CN110982871A - 一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物，所述稀释液组合物包括：质量百分比为0.3％至0.9％氯化钠、0.3％至0.8％硫酸钠、0.6％至0.9％磷酸氢二钠、0.1％至0.2％磷酸二氢钠、0.2％至0.5％草酸钠、0.1％至0.3％叠氮钠、0.1％至0.3％乙二胺四乙酸以及纯水。本发明技术方案能够实现电阻细菌计数过程中样品稀释、仪器管路清洗及冲洗的功能；工艺简单，成本较低能够满足细菌计数的要求；颗粒物质含量少，降低本底；检测结果的重复性及稳定性好。

Description

一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物、制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物、制备方法及其应用。

背景技术

细菌计数可以用于检测样品中的细菌数量，其反映细菌的生长情况。例如，通过细菌计数反映生长环境对该细菌的繁殖作用是促进的还是抑制的。细菌计数可以通过常规的细菌计数法或细菌计数设备来实现。同时，在食品、饮料行业的质量控制过程、环境监测过程、药物安全性评价等方面的要求细菌计数的准确性。目前市面上的稀释液用于血液细胞分析仪，没有专门针对于细菌阻抗法仪器的稀释液，为了满足细菌计数的要求，有待开发专门用于细菌计数的稀释液。血液的计数与细菌的计数不同在于，细菌样本的粘度要小于血液样本的粘度，细菌计数中的细胞形态相对于血液样本要单一，同时大部分细菌的大小要小于血液中的细胞，故针对这些不同，有待提出一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物、制备方法及其应用。

发明内容

本申请的一个方面提供一种组合物，用于电阻法细菌计数过程中样本的稀释，仪器管路的清洗及反冲功能。所述稀释液组合物包括溶剂；添加剂，其选自无机盐类。

在一些实施例中，提供了一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物，上述稀释液组合物包括：质量百分比为0.3％至0.9％氯化钠、0.3％至0.8％硫酸钠、0.6％至0.9％磷酸氢二钠、0.1％至0.2％磷酸二氢钠、0.2％至0.5％草酸铵、0.1％至0.3％叠氮钠、0.1％至0.3％乙二胺四乙酸以及纯水。

在一些实施例中，上述稀释液组合物包括：质量百分比为0.46％氯化钠、0.52％硫酸钠、0.8％磷酸氢二钠、0.12％磷酸二氢钠、0.3％草酸铵、0.2％叠氮钠、0.2％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

在一些实施例中，上述稀释液组合物包括：质量百分比为0.3％氯化钠、 0.3％硫酸钠、0.9％磷酸氢二钠、0.1％磷酸二氢钠、0.5％草酸铵、0.1％叠氮钠、0.1％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

在一些实施例中，上述稀释液组合物包括：质量百分比为0.9％氯化钠、 0.8％硫酸钠、0.6％磷酸氢二钠、0.2％磷酸二氢钠、0.2％草酸铵、0.3％叠氮钠、0.3％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

在一些实施例中，提供了一种制备任意一项上述稀释液组合物的方法，上述方法包括：对所用器具进行清洗；对上述氯化钠、上述硫酸钠、上述磷酸氢二钠；上述磷酸二氢钠、上述草酸铵、上述叠氮钠、上述乙二胺四乙酸以及上述水进行称量；对上述氯化钠、上述硫酸钠、上述磷酸氢二钠；上述磷酸二氢钠、上述草酸铵、上述叠氮钠、上述乙二胺四乙酸以及上述水进行溶解，得到溶解物；对上述溶解物进行过滤，得到稀释液组合物；对上述稀释液组合物进行分装。

