CN110988340A - 斯氏艾美耳球虫sag8蛋白的应用 - Google Patents

斯氏艾美耳球虫sag8蛋白的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白作为兔球虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白能被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白可以作为兔球虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。

Description

斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的应用。
背景技术
兔球虫病(Rabbit coccidiosis)是由艾美耳属的多种球虫寄生于家兔的肠道和肝脏所引起的一种原虫性疾病，是家兔的一种常见、多发性疾病，是严重危害家兔的主要疾病之一。斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)作为致病力最强的一种兔球虫，主要侵害家兔的肝脏和胆管上皮细胞，导致肝硬化以及胆汁淤积，从而引起严重的肝型兔球虫病。患病家兔主要以腹泻、生长发育迟缓、虚弱消瘦为主要临床特征，严重感染时可导致死亡。由于肝型兔球虫病具有很高的发病率以及死亡率，因此斯氏艾美耳球虫被视为是国内养兔业所面临的危害最大的病原之一，严重制约了我国养兔业的发展。
兔球虫病在全世界范围内均存在分布，对于许多国家的养兔业带来了严重的经济损失，其中以肝型兔球虫病致病力最强且流行最为严重。目前该病的确诊需要对患病兔进行剖检，尚缺乏有效的生前诊断方法；已有研究使用斯氏艾美耳球虫卵囊作为天然的诊断抗原进行诊断，然而卵囊作为诊断抗原存在抗原标准品难以收集和制备，来源和用量难以确定，推广和应用困难等一系列的问题。
鉴于斯氏艾美耳球虫的强致病性以及其对于养兔业危害的严重性，利用可靠的诊断技术对患病兔进行诊断是有效防控的基础。然而目前有关该病生前诊断的方法尚缺乏报道，因此建立一种血清学诊断方法对肝型兔球虫病进行准确的诊断对该病的防治具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白(EsSAG8)作为兔球虫病的诊断抗原以及在制备兔球虫病的诊断抗原中的应用，使得EsSAG8具有较高的特异性和敏感性，以及良好的免疫原性和反应原性；
本发明的另外一个目的在于提供EsSAG8在制备检测兔球虫病的试剂盒中的应用，使得以所述EsSAG8建立的ELISA方法显示出其较高的特异性和敏感性，可用于ELISA检测；
本发明的另外一个目的在于提供EsSAG8在制备兔球虫病疫苗中的应用。
在本文中，斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白(EsSAG8)可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的(业内常称为重组蛋白rEsSAG8)。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。
SAGs位于原虫细胞膜表面，是一类糖基磷脂酰肌醇(GPI)相关的表面蛋白，文献报道了刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)，疟原虫(Plasmodium)，犬新孢子虫(Neosporacaninum)，神经肉孢子虫(Sarcocystis neurona)中SAGs的相关研究成果，目前未见有关于兔斯氏艾美耳球虫SAG基因家族的相关研究。
本发明对EsSAG8进行了克隆以及原核表达，利用免疫印迹验证了重组蛋白rEsSAG8的反应原性并建立了间接ELISA方法以评估其作为重组抗原对于肝型兔球虫病的诊断价值。结果显示，EsSAG8(全长663bp，序列如SEQ ID NO:1所示)基因的ORF编码的蛋白质分子量约为24.2kDa(序列如SEQ ID NO:2所示)。免疫印迹显示重组蛋白rEsSAG8能够被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，表明了其具有良好的反应原性。基于rEsSAG8建立的间接ELISA方法具有93.75％(45/48)的敏感性和100％(48/48)的特异性。因此，EsSAG8可作为由斯氏艾美耳球虫引起的兔球虫病的候选诊断抗原。
基于上述内容，本发明提供了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白作为兔球虫病的诊断抗原的应用，以及在制备兔球虫病诊断抗原中的应用。同时，本发明还提供了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白在制备诊断兔球虫病的试剂盒中的应用；其中，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒，更具体地，该ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。此外，本发明还提供了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白在制备兔球虫病疫苗中的应用。
