列的宿主的受体。

表4

沙门氏菌属和铜绿假单胞菌噬菌体的特定宿主受体。

已经确立沙门氏菌属O66的O-抗原结构，据报道其与已知的大肠杆菌O166的O-抗原结构的不同之处仅在于一个连键(最可能是O-单元之间的连键)和O-乙酰化。发现沙门氏菌属O66和大肠杆菌O166的O-抗原基因簇具有类似的组构，仅有的例外在于在沙门氏菌属O66中wzy基因被非编码区置换。在大肠杆菌O166中wzy基因的功能通过构建和分析缺失和反式互补突变体证实。提议位于O-抗原基因簇外的功能性wzy基因参与沙门氏菌属O66 O-抗原生物合成，如之前在沙门氏菌属血清型A、B和D1中报道的。沙门氏菌属O66和大肠杆菌O166的O-抗原基因簇之间的相应基因的序列同一性范围从64至70 %，表明它们可能来源于共同的祖先。可能的是，在物种趋异后，沙门氏菌属O66通过失活位于O-抗原基因簇中的wzy基因和获得两个均位于O-抗原基因簇外的新基因(wzy基因和原噬菌体基因，用于O-乙酰基修饰)，获得其特定的O-抗原形式。

在一个实例中，第二细胞经改造以包含可表达的大肠杆菌(例如，大肠杆菌O166)wzy基因。在一个实例中，第二细胞不包含可表达的大肠杆菌(例如，大肠杆菌O166) wzy基因。任选地，宿主细胞是大肠杆菌或沙门氏菌属(例如，沙门氏菌属O66)细胞。

在一个实例中，噬菌体或颗粒包含噬菌体基因组或噬菌粒，例如，其中基因组或噬菌粒包含编码用于靶向宿主细胞基因组或抗生素以杀死宿主细胞的一种或多种目标蛋白或核酸(例如crRNA)的DNA。

在备选方案中，代替细菌，宿主和第二细胞(增殖者细胞)是古细菌细胞和本文涉及细菌的公开内容代替地可理解为经适当修改应用于古细菌。

细菌的靶宿主菌株或物种可包含限制修饰系统(R-M系统)，例如包含限制性内切核酸酶的R-M，其可识别和切割或以其它方式破坏或降解侵入性核酸。宿主DNA通过甲基转移酶的作用得到保护，所述甲基转移酶将宿主DNA甲基化和保护它免于R-M系统。因此，可能需要的是提供第二细菌细胞(增殖者细胞)，其不包含R-M系统或其基因组不含编码由宿主细胞编码的一种或多种限制性内切核酸酶的核酸。另外或备选地，第二细胞包含编码由宿主细胞编码的一种或多种甲基转移酶，任选地所有或基本上所有(例如，至少50、60、70、80或90%)的由宿主细胞编码的所有甲基转移酶的核酸。任选地，第二细胞包含编码由宿主细胞编码的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种(或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)甲基转移酶的核酸。

有利的是，为了产生靶向特定细菌宿主群的噬菌体或转导颗粒，可能有利的是在与靶宿主菌株相关的细菌菌株中产生噬菌体或颗粒，例如以产生可逃避宿主细胞防御机制、例如R-M系统或限制性内切核酸酶作用的噬菌体或颗粒核酸(例如，DNA)。因此任选地，宿主细胞和第二细胞(增殖者细胞)是相同物种的细胞(或物种的相同菌株，只是第二细胞包含在宿主细胞的基因组中不存在的一种或多种基因修饰；这样的修饰可以是一个或多个前间隔区(protospacer)序列的缺失，例如其中宿主细胞包含这样的序列和噬菌体或颗粒表达crRNA，其识别宿主细胞中的该序列以指导Cas和修饰前间隔区序列)。例如，在第二细菌中通过甲基转移酶修饰噬菌体或颗粒的DNA可用于保护DNA免于一旦噬菌体或颗粒随后感染靶宿主细胞时的限制性修饰，其中靶宿主细胞也包含与第二细胞一样的甲基转移酶。通过改变(或选择)根据本发明的第二细胞以展示也在宿主细胞上展示的表面受体，本发明能够在可展示有利的DNA修饰免于随后由靶宿主细菌进行的限制性修饰的菌株中进行噬菌体或颗粒生产。有用的是，(在一个实施方案中)在靶宿主细菌中由噬菌体或颗粒编码的crRNA靶向的前间隔区序列可在第二细菌的基因组中被缺失或天然不存在，使得第二细胞基因组的Cas-介导的切割在生产噬菌体或颗粒期间不发生。

异源甲基转移酶(MTase)可用于赋予生产细菌(本文的增殖者细菌或第二细胞)与靶宿主细菌类似的甲基化模式。参见例如WO2016205276（其通过引用并入本文），例如以提供如何提供包含用于本发明的所需MTase的生产菌株基因组的说明)。在细菌和古细菌中，一些DNA甲基转移酶可根据修饰的位置和它们催化的反应类型而分为三个不同类别。N6-甲基腺嘌呤(m6A)和N4-甲基胞嘧啶(m4C)分别从腺嘌呤和胞嘧啶的氨基部分的甲基化产生，而5-甲基胞嘧啶(m5C)是胞嘧啶的C5位置的甲基化的结果。

可用于本发明的DNA MTase的非限制性实例包括来自噬菌体Φ50的LlaPI，其可经引入以保护免于在乳球菌属(lactococci)中的II型R-M系统(Hill et al. J Bacteriol.173(14):4363-70 (1991))。任选地，生产细菌编码和表达一种或多种DNA修饰酶，其催化腺嘌呤的甲基化，例如，以产生N6-甲基腺嘌呤(m6A)。任选地，生产细菌编码和表达一种或多种DNA修饰酶，其催化胞嘧啶的甲基化，例如，以产生N4-甲基胞嘧啶(m4C)或5-甲基胞嘧啶(m5C)。任选地，生产细菌编码和表达一种或多种DNA修饰酶，其催化腺嘌呤残基的乙酰亚胺化。一些R-M系统对腺嘌呤甲基化敏感。将噬菌体或颗粒DNA中的腺嘌呤残基乙酰亚胺化的多肽将保护DNA免于这样的系统。在生产宿主细菌中可将腺嘌呤残基乙酰亚胺化的多肽的非限制性实例包括来自噬菌体Mu的mom基因和Mu-样原噬菌体序列(参见流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) Rd (FluMu)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)A型菌株Z2491 (Pnmel)和流感嗜血杆菌埃及生物型ATCC 111 16)，其将腺嘌呤残基转化为N(6)-甲基腺嘌呤，从而保护免于腺嘌呤敏感性限制酶。由单独的甲基转移酶提供的甲基化模式可使用建立的DNA测序技术例如Pacbio SMRT测序(O'Loughlin et al. PLoS One.2015:e0118533)评价。一旦产生，生产菌株可用于产生噬菌体颗粒以将DNA递送至靶菌株。

细菌的"限制修饰系统" (R-M系统)包含(1) 在特定序列处将DNA甲基化的甲基转移酶和/或(2) 裂解未甲基化(I、II和III型)或甲基化(IV型)的DNA的限制酶。R-M系统构成细菌防御系统，其中具有外源甲基化模式的DNA在多个位置被R-M系统的限制酶裂解。大多数细菌包含超过一种R-M系统。Roberts, R. J. et al. Nucleic Acids Res . 31 ,1805-1812 (2003)。I型甲基转移酶需要存在相容的特异性蛋白用于功能性。II型和III型甲基转移酶不需要任何另外的蛋白以行使功能。因此，可用于本发明的甲基转移酶和限制酶(作为修饰或抑制的靶标，或作为在生产细菌中表达的异源多肽，从而修饰生产细菌的R-M系统)可包括在细菌限制修饰系统中包含的任何甲基转移酶或限制酶(例如I、II、III或IV型)。因此，在一个实例中，生产细菌(第二或增殖者细胞)的基因组编码也由宿主细菌编码的I型甲基转移酶。另外或备选地，在一个实例中，生产细菌(第二或增殖者细胞)的基因组编码也由宿主细菌编码的II型甲基转移酶。另外或备选地，在一个实例中，生产细菌(第二或增殖者细胞)的基因组编码也由宿主细菌编码的III型甲基转移酶。另外或备选地，在一个实例中，生产细菌(第二或增殖者细胞)的基因组编码也由宿主细菌编码的IV型甲基转移酶。

在一个实例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)编码生产细菌的内源限制修饰系统的酶的核酸序列在活性上被破坏或改变(例如，在活性上降低或消除)。

生产细菌(即，第二细胞或增殖者细胞)可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。因此，例如生产细菌是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enteria)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、李斯特氏菌属(Listeria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或金黄色葡萄球菌细菌。在一个实例中，生产细菌是大肠杆菌菌株MG1655、Nissle、BW25113、BL21、TOP10或MG1655 Δdam Δdcm ΔhsdRMS。

内源R-M系统的酶的活性可使用本领域众所周知或后来开发的用于破坏多肽的功能和活性的方法破坏。这样的方法可包括但不限于产生点突变(例如，单个碱基对的错义或无义或插入或缺失，其导致移码)、插入、缺失和/或截短。在一些实施方案中，多肽抑制剂可用于破坏或抑制细菌限制修饰系统(R-M系统)的酶的活性。这样的多肽抑制剂是本领域已知的。可将多肽抑制剂例如在噬菌体或颗粒DNA内编码和/或作为在噬菌体或颗粒中的蛋白包装。例如，P1噬菌体编码两种多肽抑制剂，其抑制大肠杆菌中发现的I型限制酶(Lobockaet al. J. Bacteriol. 186, 7032-7068 (2004))。在一些实施方案中，内源R-M系统可通过引入多肽抑制剂、刺激宿主甲基化酶的活性以加速递送的DNA的甲基化和保护的多肽而被抑制或破坏。