在一些实施例中，对分装好的上述稀释液组合物进行理化指标的检验。

在一些实施例中，上述对所用器具进行清洗，包括：对上述器具进行超声清洗和/或纯化水冲洗。

在一些实施例中，过滤上述溶解物，包括：对上述溶解物进行两次过滤，对上述溶解物进行两次过滤的滤膜孔径为0.1微米至1微米。

在一些实施例中，对上述溶解物进行两次过滤的滤膜孔径为0.22微米。

在一些实施例中，任一上述稀释液组合物在细菌电阻计数过程中对上述细菌的待测样本的稀释中的应用。

本发明技术方案中加入了硫酸钠用于稳定PH值，提高比密防止细菌成团；同时加入了草酸铵保证细菌计数的准确度，使细菌不变形；同时本发明采用过滤的滤膜孔径更小一些，能够更大程度上降低颗粒性物质的干扰，本发明技术方案具有以下优点：工艺简单，成本较低能够满足细菌计数的要求；颗粒物质含量少，降低本底；检测结果的重复性及稳定性好。

如本申请和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

{{组合物的描述}}

本申请公开了一种稀释液组合物，所述稀释液组合物可以用于细菌计数时对被计数样本的稀释。

在一些实施例中，所述测量方法可以是现有的细菌计数方法中的一种，例如，计数器测定法(又可以被称为镜检计数法)、电子计数器计数法(又可以被称为电阻计数法)、活细胞计数法、重量测定法等。在一些实施例中，所述测量方法可以为电阻计数法，所述测量方法可以为镜检计数法。

所述稀释液组合物在制备完毕后，其中所包含的细菌会在长时间的存放中发生解体。这样会导致长时间存放后(例如，存放半年、存放一年等) 的组合物中包含的细菌个数与在制备后的短时间内(例如，一天、一周等) 包含的细菌个数是不一致的。当两次测量得到的细菌个数相差太大时，所述组合物也失去了对于细菌计数的方法和/或设备的样本的稀释作用。

在一些实施例中，所述组合物可以包括溶剂以及添加剂。溶剂可以指用于溶解和/或稀释所述组合物中的其他组分(例如，细菌、固定剂、添加剂等)的液体。示例性的溶剂可以包括但不限于水、草酸铵、二甲亚砜、三氟乙酸、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、乙腈、乙酸、丙酮、吡啶、二氧六环、氯仿、异丙醇、四甲基乙二胺、三乙胺、甲酸甲酯、三丁胺、甲基乙基酮、乙酸乙酯、三辛胺、碳酸二甲酯、四氢呋喃、丙醇、正丁醇、二氯甲烷、苯、乙醚、异丙醚、正丁醚、三氯乙烯、二苯醚、二氯甲烷、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、己烷、石油醚等或其任意组合。优选地，所述溶剂可以为纯水。在一些实施例中，所述溶剂可以占所述组合物总体积的40％-75％。较为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的 41％-70％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的42％-65％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的43％-60％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的44％-59％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的45％-58％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的46％-57％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的47％-56％。更为优选地，溶剂可以占所述组合物总体积的48％-54％。更为优选地，溶剂可以占所述组合物总体积的54％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的53％。更优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的52％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的51％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的50％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的49％。特别优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的48％。

待测样本的细菌可以是组合物(使用稀释液组合物稀释后的待测样本) 中最终被计数的组分。在使用所述组合物对细菌计数设备或方法进行稀释时，在一些实施例中，所述细菌可以选自杆菌、球菌、螺旋菌等中的一种或其任意组合。优选地，所述细菌可以选自杆菌或球菌中的一种或其任意组合。示例性的杆菌可以包括但不限于产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、聚团肠杆菌、大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌、粘质沙雷菌、深红沙雷菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、产碱普罗维登菌、拉式普罗维登菌、沙门氏菌、枸缘酸杆菌、美洲爱文菌、水生布特维西菌、西地西菌、志贺氏菌、不动杆菌、双歧杆菌、黄杆菌、芽孢杆菌等或其任意组合。示例性的球菌可以包括但不限于金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、中间葡萄球菌、头葡萄球菌、解糖葡萄球菌、微球菌、铬黄肠球菌、牛链球菌、血液链球菌、中间链球菌、化脓性链球菌、β溶血链球菌、咽峡炎链球菌、溶血孪生球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、奈瑟菌等或其任意组合。优选地，细菌可以选自大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌中的一种或其组合。市售的标准菌株可以用于本申请所披露的组合物。仅作为示例，所述细菌可以选自的大肠埃希菌的ATCC 25922标准菌株、和/或金黄色葡萄球菌的ATCC 29213标准菌株。在一些实施例中，所述细菌的总浓度可以为105-109个/ml。较为优选地，所述细菌的总浓度可以为106-108个/ml。更为优选地，所述细菌的总浓度可以为106个/ml。更为优选地，所述细菌的总浓度可以为107个/ml。特别优选地，所述细菌的总浓度可以为108 个/ml。

