CN110988097A - 一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于支持向量机回归模型的水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，包括获取水质监测数据；利用稳定同位素质谱法测定每个水体样本的硝酸盐氮稳定同位素丰度；将样本数据划分为训练集和验证集并进行归一化处理；硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型建模训练；硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型性能评价；利用建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正模型测量未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。实施本发明，可以快速、高效、低价地测量水体硝酸盐氮稳定同位素丰度。

Description

一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法

技术领域

本发明涉及环境科学技术领域，尤其涉及一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法。

背景技术

近年来，我国对生态环境保护工作高度重视，工业点源污染已经逐步得到有效控制，面源污染的危害日益凸显。硝酸盐是面源污染的主要污染物之一，水体中硝酸盐含量过高不仅能够引发水华等水体富营养化现象，而且会引起高铁血红蛋白症和癌症等多种疾病，严重危害人类健康。因此，如何有效控制水体中硝酸盐污染是国内外环境工作者持续关注和研究的热点问题之一。

基于不同来源的硝酸盐具有不同氮同位素丰度这一理论依据，稳定同位素技术弥补了传统方法无法直接识别污染源的缺点，以其灵敏度高、结果准确、数据需求量少等优点在研究含氮污染物的来源、迁移和转化方面显示出较强的优越性，越来越受本领域技术人员的青睐。然而，稳定同位素技术的应用依赖于样品稳定同位素丰度的测量。

目前，实验室测量硝酸盐氮稳定同位素采用稳定同位素质谱法，包括水样的预处理和质谱分析两部分。预处理方法主要包括蒸馏法、扩散法、两步化学还原法、阴离子交换法和细菌反硝化法。以上测试样品预处理过程步骤复杂，实验周期长。质谱分析需要使用同位素质谱仪，而稳定同位素质谱仪价格高昂，国内只有少数单位有条件购买，并且需专业人员操作，测试成本高。因此，质谱分析法测量水体硝酸盐氮稳定同位素丰度有以下不足：仪器昂贵，测试成本高；实验步骤复杂，不易操作；测试周期长，无法及时获得相关数据；难以推广使用。如何快速、高效、低价地测量水体中硝酸盐的氮同位素丰度对于硝酸盐污染的控制具有非常重要的价值和意义，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

近年来，随着机器学习的发展，线性/非线性回归模型等软测量技术已在溶解氧、化学需氧量、五日生化需氧量和叶绿素a等水质参数测量中取得了良好的效果，应用越来越广泛。线性/非线性回归模型等软测量技术测量水质参数具有快速、高效、低价的特点。基于统计学习理论的支持向量机回归(SVR)模型是最具代表性的机器学习方法之一。该模型以结构风险最小化为原则，能够很好地解决数据的高维度和过拟合问题，具有良好的泛化能力，并且结构简单，易于使用。

目前，还未见利用SVR模型预测水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，可利用常规水质参数准确预测水体硝酸盐氮稳定同位素丰度。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，包括以下步骤：

步骤S1、获取水质监测数据；

步骤S2、利用稳定同位素质谱法测定每个水体样本的硝酸盐氮稳定同位素丰度；

步骤S3、将样本数据划分为训练集和验证集并进行归一化处理；

步骤S4、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型建模训练；

步骤S5、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型性能评价；

步骤S6、利用建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型测量未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

进一步设置是所述的步骤S1具体包括：采集N个河流水体样本，测定其中水质指标浓度，水质指标包括但不限于溶解氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐、总碳、总无机碳、总有机碳和氯离子。

进一步设置是所述的步骤S2具体包括：

步骤S21、将致黄假单孢菌菌株活化，划出单菌落，并接种到TSB-A营养液中，置摇床培养1天，接着转接到培养瓶中，置摇床培养7天，得到菌液；

步骤S22、将步骤S21中得到的菌液在高速离心机中以5000～8000r·min^-1的速度高速离心20min后，弃上清液，将离心后的菌体悬浮于TSB-B培养液，浓缩成2倍浓度的菌液；吸取2～3mL菌液注入20mL顶空瓶，用流速为30～40mL·min^-1的高纯氮气吹扫1～3h，将0.4～3.5μg的样品注入顶空瓶并充分混匀，将顶空瓶倒置放入恒温箱过夜培养,次日注入0.15mL浓度为10mol·L^-1的NaOH，将致黄假单孢菌裂解，同时吸收产生的CO₂，

