CN110964794A - 适用于dna编码化合物测序文库测序的引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于DNA编码化合物库测序的测序引物，它是由DNA编码化合物扩增引物序列、接头序列与测序引物序列连接而成的序列。本发明提供的引物可以提高DNA编码化合物库的测序质量，还可实现一步测序，应用前景优良。

Description

适用于DNA编码化合物测序文库测序的引物
技术领域
本发明公开了一种适用于DNA编码化合物测序文库构建测序的引物。
背景技术
DNA编码化合物库技术结合了组合化学和分子生物学技术，通过将一个片段化合物与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库。其中，化合物库中每一个化合物都由不同片段化合物组成，并由相应的特异碱基序列的DNA进行编码标识。目前工业上应用的DNA编码化合物库的规模可以达到千亿至万亿级，能通过筛选和测序的方法进行识别。该技术使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效，已成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of Chemical Research，2014，47，1247-1255)。
经过筛选后得到的DNA编码化合物需要通过测序确定其独特的DNA编码序列标识，才能分析得到其相应的结构信息。DNA编码化合物测序与常规的基因组DNA测序不同，DNA编码化合物由一系列的化合物混合物与其对应的DNA标签组成，因此需要扩增出DNA编码化合物的双链DNA进行测序。常规基因组DNA需要通过片段化之后进行建库测序，而DNA编码化合物的片段通常在100-150bp，不需要通过片段化，直接扩增出目的片段进行建库测序。常规基因组DNA的碱基多样性较好，而DNA编码化合物库使用的碱基多样性较差，使用常规测序方法对DNA编码化合物进行测序时，测序质量较低。另外常规建库方法先扩增出DNA编码化合物的双链DNA，经过末端修复加A、连接测序接头和PCR扩增形成测序文库，该方法需要四步操作，特别是多步PCR会引入更多的扩增偏差，从而影响DNA编码化合物的筛选样品富集化合物对应DNA分子的真实性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种适用于DNA编码化合物测序的扩增引物及其使用方法。本发明还提供了一种测序引物，只需用一步PCR扩增即可得到测序文库，进而完成测序，极大节省时间和成本，且更能反应DNA编码化合物的筛选样品富集化合物对应DNA分子的真实性。
本发明提供了一种适用于DNA编码化合物库测序的扩增引物，它包括接头序列、DNA编码化合物扩增引物序列连接而成的序列。
其中，所述接头序列的长度为2-8bp。
其中，所述引物的前5-8个碱基的A、T、C、G的含量均在10％～40％范围内；优选的，含量在20％～30％范围内。
前5～8个：是指前5个、前6个、前7个或者前8个。
其中，接头序列与DNA编码化合物扩增引物序列不形成互补序列、回文序列、发卡结构。
其中，所述引物中不出现3个以上连续的相同碱基、5个以上连续的配对碱基。
配对碱基指GC或AT，即不出现GCGCC这种情况。
本发明还提供了一种适用于DNA编码化合物库测序的测序引物，它是由前述引物与测序引物序列连接而成的序列。
优选地，所述引物由测序引物序列、接头序列、DNA编码化合物扩增引物序列依次连接而成的序列。
本发明还提供了一种适用于DNA编码化合物测序文库构建的方法，包括以下步骤：
(1)使用前述的测序引物对筛选后的DNA编码化合物进行PCR扩增；
(2)对PCR产物进行纯化。
其中，所述纯化的方法是：吸附柱纯化方法、电泳纯化方法或磁珠纯化方法。
采用多条不同的前述测序引物扩增时，得到接头序列错位的测序文库，所述测序文库前5～8轮的每一轮测序中，测序样本中的A、T、C、G的含量均为20～30％；优选的，含量为24～26％。
本发明还提供了前方法构建的测序文库。
本发明中，DNA编码化合物扩增引物序列是指能与DNA编码化合物中DNA标签上带有的特殊序列对应，用于PCR扩增DNA标签的序列。
本发明中，测序引物序列是指适用于各种测序仪器的特异性序列。根据所选用的测序仪器的不同，可以使用不同的测序引物序列。
本发明适用于DNA编码化合物库测序的扩增引物，具有如下有益效果：
本发明的扩增引物，可有效实现DNA编码化合物中DNA标签的扩增，扩增后的序列用于常规测序建库(加A碱基，连接测序接头)，可实现较高的数据利用度：其完美匹配率是60％以上，未匹配率在20％以下。
本发明的适用于DNA编码化合物库测序的测序引物，相比现有的扩增引物，增加了接头序列和测序引物序列，具有如下有益效果：
1)可实现较高的数据利用度：其完美匹配率是60％以上，未匹配率在20％以下；
2)提高测序质量，大幅度提高碱基测序质量＞Q30的比例；
3)可以实现一步测序，简化操作步骤，降低检测成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1常规建库方法和实施例2本发明建库方法的PCR扩增产物电泳图。其中条带1条带2为常规建库方法的PCR扩增产物；条带3和条带4为本发明建库方法的PCR扩增产物。
图2为实施例1常规建库方法的第二步PCR扩增产物。