R-M系统酶的抑制剂包括但不限于降解REase (限制性内切核酸酶)，从而防止宿主R-M酶系统裂解噬菌体或颗粒DNA的蛋白。可用于本发明以破坏或改变内源细菌R-M系统酶的活性的R-M酶抑制剂的非限制性实例包括(a) 来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的orf18，其产生抑制所有主要类型的I型R-M系统的蛋白ArdA；和(b) 来自噬菌体T7的gp0.3，其产生螯合I型R-M酶EcoKI的蛋白Ocr。可用于阻断R-M系统的酶的活性的蛋白的另外的非限制性实例包括掩蔽蛋白。掩蔽蛋白被包装至噬菌体头中，和在DNA注入时结合噬菌体DNA，从而掩蔽R-M识别位点。可用于本发明的掩蔽蛋白的非限制性实例包括DarA和DarB蛋白(Iida et al. Virology. 1 57(1): 156-66 (1987))。这些蛋白在溶菌性周期过程中由P1噬菌体表达和包装至头中。在DNA注入宿主细菌时，它们结合和掩蔽I型R-M识别位点。

此外或在备选方案中，生产细菌的内源R-M系统可通过表达至少一种异源甲基转移酶而被改变/修饰。改变生产宿主细菌的内源甲基化模式使得生产宿主细菌的甲基化模式基本上类似于靶宿主细菌的甲基化模式的任何甲基转移酶可用于本发明。异源甲基转移酶可来自相同或不同的生物，只要它赋予生产宿主细菌基本上类似于靶细菌菌株的甲基化模式。可用于本发明的DNA MTase的非限制性实例包括来自噬菌体Φ50的LlaPI，其可经引入以针对乳球菌中的II型R-M系统提供保护(McGrath et al. Applied EnvironmentalMicrobiology. 65:1891 - 1899 ( 1999))。由单独的甲基转移酶赋予的甲基化模式然后使用建立的DNA测序技术，例如Pacbio SMRT测序(O'Loughlin et al. Pl.oS One. 2015:e0118533)评价。一旦产生，生产菌株用于产生噬菌体或颗粒，以递送DNA至靶宿主菌株。

其它异源DNA修饰酶可在生产细菌中表达，使得生产细菌的R-M系统基本上类似于靶宿主细菌的R-M系统。可用于此目的的这样的DNA修饰酶的实例包括编码转化DNA中的腺嘌呤残基为乙酰胺基腺嘌呤的多肽的那些。转化噬菌体或颗粒DNA中的腺嘌呤残基为乙酰胺基腺嘌呤的多肽将保护DNA免于对腺嘌呤甲基化敏感的限制酶。可在生产细菌中转化DNA中的腺嘌呤残基为乙酰胺基腺嘌呤的多肽的非限制性实例包括来自噬菌体Mu的mom基因和Mu-样原噬菌体序列(参见流感嗜血杆菌Rd (FluMu)、脑膜炎萘瑟氏菌A型菌株Z2491 (Pnme1)和流感嗜血杆菌埃及生物型ATCC 1 1116；(Drozdz et al. Nucleic Acids Res. 40(5):2119-30 (2012))，其转化腺嘌呤残基为N(6)-甲基腺嘌呤，从而针对腺嘌呤敏感性限制酶提供保护。

在一些实施方案中，编码本文所述的多肽抑制剂和其它DNA修饰酶的多核苷酸可直接引入噬菌体或颗粒基因组中，用于保护递送的DNA免于靶宿主细菌的R-M系统。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种通过噬菌体或转导颗粒增加将目标异源核酸引入靶宿主细菌的效率的方法，其包括将至少一种目标异源核酸引入噬菌体或颗粒DNA，然后引入生产细菌，其中生产宿主细菌已被修饰以破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸，从而将所述噬菌体或颗粒DNA甲基化和生产包含具有修饰的甲基化模式的至少一种目标异源核酸的噬菌体或颗粒DNA (与在没有所述改变的甲基化活性的生产细菌中产生的噬菌体或颗粒DNA相比)；生产包含含有至少一种目标异源核酸的所述重组DNA的噬菌体或颗粒；和用所述噬菌体或颗粒感染靶宿主细菌，其中靶宿主细菌具有与生产细菌相同、类似或基本上类似的甲基化模式(或R-M系统)，从而与使用在对照生产细菌(其中对照生产宿主细菌未改变其甲基化活性以与靶宿主细菌相同、类似或基本上类似)中生长的噬菌体引入所述目标异源核酸相比，增加将所述目标异源核酸引入所述靶宿主细菌的效率。在一些方面，在被噬菌体或颗粒感染后，生产细菌可经修饰以改变其R-M系统(例如，破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸)。

在一些实施方案中，提供了一种通过噬菌体或转导颗粒增加将目标异源核酸引入靶宿主细菌的效率的方法，其包括：用包含含有至少一种目标异源核酸的DNA的噬菌体或颗粒感染生产细菌，其中生产细菌通过破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或表达至少一种异源甲基转移酶从而将所述DNA甲基化而具有改变的甲基化活性；生产包含具有修饰的甲基化模式和包含/编码至少一种目标异源核酸的噬菌体或颗粒DNA的噬菌体颗粒；和用所述噬菌体或颗粒感染靶宿主细菌，其中靶宿主细菌具有与生产宿主细菌相同、类似或基本上类似的甲基化模式(或R-M系统)，从而与使用在对照生产细菌(其中对照生产细菌没有改变其甲基化活性以与本文所述的靶宿主细菌相同、类似或基本上类似)中产生的噬菌体或颗粒引入所述目标异源核酸相比，增加将所述目标异源核酸引入所述靶宿主细菌的效率。在一些方面，在被噬菌体或颗粒感染后，生产细菌可经修饰以改变其R-M系统(例如，破坏内源R-M系统的至少一种酶和/或包含编码至少一种异源甲基转移酶的多核苷酸)。

在一个实例中，根据具有基本上类似于生产宿主细菌的限制修饰系统(R-M系统)的DNA甲基化模式，选择靶宿主细菌。

甲基化模式通过细菌中存在的甲基化的类型(例如m4C)以及甲基化的具体序列(例如GmATC)来确定。因此，在甲基化模式之间的相似性水平(其是天然的还是修饰的结果)是指靶位点具有合适类型的甲基化的频率。因此，基本上类似的甲基化模式是指在具有本文所述的合适类型的甲基化的靶位点之间具有至少约20%或更大的相似性(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71 、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大，或其中的任何范围或值)。因此，在一些实施方案中，在宿主和靶细菌之间甲基化模式可具有约20%至99%或更大相似性、约30%至99%或更大%相似性、约40%至99%或更大相似性、约50%至99%或更大相似性、约60%至99%或更大相似性、约70%至99%或更大相似性、约80%至99%或更大相似性、约85%至99%或更大相似性、约90%至99%或更大相似性、或约95%至99%或更大相似性。靶宿主细菌和引入的DNA (已被修饰的噬菌体或颗粒DNA)的甲基化模式之间的基本相似性是指引入的DNA与不共有与靶宿主细菌基本相似的甲基化模式的引入的DNA相比，更少被降解。在一些实施方案中，生产细菌和靶细菌的甲基化模式可相同。

在一些实施方案中，本发明提供噬菌体或颗粒，其包含含有与靶宿主细菌的R-M系统相同、类似或基本上类似的修饰DNA甲基化模式的DNA，其中至少一种目标异源核酸被整合至噬菌体或颗粒DNA (基因组)。因此，例如具有修饰的甲基化模式(其基本上类似于靶宿主细菌的R-M系统)的噬菌体或转导颗粒DNA可包含(1) 编码CRISPR阵列的多核苷酸或(2)II型CRISPR-Cas系统，其包含：(a) 编码Cas9多肽的多核苷酸；(b) 编码CRISPR阵列的多核苷酸；和/或c) tracr核酸。在一些实施方案中，编码CRISPR阵列的多核苷酸(a)和tracr核酸(c)可彼此融合。在另外的实施方案中，具有修饰的甲基化模式(其与靶宿主细菌的R-M系统相同、类似或基本上类似)的噬菌体或颗粒DNA可包含(1) 编码CRISPR阵列的多核苷酸或(2) 重组I型CRISPR-Cas系统，其包含：(a) 编码CRISPR阵列的多核苷酸；和/或(b) 编码一种或多种I型CRISPR多肽的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，至少一种目标异源核酸可在非必需的整合位点或在补充的整合位点，整合至噬菌体或颗粒DNA (例如，基因组)。

如本文使用的，"非必需的位点"是指DNA或基因组中对于维持噬菌体或颗粒基因组、产生噬菌体或颗粒和递送包装的DNA不是必需的位点。因此，噬菌体或颗粒基因组中对于执行这样的功能不是必需的任何位点可用作整合目标核酸的"着陆"位点。一些示例性的非必需的位点包括但不限于(a) 噬菌体编码的限制修饰系统(例如，P1噬菌体中的res/ mod)，(b) 阻断超感染的基因(例如，simABC)，(c) 限制修饰系统的抑制剂(例如，P1噬菌体中的darA)，(d) 插入序列元件(例如，P1噬菌体中的IS1)，(e) 成瘾系统(例如，P1噬菌体中的phd/doc)或(f) 其任何组合。

