CN110964736A - 一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法，所述体外蛋白合成体系，包括组分：(a)细胞提取物，(b)吸附剂：所述吸附剂用于提高蛋白合成效率，(c)氨基酸，(d)无或NTPs，(e)外源DNA分子。本发明提供了一种提高体外蛋白合成效率的方法，所述方法采用本发明第一方面所述合成体系，包括步骤：(1)混合，(2)加入外源DNA分子，（3）孵育合成，（4）后处理，以及还包括一步骤：在所述步骤（1)或（2）之后，加入吸附剂。此外，还提供了一种体外蛋白合成体系的试剂盒。本发明可显著提高外源蛋白的合成效率。

Description

一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、 试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、试剂盒。

背景技术

生物反应即生物化学反应，就是指在生物体内进行的化学反应，这些反应都由酶催化，酶和反应物溶于内环境的水中，才能发生反应，水为体内物质提供载体和介质[1]。在20世纪的最后几十年里，生物化学在解释生命过程方面已经取得了非常大的成就，现在几乎植物学，医学，遗传学等生命科学相关的领域都有从事生物化学研究[2]。

传统的蛋白表达系统是指通过模式生物，包括细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的一种多步级联生物化学反应术[3-4]。随着科学技术的发展，无细胞表达体系也称为体外蛋白合成系统应运而生，其是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成[5-7]。体外翻译系统中表达蛋白质无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式[8]。随着科学技术的发展，蛋白合成体系已经开始得到广泛应用。

在生物体或细胞中所进行的生物化学反应，在复杂的网络体系中都可以通过正、负反馈得到自动调控，并且在生物体中所进行的生物化学反应都是远离平衡点的反应，它需要从外界获取能量或向外界输出物质、能量和熵[9]。在细胞内，生物反应的副产物去除主要是靠机体新陈代谢、机体稳态的维持、生物酶的催化作用以及细胞内远离平衡点的氧化还原反应达到，但这些生化反应在体外生物技术是难以实现的[10]。另外，蛋白合成体系存在的一个缺点是产量不高，反应不够快速、灵敏，体外生物合成体系中，一方面是反应过程会产生抑制蛋白合成的副产物（自由磷酸根离子、焦磷酸离子(PPi)）；另一方面是反应体系中，比如细胞提取物中可能本身会含有对反应不利的成分；还有反应体系环境参数的变化，比如pH值的变化，都会影响反应的进行与蛋白产率。

目前已知有其他去除反应副产物的方法如通过半透膜允许小分子在反应混合物和透析液之间被动扩散的方法进行半连续反应来控制副产物如自由磷酸根离子。但存在着半透膜透析装置成本高，反应体系不能进行扩大化，反应产物容易堵塞半透膜孔的缺陷。

因此，本领域迫切需要开发并建立一种能够在体外蛋白合成体系中，通过原位去除（in situ removal）的方式在蛋白合成体系中控制相关抑制反应的不利因素，来提高蛋白合成效率的方法。

发明内容

本发明提供一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、试剂盒，采用本发明的合成体系和方法，通过向合成体系中添加吸附剂，可以提高体外蛋白合成效率。

本发明第一方面提供了一种体外蛋白合成体系，包括组分：

(a) 细胞提取物

(b) 吸附剂

所述吸附剂用于提高蛋白合成效率；

(c) 氨基酸

(d) 无或NTPs

(e) 外源DNA分子

进一步地，所述组分(a)与组分(b)的质量比为0.1-10：0.1-10，较佳地，0.5-8:0.5-8，更佳地，0.8-5：0.8-5，更佳地，0.9-2：0.9-2。

在另一优选例中，所述的氨基酸包括：1-20种天然氨基酸、以及非天然氨基酸。

在另一优选例中，所述氨基酸为选自下组：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或其组合。

在另一优选例中，所述氨基酸包括D型氨基酸和/或L型氨基酸。

在另一优选例中，所述的DNA分子为线性的。

在另一优选例中，所述的DNA分子为环状的。

在另一优选例中，所述的DNA分子含有编码外源蛋白的序列。

在另一优选例中，所述的编码外源蛋白的序列包括基因组序列、cDNA序列。

在另一优选例中，所述的编码外源蛋白的序列还含有启动子序列、5'非翻译序列、3'非翻译序列。

进一步地，所述吸附剂的粒径为0.5-10 mm，较佳地，0.8-4.0 mm，更佳地，1.0-2.0mm。

进一步地，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为木质活性炭、煤质活性炭、果壳活性炭、石油类活性炭、再生炭、矿物质原料活性炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为木质活性炭、煤质活性炭、果壳活性炭、石油类活性炭、再生炭、矿物质原料活性炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为粉末状性炭、颗粒状性炭、柱状炭、球形炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭为磁性活性炭。

进一步地作为优选，所述沸石为改性沸石。

在另一优选例中，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：原核细胞、真核细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、或其组合。