依据斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白在制备试剂盒中的应用，本发明提供了一种诊断兔球虫病的ELISA试剂盒，包括包被有斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白(EsSAG8)的固相载体。在本发明具体实施方式中，所述固相载体可选择为96孔培养板或与其相似的固相载体，所述EsSAG8包被浓度为0.725μg/孔，可采用包被液包被于载体上，包被液由0.39g Na2CO3，35mMNaHCO3，0.2M NaCl，调PH至9.6获得。
在确定了试剂盒核心组分后，所述ELISA试剂盒还包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液中的一种或两种以上。
其中，所述酶标二抗优选为HRP标记的山羊抗兔IgG，在本发明具体实施方式中，所述酶标二抗采用购自于武汉博士德生物工程有限公司的产品，酶标二抗稀释比例为1：3000；
所述洗涤液优选为PBS-T洗涤液，在本发明具体实施方式中，所述PBS-T洗涤液组成为0.01M PBS+0.05％Tween-20；所述显色液优选为TMB显色液；
所述封闭液优选为脱脂牛奶，在本发明具体实施方式中，所述脱脂牛奶浓度为5％，以0.01M PBS溶液稀释。
所述终止液优选为硫酸溶液，浓度优选为2mol/L；配制方法为178mL去离子水中缓慢滴加21.7mL的98％的浓硫酸，冷却至室温，4℃保存；
所述稀释液优选为0.01M PBS；配制方法为8gNaCl，0.2gKCl，1.42gNa2HPO4，0.27gKH2PO4，溶于800mL去离子水中，定溶至1L，灭菌后，室温保存。
由以上技术方案可知，本发明提供了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白作为兔球虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白能被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白可以作为兔球虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。
附图说明
图1所示为rEsSAG8的表达纯化以及免疫印迹结果；其中，泳道M：蛋白质标准品Maker；泳道1：经IPTG诱导由大肠杆菌BL21(DE3)表达的rEsSAG8(未纯化)；泳道2：纯化后的rEsSAG8(6μg)；泳道3：斯氏艾美耳球虫阳性血清识别的rEsSAG8；泳道5：斯氏艾美耳球虫阴性血清识别的rEsSAG8；泳道5-7：兔肠球虫阳性血清识别的rEsSAG8；泳道8-10：兔疥螨阳性血清识别的rEsSAG8；
图2所示为利用建立的间接ELISA方法检测斯氏艾美耳球虫阳性及阴性血清样品；其中，水平线代表ELISA方法的临界值(Cut-Off＝0.554)，分别检测了48份斯氏艾美耳球虫阳性及阴性血清样品，数据间具有明显差异性(***表示P<0.01)。
具体实施方式
本发明公开了斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过提取斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA，OligodT(18)作为反转录引物，进行反转录合成cDNA，从cDNA中扩增斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白编码序列。经T克隆后，将扩增产物以酶切连接的方式导入表达载体中，以大肠杆菌进行原核表达获得重组的rEsSAG8。
在具体实施方的实验中，所有实验动物严格按照“中华人民共和国动物保护法”(2009年9月18日发布的草案)进行处理。所有程序均按照四川农业大学动物伦理委员会(中国，雅安)实验动物护理和使用规则进行(批准号：2015-028)。
用于本发明的斯氏艾美耳球虫虫种分离自自然感染的新西兰兔的肝脏以及胆囊，并于2.5％重铬酸钾溶液中在28℃的条件孢子化后再于4℃保存；48只30日龄无球虫幼兔由四川农业大学动物寄生虫病研究中心繁育，并严格饲养于无球虫的环境，期间提供煮沸的饮水和80℃烘烤过的兔饲料进行饲喂，交叉轮换使用抗球虫药物地克珠利和癸氧喹酯同时定期喷烧兔笼防止球虫污染。