本文使用的"补充的位点"或"可补充位点"是指噬菌体或颗粒DNA或基因组中对于维持噬菌体或颗粒基因组、产生噬菌体或颗粒和递送包装的DNA所必需，但可通过编码被目标核酸的整合(补充的整合位点)破坏的核酸的补充多核苷酸而补充的必需位点。补充多核苷酸可整合至生产细菌的基因组或它可包含在生产细菌中的质粒上。因此，当目标核酸整合至噬菌体或颗粒DNA的补充的位点时，生产细菌可在质粒上或在其基因组中包含编码噬菌体或颗粒DNA中的补充的位点的补充物的多核苷酸。示例性的补充的位点可包括但不限于(a) 溶菌性周期的激活物(例如，P1噬菌体中的coi)，(b) 溶菌性基因(例如，P1噬菌体中的kilA)，(c) tRNA (例如，P1噬菌体中的tRNAl ,2)，(d) 颗粒组分(例如，P1噬菌体中的cixL和cixR尾丝基因)或(e) 其任何组合。

在实施方案中，生产菌株例如大肠杆菌MG1655或枯草芽孢杆菌168的甲基化模式通过缺失其内源限制修饰系统和引入异源甲基转移酶基因而改变，如下所述。限制修饰基因通过本领域已知的方法鉴定，例如通过在线REBASE数据库(Roberts et al. NucleicAcids Res 43:D298-D299. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkul046)。这些限制修饰系统可使用本领域已知的标准重组策略缺失。一旦缺失，外源甲基转移酶基因在组成型或诱导型启动子的控制下被插入复制性质粒或重组至宿主基因组。这些基因从靶菌株使用天然序列或对生产宿主进行密码子优化的序列直接获得。或者，异源甲基转移酶基因可用于赋予与靶菌株类似的甲基化模式。由单独的甲基转移酶赋予的甲基化模式然后使用建立的DNA测序技术例如PacBio SMRT测序(O'Loughlin et al. PLoS One. 2015:e0118533.)评估。一旦产生，生产菌株用于产生噬菌体或转导颗粒，以递送DNA至靶宿主菌株。

启动子：

启动子可包括例如组成型、诱导型、时间调节、发育调节、化学调节的启动子，用于制备本发明的重组核酸构建体、多核苷酸、表达盒和包含多核苷酸和重组核酸构建体的载体。这些各种类型的启动子是本领域已知的。

因此，在一些实施方案中，本文根据本发明的表达可使用可操作连接至在目标生物中有功能的合适启动子的本发明的重组核酸构建体，用组成型、诱导型、时间调节、发育调节、化学调节的启动子进行。在代表性的实施方案中，使用可操作连接至例如在目标生物中有功能的诱导型启动子的本发明的重组核酸构建体，可使抑制可逆。

启动子的选择根据表达的数量、时间和空间要求以及还根据待转化的宿主细胞而改变。许多不同生物的启动子是本领域众所周知的。根据本领域存在的广泛知识，可为特定的目标宿主生物选择合适的启动子。因此，例如，关于在模型生物中高度组成型表达的基因上游的启动子知之甚多，和在合适时，可在其它系统中容易获得和实施这样的知识。

可用于本发明的示例性的启动子包括在细菌中有功能的启动子。可用于细菌的启动子可包括但不限于L-阿拉伯糖诱导型(araBAD, P _BAD)启动子、任何lac启动子、L-鼠李糖诱导型(rhaP _B AD)启动子、T7 RNA聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(P _L, P _L -9G-50)、无水四环素诱导型(tetA)启动子、trp、lpp、phoA、recA、proU、cst-1、cadA、nar、 lpp-lac、cspA、T7-lac操纵子、T3-lac操纵子、T4基因32、T5-lac操纵子、nprM-lac操纵子、Vhb、蛋白A、棒状杆菌-大肠杆菌样启动子、thr、hom、白喉毒素启动子、sig A、sig B、nusG、 SoxS、katb、α-淀粉酶(Pamy)、Ptms、P43 (包含两个重叠的RNA聚合酶σ因子识别位点，σΑ、σΒ)、Ptms、P43、rplK-rplA、铁氧还蛋白启动子和/或木糖启动子(参见K. Terpe Appl.Microbiol, Biotechnol. 72:211-222 (2006); Hannig et al. Trends inBiotechnology 16:54-60 (1998); 和Srivastava Protein Expr Purif 40:221-229(2005))。

在本发明的一些实施方案中，可使用诱导型启动子。因此例如，化学调节的启动子可用于通过应用外源化学调节剂，在生物中调节基因表达。通过化学调节的启动子调节本发明的核苷酸序列的表达能够仅当例如生物用诱导化学物质处理时才合成本发明的RNA和/或多肽。根据目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中应用化学物质诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中应用化学物质抑制基因表达。在一些方面，启动子还可包括光诱导型启动子，其中应用特定波长的光诱导基因表达(Levskaya et al. 2005. Nature438:441-442)。

声明

以举例说明的方式，本发明提供以下声明。

1. 一种生产噬菌体群的方法，其中噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述方法包括

(a) 提供在其表面上包含所述受体的第二细胞群，其中第二细胞是第二物种或菌株的细胞，其中第二物种或菌株不同于第一物种或菌株；

(b) 用所述第一类型的噬菌体感染第二细胞；

(c) 增殖第二细胞中的噬菌体，从而生产噬菌体群；和

(d) 任选地分离所述群的噬菌体。

优选地，第二细胞是细菌细胞。或者，第二细胞是古细菌细胞、真核细胞、酵母细胞、CHO细胞或HEK293细胞。

在实施方案中，受体包含由可表达的外源核苷酸序列(即，第二细菌的非野生型序列)编码的蛋白，其中外源序列由第二细菌的基因组包含。例如，核苷酸序列与宿主细胞所包含的核苷酸序列相同或与其具有至少85、90、95或98%同一性。

在另一个实施方案中，所述受体包含糖部分，其通过第二细菌中的一种或多种酶的作用生产，其中第二细菌的基因组包含编码一种或多种酶的一个或多个可表达的外源核苷酸序列(即，第二细菌的非野生型序列)。例如，每个核苷酸序列与宿主细胞所包含的核苷酸序列相同或与其具有至少85、90、95或98%同一性。

任选地，第二物种或菌株不天然表达所述受体。宿主和/或第二细胞可以是改造的细胞。宿主和/或第二细胞可以是非天然存在的细菌细胞。宿主和/或第二细胞可以是非野生型细胞。

任选地，宿主细胞包含编码所述受体的可表达的外源核苷酸序列(例如，经染色体整合)。

在备选方案中，代替在步骤(b)中用噬菌体感染第二细胞，噬菌体编码DNA通过其它方式引入第二细胞，例如通过电穿孔。在一个实例中，步骤(c)包括培养第二细胞，例如在培养容器例如钢发酵罐中。

第二细胞包含可操作成复制编码噬菌体的DNA的细胞机器。

在一个实例中，宿主细胞对人类是病原性的(例如，宿主细胞是艰难梭菌(Cdifficile)细胞)和/或第二细胞对人类是非病原性的或是肠共生物种的细胞(例如，第二细胞是乳杆菌属细胞，例如乳酸乳杆菌或罗伊氏乳杆菌细胞)。例如，第二细胞是载体细胞，例如描述于US20160333348 (该特定公开内容通过引用并入本文)。在一个实例中，本发明提供一种治疗或预防人类或动物受试者的宿主细胞感染(例如，受试者的肠的感染)的方法，所述方法包括给予所述第二细胞群至受试者(例如，以定殖在受试者的肠)，其中所述细胞是包含第一类型的所述噬菌体(例如，原噬菌体)的载体细胞，其中噬菌体编码靶向受试者所包含的宿主细胞(例如，受试者的肠所包含的宿主细胞)的前间隔区序列的cRNA或gRNA，其中第二细胞是感染受试者的宿主细胞的噬菌体的载体，其中编码所述crRNA或gRNA的噬菌体核酸在宿主细胞中生产，从而在宿主细胞中形成活性的CRISPR/Cas系统，由此Cas被crRNA或gRNA导向宿主细胞基因组所包含的前间隔区序列，以修饰(例如切割)宿主细胞DNA，从而杀死宿主细胞或抑制宿主细胞生长或增殖，由此治疗或预防感染。在实施方案中，这样的方法用于治疗或预防受试者的疾病或病况，其中所述疾病或病况与宿主细胞感染有关或由宿主细胞感染引起，由此所述疾病或病况得到治疗或预防。宿主细胞和/或第二细胞可以是本文公开的任何这样的细胞。

2. 声明1的方法，其中噬菌体包含编码crRNA (或单一指导RNA)的核苷酸序列，所述crRNA (或单一指导RNA)与在所述宿主细胞菌株或物种的细菌中的Cas (和必要时，tracrRNA)是可操作的，以形成活性的CRISPR/Cas系统，其能够靶向一个或多个前间隔区核苷酸序列，其中每个靶序列由所述宿主细胞的基因组包含，由此crRNA (或gRNA)指导宿主细胞的Cas以修饰(例如切割)靶序列，从而杀死宿主细胞或减少宿主细胞群生长。