进一步地，所述细菌为大肠杆菌。

进一步地，所述哺乳动物细胞为HF9、Hela、CHO或HEK293。

在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。

在另一优选例中，所述细胞提取物包括酵母细胞提取物。

在另一优选例中，所述的酵母细胞提取物为对酵母细胞的水性提取物。

在另一优选例中，所述酵母细胞提取物不含酵母内源性的长链核酸分子。

在另一优选例中，所述的酵母细胞提取物是用包括以下步骤的方法制备：

（i）提供酵母细胞；

（ii）对酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的酵母细胞；

（iii）对经洗涤的酵母细胞进行破细胞处理，从而获得酵母粗提物；和

（iv）对所述酵母粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为酵母细胞提取物。

在另一优选例中，所述的固液分离包括离心。

在另一优选例中，在液态下进行离心。

在另一优选例中，所述离心条件为5000-100000 g，较佳地，8000-30000 g。

在另一优选例中，所述离心时间为0.5 min-2 h，较佳地，20 min-50 min。

在另一优选例中，所述离心在1-10 ℃下进行，较佳地，在2-6 ℃下进行。

在另一优选例中，所述的洗涤处理采用洗涤液在pH为7-8（较佳地，7.4）下进行处理。

在另一优选例中，所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。

在另一优选例中，所述的破细胞处理包括高压破碎、冻融（如液氮低温）破碎。

进一步地，所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：镁离子、钾离子、缓冲剂、能量再生系统、聚乙二醇、、磷酸盐、RNA聚合酶、二硫苏糖醇(DTT)和任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。

在另一优选例中，所述镁离子来源于镁离子源，所述镁离子源选自下组：醋酸镁、谷氨酸镁、或其组合。

在另一优选例中，所述钾离子来源于钾离子源，所述钾离子源选自下组：醋酸钾、谷氨酸钾、或其组合。

在另一优选例中，所述能量再生系统选自下组：磷酸肌酸/磷酸肌酸酶系统、糖酵解途径及其中间产物能量系统、或其组合。

在另一优选例中，所述蛋白合成体系还包括人工合成的tRNA。

在另一优选例中，所述缓冲剂选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷、或其组合。

在另一优选例中，所述聚乙二醇选自下组：PEG3000、PEG8000、PEG6000、PEG3350、或其组合。

在另一优选例中，所述聚乙二醇包括分子量(Da)为200-10000的聚乙二醇，较佳地，分子量为3000-10000的聚乙二醇。

在另一优选例中，所述蛋白合成体系中，组分(a)的浓度(v/v)为20%-70%，较佳地，30-60%，更佳地，40%-50%，以所述蛋白合成体系的总体积计。

本发明第二方面提供了一种提高体外蛋白合成效率的方法，所述方法采用本发明第一方面所述合成体系，包括步骤：

(1)混合

将组分（b）和组分（e）以外的其他组分混合，获得混合液；

(2)加入外源DNA分子

加入一定量的外源DNA分子，获得预反应液；

（3）孵育合成

在适合的条件下，孵育一段时间，获得反应液，所述反应液包含由所述外源DNA编码的外源蛋白质；

还包括一步骤：

在所述步骤（1)或（2)之后加入组分（b）吸附剂，

或在所述步骤（3)的孵育合成过程中加入组分（b）吸附剂。

进一步地，在所述步骤(1)之前，还包括一步骤：（S0）预处理组分（a）细胞提取物。

进一步的，所述预处理包括将细胞提取物与吸附剂接触一段时间后，将细胞提取物与吸附剂分离或不分离。例如，可以是将细胞提取物与吸附剂混合振荡一段时间后，滤去吸附剂；也可以是将细胞提取物流经吸附剂柱，并收集流出的细胞提取物；也可以是将细胞提取物与吸附剂混合后直接用于下一步骤。

进一步地，在所述步骤(3)之后，还包括一步骤：（S1）后处理，所述后处理包括分离、纯化或检测所述的由外源DNA编码的蛋白质。

进一步地，当在所述步骤（3)的孵育合成过程中加入组分（b）吸附剂时，在孵育合成开始后2小时内进行添加。

在本发明中，所述外源DNA的选择没有特别限制，通常，外源DNA选自下组：编码荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源DNA、萤光素酶突变体的DNA、或其组合。

外源DNA还可以选自下组：编码α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶的外源DNA、或其组合。

在一优选实施方式中，所述外源DNA编码选自下组的蛋白：绿色荧光蛋白(enhanced GFP, eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)、人赖氨酸-tRNA合成酶 (Lysine-tRNA synthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(Leucine-tRNA synthetase)、拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、鼠过氧化氢酶 (Catalase)、或其组合。

本发明第三方面提供了一种包含本发明第一方面中任一种所述体外蛋白合成体系的试剂盒，包括：容器，以及单独或混合位于所述容器内的所述合成体系的组分。

进一步地，所述容器为n个，n≧1。

作为优选，所述n=5，本发明第三方面提供了一种包含本发明第一方面中任一种所述体外蛋白合成体系的试剂盒，所述组分独立位于容器内，具体包括：

(k1) 第一容器，以及位于第一容器内的组分(a)，所述组分(a)选自下组：细胞或细胞提取物、或其组合；

(k2) 第二容器，以及位于第二容器内的组分(b)，所述组分(b)为吸附剂，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其组合；

