CN110960512A - 一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用 - Google Patents

一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基酸‑壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用。所述载药系统包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在100～150:1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠，氨基酸包封率30‑40％。其制备方法包括：(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10‑50mg/mL的壳聚糖溶液；(2)加入待负载的氨基酸10‑100mg/mL，均匀混合，调节pH值在5‑7之间，制得混合溶液；(3)不断搅拌30min以上，同时逐滴滴加浓度在1‑10mg/mL三聚磷酸钠水溶液，使壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比在100～150:1之间。所述载药系统应用于制备入脑药物。

Description

一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米载药领域，更具体地，涉及一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用。
背景技术
脑卒中是脑血管破裂引起出血或堵塞引起缺血导致的严重脑损伤疾病。常见于中年以上人群的急性发作，是死亡率和致残率最高的重大疾病，并且复发率高、并发症多。急性期6小时以内如果不及时诊断和治疗可造成严重的并发症，甚至死亡。现在溶栓治疗是目前公认的脑卒中最有效的救治方法，可用于静脉注射治疗缺血性脑卒中的溶栓药物治疗时间窗狭窄，静脉溶栓限定在4.5小时内，动脉溶栓可以适当延长。
急性缺血性脑梗死发生后6小时以内实施静脉溶栓为抢救措施是否有效的关键时间窗，此时间段内实施静脉溶栓可使梗死区的血液灌注快速恢复，并减少梗死的发生，反之溶栓效果将大大降低，不利于临床预后。因此在溶栓时间窗内进行给药可以安全有效地改善患者脑部动脉血流和神经功能，目前透过血脑屏障的载药系统，都是针对脑部起调节作用的调节因子、信号因子，例如多肽、蛋白质、核酸、疫苗等生物活性大分子药物。这类调节因子只需要小剂量的透过血脑屏障即可起到药效。
尽管某些氨基酸(如甘氨酸、半胱氨酸等)都有明显的脑保护作用，然而氨基酸的给药量要明显超过调节因子。外周给药剂量过大(500mg/kg 以上)，导致副反应严重，限制了它们的临床应用。因此，如何通过安全有效的方法协助氨基酸透过血脑屏障进入中枢神经系统是目前面临的主要挑战。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统、其制备方法及应用，其目的在于通过恰当选择负载氨基酸的纳米体系及制备方法，提高氨基酸的包封率和载药量并携带氨基酸活性成分入脑，起到中枢神经系统氨基酸给药的目的，由此解决外周给药剂量过大导致的副反应的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在100～150∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠，氨基酸包封率30-40％。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述壳聚糖纳米微球平均粒径大约200-300nm，Zeta电位为14-16mV。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述载药系统载药量 20-30％。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述载药系统3天内体外共释放60％-70％。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述氨基酸活性成分为：碱性氨基酸、或亲水性氨基酸。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其所述氨基酸活性成分为丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、和/或天门冬氨酸。
按照本发明的另一个方面，提供了所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10-50mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10-100 mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌30min以上，同时逐滴滴加浓度在1-10mg/mL三聚磷酸钠水溶液，使壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比在100～150∶1之间，制得本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
优选地，所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其所述低聚壳聚糖Mw800-1000，脱乙酰度：≥93％。
按照本发明的另一个方面提供了一种所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的应用，其应用于制备入脑药物，优选应用于制备缺血性脑卒中、出血性脑卒中、脑创伤、阿尔兹海默病、帕金森病机、或其他神经退行性疾病的防治药物；更优选为注射药物。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的包封率和载药量相对于现有的透过血脑屏障的载药系统大幅提升，从而能适用于氨基酸入脑给药，起到脑保护作用。
(2)本发明提供的载药纳米粒子可以通过静脉注射，以壳聚糖纳米粒子为穿透细胞膜的载体，负载氨基酸穿透细胞膜，透过血脑屏障，进入大脑，使其发挥神经保护作用，减少脑的缺血灌注损伤，起到治疗脑卒中的目的。此外，壳聚糖纳米粒子除可用于负载脯氨酸外，还可用于负载丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等其他水溶性氨基酸穿透血脑屏障，使氨基酸更高效的进入大脑。
(3)本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统由于壳聚糖具有生物功能性、安全无毒、可生物降解和生物相容性等优点,在医学上具有较好的应用前景。水溶性壳聚糖可以直接溶于水，可以不用乙酸作增溶剂，避免了对乙酸生物活性药物的影响；另外因其较低的相对分子质量，相比高相对分子质量的壳聚糖更易在体内降解，不易积聚，副作用更小。氨基酸取自 20种组成人体蛋白质的氨基酸，安全无毒。