在一个实例中，噬菌体包含HM-阵列或gRNA-编码核苷酸序列，如US20160333348中公开的，其特定公开内容通过引用并入本文。

3. 声明2的方法，其中当被噬菌体感染，第二细胞不包含所述活性的CRISPR/Cas系统。

例如，在第二细胞中一种或多种Cas被抑制、失活或敲除，其中第二细胞包含缺陷的CRISPR/Cas系统，其与crRNA或gRNA不是可操作的。

在一个实例中，活性的CRISPR/Cas系统如US20160333348中公开的，其特定公开内容通过引用并入本文。

4. 声明2或3的方法，其中每个第二细菌细胞的基因组不包含所述靶序列。

在一个实例中，靶序列如US20160333348中公开的，其特定公开内容通过引用并入本文。

5. 声明2-4中任一项的方法，其中

(a) 所述第二细胞的Cas (例如，Cas3、9、cpf1和/或CASCADE Cas)与所述crRNA (或gRNA)不是可操作的；

(b) 所述第二细胞的tracrRNA与所述crRNA不是可操作的；和/或

(c) 所述第二细胞不可操作以从所述crRNA-编码核苷酸序列产生所述crRNA (或者不可操作以从所述gRNA-编码核苷酸序列产生所述gRNA)。

6. 声明2-5中任一项的方法，其中crRNA (或gRNA)包含重复序列，其与第二细胞的Cas (例如，第二细胞的Cas3、9、cpf1和/或CASCADE Cas)不是可操作的。

在一个实例中，重复序列如US20160333348中公开的，其特定公开内容通过引用并入本文。

7. 声明2-6中任一项的方法，其中所述噬菌体核苷酸序列与用于在所述宿主物种或菌株的细菌中转录crRNA (或gRNA)，但不在所述第二物种或菌株中转录crRNA (或gRNA)的启动子可操作连接。

在一个实例中，启动子在第二细胞中具有组成型活性。

8. 任何前述声明的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含用于杀死感染宿主细菌的所述第一类型的噬菌体或减少感染宿主细菌的所述第一类型的噬菌体的增殖的抗噬菌体毒素或机制，其中第二细菌不包含所述毒素或机制。

9. 任何前述声明的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含CRISPR/Cas系统，其有活性以杀死感染宿主细菌的所述第一类型的噬菌体或减少感染宿主细菌的所述第一类型的噬菌体的增殖，其中第二细菌不包含所述系统。

10. 任何前述声明的方法，其中第二细菌细胞经改造以产生所述受体，其中所述第二物种或菌株的野生型细菌不产生所述受体。

11. 任何前述声明的方法，其中噬菌体包含复制起点，其在所述第二细胞中和在所述第一物种或菌株的细胞中是可操作的。

12. 任何前述声明的方法，其中第二细胞是大肠杆菌细胞。

例如，第二细胞对人类不是病原性的。例如，第二细胞是危险组1或2细胞(例如，本文的表中组2所述的物种的细胞)。

13. 任何前述声明的方法，其中第一和第二细胞是相同物种的细胞(例如，大肠杆菌菌株)。

例如，第二细胞是改造版本的宿主细胞，例如，其中第二细胞包含本文所述的缺陷的CRISPR/Cas系统和/或不包含所述前间隔区序列和/或不表达由宿主细胞表达的毒素。

14. 声明13的方法，其中宿主细胞的菌株是人类病原性菌株(例如，艰难梭菌)和第二细胞菌株不是人类病原性菌株(例如，乳杆菌属，例如罗伊氏乳杆菌或乳酸乳杆菌)。

15. 任何前述声明的方法，其中与宿主物种或菌株(例如，危险组3或4)的细胞相比，第二细胞是较低危险类别(例如，危险组1或2)的细胞。见表5和6。

16. 任何前述声明的方法，其中所述受体选自脂多糖、磷壁酸(例如，ManNAc(β1→4)GlcNAc二糖，具有连接至ManNAc残基的C4羟基的1-3个甘油磷酸酯，后接甘油或核糖醇磷酸酯重复单元的长链)、蛋白和鞭毛。

17. 任何前述声明的方法，其中所述受体包含宿主细胞的O-抗原。

18. 任何前述声明的方法，其中噬菌体是可操作的以在第二细胞中表达内溶素或穴蛋白，例如，当噬菌体在第二细胞中复制时。

19. 一种用于增殖噬菌体的细胞(增殖者细胞)，其中噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，增殖者细胞在其表面上包含所述受体，其中增殖者细胞是第二物种或菌株的细胞，其中第二物种或菌株不同于第一物种或菌株，由此增殖者细胞能够被所述第一类型的噬菌体感染，以在其中增殖噬菌体。

在一个实例中，增殖者细胞(本发明的方法中的第二细胞)的基因组包含编码所述受体的外源核苷酸序列，其中所述细胞的物种或菌株的野生型细胞不包含所述核苷酸序列。

20. 声明19的增殖者细胞，其中所述受体包含由增殖者细胞的基因组所包含的可表达的核苷酸序列编码的蛋白，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

21. 声明19的增殖者细胞，其中所述受体包含糖部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

22. 声明19的增殖者细胞，其中所述受体包含磷壁酸部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

23. 声明22的增殖者细胞，其中所述酶选自TarO、TarA、TarB、TarF、TarK和TarL(或由宿主细胞和/或第二细胞表达的其同源物)。

24. 声明19-23中任一项的增殖者细胞，其与所述第一类型的噬菌体组合。

25. 声明19-24中任一项的增殖者细胞，其中所述细胞包含一种或多种所述第一类型的原噬菌体(例如，在增殖者细胞中经染色体整合)。

26. 声明19-25中任一项的增殖者细胞，其中所述增殖者细胞是革兰氏阴性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

27. 声明19-25中任一项的增殖者细胞，其中所述增殖者细胞是革兰氏阳性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。

28. 根据声明19-27中任一项的增殖者细胞的群，其任选地包含在发酵容器中，用于培养增殖者细胞和增殖所述第一类型的噬菌体。

29. 声明19-28中任一项的增殖者细胞或群，其中每个增殖者细胞是声明1-18中任一项定义的第二细胞。

30. 声明19-28中任一项的增殖者细胞或群，其中每个宿主细胞是声明1-18中任一项定义的宿主细胞。

31. 声明19-28中任一项的增殖者细胞或群，其中噬菌体是声明1-18中任一项定义的噬菌体。

32. 一种治疗或预防人类或动物受试者的疾病或病况的方法，所述疾病或病况由受试者包含(例如，由受试者的肠包含)的宿主细胞介导，所述方法包括给予增殖者细胞至受试者(例如，以定殖在受试者的肠)，其中所述增殖者细胞是根据声明19-31中任一项的细胞，其中所述增殖者细胞产生噬菌体和噬菌体感染患者中(例如，其肠中)的宿主细胞，从而在受试者中杀死宿主细胞或抑制宿主细胞的生长或增殖，由此治疗或预防所述疾病或病况。

33. 声明32的方法，其中所述增殖者细胞是乳杆菌属(例如罗伊氏乳杆菌)细胞。

34. 声明32或33的方法，其中所述噬菌体编码抗宿主细胞crRNA或gRNA，其指导宿主细胞中的Cas以修饰(例如，切割)宿主细胞DNA，从而实现所述杀死或抑制。

概念

本发明还提供以下概念：

1. 一种生产噬菌体群的方法，其中所述噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述方法包括

(a) 提供在其表面上包含所述受体的第二细菌细胞群，其中所述第二细胞是第二物种或菌株的细胞，其中所述第二物种或菌株不同于所述第一物种或菌株；

(b) 用所述第一类型的噬菌体感染所述第二细胞；

(d) 任选地分离所述群的噬菌体。

2. 一种生产转导颗粒群的方法，所述颗粒包含由噬菌体外壳蛋白包装的核酸，其中所述颗粒能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，由此宿主细胞被所述核酸转导，所述方法包括

(a) 提供在其表面上包含所述受体的第二细菌细胞群，其中所述第二细胞是第二物种或菌株的细胞，其中所述第二物种或菌株不同于所述第一物种或菌株，和其中所述第二细胞包含能够生产所述核酸的拷贝的DNA；

(b) 通过结合噬菌体至由第二细菌细胞所包含的受体，用噬菌体感染第二细胞；

(c) 增殖所述第二细胞中的噬菌体，其中生产包装所述核酸的拷贝的噬菌体外壳蛋白，从而生产所述颗粒群；和

(d) 任选地分离所述群的颗粒。

在一个实例中，颗粒包含的核酸是DNA。在一个实例中，核酸是RNA。在一个实例中，在步骤(b)中用于感染第二细胞的噬菌体是辅助噬菌体，任选地其不同于转导颗粒(当转导颗粒是噬菌体时)。任选地，辅助噬菌体对于在第二细胞中自我复制是缺陷的。

例如，第二细胞包含的DNA由每个第二细胞的染色体DNA包含。在另一个实例中，DNA由每个第二细胞包含的一个或多个附加体(例如，质粒)包含。

“转导颗粒”可以是噬菌体或小于噬菌体，并且是能够转导核酸(例如，编码抗生素或其组分，例如CRISPR阵列)至宿主细菌细胞的颗粒。

颗粒包含由步骤(b)中使用的噬菌体编码的噬菌体外壳蛋白和任选其它噬菌体结构蛋白。结构蛋白的实例是噬菌体蛋白，其选自主要头和尾蛋白、入口蛋白、尾丝蛋白和次要尾蛋白的一种、多种或全部。

颗粒包含核酸(例如，DNA，例如编码阵列或抗生素的DNA)，其中核酸包含包装信号序列，其与步骤(b)的噬菌体编码的蛋白是可操作的，以包装核酸或其拷贝至能够感染宿主细胞的转导颗粒中。

在一个实例中，每个转导颗粒是非自我复制性转导颗粒。“非自我复制性转导颗粒”是指颗粒(例如，噬菌体或噬菌体样颗粒；或从基因组岛(例如，金黄色葡萄球菌病原性岛(SaPI))或其修饰形式产生的颗粒)，其能够递送颗粒的核酸分子(例如，编码抗细菌剂或组分)至细菌细胞，但不包装其自身复制的基因组至转导颗粒。