(k3) 第三容器，以及位于第三容器内的组分(c)氨基酸；

(k4) 第四容器，以及位于第四容器内的组分(d)无或NTPs；

(k5) 第五容器，以及位于第五容器内的组分(e)外源DNA。

进一步地，所述哺乳动物细胞为HF9、Hela、CHO或HEK293细胞。

进一步地，所述酵母细胞为克鲁维酵母细胞，更佳地，为乳酸克鲁维酵母细胞。

进一步地，作为另一实施方式，所述沸石为改性沸石。

与现有技术相比，本发明提供了一种体外蛋白合成体系，包括组分：(a) 细胞提取物，(b) 吸附剂：所述吸附剂用于提高蛋白合成效率，(c) 氨基酸，(d) 无或NTPs，(e) 外源DNA分子。本发明提供了一种用于提高体外蛋白合成效率的方法，所述方法采用本发明第一方面所述合成体系，包括步骤：(1)混合，(2)加入外源DNA分子，（3）孵育合成，以及还包括一步骤，加入组分（b）吸附剂。此外，还提供了一种体外蛋白合成体系的试剂盒。本发明可显著提高外源蛋白的合成效率。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明方法流程图,其中，实线方框表示的步骤1-4为基本步骤，虚线方框表示的另一步骤可根据虚线箭头的指示添加到相应步骤，三个虚线箭头分别表示三种技术方案，即可在步骤1之后，或在步骤2之后，或在步骤3的孵育合成过程中。

图2为不同材料的吸附剂对体外蛋白合成体系的合成蛋白效率的影响。1为未做任何处理的陶粒，2为树脂和3为活性炭。

图3为孵育合成过程中的不同反应时间点加入活性炭对蛋白合成的影响。

图4为等量的不同类型活性炭对蛋白合成的影响。

图5为不同量的活性炭对蛋白合成的影响。

图6为活性炭的不同处理方式对蛋白合成的影响。

图7为活性炭对不同DNA模板合成同种蛋白和同种DNA模板合成不同蛋白的影响。其中，所述不同的DNA模板（T1、T2和T3）表达同种蛋白是指DNA骨架或载体不相同、编码蛋白的序列相同。所述同种DNA模板表达不同蛋白（P1、P2、P3和P4）是指DNA骨架或载体相同、编码蛋白的序列不相同。

图8为活性炭对不同合成体系中蛋白合成的影响。

具体实施方式

经过广泛而深入的探索研究，发明人发现由特定比例的(a)细胞或细胞提取物、或其组合；和(b) 吸附剂(如活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其组合)混合所形成体外蛋白合成体系可显著提高外源蛋白的合成效率。并且在吸附剂的作用下，与未加入吸附剂的酵母无细胞表达体系相比，反应开始1 h后加入吸附剂的酵母无细胞表达体系所合成的外源蛋白（如增强型绿色荧光蛋白，简称eGFP）活性的相对荧光单位值显著提高，提高了反应效率，增加了目标蛋白的产量。在此基础上，完成了本发明。

此外，本发明的实验结果表明，在特定的时间段，如反应进行大约1 h时，加入吸附剂的无细胞体外蛋白合成体系可显著促进蛋白合成体系中体外蛋白的合成，如酵母体外蛋白合成体系，并且可以在蛋白合成体系（如酵母体外蛋白合成体系）反应开始时、反应开始1h后和反应开始2 h后，分别加入本发明的吸附剂，其中，在蛋白合成体系（如酵母体外蛋白合成体系）反应开始1 h后加入吸附剂对蛋白合成的促进作用更好。

吸附剂

在本发明中，所述吸附剂没有特别限制，只要能够显著提高本发明的体外蛋白合成体系的蛋白合成效率的吸附剂均在本发明的保护范围内。

在一优选实施方式中，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其组合。

进一步地，所述吸附剂的粒径为0.5-10 mm，较佳地，0.8-4.0 mm，更佳地，1.0-2.0mm。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为木质活性炭、煤质活性炭、果壳活性炭、石油类活性炭、再生炭、矿物质原料活性炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为木质活性炭、煤质活性炭、果壳活性炭、石油类活性炭、再生炭、矿物质原料活性炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭可以为粉末状性炭、颗粒状性炭、柱状炭、球形炭，或其任意组合。

进一步地作为优选，所述活性炭为磁性活性炭。

进一步地作为优选，所述沸石为改性沸石。

生物反应

生物反应即生物化学反应，就是指在生物体内进行的化学反应，这些反应都由酶催化，酶和反应物溶于内环境的水中，才能发生反应，水为体内物质提供载体和介质。在20世纪的最后几十年里，生物化学在解释生命过程方面已经取得了非常大的成就，现在几乎植物学，医学，遗传学等生命科学相关的领域都有从事生物化学研究。生物体或细胞中所进行的生物化学反应，在复杂的网络体系中都可以通过正、负反馈得到自动调控。细胞内所进行的生物化学反应都需要有酶的催化。酶的催化效率高，反应条件温和，具有方向性，对底物有高度专一性。

细胞提取物

在一优选实施方式中，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：原核细胞和真核细胞。

在一优选实施方式中，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：大肠杆菌、细菌、哺乳动物细胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或其组合。