添加剂可以是一种用于调节pH，使所述组合物中的组分在保存过程中能够保持其完整的特性的物质。在一些实施例中，所述添加剂可以选自无机盐类，其包括但不限于磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化钾、硫酸铜、硫酸钠、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、碳酸氢钠、硫酸锌、草酸铵、叠氮钠、乙二胺四乙酸等或其任意组合。优选地，所述添加剂可以包括氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠、乙二胺四乙酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或其任意组合。更为优选地，所述添加剂可以包括氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸。在一些实施例中，所述添加剂中包括的氯化钠的质量占所述组合物总质量的0.3％-0.9％。较为优选地，所述添加剂中包括的硫酸钠的质量占所述组合物总质量的0.3％-0.8％。更为优选地，所述添加剂中包括的磷酸氢二钠的质量占所述组合物总质量的0.6％-0.9％。更为优选地，所述添加剂中包括的草酸铵的质量占所述组合物总质量的0.2％-0.5％。更为优选地，所述添加剂中包括的叠氮钠的质量占所述组合物总质量的0.1％-0.3％。特别优选地，所述添加剂中包括的乙二胺四乙酸的质量占所述组合物总质量的0.1％-0.3％。特别优选地，所述添加剂中包括的氯化钠的质量占所述组合物总质量的0.5％。较为优选地，所述添加剂中包括的硫酸钠的质量占所述组合物总质量的0.6％。更为优选地，所述添加剂中包括的磷酸氢二钠的质量占所述组合物总质量的0.7％。更为优选地，所述添加剂中包括的草酸铵的质量占所述组合物总质量的0.4％。更为优选地，所述添加剂中包括的叠氮钠的质量占所述组合物总质量的0.2％。特别优选地，所述添加剂中包括的乙二胺四乙酸的质量占所述组合物总质量的0.2％。

需要注意的是，以上对于组合物、溶剂、细菌、添加剂的描述，仅为描述方便，并不能把本申请限制在所举实施例范围之内。可以理解，对于本领域的技术人员来说，在了解本申请的原理后，可能在不背离这一原理的情况下，对各个部分进行任意修改和改变。例如，所述固定剂可以通过物理的固定方法替代。示例性物理固定方法可以包括石蜡渗入法、低温冷冻法。诸如此类的变形，均在本申请的保护范围之内。

{{制备方法}}

制备所述组合物的一种通用方法可以包括，例如，将容器清洗干净后，按照配方的要求进行对原材料进行称量，对称量完的原材料进行充分溶解；通过滤膜进行二次过滤降低颗粒性物质的存在；按照灌装量的要求对配制好的稀释液进行分装；对配置好的稀释液进行理化指标的检验。