本发明试验中的48份斯氏艾美耳球虫阴性兔血清采集自48只无球虫幼兔，无球虫幼兔在30-35日龄期间每天用饱和食盐水漂浮法检查粪便，连续5天粪检球虫卵囊均为阴性；阴性血清用于确定间接ELISA的Cut-Off值和特异性。48份斯氏艾美耳球虫阳性兔血清采集自人工感染球虫孢子化卵囊(8×104个/只)至30日并经过剖检确定其肝脏出现明显症状的48只的实验兔；阳性血清用于确定间接ELISA方法的敏感性。3份兔疥螨(Sarcoptesscabiei)阳性血清采集自经人工感染兔疥螨的新西兰兔，3份兔肠球虫阳性血清采集自自然感染且经病原学检测到肠球虫的新西兰兔；兔疥螨及兔肠球虫阳性血清用于免疫印迹以验证该重组蛋白与其余兔寄生虫的交叉反应性。所有血清样品均于-20℃保存备用。
所有数据均以平均值±标准差(S.D.)表示，并使用GraphPad Prism version 5.0(GraphPad Software)进行所有相关分析。使用IBM SPSS statistics 22.0(SPSSSofware)完成批内和批间差异性的分析，P值小于0.05即被判定为数据差异显著。
以下就本发明所提供的斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的应用做进一步说明。
实施例1：EsSAG8的生物信息学分析及克隆测序
1、EsSAG8的cDNA扩增
利用开放阅读框查找器ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)确定EsSAG8的开放阅读框和推导的氨基酸序列；利用SignalP4.1在生物序列分析中心(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白是否存在信号肽和跨膜区；利用ExPASy网站(http://web.expasy.org/)预测蛋白的分子量(MW)，等电点(pI)，保守结构域和蛋白质性质。
取于2.5％重铬酸钾中4℃保存的斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊，利用生理盐水反复洗涤5次后，利用总RNA提取试剂盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,TaKaRa,Japan)进行RNA的提取，随后以抽提的斯氏艾美耳球虫总RNA为模板，利用逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser，TaKaRa,Japan)进行cDNA的合成，得到的互补双链cDNA于-80℃保存。
利用斯氏艾美耳球虫cDNA为模板以扩增EsSAG8基因。根据四川农业大学动物寄生虫病研究中心测定得到的斯氏艾美耳球虫转录组数据设计引物：SAG8-F:5’-CCAAGCTTTATTGAAAGGGATCATGTGGC-3’和SAG8-R:5’-CCCTCGAGTCACGTGAACAACGGATTG-3’。引物加入限制性酶切位点HindⅢ和XhoI(下划线为酶切位点)。EsSAG8通过如下PCR程序进行扩增：95℃预变性4min；95℃变性30s,57℃退火60s,72℃延伸1min,至变性步骤重复35个循环；72℃终延伸10min。通过琼脂糖凝胶电泳分离并使用DNA纯化试剂盒(Novagen，Germany)纯化后，将基因的扩增产物克隆到载体pMD19-T中(TaKaRa，Dalian，China)，转化入大肠杆菌DH5α(Tiangen，Beijing，China)并随后送至公司测序(Invitrogen，Shanghai，China)。
EsSAG8基因的ORF全长为663bp，共编码了220个氨基酸；蛋白质分子量约为24.2kDa，没有信号肽，不存在跨膜区。
2、重组蛋白rEsSAG8的表达及纯化
将EsSAG8的PCR产物回收纯化，连接至pMD19-TVector载体，分别使用HindⅢ和XhoI(TaKaRa，大连，中国)进行双酶切再将酶切片段连接至pET32a(+)表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)，经鉴定后进行测序。取测序正确的重组表达菌株接种到含50μg/mLAmp的LB培养液中，37℃培养4h直至菌液OD值达到0.6，再加入1mMIPTG诱导表达6h。随后使用NGCTM10中高压层析系统(Bio-RadUSA)对所表达的重组蛋白进行纯化，将收集得到的蛋白进行超滤，并用SDS-PAGE鉴定。
将编码SAG8的基因成功地连接到表达载体pET-32a(+)上，质粒转化为大肠杆菌BL21，诱导蛋白表达。用12％SDS-PAGE进行分离后，观察到约为42.2kDa的单条带(图1泳道1和泳道2)，这与预期大小一致(包括来自pET-32a(+)载体标签的约18kDa)。
实施例2：免疫印迹分析
制备12％的SDS-PAGE凝胶，将按照实施例1中的方法获得的纯化rEsSAG8蛋白，进行SDS-PAGE分离；电泳结束后，切割凝胶上含有蛋白样品的部位，采用半干式转膜装置在0.8mA/cm2恒定电流下转移40min；结束后取出薄膜，用TBST洗3次，每次5min；使用5％的脱脂奶粉PBS溶液室温封闭2h；然后使用TBST洗膜3次，每次5min；加入感染斯氏艾美耳球虫的兔阳性血清(使用PBS缓冲液按1:100稀释)作为一抗，4℃孵化过夜(约12h)；倒掉液体，使用TBST洗3次，每次5min；而后加入PBS稀释(稀释比为1:3000)的带有HRP标记的兔抗山羊IgG二抗，室温孵育2hTBST浸洗4次，DAB显色，加纯水终止反应。