任选地，每个颗粒的核酸包含修饰的基因组岛。任选地，基因组岛是天然存在于宿主物种或菌株的细菌细胞中的岛。在一个实例中，基因组岛选自SaPI、SaPI1、SaPI2、SaPIbov1和SaPibov2基因组岛。任选地，每个颗粒的核酸包含修饰的病原性岛。任选地，病原性岛是天然存在于第一物种或菌株的细菌细胞中的岛，例如，葡萄球菌属SaPI或弧菌属PLE或铜绿假单胞菌病原性岛(例如，PAPI或PAGI，例如，PAPI-1、PAGI-5、PAGI-6、PAGI-7、PAGI-8、PAGI-9或PAGI-10)。任选地，病原性岛是SaPI (金黄色葡萄球菌病原性岛)。

任选地，转导颗粒核酸的转录在诱导型启动子的控制下，用于在宿主细胞中转录抗细菌剂或组分或阵列的拷贝。这可用于例如控制打开抗细菌活性或产生抗宿主细胞crRNA，用于对抗靶细菌细胞，例如在环境(例如，土壤或水)中或在含有靶细胞的工业培养或发酵容器中的靶细菌细胞。例如，宿主细胞可用于工业过程(例如，用于发酵，例如，在酿造或乳品工业)，和诱导使得能够通过使用针对宿主细菌的抗细菌剂或crRNA控制(例如，停止或减少)该过程。

3. 概念2的方法，其中所述颗粒是非复制性转导颗粒或噬菌体。

4. 任一项前述概念的方法，其中所述噬菌体或颗粒包含编码crRNA (或单一指导RNA)的核苷酸序列，所述crRNA (或单一指导RNA)与所述宿主细胞菌株或物种的细菌中的Cas是可操作的，以形成活性的CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统能够靶向一个或多个前间隔区核苷酸序列，其中每个靶序列由所述宿主细胞的基因组所包含，由此所述crRNA(或gRNA)指导宿主细胞中的Cas以修饰(任选地切割)所述靶序列，从而杀死宿主细胞或减少宿主细胞群生长。

5. 概念4的方法，其中当被噬菌体感染，第二细胞不包含所述活性的CRISPR/Cas系统。

6. 概念4或5的方法，其中每个第二细菌细胞的基因组不包含所述靶序列。

7. 概念4-6中任一项的方法，其中

(a) 所述第二细胞的Cas (任选地Cas3、9、cpf1和/或CASCADE Cas)与所述crRNA (或gRNA)不是可操作的；

(b) 所述第二细胞的tracrRNA与所述crRNA不是可操作的；和/或

8. 概念4-7中任一项的方法，其中所述crRNA (或gRNA)包含与第二细胞的Cas(任选地第二细胞的Cas3、9、cpf1和/或CASCADE Cas)不是可操作的重复序列。

9. 概念4-8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列与用于在所述宿主物种或菌株的细菌中转录crRNA (或gRNA)，但不在所述第二物种或菌株中转录crRNA (或gRNA)的启动子可操作连接。

10. 任一项前述概念的方法，其中

(a) 所述噬菌体或颗粒包含编码crRNA (或单一指导RNA)的核苷酸序列，所述crRNA(或单一指导RNA)与所述宿主细胞菌株或物种的细菌中的Cas是可操作的，以形成活性的CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统能够靶向一个或多个前间隔区核苷酸序列，其中每个靶序列由所述宿主细胞的基因组所包含，由此所述crRNA (或gRNA)指导宿主细胞中的Cas以修饰(任选地切割)靶序列，从而杀死宿主细胞或减少宿主细胞群生长；

(b) 宿主和第二细胞是相同物种的细胞(任选地大肠杆菌菌株)；和

(c) 每个第二细菌细胞的基因组不包含所述靶序列，其中第一和第二细胞是相同物种的不同菌株。

11. 任一项前述概念的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含用于杀死所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒或者减少所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒的增殖的抗噬菌体毒素或机制，其中第二细菌不包含所述毒素或机制。

12. 任一项前述概念的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含CRISPR/Cas系统，其有活性以杀死所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒或者减少所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒的增殖，其中第二细菌不包含所述系统。

13. 任一项前述概念的方法，其中第二细菌细胞经改造以产生所述受体，其中所述第二物种或菌株的野生型细菌不产生所述受体。

14. 任一项前述概念的方法，其中所述噬菌体或颗粒包含在所述第二细胞中和在所述第一物种或菌株的细胞中是可操作的复制起点。

15. 任一项前述概念的方法，其中第二细胞是大肠杆菌细胞。

16. 任一项前述概念的方法，其中第一和第二细胞是相同物种的细胞(任选地大肠杆菌菌株)。

17. 概念16的方法，其中宿主细胞的菌株是人类病原性菌株和第二细胞菌株不是人类病原性菌株。

18. 任一项前述概念的方法，其中与宿主物种或菌株(任选地危险组3或4)的细胞相比，第二细胞是较低危险类别(任选地危险组1或2)的细胞。

19. 任一项前述概念的方法，其中所述受体选自脂多糖、磷壁酸(任选地ManNAc(β1→4)GlcNAc二糖，具有连接至ManNAc残基的C4羟基的1-3个甘油磷酸酯，后接甘油或核糖醇磷酸酯重复单元的长链)、蛋白和鞭毛。

20. 任一项前述概念的方法，其中所述受体包含宿主细胞的O-抗原。

21. 任一项前述概念的方法，其中所述噬菌体或颗粒是可操作的以在第二细胞中表达内溶素或穴蛋白，任选地当噬菌体或颗粒在第二细胞中复制时。

22. 用于增殖包含被噬菌体外壳蛋白包装的核酸的转导颗粒或噬菌体的细胞(增殖者细胞)，其中所述噬菌体或颗粒是第一类型的噬菌体或颗粒，其能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述增殖者细胞在其表面上包含所述受体，其中所述增殖者细胞是第二物种或菌株的细胞，其中第二物种或菌株不同于第一物种或菌株，由此所述增殖者细胞能够被所述第一类型的噬菌体或所述颗粒感染，以在其中分别增殖噬菌体或颗粒。

23. 概念22的增殖者细胞，其中所述受体包含由增殖者细胞的基因组所包含的可表达的核苷酸序列编码的蛋白，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

24. 概念22的增殖者细胞，其中所述受体包含糖部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

25. 概念22的增殖者细胞，其中所述受体包含磷壁酸部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

26. 概念25的增殖者细胞，其中所述酶选自TarO、TarA、TarB、TarF、TarK和TarL(或由宿主细胞和/或第二细胞表达的其同源物)。

27. 概念22-26中任一项的增殖者细胞，其与所述第一类型的噬菌体或所述转导颗粒组合。

28. 概念22-27中任一项的增殖者细胞，其中所述细胞包含一种或多种所述第一类型的原噬菌体(任选地在增殖者细胞中染色体整合)或能够生产转导颗粒的所述核酸的拷贝的DNA (任选地在增殖者细胞中染色体整合)。

29. 概念22-28中任一项的增殖者细胞，其中增殖者细胞是革兰氏阴性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

30. 概念22-28中任一项的增殖者细胞，其中增殖者细胞是革兰氏阳性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。

31. 根据概念22-30中任一项的增殖者细胞的群，其任选地包含在发酵容器中用于培养增殖者细胞和增殖所述第一类型的噬菌体或所述转导颗粒。

32. 概念22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中每个增殖者细胞是概念1-21中任一项定义的第二细胞。

33. 概念22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中每个宿主细胞是概念1-21中任一项定义的宿主细胞。

34. 概念22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中噬菌体或颗粒是概念1-21中任一项定义的噬菌体或颗粒。

35. 治疗或预防人类或动物受试者的疾病或病况的方法，所述疾病或病况由受试者包含(任选地由受试者的肠包含)的宿主细胞介导，所述方法包括给予增殖者细胞至受试者(任选地定殖在受试者的肠)，其中增殖者细胞是根据概念22-34中任一项的细胞，其中增殖者细胞产生噬菌体或转导颗粒，和噬菌体或颗粒分别感染患者(任选地在其肠中)的宿主细胞，从而在受试者中杀死宿主细胞或抑制宿主细胞的生长或增殖，由此治疗或预防所述疾病或病况。

36. 概念35的方法，其中增殖者细胞是乳杆菌属(Lactobacillus) (任选地罗伊氏乳杆菌(L reuteri))细胞。

37. 概念35或36的方法，其中所述噬菌体编码抗宿主细胞crRNA或gRNA，所述crRNA或gRNA指导宿主细胞中的Cas以修饰(任选地切割)宿主细胞DNA，从而实现所述杀死或抑制。

实施例1：改造生产菌株以变得对辅助噬菌体易感

概述：

我们改造了细菌的生产菌株(在该情况下为大肠杆菌生产菌株)以表达噬菌体受体，其赋予菌株对辅助噬菌体感染的易感性。生产细菌携带含有CRISPR阵列和噬菌体包装位点的载体，使得所述载体可在已被辅助噬菌体感染的细胞中包装(但在未如此感染的细胞中不包装)，从而能够利用细菌作为编码crRNA的噬菌体样颗粒的生产菌株。我们进一步表明，由这样的生产菌株产生的溶解产物含有噬菌体样颗粒，其可用于递送CRISPR阵列到其它相关的大肠杆菌目标群。此处我们将该载体称为CRISPR Guided Vectors (CGVs™)。