在一优选实施方式中，所述酵母细胞选自下组：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。

在本发明中，所述细胞提取物包括酵母细胞提取物。

在本发明中，所述细胞提取物的含量和纯度没有特别限制。

在一优选实施方式中，所述蛋白合成体系中，所述细胞提取物（如酵母细胞提取物）的含量（wt%）为10%－95%，较佳地，20%－80%，更佳地，40％－60%，以所述蛋白合成体系的总重量计。

体外蛋白合成体系

在一优选实施方式中，本发明的体外蛋白合成体系包括酵母体外蛋白合成体系。

酵母(yeast)兼具培养简单、高效蛋白质折叠、和翻译后修饰的优势。其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕氏酵母(Pichia pastoris)是表达复杂真核蛋白质和膜蛋白的模式生物，酵母也可作为制备体外翻译系统的原料。

克鲁维酵母(Kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 是工业上广泛使用的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点,如超强的分泌能力,更好的大规模发酵特性、食品安全的级别、以及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等。

在本发明中，酵母体外蛋白质合成体系不受特别限制，一种优选的酵母体外蛋白质合成体系为克鲁维酵母表达系统(更佳地，乳酸克鲁维酵母表达系统)。

在本发明中，克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母）不受特别限制，包括任一种能够提高合成蛋白效率的克鲁维（如乳酸克鲁维酵母）菌株。

在本发明中，所述酵母体外蛋白合成体系包括：

(a) 细胞提取物（如酵母细胞提取物）；

(b) 吸附剂，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其组合；所述吸附剂用于提高外源蛋白合成效率；

(c) 氨基酸，所述氨基酸为1-20种天然氨基酸，进一步地，包括非天然氨基酸；

(d) NTPs，包括ATP、GTP、CTP和UTP等核苷三磷酸；

(e) 外源DNA分子。

在一优选实施方式中，所述体外蛋白合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：镁离子、钾离子、缓冲剂、能量再生系统、聚乙二醇、磷酸盐、RNA聚合酶、二硫苏糖醇(DTT)和任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。

在一优选的实施方式中，所述吸附剂的粒径为0.5-10 mm，较佳地，0.8-4.0 mm，更佳地，1.0-2.0mm。

在一特别优选的实施方式中，本发明提供的体外蛋白合成体系包括组分：酵母细胞提取物，吸附剂，聚乙二醇，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，醋酸钾，醋酸镁，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)，胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)，尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)，氨基酸混合物，二硫苏糖醇(DTT)，，绿色荧光蛋白DNA，RNA聚合酶，葡萄糖，磷酸盐。

在本发明中，RNA聚合酶没有特别限制，可以选自一种或多种RNA聚合酶，典型的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。

在本发明中，所述酵母细胞提取物在体外蛋白合成体系中的比例不受特别限制，通常所述酵母细胞提取物的含量（wt%）为10%－95%，较佳地，20%－80%，更佳地，40％－60%，以所述体外蛋白合成体系的总重量计。

在本发明中，所述的酵母细胞提取物不含完整的细胞，典型的酵母细胞提取物包括用于蛋白翻译的核糖体、转运RNA、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止因子。此外，酵母提取物中还含有一些源自酵母细胞的细胞质中的其他蛋白，尤其是可溶性蛋白。

在本发明中，所述的酵母细胞提取物所含蛋白含量为20-100 mg/mL, 较佳为50-100 mg/mL。所述蛋白含量的测定方法为考马斯亮蓝法。

在本发明中，所述的酵母细胞提取物的制备方法不受限制，一种优选的制备方法包括以下步骤：

（i）提供酵母细胞；

（ii）对酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的酵母细胞；

（iii）对经洗涤的酵母细胞进行破细胞处理，从而获得酵母粗提物；

（iv）对所述酵母粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为酵母细胞提取物。

在本发明中，所述的固液分离方式不受特别限制，一种优选的方式为离心。

在一优选实施方式中，所述离心在液态下进行。

在本发明中，所述离心条件不受特别限制，一种优选的离心条件为5000-100000g，较佳地，8000-30000 g。

在本发明中，所述离心时间不受特别限制，一种优选的离心时间为0.5 min-2 h，较佳地，20 min-50 min。

在本发明中，所述离心的温度不受特别限制，优选的，所述离心在1-10 ℃下进行，较佳地，在2-6 ℃下进行。

在本发明中，所述的洗涤处理方式不受特别限制，一种优选的洗涤处理方式为采用洗涤液在pH为7-8（较佳地，7.4）下进行处理，所述洗涤液没有特别限制，典型的所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。

在本发明中，所述破细胞处理的方式不受特别限制，一种优选的所述的破细胞处理包括高压破碎、冻融（如液氮低温）破碎。

所述体外蛋白质合成体系中的NTPs为腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、鸟嘌呤核苷三磷酸（GTP）、胞嘧啶核苷三磷酸（CTP）和尿嘧啶核苷三磷酸（UTP）。

所述体外蛋白质合成体系中的氨基酸混合物可包括天然氨基酸或非天然氨基酸，可包括D型或L型氨基酸。代表性的氨基酸包括(但并不限于) 以下氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。每种氨基酸的浓度通常为0.01-0.5 mM，较佳地0.02-0.2 mM，如0.05、0.06、0.07、0.08 mM。