步骤S23、通过自动进样器将顶空瓶中产生的N₂O气体输送至痕量气体预浓缩装置，进行浓缩和捕集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪测定氮同位素组成。

进一步设置是所述步骤S3具体包括：

采用梯度法将样本数据划分为训练集和验证集；根据样本水体硝酸盐氮稳定同位素丰度数值从小到大的顺序对样本进行排序，每隔两个样本取一个样本作为验证集，其余样本作为训练集；

数据归一化采用Z标准化方法，Z标准化方法公式表达如下：

式(1)中，x为原始数据，x_n为归一化后的数据，x_mean为原始数据的均值，x_SD为原始数据的标准差。

进一步设置是所述步骤S4具体包括：

在模型训练阶段，采用网格全局搜索法结合5折交叉验证法优化支持向量机回归模型中惩罚参数C和径向基函数核参数γ的取值，建立常规水质监测指标浓度与硝酸盐氮稳定同位素丰度间的定量关系模型，得到用于预测水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型；

网格全局搜索法结合5折交叉验证法将均方误差值,即MSE作为参数优化的标准，当均方误差值最小时所对应的参数数值为模型参数的最优取值。

进一步设置是所述步骤S5具体包括：

在模型验证阶段，将验证集样本中的常规水质监测数据输入训练好的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型，输出相应样本的硝酸盐氮同位素丰度，数据反归一化处理后通过与验证集中样本的实测氮同位素丰度比较，并通过计算模型的决定系数R²，纳什系数NS，MSE评估模型的性能；R²代表预测值与观测之间的相关程度；NS可评估模型预测观测值的能力；MSE可评价模型的平均预测误差；R²＝1、NS＝1及MSE＝0，代表模型性能达到最优，R²，NS，MSE的具体计算公式如下：

在式(2)、(3)及(4)中，n代表测量值总数，O_i和P_i分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度和预测硝酸盐氮同位素丰度，

和

分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度平均值和预测硝酸盐氮同位素丰度平均值。

进一步设置是所述步骤S6具体包括：

将未知水样样品按所述步骤S1的方法获取常规水质数据，导入已建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型获得所述未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

进一步设置是所述的步骤S21中的TSB-A培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、1.0gKNO₃、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及1000mL纯净水，分装到500mL培养瓶，通过高压灭菌60min制得。

进一步设置是所述的步骤S21中的TSB-B培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及2000mL纯净水，分装到100mL血清瓶，高压灭菌60min制得。

本发明的有益效果是：

(1)本方法预测结果与实测数据之间拟合程度高，误差较小，能够满足实际应用。

(2)无需复杂的样品预处理过程和价格昂贵的测量设备，操作简便，测量快速，成本低廉。

附图说明

图1是利用支持向量机回归模型进行水体硝酸盐氮稳定同位素丰度预测方法的流程图；

图2是支持向量机回归模型中参数C和γ寻优过程的3D视图；

图3是水体样本硝酸盐氮稳定同位素丰度实测值与支持向量机回归模型预测值的相关图；

图4是水体样本硝酸盐氮稳定同位素丰度实测值与支持向量机回归模型预测值的比较图；

图5是Z标准化处理后的训练集和验证集数据表格。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

如图1所示，一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，包括以下步骤：

步骤S1、获取水质监测数据。

具体过程为，采集N个河流水体样本，测定其中水质指标浓度，水质指标包括但不限于溶解氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐、总碳、总无机碳、总有机碳和氯离子。溶解氧通过溶解氧测定仪现场测定；氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐通过连续流动注射分析仪测定；总碳、总无机碳通过总有机碳分析仪测定，总有机碳为总碳和总无机碳之差；氯离子采用离子色谱测定。