在获取所述稀释液组合物之后，还可以将所述稀释液组合物添加到待测样本中以对样本中的细菌进行计数，而起到稀释、冲洗功能。

以下进一步详细说明组合物的制备过程。

第一步，将所述添加剂溶于所述溶剂中获取稀释液。

在一些实施例中，所述添加剂可以是一种用于调节pH，使最终制备得到的组合物中的组分在保存过程中能够保持其完整的特性的物质。在一些实施例中，所述添加剂可以包括氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸。所述添加剂中包括的氯化钠的质量占所述组合物总质量的0.3％-0.9％。较为优选地，所述添加剂中包括的硫酸钠的质量占所述组合物总质量的0.3％-0.8％。更为优选地，所述添加剂中包括的磷酸氢二钠的质量占所述组合物总质量的0.6％-0.9％。更为优选地，所述添加剂中包括的草酸铵的质量占所述组合物总质量的 0.2％-0.5％。更为优选地，所述添加剂中包括的叠氮钠的质量占所述组合物总质量的0.1％-0.3％。特别优选地，所述添加剂中包括的乙二胺四乙酸的质量占所述组合物总质量的0.1％-0.3％。特别优选地，所述添加剂中包括的氯化钠的质量占所述组合物总质量的0.4％。较为优选地，所述添加剂中包括的硫酸钠的质量占所述组合物总质量的0.4％。更为优选地，所述添加剂中包括的磷酸氢二钠的质量占所述组合物总质量的0.7％。更为优选地，所述添加剂中包括的草酸铵的质量占所述组合物总质量的0.3％。更为优选地，所述添加剂中包括的叠氮钠的质量占所述组合物总质量的0.15％。特别优选地，所述添加剂中包括的乙二胺四乙酸的质量占所述组合物总质量的0.15％。特别优选地，所述添加剂中包括的氯化钠的质量占所述组合物总质量的0.8％。较为优选地，所述添加剂中包括的硫酸钠的质量占所述组合物总质量的0.7％。更为优选地，所述添加剂中包括的磷酸氢二钠的质量占所述组合物总质量的0.8％。更为优选地，所述添加剂中包括的草酸铵的质量占所述组合物总质量的0.4％。更为优选地，所述添加剂中包括的叠氮钠的质量占所述组合物总质量的0.25％。特别优选地，所述添加剂中包括的乙二胺四乙酸的质量占所述组合物总质量的0.25％。所述溶剂可以指用于溶解和/或稀释所述组合物中的其他组分(例如，细菌、添加剂等)的液体。所述溶剂可以是纯水。所述溶剂可以占所述组合物总体积的 40％-75％。较为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的41％-70％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的42％-65％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的43％-60％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的44％-59％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的45％-58％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的46％-57％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的47％-56％。更为优选地，溶剂可以占所述组合物总体积的48％-54％。更为优选地，溶剂可以占所述组合物总体积的54％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的53％。更优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的52％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的51％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的50％。更为优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的49％。特别优选地，所述溶剂可以占所述组合物总体积的48％。所述稀释液可以是所述添加剂完全溶解于所述溶剂中后得到的液体。。在一些实施例中，所述添加剂在称量完毕后，可以放置于用于溶解的仪器或设备中，例如，烧杯、试管、溶解槽等，进行溶解。上述仪器或设备中可以事先盛放有所述溶剂，或所述溶剂可以在所述添加剂放置完毕后加入。在一些实施例中，搅拌、加热等辅助操作，可以用于加快所述添加剂的溶剂。

第二步，过滤所述稀释液。

在一些实施例中，根据实际情况，可以对所述稀释液进行一次或以上次数的过滤，以除去稀释液中的杂质。过滤后的稀释液可以适用于灭菌、和无菌的检测。过滤的方式可以包括但不限于直接过滤、膜过滤等方式。示例性的直接过滤方式可以包括但不限于滤芯式过滤、细网式过滤等中的一种或其组合。示例性的膜过滤方式可以包括但不限于微孔过滤、超过滤、反渗透等中的一种或其任意组合的过滤方式。优选地，可以选用微孔滤膜对所述稀释液进行过滤。在一些实施例中，所述微孔滤膜可以包括醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚酰胺膜、聚四氟乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、无表面活性剂的纤维素乙酸膜、非对称聚醚砜、玻璃纤维膜等中的一种或其任意组合。在一些实施例中，所使用的微孔滤膜的直径可以小于或等于12μ m(微米)。较为优选地，所使用的微孔滤膜的直径可以小于或等于5μm。较为优选地，所使用的微孔滤膜的直径可以小于或等于1μm。更为优选地，所使用的微孔滤膜的直径可以为小于或等于0.8μm。更为优选地，所使用的微孔滤膜的直径可以小于或等于0.6μm。更为优选地，所使用的微孔滤膜的直径可以小于或等于0.4μm。更优选地，微孔滤膜的直径可以小于或等于0.3μm。更优选地，微孔滤膜的直径可以小于或等于0.22μm。更优选地，微孔滤膜的直径可以小于或等于0.12μm。优选通过0.22μm滤膜进行两次过滤，以降低颗粒性物质的存在。