在优选例中，所述体外蛋白质合成体系还含有聚乙二醇或其类似物。所述聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度 (w/v)为0.1-8%，较佳地，0.5-4%，更佳地，1-2%，以所述蛋白合成体系的总重量计。代表性的PEG例子包括(但并不限于)：PEG3000，PEG8000，PEG6000和PEG3350。应理解，本发明的合成体系还可包括其他各种分子量的聚乙二醇(如PEG200、400、1500、2000、4000、6000、8000、10000等)。

一种特别优选的体外蛋白质合成体系，除了酵母细胞提取物、吸附剂之外，还含有选自下组的一种或多种或全部成分：22 mM，pH为7.0-9.0的盐酸-三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），30-150 mM醋酸钾，1.0-5.0 mM醋酸镁，1.5-4 mMNTPs，0.08-0.24 mM的氨基酸的混合物， 1.7 mM二硫苏糖醇（DTT），1%-4%聚乙二醇，编码eGFP 的DNA， 0.027-0.054 mg/mL T7RNA聚合酶，5-60mM葡萄糖，10-40磷酸盐。

外源蛋白的编码序列(外源DNA)

如本文所用，术语“外源蛋白的编码序列”与“外源DNA”可互换使用，均指外源的用于指导蛋白质合成的DNA分子。通常，所述的DNA分子为线性的或环状的。所述的DNA分子含有编码外源蛋白的序列。在本发明中，所述的编码外源蛋白的序列的例子包括(但并不限于)：基因组序列、cDNA序列。所述的编码外源蛋白的序列还含有启动子序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列。

在本发明中，所述外源DNA的选择没有特别限制，通常，外源DNA选自下组：编码荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白（GFP）、增强型绿色荧光蛋白（eGFP）、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源DNA、萤光素酶突变体的DNA、或其组合。

外源DNA还可以选自下组：编码α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素α A、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶的外源DNA、或其组合。

在一优选实施方式中，所述外源DNA编码选自下组的蛋白：绿色荧光蛋白(enhanced GFP, eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)、人赖氨酸-tRNA合成酶 (Lysine-tRNA synthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(Leucine-tRNA synthetase)、拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、鼠过氧化氢酶 (Catalase)、或其组合。

试剂盒

本发明的试剂盒，包括：容器，以及单独或混合位于所述容器内的所述合成体系的组分。

进一步地，所述容器为n个，n≧1。

作为优选，本发明提供了一种体外蛋白合成体系的试剂盒，具体包括： (k1) 第一容器，以及位于第一容器内的组分(a)，所述组分(a)为：细胞提取物；

(k2) 第二容器，以及位于第二容器内的组分(b)吸附剂，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其组合；

(k3) 第三容器，以及位于第三容器内的组分(c)氨基酸；

(k4) 第四容器，以及位于第四容器内的组分(d) NTPs，包括ATP、GTP、CTP和UTP；

(k5) 第五容器，以及位于第五容器内的组分(e)外源DNA分子；

所述试剂盒还包括：(kt) 标签或说明书。

在一优选实施方式中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器是同一容器或不同容器。

一种特别优选的包含本发明第一方面所述体外蛋白质合成体系的试剂盒，该试剂盒包括选自下组的多种或全部成分：酵母细胞提取物，吸附剂，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，醋酸钾，醋酸镁，NTPs，氨基酸混合物，二硫苏糖醇(DTT)，荧光蛋白DNA， T7 RNA聚合酶，葡萄糖、磷酸盐；

本发明的主要优点包括：

(1)与一般的体外蛋白质合成系统相比，本发明的含有吸附剂的体外蛋白合成体系的合成蛋白的效率提高，蛋白产量提高了约50%，具有明显的优势。

（2）本发明首次采用原位去除（in situ removal）的方法提高生物反应效率，降低反应复杂性。

（3）与吸附剂（如活性炭）常规用于下游的产物提取、脱色、除味、废液处理等技术及研究思路不同，本发明首次将吸附剂用于反应过程中以及反应体系的预处理过程，易于操作，低成本。

（4）吸附剂易于去除，降低了反应体系后处理的难度。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1细胞提取物的制备

本实施例选用液氮冷冻破碎法用于酵母细胞的处理。

1.1．一级种子培养 ：用-80 ℃冻存菌种接种于摇瓶培养基中，30 ℃，200 rpm 培养至对数生长期。

1.2 ．二级种子培养：取适量一级种子菌液接种到二级种子，30 ℃，200 rpm 培养至对数生长期。

1.3．批培养阶段： 将二级种子菌液接种到发酵罐中，温度控制在30 ºC培养10-12h,进入补料培养阶段，当OD600值为50-55时，收集细胞培养物。

1.4．将培养好的细胞培养物放在冰水混合物中预冷，时间为10-30 min。

1.5．将1.4中预冷好的细胞培养物在低温离心机中进行离心，离心条件：3,000 g、10 min、4 ℃，得到酵母细胞。

1.6．用预冷的Washing buffer（洗涤液）对1.5酵母细胞用washing buffer（洗涤液）进行重悬，将得到的重悬液进行离心，离心条件：3000 g、10 min、4 ℃，得到酵母细胞。Washing buffer（洗涤液）组成为：20-30 mM pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾, 100-150mM醋酸钾，1-4 mM醋酸镁；