有利地，为了产生靶向特定细菌群的带有CGV的噬菌体样颗粒(CGV-PLP)，可能有利的是在与靶菌株相关的菌株中产生CGV-PLP，例如以产生在靶菌株中避免宿主防御机制的CGV-PLP。例如，在生产细菌中通过甲基转移酶修饰CGV-PLP的DNA可用于保护DNA免于一旦PLP随后感染靶细胞时的限制性修饰，其中生产和靶细菌的物种或菌株是相同的或密切相关的(或以任何比率包含共同的甲基转移酶)。通过改变根据本发明的生产菌株以展示表面受体，本发明能够在可展示有利的DNA修饰免于随后通过靶细菌的限制性修饰的菌株中进行PLP生产。有用的是，在靶细菌中PLP的crRNA靶向的前间隔区序列可在生产细菌的基因组中被缺失或天然不存在，使得生产细菌基因组的Cas-介导的切割在生产PLP期间不发生。

方法和结果：

作为生产菌株，我们使用了用表达用于辅助噬菌体M13KO7的受体的质粒转化的大肠杆菌菌株MG1655 (图1_X)，而未接受该受体的菌株行(图1_Y)用作对照。该受体是从获自NewEngland Biolabs的质粒pCJ105表达的F-菌毛。两种菌株均用CGV转化(图1_3)和用辅助噬菌体M13KO7感染用于生产CGV-PLP。

在行X中，CGV-PLP溶解产物由于存在受体而产生，而在行Y中没有产生溶解产物(图1_4)。显示得到的溶解产物能够递送CGV至与生产菌株相关和携带噬菌体受体的不同目标群(图1_5和图2)。对照菌株行没有产生能够递送CGV至目标群的CGV-PLP (图2)。

表5：危险组

表6：批准的生物学媒介列表(HSE分类)

表7：细菌实例

任选地，宿主细胞选自该表和/或第二细胞选自该表(其中宿主和第二细胞是不同物种的细胞；或相同物种的细胞，但是不同菌株或宿主细胞被改造但第二细胞是野生型或反之亦然)。

参考文献

1.Ainsworth S Sadovskaya I Vinogradov Eet al Differences in lactococcalcell wall polysaccharide structure are major determining factors inbacteriophage sensitivity mBio 2014 5 e0088014

2.Bae H Cho Y Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosapodophage MPK7, which requires type IV pili for infection Genome Announc 20131 1

3. Baptista C Santos MA São-José C Phage SPP1 reversible adsorption toBacillus subtilis cell wall teichoic acids accelerates virus recognition ofmembrane receptor YueB J Bacteriol 2008 190 498996

4.Bebeacua C Tremblay D Farenc Cet al Structure, adsorption to host, andinfection mechanism of virulent Lactococcal phage p2 J Virol 2013 87 1230212

5.Beveridge TJ Graham LL Surface layers of bacteria Microbiol Rev 1991 55684705

6.Black PN The fadL gene product of Escherichia coli is an outer membraneprotein required for uptake of long-chain fatty acids and involved insensitivity to bacteriophage T2 J Bacteriol 1988 170 28504

7.Bradbeer C Woodrow ML Khalifah LI Transport of vitamin B12 inEscherichia coli: common receptor system for vitamin B12 and bacteriophageBF23 on the outer membrane of the cell envelope J Bacteriol 1976 125 10329

8.Braun V Schaller K Wolff H A common receptor protein for phage T5 andcolicin M in the outer membrane of Escherichia coli B Biochim Biophys Acta1973 323 8797

9.Braun V Wolff H Characterization of the receptor protein for phage T5and colicin M in the outer membrane of E. coli B FEBS Lett 1973 34 7780

10.Budzik JM Rosche WA Rietsch Aet al Isolation and characterization of ageneralized transducing phage for Pseudomonas aeruginosa strains PAO1 andPA14 J Bacteriol 2004 186 32703

11.Caro LG Schnos M The attachment of the male-specific bacteriophage F1to sensitive strains of Escherichia coli P Natl Acad Sci USA 1966 56 12632

12.Chapot-Chartier M-P Vinogradov E Sadovskaya Iet al Cell surface ofLactococcus lactis is covered by a protective polysaccharide pellicle J BiolChem 2010 285 1046471

13.Chatterjee S Rothenberg E Interaction of bacteriophage λ with its E.coli receptor, LamB Viruses 2012 4 316278

14.Chaturongakul S Ounjai P Phage–host interplay: examples from tailedphages and Gram-negative bacterial pathogens Front Microbiol 2014 5 18

15.Choi Y Shin H Lee J-Het al Identification and characterization of anovel flagellum-dependent Salmonella-infecting bacteriophage, iEPS5 ApplEnviron Microb 2013 79 482937

16.Click EM Webster RE The TolQRA proteins are required for membraneinsertion of the major capsid protein of the filamentous phage f1 duringinfection J Bacteriol 1998 180 17238

17.Clokie MRJ Millard AD Letarov AVet al Phages in nature Bacteriophage2011 1 3145

18.Cvirkaite-Krupovic V Entry of the membrane-containing bacteriophagesinto their hosts Ph.D. Dissertation 2010 University of Helsinki

19.Datta DB Arden B Henning U Major proteins of the Escherichia coliouter cell envelope membrane as bacteriophage receptors J Bacteriol 1977 1318219

20.Daugelavicius R Bamford JKH Grahn AMet al The IncP plasmid-encodedcell envelope-associated DNA transfer complex increases cell permeability JBacteriol 1997 179 5195202

21.Daugelavicius R Cvirkaite V Gaidelyte Aet al Penetration of envelopeddouble-stranded RNA bacteriophages ϕ13 and ϕ6 into Pseudomonas syringaecells J Virol 2005 79 501726

22.Davison S Couture-Tosi E Candela Tet al Identification of the Bacillusanthracis γ phage receptor J Bacteriol 2005 187 67429

23.Douglas JL Wolin MJ Cell wall polymers and phage lysis ofLactobacillus plantarum Biochemistry 1971 10 15515

24.Duckworth DH History and basic properties of bacterial viruses GoyalSM Gerba CP Bitton G Phage Ecology New York John Wiley & Sons 1987 143

25.Edwards P Smit J A transducing bacteriophage for Caulobactercrescentus uses the paracrystalline surface layer protein as a receptor JBacteriol 1991 173 556872

26.Fehmel F Feige U Niemann Het al Escherichia coli capsulebacteriophages VII. Bacteriophage 29-host capsular polysaccharideinteractions J Virol 1975 16 591601

27.Feige U Stirm S On the structure of the Escherichia coli C cell walllipopolysaccharide core and on its ϕX174 receptor region Biochem Bioph ResCo 1976 71 56673

28.Filippov AA Sergueev KV He Yet al Bacteriophage-resistant mutants inYersinia pestis: identification of phage receptors and attenuation for micePLoS One 2011 6 e25486

29.Frost L Conjugative pili and pilus-specific phages Clewell DBBacterial Conjugation New York Plenum Press 1993 189222

30.Gaidelyte A Cvirkaite-Krupovic V Daugelavicius Ret al The entrymechanism of membrane-containing phage Bam35 infecting Bacillus thuringiensisJ Bacteriol 2006 188 592534

31.Garbe J Bunk B Rohde Met al Sequencing and characterization ofPseudomonas aeruginosa phage JG004 BMC Microbiol 2011 11 102

32.Garen A Puck TT The first two steps of the invasion of host cells bybacterial viruses J Exp Med 1951 94 17789

33.German GJ Misra R The TolC protein of Escherichia coli serves as acell-surface receptor for the newly characterized TLS bacteriophage J MolBiol 2001 308 57985

34.Ghannad MS Mohammadi A Bacteriophage: time to re-evaluate thepotential of phage therapy as a promising agent to control multidrug-resistant bacteria Iran J Basic Med Sci 2012 15 693701

35.Goldberg E Grinius L Letellier L Recognition, attachment and injectionKaram JD Molecular Biology of Bacteriophage T4 Washington American Societyfor Microbiology 1994 34756

36.Guerrero-Ferreira RC Viollier PH Ely Bet al Alternative mechanism forbacteriophage adsorption to the motile bacterium Caulobacter crescentus PNatl Acad Sci USA 2011 108 99638

37.Hancock REW Braun V Nature of the energy requirement for theirreversible adsorption of bacteriophages T1 and ϕ80 to Escherichia coli JBacteriol 1976 125 40915

38.Hantke K Major outer membrane proteins of E. coli K12 serve asreceptors for the phages T2 (Protein Ia) and 434 (Protein Ib) Mol Gen Genet1978 164 1315

39.Hantke K Braun V Membrane receptor dependent iron transport inEscherichia coli FEBS Lett 1975 49 3015

40.Hantke K Braun V Functional interaction of the tonA/tonB receptorsystem in Escherichia coli J Bacteriol 1978 135 1907

41.Hashemolhosseini S Holmes Z Mutschler Bet al Alterations of receptorspecificities of coliphages of the T2 family J Mol Biol 1994 240 10510

42.Heller KJ Identification of the phage gene for host receptorspecificity by analyzing hybrid phages of T5 and BF23 Virology 1984 139 1121

43.Heller KJ Molecular interaction between bacteriophage and the gram-negativecell envelope Arch Microbiol 1992 158 23548

44.Heller K Braun V Polymannose O-antigens of Escherichia coli, thebindingsites for the reversible adsorption of bacteriophage T5+ via the L-shaped tail fibers J Virol 1982 41 2227

45.Henning U Hashemolhosseini S Receptor recognition by T-even-typecoliphages Karam JD Molecular Biology of Bacteriophage T4 Washington AmericanSociety for Microbiology 1994 2918

46.Heo Y-J Chung I-Y Choi KBet al Genome sequence comparison andsuperinfection between two related Pseudomonas aeruginosa phages, D3112 andMP22 Microbiology 2007 153 288595