图3为实施例1常规建库方法和实施例2本发明建库方法的测序数据利用率比较。
图4为实施例1常规建库方法(图4a)和实施例2本发明建库方法(图4b)的样品均一性比较。
图5为实施例1常规建库方法和实施例2本发明建库方法生物学重复比较。
图6为实施例3无接头序列的常规建库方法的测序质量＞Q30的比例；横轴，测序质量＞Q30的比例；纵轴，测序反应的各个循环。
图7为实施例3带有接头序列本发明建库法的测序质量Q30；横轴，测序质量＞Q30的比例；纵轴，测序反应的各个循环。
具体实施方式
实施例1通过常规方法建立DNA编码化合物测序文库
1.PCR扩增
按照如下扩增引物序列和扩增方法，对筛选后的DNA编码化合物进行扩增，设置两个生物学重复，分别标记为S1和S2，同时设置阴性对照。
Figure BDA0002221313570000031
Figure BDA0002221313570000041
PCR扩增体系为30μL筛选后的DNA编码化合物、4μL的5’-引物、4μL的3’-引物、100μL的Q5热启动超保真2X预混液和62μL的ddH2O，每个样本总共200μL。
PCR反应程序为：第一步：98℃维持10分钟；第二步：98℃维持10秒，55℃维持10秒，72℃维持10秒，并重复18次；第三步：72℃维持10分钟后冷却至4℃。
取样电泳检测PCR产物。对每个样品取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。DNA编码化合物库筛选样品经过该上下游引物PCR扩增后片段大小为100～130bp左右，图1所示的PCR产物约为120bp，因此PCR扩增后得到的DNA片段大小是符合预期的。
使用Qiagen公司的QIAquick PCR Purification Kit对PCR产物进行纯化回收。
2.测序文库构建
使用life公司的Qubit dsDNA HS Assay Kit试剂盒按照其标准操作流程对上述样本进行定。
取10ng样本以及EB缓冲液，使其终体积为16μL。按如下反应体系在冰上进行End-Repair&Adenylation：16μL样本(10ng)、7.5μL的NEXTflexTMEnd-Repair&AdenylationBuffer Mix、1.5μL的NEXTflexTMEnd-Repair&Adenylation Enzyme Mix，总共25μL。将上述样本在22℃温浴上维持20分钟，然后在72℃温浴上维持20分钟。
按如下反应体系在冰上进行3’Adapter Ligation：25μL的End Repaired样本、23.75μL的NEXTflexTM Ligation Mix、1.25μL的NEXTflexTM DNA Barcode(0.6uM)，总共50μL。将上述样本置于22℃温浴上维持15分钟。
使用Beckman公司的AMPure XP beads(1.6倍体积比磁珠)对上述样品进行纯化。
按如下反应体系在冰上进行PCR Amplification：5μL的Ligated样本、13μL的Nuclease free H2O、6μL的NEXTflexTM PCR Master Mix、1μL的NEXTflexTM Primer Mix，总共25μL。将上述样本按照如下程序进行PCR：第一步：98℃维持2分钟；第二步：98℃维持30秒，65℃维持30秒，72℃维持60秒，并重复13次；第三步：72℃维持4分钟后冷却至4℃。
每个样本取1μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
对样本进行2％琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段，使用Omega公司的E.Z.N.A GelExtraction Kit进行胶回收。使用Beckman公司的AMPure XP beads(1.6倍体积比磁珠)对上述样本进行纯化，纯化后即可得到常规方法的测序文库。
3.测序
对常规方法得到的测序文库进行Qubit定量，通过Illumina Hiseq2500平台进行测序。
实施例2通过本发明方法建立DNA编码化合物测序文库
按照如下扩增引物序列和扩增方法，对与实施例1中相同的筛选后的DNA编码化合物进行扩增，设置两个生物学重复，分别标记为S1-ONE和S2-ONE，同时设置阴性对照。
1.引物：
Figure BDA0002221313570000051
2.建库方法：
PCR扩增体系为30μL筛选后的DNA编码化合物、4μL的5’-引物、4μL的3’-引物、100μL的Q5热启动超保真2X预混液和62μL的ddH2O，每个样本总共200μL。
PCR反应程序为：第一步：98℃维持10分钟；第二步：98℃维持30秒，70℃维持30秒，72℃维持30秒，并重复18次；第三步：72℃维持10分钟后冷却至4℃。
每个样本取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
使用Qiagen公司的QIAquick PCR Purification Kit对PCR产物进行纯化回收。对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段，使用Omega公司的E.Z.N.A GelExtraction Kit进行胶回收。使用Beckman公司的AMPure XP beads(1.6倍体积比磁珠)对上述样品进行纯化，纯化后即可得到本发明方法的测序文库。