第三步，按照灌装量的要求对配制好的稀释液进行分装。

在一些实施例中，所述稀释液可以是用于稀释包含所述细菌的组合物。

应当注意的是，所述细菌可以是所述组合物中最终被计数的组分，向过滤后的稀释液中加入的细菌为活细菌。所加入的细菌可以选自杆菌、球菌、螺旋菌等中的一种或其任意组合。优选地，所述细菌可以选自大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌。在一些实施例中，用于稀释包含所述细菌的组合物制备菌悬液的方法可以包括但不限于麦氏比浊法或麦氏比浊仪。麦氏比浊法可以是用于粗略判断菌悬液中的细菌浓度或细菌数量的方法，其通过调节待测菌悬液之间的浊度，使待测菌悬液的浊度与麦氏标准管的浊度相同或基本相同，得到待测菌悬液的浓度。仅作为示例，麦氏比浊法可以利用硫酸和氯化钡配制麦氏标准管号(例如，0.5麦氏标准管号、1麦氏标准管号、2麦氏标准管号、3麦氏标准管号、4麦氏标准管号)，生成硫酸钡沉淀的浊度可以对应于细菌浓度(例如，0.5麦氏对应的细菌浓度为1.5× 108个/ml、1麦氏对应的细菌浓度为3×108个/ml、2麦氏对应的细菌浓度为6×108个/ml、3麦氏对应的细菌浓度为9×108个/ml、4麦氏对应的细菌浓度为12×108个/ml)。通过比较待测菌悬液与麦氏标准管浊度判断出菌悬液的浓度。作为另一示例，麦氏比浊仪可以通过测量待测菌悬液直接显示麦氏单位的浊度值，根据国际通用麦氏浊度值(例如，0.5McF、1McF、2McF、3McF、4McF)与菌悬液的浓度(例如，0.5McF对应1.5×108个/ml、 1McF对应3×108个/ml、2McF对应6×108个/ml、3McF对应9×108个 /ml、4McF对应12×108个/ml)的关系表可以得到待测的菌悬液浓度。制备完毕的菌悬液，其所包含的细菌的浓度可以为105-109个/ml。较为优选地，所述菌悬液包含的细菌的浓度可以为106-108个/ml。更为优选地，所述菌悬液包含的细菌的浓度可以为106个/ml。更为优选地，所述菌悬液包含的细菌的浓度可以为107个/ml。特别优选地，所述菌悬液包含的细菌的浓度可以为108个/ml。

第四步，质检：对配置好的稀释液进行理化指标的检验。

需要注意的是，以上对于制备所述组合物流程的描述，仅为了示例和说明，而不限定本申请的适用范围。对于本领域的技术人员来说，在了解本申请的原理后，可能在不背离这一原理的情况下，可以对该流程100进行任意修正和改变。然而这些修正和改变仍在本申请的范围之内。

{{用于细菌电阻计数的稀释液组合物的应用方法}}

在一些实施例中，所述稀释液组合物可以用于细菌计数的待测样本的稀释。例如，所述组合物可以用于待测细菌计数方法或设备。待校验的细菌计数方法或设备可以使用所述组合物进行细菌待测液的稀释。以下进一步详细说明使用本申请的稀释液组合物对细菌计数的待测样本的稀释的过程。

第一步，按照上述制备方法制备本申请稀释液组合物。

在一些实施例中，所述细菌计数方法可以包括电子计数、镜检、活细胞计数、细胞重量法等中的一种或其任意组合。所述细菌计数设备可以是采用如上所述的细菌计数方法实现细菌计数的设备。所述细菌计数可以是利用所述细菌计数方法在现有步骤下或利用所述细菌计数设备在现有状态下对所述组合物中的细菌进行计数得到的数值。实现所述细菌计数的所有步骤或运行所述细菌计数设备即可得到所述测取值。