免疫印迹分析显示，rEsSAG8能被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别且呈现单一条带，表明了重组蛋白具有良好的反应原性和抗原性(图1，泳道3)；同时当使用斯氏艾美耳球虫阴性血清识别该rEsSAG8未观察到条带(图1，泳道4)。用疥螨及兔肠球虫阳性血清识别rEsSAG8也未观察到条带，表明重组蛋白与疥螨与肠球虫均不存在交叉反应(图1，泳道5-10)。
实施例3：间接ELISA方法的建立以及检测验证
1、间接ELISA方法的建立
间接ELISA的建立方法依据先前的报道进行(CROWTHER J R.The ELISAGuidebook[J].Methods in Molecular Biology,2000,149(149):III-IV,1-413.)。用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将已纯化的rEsSAG8蛋白通过标准棋盘滴定法进行6种不同浓度的倍比稀释用作间接ELISA中的抗原(1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640)并加入到96孔微量滴定板(Invitrogen)中，每孔100μl，4℃包被过夜。用PBST(0.01M PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次后，将包被后的酶标板用5％脱脂奶粉(以0.01M PBS溶液稀释)封闭，每孔300μL，37℃孵育2h。再次用PBST洗涤3次，同时用0.01M PBS溶液将斯氏艾美耳球虫阴、阳性血清进行6种不同浓度的倍比稀释(1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640)，每孔100μL加入酶标板，37℃同时孵育阴、阳性血清1h。继续用PBST洗涤3次，用0.01MPBS溶液将HRP标记的山羊抗兔IgG(Boster，Wuhan，China)按照推荐工作浓度进行稀释(1:3000)并加入板中，每孔100μL，37℃作用1h。用PBST彻底洗涤4次以后，每孔加入100μL四甲基联苯胺显色液(TIANGEN,Beijing,China)，室温作用20min。最后向酶标板每孔加入100μL 2mol/L浓硫酸终止反应，用酶标仪(Thermo，USA)测定OD450值后，根据P/N值确定抗原和血清的最佳工作浓度。同时，最佳封闭液的选择、最佳封闭时间、血清反应的最佳时间、HRP标记的山羊抗兔IgG的最佳稀释度以及作用时间均已按之前的报道进行优化。
rEsSAG8的最佳抗原包被浓度为0.725μg/每孔，最佳血清稀释比例为1:100，重组蛋白在最佳条件下达到最大的P/N值。
在间接ELISA的最佳条件下，使用来自无球虫幼兔的48份阴性血清样品来确定间接ELISA的临界值(Cut-Off)，其计算方法为48份阴性血清OD450平均值加上三倍标准偏差(S.D.)，当检测样本OD450nm值大于且等于Cut off值则判定为阳性，反之则判定为阴性。
在最佳反应条件下，检测48份斯氏艾美耳球虫阴性血清样品以确定通过重组蛋白建立的间接ELISA方法的临界值(Cut-Off)。依据临界值计算公式(Cut-Off＝阴性样本OD450平均值+3×S.D.)，计算出由rEsSAG8建立的间接ELISA方法的临界值为0.447。由此可得出，当利用rEsSAG8建立的间接ELISA方法检测兔血清样品时，当OD450值≥0.554时即被确定为斯氏艾美耳球虫阳性；反之，当OD450值＜0.554时即被确定为斯氏艾美耳球虫阴性。
2、间接ELISA检测方法的批内和批间重复性
选取6份斯氏艾美耳球虫阳性血清以确定EsSAG8间接ELISA的批内和批间可重复性。分别检测同一批次和5个不同批次包被的酶标板中的6个阳性血清样品，每个样本在同一酶标板上做3个重复孔并测定OD450值，分别计算每个血清样本的OD450平均值和标准方差(SD)，通过计算变异系数，以确定建立的间接ELISA方法的批内和批间重复性。
结果显示，基于rEsSAG8建立的间接ELISA方法的批内的变异系数在0.93％-4.57％之间，批间变异系数在1.53％-6.47％之间，所有变异系数均在10％以内，表明rEsSAG8间接ELISA方法重复性好，结果可靠。
3、间接ELISA检测方法的敏感性和特异性
依照已建立的EsSAG8间接ELISA方法检测48份斯氏艾美耳球虫阳性兔血清，48份斯氏艾美耳球虫阴性兔血清以确定间接ELISA方法的敏感性和特异性。在最佳工作条件下对所有血清进行间接ELISA方法检测，测定其OD450值，根据EsSAG8的临界值判定每个血清样品的阴阳性。并依据计算公式评估间接ELISA方法的敏感性和特异性。
计算公式为：敏感性＝(ELISA检出阳性样品数/斯氏艾美耳球虫阳性血清样品数)×100％；特异性＝(ELISA检出阴性样品数/斯氏艾美耳球虫阴性血清样品数)×100％。