3.测序：
对本发明方法得到的测序文库进行Qubit定量，通过Illumina Hiseq2500平台进行测序。
从测序结果(图3)可以看出，用本发明的扩增引物(不带测序引物序列)结合常规建库方法，以及本发明测序引物结合一步扩增建库方法(本发明的测序文库构建方法)，均可得到较高的数据利用率，其完美匹配率是均在60％以上，未匹配率均在在20％以下。本发明的测序文库构建方法相比常规建库方法，数据利用率略高。
图4显示本发明方法相比于常规方法测序数据更偏向PerfMatchDegen，表明测序文库的样本均一性更好。
另外，本发明方法的生物学重复性也与常规方法一致(图5)。
实施例3无接头序列的常规建库方法与带有接头序列本发明建库法测序质量比较
二代测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。质量值(Q)越高代表碱基被测错的概率(P)越小，其计算公式为Q＝-101gP。因此，当某单个碱基的Q≥30(有时候也写成“质量≥Q30”)时，代表该碱基被测错的概率低于1‰。对于整条测序读段(reads)而言，通常测序质量＞Q30的碱基占比大于85％时，才被认为测序质量良好。
以下将比较无接头序列的常规建库方法以及本发明建库方法对应测序反应得到的Q30比例。
1.无接头序列的常规建库方法
按照上述(实施例1)的常规建库方法，使用不带有接头序列的扩增引物，对4个DNA编码化合物库的筛选样品进行建库和上机测序。建库引物如下：
Figure BDA0002221313570000061
Figure BDA0002221313570000071
2.带有接头序列的本发明建库法
按照本发明的建库方法(实施例2)，对4个DNA编码化合物库的筛选样品(与本实施例第1节所用样品来源相同)进行建库和上机测序。建库引物如下：
Figure BDA0002221313570000072
Figure BDA0002221313570000081
测序结果如图6-7所示，常规方法测序质量＞Q30的读段难以超过90％，而本发明带有接头序列的建库方法测序质量＞Q30的读段多数在98％以上。带有接头序列的本发明建库法与无接头序列的常规建库方法相比，测序质量显著提高。
实验证明，本发明提供的扩增引物和测序引物，均可实现较高的数据利用度；本发明的测序引物，还具有测序质量高、建库操作简便等优点。
总之，本发明能够很好地适用于DNA编码化合物的DNA编码标签的测序，取代传统的DNA测序相关引物和建库方法，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都先导药物开发股份有限公司
<120> 适用于DNA编码化合物测序文库测序的引物
<130> GY167-2019P016954CCZ
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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cgatctagcc ctcgcgccag aatctct 87

Claims (11)

1.一种适用于DNA编码化合物库测序的扩增引物，其特征在于：它包括接头序列、DNA编码化合物扩增引物序列连接而成的序列。
2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于：所述接头序列的长度为2-8bp。
3.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于：所述引物的前5-8个碱基的A、T、C、G的含量均在10％～40％范围内；优选的，含量在20％～30％范围内。
4.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于：接头序列与DNA编码化合物扩增引物序列不形成互补序列、回文序列、发卡结构。
5.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于：所述引物中不出现3个以上连续的相同碱基、5个以上连续的配对碱基。
6.一种适用于DNA编码化合物库测序的测序引物，其特征在于：它是由权利要求1～5任意一项所述引物与测序引物序列连接而成的序列。
7.根据权利要求6所述的测序引物，其特征在于：所述引物由测序引物序列、接头序列、DNA编码化合物扩增引物序列依次连接而成的序列。
8.一种适用于DNA编码化合物测序文库构建的方法，包括以下步骤：
(1)使用权利要求6或7所述的测序引物对筛选后的DNA编码化合物进行PCR扩增；
(2)对PCR产物进行纯化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述纯化的方法是：吸附柱纯化方法、电泳纯化方法或磁珠纯化方法。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：采用多条不同的权利要求6或7所述的测序引物扩增时，得到接头序列错位的测序文库，所述测序文库前5～8轮的每一轮测序中，测序样本中的A、T、C、G的含量均为20～30％；优选的，含量为24～26％。
11.权利要求8～10任意一项所述方法构建的测序文库。
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