第二步，按照一定比例使用本申请稀释液稀释包含细菌计数的待测样本。

在一些实施例中，一定比例可以示例性的选择为1:5-1:50，即按照1:5 至1:50的比例使用本申请稀释液稀释包含细菌计数的待测样本。

本申请实施例可能带来的有益效果包括但不限于：本申请所披露的组合物可以用于细菌计数设备或方法的校验，其准确性高、稳定性好。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。

具体实施方式

下面将参考若干示例性实施方式来描述本发明的原理和精神。应当理解，给出这些实施方式仅仅是为了使本领域技术人员能够更好地理解进而实现本发明，而并非以任何方式限制本发明的范围。相反，提供这些实施方式是为了使本申请公开更加透彻和完整，并且能够将本申请公开的范围完整地传达给本领域的技术人员。

下面通过具体实施例对本申请做进一步阐述。

实施例1-稀释液组合物的制备

制备过程如下：

第一步，清洗准备：对容器进行超声清洗及纯水冲洗，保证清洁干净；

第二步，称量：按照表1中配方的要求进行对原材料进行称量；

第三步，将氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸(EDTA)溶于纯水中进行溶解，得到溶解液；

第四步，用直径为0.1微米至1微米的微孔滤膜将溶解好的上述溶解液进行两次过滤，得到稀释液；

第五步，分装：按照灌装量的要求对配制好的上述稀释液进行分装，得到稀释液组合物；

第六步，质检：对配置好的上述稀释液进行理化指标的检验，合格的稀释液组合物备用。

表1.

实施例2-稀释液组合物的制备

制备过程如下：

作为实施例1的其中一组稀释液组合物的详细制备过程，以上述稀释液A 组方为示例，第一步，清洗准备：对容器进行超声清洗及纯水冲洗，保证清洁干净；第二步，称量：对原材料进行称量：取氯化钠4.6g、硫酸钠5.2g、磷酸氢二钠8g、磷酸二氢钠1.2g、草酸铵3g、叠氮钠2g、乙二胺四乙酸(EDTA)2g，以及纯水1L；第三步，将氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸(EDTA)溶于纯水中进行溶解，得到溶解液；第四步，用直径为0.22μm的微孔滤膜将溶解好的稀释液进行两次过滤，得到稀释液；第五步，分装：按照灌装量的要求对配制好的上述稀释液进行分装，得到稀释液组合物；第六步，质检：对配置好的稀释液进行理化指标的检验，合格的稀释液组合物备用。

实施例3-稀释液组合物的制备

制备过程如下：

作为实施例1的其中一组稀释液组合物的详细制备过程，以上述稀释液B 组方为示例，第一步，清洗准备：对容器进行超声清洗及纯水冲洗，保证清洁干净；第二步，称量：对原材料进行称量：取氯化钠3g、硫酸钠3g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1g、草酸铵5g、叠氮钠1g、乙二胺四乙酸(EDTA) 1g，以及纯水1L；第三步，将氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸(EDTA)溶于纯水中进行溶解；第四步，用直径为0.4μm的微孔滤膜将溶解好的稀释液进行两次过滤，得到稀释液；第五步，分装：按照灌装量的要求对配制好的上述稀释液进行分装，得到稀释液组合物；第六步，质检：对配置好的上述稀释液进行理化指标的检验，合格的稀释液组合物备用。

实施例4-稀释液组合物的制备

制备过程如下：

作为实施例1的其中一组稀释液组合物的详细制备过程，以上述稀释液C 组方为示例，第一步，清洗准备：对容器进行超声清洗及纯水冲洗，保证清洁干净；第二步，称量：对原材料进行称量：取氯化钠9g、硫酸钠8g、磷酸氢二钠6g、磷酸二氢钠2g、草酸铵2g、叠氮钠3g、乙二胺四乙酸(EDTA) 3g，以及纯水1L；第三步，将氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、草酸铵、叠氮钠和乙二胺四乙酸(EDTA)溶于纯水中进行溶解；第四步，用直径为0.3μm的微孔滤膜将溶解好的稀释液进行两次过滤，得到稀释液；第五步，分装：按照灌装量的要求对配制好的上述稀释液进行分装，得到稀释液组合物；第六步，质检：对配置好的上述稀释液进行理化指标的检验，合格的稀释液组合物备用。