步骤S2、利用稳定同位素质谱法测定每个水体样本的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

具体过程为：

步骤S21、将致黄假单孢菌(Pseudomonas aureofaciens)菌株活化，划出单菌落。接种到5mL的TSB-A培养液中，置摇床培养1天，接着转接到500mL的培养瓶；置摇床培养7天，得到菌液；需要解释的是TSB-A培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、1.0gKNO₃、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及1000mL纯净水，分装到500mL培养瓶，通过高压灭菌60min制得。

步骤S22、将步骤S21中得到的菌液在高速离心机中以5000～8000r·min^-1的速度高速离心20min(温度设置在18℃)后，弃上清液，将离心后的菌体悬浮于TSB-B培养液，浓缩成2倍浓度的菌液；吸取2～3mL菌液注入20mL顶空瓶，用流速为30～40mL·min^-1的高纯氮气吹扫1～3h，将0.4～3.5μg的样品注入顶空瓶并充分混匀，将顶空瓶倒置放入恒温箱(26℃)过夜培养，次日注入0.15mL浓度为10mol·L^-1的NaOH，将致黄假单孢菌裂解，同时吸收产生的CO₂。需要解释的是TSB-B培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及2000mL纯净水，分装到100mL血清瓶，高压灭菌60min制得。

步骤S23、测定N₂O氮同位素组成，通过CTC-Combi PAL自动进样器(载气为高纯氦气，流量为50～60mL·min^-1)将顶空瓶中产生的N₂O气体输送至PreCon痕量气体预浓缩装置，进行浓缩和捕集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪(IRMS,ISOPRIME-100)测定氮同位素组成。δ¹⁵N的测量精度为±0.2‰。

步骤S3、将样本数据划分为训练集和验证集并进行归一化处理。

具体过程为，采用梯度法将样本数据划分为训练集和验证集；根据样本水体硝酸盐氮稳定同位素丰度数值从小到大的顺序对样本进行排序，每隔两个样本取一个样本作为验证集，其余样本作为训练集；

数据归一化采用Z标准化方法，Z标准化方法公式表达如下：

式(1)中，x为原始数据，x_n为归一化后的数据，x_mean为原始数据的均值，x_SD为原始数据的标准差。

步骤S4、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型建模训练。

具体过程为，在模型训练阶段，采用网格全局搜索法结合5折交叉验证法优化支持向量机回归模型中惩罚参数C和径向基函数核参数γ的取值，建立常规水质监测指标浓度与硝酸盐氮稳定同位素丰度间的定量关系模型，得到用于预测水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型；

在5折交叉验证中，训练集样本被划分为5个相同规模的子集，以1个子集为测试，其余4个子集为训练集，这样训练集中的每个样本均可被预测一次，可避免模型的过度训练。网格寻优算法把需要优化的参数在一定搜索范围内划分为网格并评估所有的网格去寻找最优值。提高参数寻优精度可以通过扩大参数搜索范围或缩小步长来完成。网格全局搜索法结合5折交叉验证法将均方误差(MSE)值作为参数优化的标准，当MSE值最小时所对应的参数数值为模型的参数的最优取值。

步骤S5、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型性能评价。

具体过程为，在模型验证阶段，将验证集样本中的常规水质监测数据输入训练好的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型，输出相应样本的硝酸盐氮同位素丰度，数据反归一化处理后通过与验证集中样本的实测氮同位素丰度比较，并通过计算模型的决定系数R²，纳什系数NS，MSE评估模型的性能；R²代表预测值与观测之间的相关程度；NS可评估模型预测观测值的能力；MSE可评价模型的平均预测误差；R²＝1、NS＝1及MSE＝0，代表模型性能达到最优，R²，NS，MSE的具体计算公式如下：

在式(2)、(3)及(4)中，n代表测量值总数，O_i和P_i分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度和预测硝酸盐氮同位素丰度，

和

分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度平均值和预测硝酸盐氮同位素丰度平均值。

步骤S6、利用建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型测量未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

具体过程为，将未知水样样品按所述步骤S1的方法获取常规水质数据，导入已建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型获得所述未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