47.Ho TD Slauch JM OmpC is the receptor for Gifsy-1 and Gifsy-2bacteriophages of Salmonella J Bacteriol 2001 183 14958

48.Hyman P Abedon ST Bacteriophage host range and bacterial resistanceLaskin AI Sariaslani S Gadd GM Advances in Applied Microbiology Vol.70 SanDiego Elsevier Inc. 2010 21748

49.Iwashita S Kanegasaki S Smooth specific phage adsorption:endorhamnosidase activity of tail parts of P22 Biochem Bioph Res Co 1973 554039

50.Iwashita S Kanegasaki S Deacetylation reaction catalyzed by Salmonellaphage c341 and its baseplate parts J Biol Chem 1976 251 53615

51.Jarrell KF Kropinski AMB Isolation and characterization of abacteriophage specific for the lipopolysaccharide of rough derivatives ofPseudomonas aeruginosa strain PAO J Virol 1981 38 52938

52.Kaneko J Narita-Yamada S Wakabayashi Yet al Identification of ORF636in phage ϕSLT carrying panton-valentine leukocidin genes, acting as anadhesion protein for a poly(glycerophosphate) chain of lipoteichoic acid onthe cell surface of Staphylococcus aureus J Bacteriol 2009 191 467480

53.Killmann H Braun M Herrmann Cet al FhuA barrel-cork hybrids are activetransporters and receptors J Bacteriol 2001 183 347687

54.Kim M Ryu S Spontaneous and transient defence against bacteriophage byphase-variable glucosylation of O-antigen in Salmonella enterica serovarTyphimurium Mol Microbiol 2012 86 41125

55.Kivela HM Madonna S Krupovic Met al Genetics for Pseudoalteromonasprovides tools to manipulate marine bacterial virus PM2 J Bacteriol 2008 1901298307

56.Kokjohn TA Miller RV Gene transfer in the environment: transductionFry JC Day MJ Release of Genetically Engineered and Other Micro-OrganismsCambridge Cambridge University Press 1992 5481

57.Labrie SJ Samson JE Moineau S Bacteriophage resistance mechanisms NatRev Microbiol 2010 8 31727

58.Letellier L Boulanger P Plançon Let al Main features on tailed phage,host recognition and DNA uptake Front Biosci 2004 9 122839

59.Lindberg AA Bacteriophage receptors Annu Rev Microbiol 1973 27 20541

60.Lindberg AA Bacterial surface carbohydrates and bacteriophageadsorption Sutherland I Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell LondonAcademic Press 1977 289356

61.Lindberg AA Wollin R Gemski Pet al Interaction between bacteriophageSf6 and Shigella flexneri J Virol 1978 27 3844

62.Loeb T Isolation of a bacteriophage specific for the F+ and Hfr matingtypes of Escherichia coli K-12 Science 1960 131 9323

63.Madigan MT Martinko JM Stahl DAet al Brock Biology of MicroorganismsSan Francisco Benjamin Cummings 2012

64.Mahony J van Sinderen D Gram-positive phage-host interactions FrontMicrobiol 2015 6 12

65.Manning PA Reeves P Outer membrane of Escherichia coli K-12:differentiation of proteins 3A and 3B on acrylamide gels and furthercharacterization of con (tolG) mutants J Bacteriol 1976 127 10709

66.Manning PA Reeves P Outer membrane proteins of Escherichia coli K-12:isolation of a common receptor protein for bacteriophage T6 and colicin K MolGen Genet 1978 158 27986

67.Marti R Zurfluh K Hagens Set al Long tail fibres of the novel broad-host-range T-even bacteriophage S16 specifically recognize Salmonella OmpCMol Microbiol 2013 87 81834

68.Meadow PM Wells PL Receptor sites for R-type pyocins and bacteriophageE79 in the core part of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa PAC1J Gen Microbiol 1978 108 33943

69.Mindich L Qiao X Qiao Jet al Isolation of additional bacteriophageswith genomes of segmented double-stranded RNA J Bacteriol 1999 181 45058

70.Moineau S Lévesque C Control of bacteriophages in industrialfermentations Kutter E Sulakvelidze A Bacteriophages: Biology andApplications Boca Raton CRC Press 2005

71.Molineux IJ No syringes please, ejection of phage T7 DNA from thevirion is enzyme driven Mol Microbiol 2001 40 18

72.Molineux IJ Panja D Popping the cork: mechanism of phage genomeejection Nat Rev Microbiol 2013 11 194204

73.Monteville MR Ardestani B Geller BL Lactococcal bacteriophages requirea host cell wall carbohydrate and a plasma membrane protein for adsorptionand ejection of DNA Appl Environ Microb 1994 60 320411

74.Morona R Henning U Host range mutants of bacteriophage Ox2 can use twodifferent outer membrane proteins of Escherichia coli K-12 as receptors JBacteriol 1984 159 57982

75.Morona R Henning U New locus (ttr) in Escherichia coli K-12 affectingsensitivity to bacteriophage T2 and growth on oleate as the sole carbonsource J Bacteriol 1986 168 53440

76.Munsch-Alatossava P Alatossava T The extracellular phage-hostinteractions involved in the bacteriophage LL-H infection of Lactobacillusdelbrueckii ssp. lactis ATCC 15808 Front Microbiol 2013 4 15

77.Mutoh N Furukawa H Mizushima S Role of lipopolysaccharide and outermembrane protein of Escherichia coli K-12 in the receptor activity forbacteriophage T4 J Bacteriol 1978 136 6939

78.Pickard D Toribio AL Petty NKet al A conserved acetyl esterase domaintargets diverse bacteriophage to the Vi capsular receptor of Salmonellaenterica serovar Typhi J Bacteriol 2010 192 574654

79.Picken RN Beacham IR Bacteriophage-resistant mutants of Escherichiacoli K12. Location of receptors within the lipopolysaccharide J Gen Microbiol1977 102 30518

80.Pommerville JC Alcamo's Fundamentals of Microbiology Sudbury Jones &Barlett Publishers 2010

81.Prehm P Jann B Jann Ket al On a bacteriophage T3 and T4 receptorregion within the cell wall lipopolysaccharide of Escherichia coli B J MolBiol 1976 101 27781

82.Rakhuba DV Kolomiets EI Szwajcer Dey Eet al Bacteriophage receptors,mechanisms of phage adsorption and penetration into host cell Pol J Microbiol2010 59 14555

83.Randall-Hazelbauer L Schwartz M Isolation of the bacteriophage lambdareceptor from Escherichia coli J Bacteriol 1973 116 143646

84.Reske K Wallenfels B Jann K Enzymatic degradation of O-antigeniclipopolysaccharides by coliphage Ω8 Eur J Biochem 1973 36 16771

85.Riede I Receptor specificity of the short tail fibres (gp12) of T-eventype Escherichia coli phages Mol Gen Genet 1987 206 1105

86.Roa M Interaction of bacteriophage K10 with its receptor, the lamBprotein of Escherichia coli J Bacteriol 1979 140 6806

87.Russel M Whirlow H Sun T-Pet al Low-frequency infection of F- bacteriaby transducing particles of filamentous bacteriophages J Bacteriol 1988 17053126

88.Sandulache R Prehm P Expert Det al The cell wall receptor forbacteriophage Mu G(-) in Erwinia and Escherichia coli C FEMS Microbiol Lett1985 28 30710

89.Sandulache R Prehm P Kamp D Cell wall receptor for bacteriophage Mu G(+) J Bacteriol 1984 160 299303

90.São-José C Baptista C Santos MA Bacillus subtilis operon encoding amembrane receptor for bacteriophage SPP1 J Bacteriol 2004 186 833746

91.Schade SZ Adler J Ris H How bacteriophage χ attacks motile bacteria JVirol 1967 1 599609

92.Schwartz M Interaction of phages with their receptor proteins RandallLL Philipson L Virus Receptors—Part 1 London Chapman & Hall 1980 5994

93.Shaw DRD Chatterjee AN O-Acetyl groups as a component of thebacteriophage receptor on Staphylococcus aureus cell walls J Bacteriol 1971108 5845

94.Shin H Lee J-H Kim Het al Receptor diversity and host interaction ofbacteriophages infecting Salmonella enterica Serovar Typhimurium PLoS One2012 7 e43392

95.Skurray RA Hancock REW Reeves P Con- mutants: Class of mutants inEscherichia coli K-12 lacking a major cell wall protein and defective inconjugation and adsorption of a bacteriophage J Bacteriol 1974 119 72635

96.Stirm S Bessler W Fehmel Fet al Bacteriophage particles with endo-glycosidase activity J Virol 1971 8 3436

97.Sukupolvi S Role of lipopolysaccharide in the receptor function forbacteriophage Ox2 FEMS Microbiol Lett 1984 21 837

98.Takeda K Uetake H Receptor splitting enzyme of Salmonella phage ɛ34Annu Rep Inst Virus Res 1973 16 256

99.Thurow H Niemann H Stirm S Bacteriophage-borne enzymes in carbohydratechemistry: Part 1—on the glycanase activity associated with particles ofKlebsiella bacteriophage no 11 Carbohyd Res 1975 41 25771

100.Tortora GJ Funke BR Case CLMicrobiology: An Introduction SanFrancisco Benjamin Cummings 2007

101.Van Alphen L Havekes L Lugtenberg B Major outer membrane protein d ofEscherichia coli K12. Purification and in vitro activity of bacteriophage k3and f-pilus mediated conjugation FEBS Lett 1977 75 28590