结果显示，就基于rEsSAG8建立的间接ELISA方法而言，48份阳性血清的OD450值只有3份样品的OD450低于其cut-off值0.554，所以其敏感性为93.75％(45/48)(图2)；同时，用基于rEsSAG8建立的间接ELISA方法分别对48份斯氏艾美耳球虫阴性兔血清进行检测以确定检测方法的特异性。结果显示，48份阴性血清的OD450值均低于其cut-off值0.554，所以其特异性为100％(48/48)(图2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的应用
<130> MP1930887
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggcgtt caagcctcct gctcttcaca gcagcctctc acgtcctcgt cgacttcagt 60
gcggcatcgc aagagaaaaa aaaagtcgtt cggctcgcgg atgcaaacag ctgcctcact 120
gatttgaacg cggcccgcca cgatgcaggt ctcgcagctt taacaacaga aactcaagac 180
gaaaagtttg acaaagtcat aatcgccgag ggttttttga agtctgtttg tgacaccttg 240
ttagatggaa aacctttcgc accctcacag gaagaccttc ctggggcgac ttccgcgctt 300
ttttctttgg gtgaaggcga cgagaagacc gcccctcagt gcggtgctgc tgtcaaacac 360
tggcagaaag gatacgacat tttgaaggga gatccacctg tggacagaaa agttgaactt 420
cctgaaataa ctgccgaggg ggtttctttt gtgaccctct acaaccccac cgtcggagcc 480
agggggcagt gtgtagtggc cgcgtgcacg gaaagaccca agactggaag cgaggaggat 540
gaggatgagg atcaggatga gggagaggaa ctgcgcaatg cccagcctga cagcaagatg 600
gtttccgccc tactttgtct tacagctcca gtcgccttca acaacaatcc gttgttcacg 660
tga 663
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Trp Arg Ser Ser Leu Leu Leu Phe Thr Ala Ala Ser His Val Leu
1 5 10 15
Val Asp Phe Ser Ala Ala Ser Gln Glu Lys Lys Lys Val Val Arg Leu
20 25 30
Ala Asp Ala Asn Ser Cys Leu Thr Asp Leu Asn Ala Ala Arg His Asp
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Ala Leu Thr Thr Glu Thr Gln Asp Glu Lys Phe Asp
50 55 60
Lys Val Ile Ile Ala Glu Gly Phe Leu Lys Ser Val Cys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Gly Lys Pro Phe Ala Pro Ser Gln Glu Asp Leu Pro Gly Ala
85 90 95
Thr Ser Ala Leu Phe Ser Leu Gly Glu Gly Asp Glu Lys Thr Ala Pro
100 105 110
Gln Cys Gly Ala Ala Val Lys His Trp Gln Lys Gly Tyr Asp Ile Leu
115 120 125
Lys Gly Asp Pro Pro Val Asp Arg Lys Val Glu Leu Pro Glu Ile Thr
130 135 140
Ala Glu Gly Val Ser Phe Val Thr Leu Tyr Asn Pro Thr Val Gly Ala
145 150 155 160
Arg Gly Gln Cys Val Val Ala Ala Cys Thr Glu Arg Pro Lys Thr Gly
165 170 175
Ser Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gln Asp Glu Gly Glu Glu Leu Arg
180 185 190
Asn Ala Gln Pro Asp Ser Lys Met Val Ser Ala Leu Leu Cys Leu Thr