应用实施例

如图2至图4所示，对本发明实施例中的测定水体中硝酸盐氮同位素丰度的方法的应用场景做进一步说明：

第一步、获取水质监测数据。选取我国东南沿海地区某平原河网流域作为研究流域，于2019年4月份对河流进行了取样，共获得22个河流水体样本，测定每个样本的溶解氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐、总碳、总无机碳、总有机碳和氯离子浓度。其中，溶解氧通过溶解氧测定仪现场测定；氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐通过连续流动注射分析仪测定；总碳、总无机碳通过总有机碳分析仪测定，总有机碳为总碳和总无机碳之差；氯离子采用离子色谱测定。

第二步、利用细菌反硝化法对水体样本进行预处理，之后采用质谱分析测定每个水体样本的硝酸盐氮稳定同位素丰度。将致黄假单孢菌(Pseudomonas aureofaciens)菌株活化，划出单菌落。接种到5mL TSB-A培养液中，置摇床培养1天，接着转接到500mL培养瓶，置摇床培养7天。将菌液高速离心20min(转速5000～8000r·min^-1，温度18℃)，弃上清液，菌体悬浮于TSB-B培养液，浓缩成2倍浓度的菌液。吸取2～3mL菌液注入20mL顶空瓶，用流速为30～40mL·min^-1的高纯氮气吹扫1～3h，将0.4～3.5μg的样品注入顶空瓶并充分混匀，将顶空瓶倒置放入恒温箱(26℃)过夜培养。次日注入0.15mL的NaOH(10mol·L^-1)，将致黄假单孢菌裂解，同时吸收产生的CO₂。通过CTC-Combi PAL自动进样器(载气为高纯氦气，流量为50～60mL·min^-1)将顶空瓶中产生的N₂O气体输送至PreCon痕量气体预浓缩装置，经PreCon浓缩和捕集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪(IRMS,ISOPRIME-100)测定氮同位素组成。δ¹⁵N的测量精度为±0.2‰。

第三步、根据硝酸盐氮稳定同位素丰度数值从小到大的顺序对22组样本进行排序，每隔两个样本取一个样本作为验证集，其余样本作为训练集，最终，训练集包括15个样本，验证集包括7个样本。在模型训练之前，为防止数据间量纲不一致对结果造成的影响，先将训练集和验证集中的常规水质数据和硝酸盐氮稳定同位素丰度进行Z标准化处理。Z标准化处理后的训练集和验证集数据如图5所示。

第四步、在硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型训练阶段，采用网格全局搜索法结合5折交叉验证法优化SVR模型中惩罚参数C和径向基函数核参数γ的取值。参数C和γ的搜索范围设置为2^-10到2¹⁰，步长设置为2^0.5。图2是网格寻优法结合5折交叉验证寻找参数C和γ的最优取值过程3D视图。根据MSE最小时寻到的参数C和γ为最优值原则，确定C＝5.6569,γ＝0.1250。利用最佳C和γ，建立常规水质监测指标浓度与硝酸盐氮稳定同位素丰度间的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正SVR模型。

第五步、将验证集样本中的常规水质监测数据输入训练好的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正SVR模型，输出相应样本的硝酸盐氮同位素丰度，数据反归一化处理后通过与验证集中样本的实测氮同位素丰度比较，并通过计算模型的R²，NS，MSE评估模型的性能。如下图3所述为水体样本硝酸盐氮稳定同位素丰度实测值与SVR模型预测值的比较图。从图3可以看出验证集的R²为0.8040，NS为0.7987，MSE为2.2404‰，说明所建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正SVR模型预测结果准确，精度较高。并且，所述水体样本硝酸盐氮稳定同位素丰度实测值与SVR模型预测值的散点图如图4所示。图4表明，验证集中所有数据点较为紧密地聚集在1:1线(对角线)附近，说明所建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正SVR模型具有良好的预测能力，可以满足硝酸盐氮稳定同位素丰度定量检测的要求。

第六步、将未知水样样品按第一步的方法获取样品常规水质数据，导入已建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正SVR模型获得所述未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、获取水质监测数据；