1.7．重复1.6步2-3次。

1.8．将1.7步中获得的酵母细胞直接进行后续操作，或者采用液氮进行速冻后-80℃保存。

1.9．采用液氮匀浆器进行破碎：在匀浆器中加入适量液氮，再加入离心得到的酵母细胞或1.8中-80 ℃保存的酵母细胞，转速：45,000 rpm，破碎3-10 min；将破碎好的低温粉末分装到50 mL离心管中，称重并储存于-80 ℃待用。

1.10．将1.9中得到的酵母细胞破碎粉在室温下降温至4 ℃，每克细胞破碎粉用0.2-1 mL 4 ℃预冷的Lysis buffer（裂解缓冲液）进行溶解，得到酵母细胞粗提物。Lysisbuffer由10-40 mM pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾, 50-150 mM醋酸钾，1-4 mM醋酸镁，2-7 mM二硫苏糖醇，0.5-2 mM苯甲基磺酰氟组成。

1.11．把步骤1.10中收获的酵母细胞粗提物进行离心1-2次，离心力为12000-30000 g时间为30 min，温度为4 ℃；

1.12．离心后，取上层澄清液体即为酵母细胞提取物。

1.13．将制备好的酵母细胞提取物分装，并在液氮中速冻后于-80 ℃保存。

实施例2 细胞提取物的冷冻干燥

2.1 将-80 ℃保存的酵母提取物放置于室温，解冻；

2.2 将每个玻璃瓶或玻璃平板进行称重，并做好记录；

2.3 将解冻的酵母提取物分装于玻璃瓶或玻璃平板内，每个玻璃瓶约500微升细胞提取物，每个玻璃平板约5毫升细胞提取物。

2.4 将2.3中的装有细胞提取物的玻璃瓶和玻璃平板，进行再次称量，并做好记录；

2.5 将2.4中的装有细胞提取物的玻璃瓶和玻璃平板，预冻于-80 ℃，预冻时间为2-4h；

2.6 设置冷冻干燥程序: 预冻阶段：-55 ℃，4 h；冷冻干燥第一阶段：-30 ℃，4-10 h；冷冻干燥第二阶段：-30 ℃，10 h；最终冻干阶段：-20 ℃，10-20 h。

2.7 将2.5中预冻好的细胞提取物玻璃瓶和玻璃平板，放置于冻干机的平板上，进行冻干程序，真空度约为0.1 Mpa。

2.8 将冻干的细胞提取物储存于-80 ℃，或直接加入与冻干前的相等质量的水，混匀，等待用于后续的体外蛋白合成活性测定。

实施例3 体外蛋白合成体系的制备

3.1细胞提取物的处理

将实施例2所制备的细胞提取物冻干制剂解冻、活化；

3.2吸附剂的处理

将市售吸附剂（活性炭、陶粒等）进行分拣、称量、清洗等处理，分别称取0.04mg，备用；

3.3 制备氨基酸混合物

氨基酸包括天然氨基酸的混合物：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，二十种氨基酸的浓度均为1.0 mM；

需要说明的是，此处可根据合成蛋白的需要，也可以添加非天然氨基酸。

3.4 制备NTPs

制备25 mM四种NTPs的混合物，包括腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，各组分比例优选为1：1：1：1。

3.5 获取外源DNA

由第三方提供或自行所编码合成eGFP的DNA序列；

3.6配制储存液

1 M pH为8.0的盐酸-三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），5 M醋酸钾，1M醋酸镁，3M葡萄糖，1M二硫苏糖醇，3M磷酸钾，40 % 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)8000；

3.7 聚合酶的制备

所述聚合酶为市售产品或自行制备，重浓度为2.4 mg/mL T7 RNA聚合酶；

3.8 使用时，将上述各组分混合

获得合成体系的终浓度为：22 mM pH为8.0的Tris-HCl，50 mM醋酸钾，3.0 mM醋酸镁，2.5 mMNTPs(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸)，0.15 mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，20 mM葡萄糖，1.7 mM二硫苏糖醇，25 mM磷酸钾，15 ng/µleGFP的DNA，0.045 mg/mL T7 RNA 聚合酶，13% 的聚乙二醇。

实施例6 不同材料的吸附剂的蛋白合成的影响

选取活性炭、陶粒和树脂几种常见吸附材料，用于体外蛋白合成体系中外源蛋白的合成，以合成增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为外源蛋白（参阅图1和图2）。

试验内容：选取了不同材料来源的吸附剂作为初始实验检测样品。分别取0.04g的不同的未做任何处理的陶粒（1），树脂（2）和活性炭（3）等吸附剂加入到0.5mL 体外蛋白合成体系中，相应为实验处理1，处理2和处理3，PC是不加入活性炭的实验对照组，在室温下反应，在3小时时候检测RFU值。