195 200 205
Ala Pro Val Ala Phe Asn Asn Asn Pro Leu Phe Thr
210 215 220

Claims (7)

1.斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白作为兔球虫病的诊断抗原的应用和/或在制备兔球虫病诊断抗原中的应用。
2.斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白在制备诊断兔球虫病的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。
5.斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白在制备兔球虫病的疫苗中的应用。
6.一种诊断兔球虫病的ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有斯氏艾美耳球虫SAG8蛋白的固相载体。
7.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液中的一种或两种以上。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114288401A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 四川农业大学 抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1745794A2 (fr) * 2005-07-22 2007-01-24 Université Blaise Pascal Utilisation de micro-algues pour traiter et/ou prevenir les infections parasitaires
WO2009086471A2 (en) * 2007-12-27 2009-07-09 Tyratech, Inc. Synergistic antiparasitic compositions and screening methods
CN106093435A (zh) * 2016-07-14 2016-11-09 四川农业大学 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用
CN108815222A (zh) * 2018-09-13 2018-11-16 四川农业大学 一种抗球虫中药组合物的制备方法和应用
CN110133290A (zh) * 2019-05-31 2019-08-16 四川农业大学 一种诊断犬恶丝虫病的elisa试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1745794A2 (fr) * 2005-07-22 2007-01-24 Université Blaise Pascal Utilisation de micro-algues pour traiter et/ou prevenir les infections parasitaires
WO2009086471A2 (en) * 2007-12-27 2009-07-09 Tyratech, Inc. Synergistic antiparasitic compositions and screening methods
CN106093435A (zh) * 2016-07-14 2016-11-09 四川农业大学 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用
CN108815222A (zh) * 2018-09-13 2018-11-16 四川农业大学 一种抗球虫中药组合物的制备方法和应用
CN110133290A (zh) * 2019-05-31 2019-08-16 四川农业大学 一种诊断犬恶丝虫病的elisa试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
廖艳 等: "兔肝球虫生物学与免疫学的研究进展", 《中国养兔》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114288401A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 四川农业大学 抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒
CN114288401B (zh) * 2021-12-31 2023-10-03 四川农业大学 抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒

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