实施例5-稀释液组合物的制备

制备过程如下：

实施例1的稀释液组合物的详细制备过程，上述稀释液D组方、稀释液E 组方、稀释液F组方、稀释液G组方、稀释液H组方、稀释液I组方以及稀释液J组方与实施例2至实施例4的制备过程相同，区别在于按照实施例1表1中的组方不同称量主要成分，且在对所述溶解物进行两次过滤的滤膜孔径可以在0.1微米至1微米中选取。

实施例6-配方的确定

实验目的：通过稀释液的配制，确定更加适应仪器的配方及重复性及稳定性更好的试剂。

实验步骤:

1.分别按照实施例1至实施例5的制备方法制备上述稀释液组合物。

2.分别检测上述稀释液组合物的理化指标PH值、电导率及渗透压，是否符合要求。

3.挑取0.5麦氏的细菌，稀释100倍，进行10次测量，对比检测数据的稳定性。

实验结果记录：

上述稀释液组合物理化指标测定如表2所示：

表2

重复性测定的结果如表3所示：

表3

电阻计数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	CV
												A组分	364	383	367	372	374	383	367	364	372	374	1.85％
B组分	350	378	351	361	342	354	372	364	339	356	3.46％
												C组分	334	351	354	361	384	351	354	361	361	384	4.21％
D组分	354	365	372	380	365	356	371	369	382	364	2.46％
												E组分	354	384	354	374	364	381	352	374	374	364	3.16％
F组分	351	364	383	367	386	334	364	351	354	361	4.26％
												G组分	351	347	361	384	354	376	381	349	356	363	3.75％
H组分	367	372	374	364	383	347	361	387	354	346	3.83％
												I组分	384	354	346	347	361	354	374	384	347	361	4.07％
J组分	381	361	361	383	367	361	361	383	383	367	2.79％

实验结果分析

在现有配方的情况下均能满足细菌计数仪对理化指标的要求，同时进行重复性的实验结果CV均低于5％。

本发明的主要作用为电阻法细菌计数仪器进行细菌计数过程中对包含上述细菌的待测样本的稀释，仪器管路的清洗及反冲功能，这个清洗和反冲是在测试的过程中进行的。与血液细胞分析仪的稀释液不同的是本发明中的稀释液是针对于细菌计数仪进行的单独配方，能够实现细菌计数过程中稀释的功能，对于细胞分析仪的样本来说，主要存在于血液样本比较复杂，但细菌样本较为简单，且重点解决了细菌抱团生长，进行分散的问题。

实施例7-稀释液组合物的稀释效果

选取市售迈瑞的细胞计数仪稀释液(现有技术)作为对比试剂代替细菌计数，分别检测批号为201900804的迈瑞稀释液组合物的理化指标PH 值、电导率及渗透压。

其对比数据如下：

1、理化指标测定如表4所示

表4

指标	要求指标	实测值
			PH值	6.8～7.5	7.1
电导率	12～18sm/cm	16.7
			渗透压	260～320Mosm/kg。	279

挑取0.5麦氏的ATCC25922，稀释100倍，分别用本发明实施例2试剂及市售临床效果最好的迈瑞稀释液(实施例7的现有技术对比试剂)进行10次电阻计数。

2、重复性数据结果如表5所示

表5

试剂	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均值	CV
													迈瑞对比试剂	343	256	317	318	296	351	282	314	369	301	314	10.7％
实施例2试剂	364	383	367	372	374	383	367	364	372	374	372	1.85％

实验结论，使用市售稀释液(现有技术对比试剂)其理化指标均符合要求，但是稀释后重复性较差，变异系数达到10以上，不能保证实验结果的准确性，而对于本发明实施例2试剂的配方，其数据重复性好，且现有技术对比试剂的电阻计数值比较小，其平均值为314，小于本发明实施例2试剂的电阻计数值平均值372，同时实施例1至5的稀释后重复性均较好，和现有技术相比，有意向不到的技术效果。说明本发明实施例在解决细菌抱团问题上有较大的优势，细菌抱团生长，如果稀释液未能对其分散开，细菌电阻计数值会小，反之会更接近于单个细菌个数，故本发明实施例在分散细菌抱团上有意向不到的效果。