步骤S2、利用稳定同位素质谱法测定每个水体样本的硝酸盐氮稳定同位素丰度；

步骤S3、将样本数据划分为训练集和验证集并进行归一化处理；

步骤S4、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型建模训练；

步骤S5、硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型性能评价；

步骤S6、利用建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型测量未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

2.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述的步骤S1具体包括：采集N个河流水体样本，测定其中水质指标浓度，水质指标包括但不限于溶解氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、总磷、正磷酸盐、总碳、总无机碳、总有机碳和氯离子。

3.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述的步骤S2具体包括：

步骤S21、将致黄假单孢菌菌株活化，划出单菌落，并接种到TSB-A营养液中，置摇床培养1天，接着转接到培养瓶中，置摇床培养7天，得到菌液；

步骤S22、将步骤S21中得到的菌液在高速离心机中以5000～8000r·min^-1的速度高速离心20min后，弃上清液，将离心后的菌体悬浮于TSB-B培养液，浓缩成2倍浓度的菌液；吸取2～3mL菌液注入20mL顶空瓶，用流速为30～40mL·min^-1的高纯氮气吹扫1～3h，将0.4～3.5μg的样品注入顶空瓶并充分混匀，将顶空瓶倒置放入恒温箱过夜培养,次日注入0.15mL浓度为10mol·L^-1的NaOH，将致黄假单孢菌裂解，同时吸收产生的CO₂，

步骤S23、通过自动进样器将顶空瓶中产生的N₂O气体输送至痕量气体预浓缩装置，进行浓缩和捕集N₂O气体，最后由同位素比质谱仪测定氮同位素组成。

4.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：

采用梯度法将样本数据划分为训练集和验证集；根据样本水体硝酸盐氮稳定同位素丰度数值从小到大的顺序对样本进行排序，每隔两个样本取一个样本作为验证集，其余样本作为训练集；

数据归一化采用Z标准化方法，Z标准化方法公式表达如下：

式(1)中，x为原始数据，x_n为归一化后的数据，x_mean为原始数据的均值，x_SD为原始数据的标准差。

5.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：

在模型训练阶段，采用网格全局搜索法结合5折交叉验证法优化支持向量机回归模型中惩罚参数C和径向基函数核参数γ的取值，建立常规水质监测指标浓度与硝酸盐氮稳定同位素丰度间的定量关系模型，得到用于预测水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型；

网格全局搜索法结合5折交叉验证法将均方误差值,即MSE作为参数优化的标准，当均方误差值最小时所对应的参数数值为模型参数的最优取值。

6.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：

在模型验证阶段，将验证集样本中的常规水质监测数据输入训练好的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型，输出相应样本的硝酸盐氮同位素丰度，数据反归一化处理后通过与验证集中样本的实测氮同位素丰度比较，并通过计算模型的决定系数R²，纳什系数NS，MSE评估模型的性能；R²代表预测值与观测之间的相关程度；NS可评估模型预测观测值的能力；MSE可评价模型的平均预测误差；R²＝1、NS＝1及MSE＝0，代表模型性能达到最优，R²，NS，MSE的具体计算公式如下：

在式(2)、(3)及(4)中，n代表测量值总数，O_i和P_i分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度和预测硝酸盐氮同位素丰度，

和

分别代表测量硝酸盐氮同位素丰度平均值和预测硝酸盐氮同位素丰度平均值。

7.根据权利要求1所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述步骤S6具体包括：

将未知水样样品按所述步骤S1的方法获取常规水质数据，导入已建立的硝酸盐氮稳定同位素丰度校正支持向量机回归模型获得所述未知水样的硝酸盐氮稳定同位素丰度。

8.根据权利要求3所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述的步骤S21中的TSB-A培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、1.0gKNO₃、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及1000mL纯净水，分装到500mL培养瓶，通过高压灭菌60min制得。

9.根据权利要求3所述的一种水体硝酸盐氮稳定同位素丰度的软测量方法，其特征在于，所述的步骤S21中的TSB-B培养液的配置过程为：取30g胰蛋白胨大豆肉汤、0.5g(NH₄)₂SO₄、4.9gK₃PO₄及2000mL纯净水，分装到100mL血清瓶，高压灭菌60min制得。

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