102.Verhoef C de Graaff PJ Lugtenberg EJJ Mapping of a gene for a majorouter membrane protein of Escherichia coli K12 with the aid of a newlyisolated bacteriophage Mol Gen Genet 1977 150 1035

103.Vidaver AK Koski RK Van Etten JL Bacteriophage ϕ6: a lipid-containing virus of Pseudomonas phaseolicola J Virol 1973 11 799805

104.Vinga I Baptista C Auzat Iet al Role of bacteriophage SPP1 tail spikeprotein gp21 on host cell receptor binding and trigger of phage DNA ejectionMol Microbiol 2012 83 289303

105.Vinga I São-José C Tavares Pet al Bacteriophage entry in the hostcell Wegrzyn G Modern Bacteriophage Biology and Biotechnology Trivandrum:Research Signpost 2006 165205

106.Wayne R Neilands JB Evidence for common binding sites for ferrichromecompounds and bacteriophage ϕ80 in the cell envelope of Escherichia coli JBacteriol 1975 121 497503

107.Wendlinger G Loessner MJ Scherer S Bacteriophage receptors onListeria monocytogenes cells are the N-acetylglucosamine and rhamnosesubstituents of teichoic acids or the peptidoglycan itself Microbiology 1996142 98592

108.Willey JM Sherwood LM Woolverton CJ Prescott, Harley, and Klein'sMicrobiology New York McGraw-Hill 2008

109.Wright A McConnell M Kanegasaki S Lipopolysaccharide as abacteriophage receptor Randall LL Philipson L Virus Receptors—Part 1 LondonChapman & Hall 1980 2757

110.Xia G Corrigan RM Winstel Vet al Wall teichoic acid-dependentadsorption of Staphylococcal siphovirus and myovirus J Bacteriol 2011 19340069

111. Xiang Y Leiman PG Li Let al Crystallographic insights into theautocatalytic assembly mechanism of a bacteriophage tail spike Mol Cell 200934 37586

112.Yokota S-I Hayashi T Matsumoto H Identification of thelipopolysaccharide core region as the receptor site for a cytotoxin-converting phage, ϕCTX, of Pseudomonas aeruginosa J Bacteriol 1994 17652629。

Claims

1.一种生产噬菌体群的方法，其中所述噬菌体是第一类型的噬菌体，其能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述方法包括

(b) 用所述第一类型的噬菌体感染所述第二细胞；

(d) 任选地分离所述群的噬菌体。

2.一种生产转导颗粒群的方法，所述颗粒包含由噬菌体外壳蛋白包装的核酸，其中所述颗粒能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，由此宿主细胞被所述核酸转导，所述方法包括

(d) 任选地分离所述群的颗粒。

3.权利要求2的方法，其中所述颗粒是非复制性转导颗粒或噬菌体。

4. 任一项前述权利要求的方法，其中所述噬菌体或颗粒包含编码crRNA (或单一指导RNA)的核苷酸序列，所述crRNA (或单一指导RNA)与所述宿主细胞菌株或物种的细菌中的Cas是可操作的，以形成活性的CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统能够靶向一个或多个前间隔区核苷酸序列，其中每个靶序列由所述宿主细胞的基因组所包含，由此所述crRNA(或gRNA)指导宿主细胞中的Cas以修饰(任选地切割)所述靶序列，从而杀死宿主细胞或减少宿主细胞群生长。

5.权利要求4的方法，其中当被噬菌体感染，第二细胞不包含所述活性的CRISPR/Cas系统。

6. 权利要求4或5的方法，其中每个第二细菌细胞的基因组不包含所述靶序列。

7.权利要求4-6中任一项的方法，其中

(b) 所述第二细胞的tracrRNA与所述crRNA不是可操作的；和/或

8. 权利要求4-7中任一项的方法，其中所述crRNA (或gRNA)包含与第二细胞的Cas(任选地第二细胞的Cas3、9、cpf1和/或CASCADE Cas)不是可操作的重复序列。

9. 权利要求4-8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列与用于在所述宿主物种或菌株的细菌中转录crRNA (或gRNA)，但不在所述第二物种或菌株中转录crRNA (或gRNA)的启动子可操作连接。

10.任一项前述权利要求的方法，其中

11.任一项前述权利要求的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含用于杀死所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒或者减少所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒的增殖的抗噬菌体毒素或机制，其中第二细菌不包含所述毒素或机制。

12.任一项前述权利要求的方法，其中所述宿主物种或菌株的细菌包含CRISPR/Cas系统，其有活性以杀死所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒或者减少所述第一类型的噬菌体或感染宿主细菌的颗粒的增殖，其中第二细菌不包含所述系统。

13.任一项前述权利要求的方法，其中第二细菌细胞经改造以产生所述受体，其中所述第二物种或菌株的野生型细菌不产生所述受体。

14.任一项前述权利要求的方法，其中所述噬菌体或颗粒包含在所述第二细胞中和在所述第一物种或菌株的细胞中是可操作的复制起点。

15.任一项前述权利要求的方法，其中第二细胞是大肠杆菌细胞。

16.任一项前述权利要求的方法，其中第一和第二细胞是相同物种的细胞(任选地大肠杆菌菌株)。

17.权利要求16的方法，其中宿主细胞的菌株是人类病原性菌株和第二细胞菌株不是人类病原性菌株。

18.任一项前述权利要求的方法，其中与宿主物种或菌株(任选地危险组3或4)的细胞相比，第二细胞是较低危险类别(任选地危险组1或2)的细胞。

19.任一项前述权利要求的方法，其中所述受体选自脂多糖、磷壁酸(任选地ManNAc(β1→4)GlcNAc二糖，具有连接至ManNAc残基的C4羟基的1-3个甘油磷酸酯，后接甘油或核糖醇磷酸酯重复单元的长链)、蛋白和鞭毛。

20.任一项前述权利要求的方法，其中所述受体包含宿主细胞的O-抗原。

21.任一项前述权利要求的方法，其中所述噬菌体或颗粒是可操作的以在第二细胞中表达内溶素或穴蛋白，任选地当噬菌体或颗粒在第二细胞中复制时。

22.用于增殖包含被噬菌体外壳蛋白包装的核酸的转导颗粒或噬菌体的细胞(增殖者细胞)，其中所述噬菌体或颗粒是第一类型的噬菌体或颗粒，其能够通过结合由第一细菌物种或菌株的细菌所包含的细胞表面受体感染所述物种或菌株的细胞(宿主细胞)，所述增殖者细胞在其表面上包含所述受体，其中所述增殖者细胞是第二物种或菌株的细胞，其中第二物种或菌株不同于第一物种或菌株，由此所述增殖者细胞能够被所述第一类型的噬菌体或所述颗粒感染，以在其中分别增殖噬菌体或颗粒。

23.权利要求22的增殖者细胞，其中所述受体包含由增殖者细胞的基因组所包含的可表达的核苷酸序列编码的蛋白，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

24.权利要求22的增殖者细胞，其中所述受体包含糖部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

25.权利要求22的增殖者细胞，其中所述受体包含磷壁酸部分，其是增殖者细胞中的一种或多种酶的作用产物，其中增殖者细胞的基因组包含编码所述一种或多种酶的一个或多个可表达的核苷酸序列，其中与增殖者细胞相同物种或菌株的野生型细胞不包含所述可表达的核苷酸序列。

26. 权利要求25的增殖者细胞，其中所述酶选自TarO、TarA、TarB、TarF、TarK和TarL(或由宿主细胞和/或第二细胞表达的其同源物)。

27.权利要求22-26中任一项的增殖者细胞，其与所述第一类型的噬菌体或所述转导颗粒组合。

28. 权利要求22-27中任一项的增殖者细胞，其中所述细胞包含一种或多种所述第一类型的原噬菌体(任选地在增殖者细胞中染色体整合)或能够生产转导颗粒的所述核酸的拷贝的DNA (任选地在增殖者细胞中染色体整合)。

29.权利要求22-28中任一项的增殖者细胞，其中增殖者细胞是革兰氏阴性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

30.权利要求22-28中任一项的增殖者细胞，其中增殖者细胞是革兰氏阳性细菌细胞和任选地宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。

31.根据权利要求22-30中任一项的增殖者细胞的群，其任选地包含在发酵容器中用于培养增殖者细胞和增殖所述第一类型的噬菌体或所述转导颗粒。

32.权利要求22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中每个增殖者细胞是权利要求1-21中任一项定义的第二细胞。

33.权利要求22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中每个宿主细胞是权利要求1-21中任一项定义的宿主细胞。

34.权利要求22-31中任一项的增殖者细胞或群，其中噬菌体或颗粒是权利要求1-21中任一项定义的噬菌体或颗粒。

35.治疗或预防人类或动物受试者的疾病或病况的方法，所述疾病或病况由受试者包含(任选地由受试者的肠包含)的宿主细胞介导，所述方法包括给予增殖者细胞至受试者(任选地定殖在受试者的肠)，其中增殖者细胞是根据权利要求22-34中任一项的细胞，其中增殖者细胞产生噬菌体或转导颗粒，和噬菌体或颗粒分别感染患者(任选地在其肠中)的宿主细胞，从而在受试者中杀死宿主细胞或抑制宿主细胞的生长或增殖，由此治疗或预防所述疾病或病况。

36. 权利要求35的方法，其中增殖者细胞是乳杆菌属(Lactobacillus) (任选地罗伊氏乳杆菌(L reuteri))细胞。

37.权利要求35或36的方法，其中所述噬菌体编码抗宿主细胞crRNA或gRNA，所述crRNA或gRNA指导宿主细胞中的Cas以修饰(任选地切割)宿主细胞DNA，从而实现所述杀死或抑制。