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本申请的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本申请进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本申请中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本申请示范实施例的精神和范围。

同时，本申请使用了特定词语来描述本申请的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本申请至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本申请的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

此外，本领域技术人员可以理解，本申请的各方面可以通过若干具有可专利性的种类或情况进行说明和描述，包括任何新的和有用的工序、机器、产品或物质的组合，或对他们的任何新的和有用的改进。

此外，除非权利要求中明确说明，本申请所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本申请流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本申请实施例实质和范围的修正和等价组合。

同理，应当注意的是，为了简化本申请披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本申请实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本申请对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。

一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本申请一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。

针对本申请引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本申请作为参考。与本申请内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本申请权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本申请中的)也除外。需要说明的是，如果本申请附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本申请所述内容有不一致或冲突的地方，以本申请的描述、定义和 /或术语的使用为准。

最后，应当理解的是，本申请中所述实施例仅用以说明本申请实施例的原则。其他的变形也可能属于本申请的范围。因此，作为示例而非限制，本申请实施例的替代配置可视为与本申请的教导一致。相应地，本申请的实施例不仅限于本申请明确介绍和描述的实施例。

Claims (10)

1.一种用于细菌电阻计数的稀释液组合物，其特征在于，所述稀释液组合物包括：质量百分比为0.3％至0.9％氯化钠、0.3％至0.8％硫酸钠、0.6％至0.9％磷酸氢二钠、0.1％至0.2％磷酸二氢钠、0.2％至0.5％草酸铵、0.1％至0.3％叠氮钠、0.1％至0.3％乙二胺四乙酸以及纯水。

2.如权利要求1所述的稀释液组合物，其特征在于，所述稀释液组合物包括：质量百分比为0.46％氯化钠、0.52％硫酸钠、0.8％磷酸氢二钠、0.12％磷酸二氢钠、0.3％草酸铵、0.2％叠氮钠、0.2％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

3.如权利要求1所述的稀释液组合物，其特征在于，所述稀释液组合物包括：质量百分比为0.3％氯化钠、0.3％硫酸钠、0.9％磷酸氢二钠、0.1％磷酸二氢钠、0.5％草酸铵、0.1％叠氮钠、0.1％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

4.如权利要求1所述的稀释液组合物，其特征在于，所述稀释液组合物包括：质量百分比为0.9％氯化钠、0.8％硫酸钠、0.6％磷酸氢二钠、0.2％磷酸二氢钠、0.2％草酸铵、0.3％叠氮钠、0.3％乙二胺四乙酸以及1升纯水。

5.一种制备根据权利要求1至4中任意一项所述稀释液组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

对所用器具进行清洗；

对所述氯化钠、所述硫酸钠、所述磷酸氢二钠；所述磷酸二氢钠、所述草酸铵、所述叠氮钠、所述乙二胺四乙酸以及所述水进行称量；

对所述氯化钠、所述硫酸钠、所述磷酸氢二钠；所述磷酸二氢钠、所述草酸铵、所述叠氮钠、所述乙二胺四乙酸以及所述水进行溶解，得到溶解物；

对所述溶解物进行过滤，得到稀释液组合物；

对所述稀释液组合物进行分装。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对分装好的所述稀释液组合物进行理化指标的检验。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对所用器具进行清洗，包括：对所述器具进行超声清洗和/或纯化水冲洗。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，过滤所述溶解物，包括：对所述溶解物进行两次过滤，对所述溶解物进行两次过滤的滤膜孔径为0.1微米至1微米。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对所述溶解物进行两次过滤的滤膜孔径为0.22微米。

10.权利要求1至5任一所述稀释液组合物在细菌电阻计数过程中对所述细菌的待测样本的稀释中的应用。