试验方法，包括步骤：

(1)混合

将吸附剂和eGFP 的DNA分子以外的体外蛋白合成体系的其他组分混合，获得混合液；

(2)加入外源DNA分子

加入一定量的eGFP 的DNA分子，获得预反应液；

（3）孵育合成

在适合的条件下，孵育一段时间T1为3h，获得反应液，所述反应液包含由所述外源DNA编码的eGFP；

并且，在所述步骤（2）之后，加入吸附剂，具体为：在实验处理1加入陶粒，在实验处理2加入树脂，在实验处理3加入活性炭。

反应结束后，将96孔白板或384孔白板立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer), 读数，检测相对荧光单位（RFU）值，作为活性单位。

试验结果：

根据图2可知，陶粒和树脂对活性影响不大，活性炭对反应活性有一定的促进作用（RFU值大约提高到原来的1.25倍）。根据本实验结果，将活性炭作为主要的吸附剂作为后续实验优化的原材料。

实施例7 孵育合成过程中的不同时间点加入活性炭对蛋白合成的影响

本实施例以活性炭作为吸附剂，体外合成增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为外源蛋白（参阅图1和图3）。

试验内容：检测不同的反应时间点加入活性炭对体外蛋白合成反应活性的影响，本反应加入活性炭的量为0.5mL中加入0.08g活性炭，实验前活性炭未做任何处理，PC是不加入活性炭的实验对照组，在反应3h后检测RFU值。

试验方法，具体包括如下步骤：

(1)混合

将活性炭和编码eGFP的DNA分子以外的体外蛋白合成体系的其他组分混合，获得混合液；

(2)加入外源DNA分子

加入一定量的eGFP的DNA分子，获得预反应液；

（3）孵育合成

在适合的条件下，孵育一段时间，获得反应液，所述反应液包含由所述eGFP的DNA编码的eGFP；

（S1）后处理

分离、检测eGFP。

还包括一步骤：在所述步骤（2)之后加入活性炭。

反应结束后，将96孔白板或384孔白板立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer), 读数，检测相对荧光单位（RFU）值，作为活性单位。

试验结果：

结果显示在不同时间点加入活性炭对反应活性都有一定程度的提升，其中1小时加入提升效果最为显著，提升至大约为原始体系的1.5倍。结合实验结果、实验实施的难易程度以及后续优化安排，之后实验活性炭全部安排在体外蛋白合成反应体系配制完成后立即加入。

实施例8 等量的不同活性炭对蛋白合成的影响

本实施例选取等量的不同活性炭为吸附材料，以合成增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为例（参阅图1和图4），研究对蛋白合成的影响.

试验内容：检测等量的不同活性炭对体外蛋白合成反应活性的影响，图中1，2分别代表：1是粒径1.0-2.0mm柱状活性炭、2是粒径0.5-1.0mm椰壳活性炭、3是1.5mm柱状活性炭（含碘），加入活性炭的量为0.04g/mL, 本反应体系为1ml，实验前活性炭未做任何处理，PC是不加入活性炭的实验对照组，反应26小时检测RFU值。

试验方法，具体包括如下步骤：

(S0)预处理

解冻、活化酵母细胞提取物；

(1)混合

将活性炭和编码eGFP的DNA分子以外的其他体外蛋白合成体系的组分混合，获得混合液；

(2)加入外源DNA分子

加入一定量的外源DNA分子，获得预反应液；

（3）孵育合成

在适合的条件下，孵育一段时间，获得反应液，所述反应液包含由所述外源DNA编码的外源蛋白质；

（S1）后处理

分离、检测外源蛋白质。

反应结束后，低速离心1min分离活性炭，再将96孔白板或384孔白板立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer), 读数，检测相对荧光单位（RFU）值，作为活性单位。

试验结果：

实验结果表明，1号吸附剂（柱状活性炭）有更加明显的反应活性促进作用，RFU值大约提高至原来的1.25倍。后续实验可以使用1号吸附剂作为优化原料。

实施例9 同种活性炭不同加入量对蛋白合成的影响

试验内容：检测不同量的活性炭对体外蛋白合成反应活性的影响，实验前活性炭未做任何处理，PC是不加入活性炭的实验对照组，本反应体系为1ml，反应12h后，检测RFU值。

试验方法：具体方法同实施例8，在此不再一一赘述。

试验结果：

实验结果表明，在1.0mL反应体系中，加入0.04g的活性炭有更加明显的反应活性促进作用，提高蛋白合成反应效率，活性炭/反应体系为0.04g/1.0 mL为优选，RFU值大约提高至原始体系的1.3倍（参阅图5）。

实施例10 活性炭的处理方式对蛋白合成的影响

试验内容：检测不同的活性炭处理方式对体外蛋白合成体系反应活性的影响，活性炭加入到体系的量分别为0.08g/mL和0.04g/mL，本反应体系为1.0ml，处理方式分别为1-无菌水水洗（Wash）和2-未做任何处理（original），PC是不加入活性炭的实验对照组，室温反应18小时检测RFU值（具体参阅图6）。

试验方法：具体试验方法同实施例8，在此不再一一赘述。

试验结果：

实验结果表明，无菌水水洗处理活性炭加入到反应体系中有更加明显的反应活性促进作用。相比添加未经水洗的活性炭，添加经水洗处理的活性炭的反应体系所检测的RFU值高约300，蛋白合成效率提高了近30%。因此，优选使用无菌水对活性炭进行水洗预处理，有利于提高蛋白合成反应体系的反应效率。

实施例11 活性炭对不同的DNA模板（T1、T2和T3）表达同种蛋白时和同种DNA模板表达不同蛋白（P1、P2、P3和P4）的影响

试验内容：

检测体外蛋白合成反应体系中，吸附剂对不同的DNA模板（T1、T2和T3）表达同种蛋白时和同一种模板表达不同的融合蛋白（P1、P2、P3和P4）的影响，本实施例以活性炭为例。

本实验采用无菌水水洗对活性炭进行预处理，并使用0.04g/mL的使用量，在反应体系配制完成后立即加入活性炭，室温下，反应20h后检测RFU值，加入活性炭组（+AC）和不加入活性炭组（-AC）同时进行实验。不同的DNA模板分别表示为T1、T2和T3，不同的蛋白分别表示为P1、P2、P3和P4。

试验方法：具体试验方法同实施例8，在此不再一一赘述。

试验结果：根据图7可知，不同的DNA模板和不同的融合蛋白表达反应活性都有显著的提升，其中T3, P2和P4活性提升了一倍。实验结果表明，在体外蛋白合成反应体系中，活性炭对不同的DNA模板和融合蛋白表达都具有适用性。

实施例12 活性炭对不同反应体系的蛋白合成的影响

试验内容：检测不同量的活性炭对两种不同的体外蛋白合成体系反应活性的影响

实验前活性炭未做任何处理，两种不同的反应体系（分别表示为ST1和ST2）的区别是ST1不需要添加外源RNA聚合酶，而ST2需要添加外源RNA聚合酶，PC是不加入活性炭的实验对照组，本反应体系为0.5ml，反应3h和20h分别检测RFU值。根据实施例11可知，活性炭/反应体系为0.02g/0.5mL为优选体系，本实施例按此配比。

试验方法：具体试验方法同实施例8，在此不再一一赘述。

试验结果：

实验结果表明，0.5mL的不同反应体系中，分别加入0.02g活性炭有更加明显的反应活性促进作用，具体参阅图8。

需要指出的是，实施例6，以及实施例8-12中吸附剂是在加入外源DNA分子之后立即添加，若在加入外源DNA分子之前，或者在孵育合成开始后某一时间添加吸附剂，可以得到同等的实验结果。

发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种替换、改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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10. Fromm, H. J., & Hargrove, M. (2012). Essentials of Biochemistry.

Claims (13)

1.一种体外蛋白合成体系，其特征在于，包括组分：

(a) 细胞提取物

(b) 吸附剂

所述吸附剂用于提高外源蛋白合成效率；

(c) 氨基酸

(d) 无或NTPs

(e) 外源DNA分子。

2.如权利要求1所述的合成体系，其特征在于，所述组分(a)与组分(b)的质量比为0.1-10：0.1-10，较佳地，0.5-8:0.5-8，更佳地，0.8-5：0.8-5，更佳地，0.9-2：0.9-2。

3.如权利要求1所述的合成体系，其特征在于，所述吸附剂的粒径为0.5-10 mm，较佳地，0.8-4.0 mm，更佳地，1.0-2.0mm。

4.如权利要求1所述的合成体系，其特征在于，所述吸附剂选自下组：活性炭、沸石、硅藻土、树脂、硅胶、生物陶粒，或其任意组合。

5.如权利要求1所述的合成体系，其特征在于，所述细胞选自下组：细菌、酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、或其组合。

6.如权利要求5所述的合成体系，其特征在于，所述酵母细胞为克鲁维酵母细胞。

7.如权利要求6所述的合成体系，其特征在于，所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：镁离子、钾离子、缓冲剂、能量再生系统、聚乙二醇、磷酸盐、RNA聚合酶、二硫苏糖醇(DTT)和任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。

8.一种提高体外蛋白合成效率的方法，所述方法采用权利要求1或7所述合成体系，包括步骤：

(1)混合

将组分（b）和组分（e）以外的其他组分混合，获得混合液；

(2)加入外源DNA分子

加入一定量的外源DNA分子，获得预反应液；

(3)孵育合成

在适合的条件下，孵育一段时间T1，获得反应液，所述反应液包含由所述外源DNA编码的外源蛋白质；

其特征在于，还包括一步骤：

在所述步骤（1)或（2)之后加入组分（b）吸附剂，

或在所述步骤（3)的孵育合成过程中加入组分（b）吸附剂。

9.如权利要求8所述的一种提高体外蛋白合成效率的方法，其特征在于，在所述步骤(1)之前，还包括一步骤：（S0）预处理组分（a）细胞提取物。

10.如权利要求9所述的一种提高体外蛋白合成效率的方法，其特征在于，在所述步骤(3)之后，还包括一步骤：（S1）后处理，所述后处理包括分离、纯化或检测所述的由外源DNA编码的蛋白质。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，当在所述步骤（3)的孵育合成过程中加入组分（b）吸附剂时，在孵育合成开始后2小时内进行添加。

12.一种包含权利要求1-7中任一项所述体外蛋白合成体系的试剂盒，其特征在于，包括：容器，以及单独或混合位于所述容器内的所述合成体系的组分。

13.如权利要求11所述体外蛋白合成体系的试剂盒，其特征在于，所述容器为n个，n≧1。

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