(4)该载药纳米粒子采用水溶性壳聚糖为载体，壳聚糖可以由生物提取而得，成本较低且便于质量管理。
附图说明
图1是本发明实施例提供的氨基酸壳聚糖纳米载药系统透射电镜照片；其中A.CS(10mg/mL)；B.CS(10mg/mL)：TPP(10mg/mL)＝15∶1；C.CS (10mg/mL)：TPP(10mg/mL)＝5∶1；D.CS(10mg/mL)：TPP(10mg/mL) ＝10∶1；E.CS(10mg/mL)：TPP(1mg/mL)＝5∶1；F.CS(10mg/mL)：TPP (1mg/mL)＝10∶1
图2是本发明实施例6提供的氨基酸壳聚糖纳米载药粒子的形貌(A)、粒径分布(B)、电位分析(C)以及数据统计(D)；
图3是氨基酸浓度标准曲线(A)和载药纳米粒子的体外释放曲线(B)；
图4是对照组(FITC-Pro)和负载FITC-Pro壳聚糖载药纳米粒子 (CNS-FITC-Pro)在通过静脉注射，穿透血脑屏障，进入大脑的示意图；
图5是注射药物后，小鼠大脑蛋白的变化情况，分别为生理盐水(con)，脯氨酸水溶液(Pro)，以及壳聚糖载药纳米粒子(CsP)。
图6是TTC染色后，小鼠脑梗死面积的变化情况，分别为假手术组 (Sham)生理盐水(con)，以及壳聚糖载药纳米粒子(CsP)；
图7是本发明对比例提供的氨基酸壳聚糖纳米载药系统透射电镜照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
氨基酸的脑保护作用原理，与影响代谢通路的调节因子不同，可能是由于其“营养”神经细胞，从而表现出神经元保护作用。正常状态下的，脑神经细胞能正常摄取其所必须氨基酸，而病理情况下，脑神经细胞摄取正常氨基酸的能力减弱，因此加强氨基酸的供给能起到“营养”神经细胞，从而具有良好的“脑保护”作用。
但是血脑屏障摄取氨基酸表现严格的选择性，入脑差异很大。苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸及组氨酸等和葡萄糖一样很容易入脑。丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸却很难入脑。赖氨酸、精氨酸、苏氨酸以及丝氨酸介于两组之间。病理情况下，即使是容易入脑的氨基酸，也需要外周给药剂量过大(500mg/kg以上)，才能起到效果，导致副反应严重，限制了它们的临床应用。
即使采用载药系统给药，包封率也要达到20％以上，才能起到良好的药效。目前尚没有良好的氨基酸载药系统能在包封率达到20％以上的同时，具有较低的毒性，同时能成功携带药物跨越血脑屏障。
本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在 100～150∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径在200-300nm之间， Zeta电位为14-16mV，载药量20-30％，氨基酸包封率30-40％，3天内体外共释放60％-70％。
所述系统其载药量和包封率明显高于，现有的蛋白质载药系统；在Zeta 电位为14-16mV区间，载药粒子表现稳定，3天内体外共释放60％-70％，以上性能使得所述系统适合作为氨基酸透血脑屏障给药的载药系统。
所述按照如下方法计算：
载药量＝(总氨基酸量-游离氨基酸量)/纳米粒子量*100％
所述氨基酸包封率按照如下方法计算：
氨基酸包封率＝(总氨基酸量-游离氨基酸量)/总氨基酸量*100％
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：碱性氨基酸、或亲水性氨基酸；优选无法自身通过血脑屏障的氨基酸，包括丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸；更优选甘氨酸。
实验显示壳聚糖在pH值5-7范围内形成纳米粒子，负载碱性氨基酸，载药系统包封率较高，且更加稳定；采用的壳聚糖优选为水溶性壳聚糖，纳米粒子体系在水溶液中形成，适合负载亲水性氨基酸。
所述载药系统作为入脑载药系统系统，因此壳聚糖纳米粒子优先负载无法自身通过血脑屏障的氨基酸，包括丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等；其中甘氨酸具有显著的神经保护作用，更加适合作为氨基酸活性成分。
本发明提供的氨基酸-壳聚糖载药系统在荧光蛋白标记法显示，可携带氨基酸穿透血脑屏障，进入大脑并表现出高剂量游离氨基酸所起到的甚至更好的神经保护作用。所述氨基酸-壳聚糖载药系统为难以穿透血脑屏障的游离氨基酸提供了一种安全有效的方法来协助氨基酸透过血脑屏障进入中枢神经系统，提高了氨基酸进入中枢神经系统的效率，可以减少氨基酸的给药量，避免引起毒副反应。为难以穿透血脑屏障的游离氨基酸提供了一种安全有效的方法来协助氨基酸透过血脑屏障进入中枢神经系统，提高了氨基酸进入中枢神经系统的效率，可以减少氨基酸的给药量，避免引起毒副反应。
本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10-50mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10-100mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌30min以上，同时逐滴滴加浓度在1-10mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在100～150∶1之间，制得本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
其中壳聚糖的浓度，在一定程度上影响了纳米颗粒形态，过低无法形成纳米颗粒，过高则不易溶解，形成团聚状态；另外pH值对于纳米颗粒的形成有着重大影响，我们发现在该浓度下在特定的pH值下形成的微粒不仅粒径大小、分散状态良好，其对大部分的氨基酸都有良好的包封率，达到 30％至40％。
本发明提供的纳米载药系统，其以低聚壳聚糖为载体的主要成分具有无毒、良好的生物相容性及可降解性等优点，经过实验证实所述氨基酸-壳聚糖纳米载药系统能跨血脑屏障，并成功携载氨基酸跨过血脑屏障，起到脑靶向给药的作用。
所述低聚壳聚糖(Chitosan Oligosaccharide)，以深海鳕蟹为原料，通过生物酶技术降解而得。壳寡糖是自然界中呈碱性、带正电、水溶性、动物性纤维寡糖，是2～10个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接起来的小分子聚合物。本发明采用的低聚壳聚糖为粉末形式，生物技术级，脱乙酰度：≥93％。脱乙酰基程度(D.D)决定了大分子链上胺基(NH2)含量的多少，而且 D.D增加，由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多，聚电解质电荷密度增加，其结果必将导致其结构，性质和性能上的变化，至今壳聚糖稀溶液性质方面的研究都忽略了D.D值对方程的影响。我们发现低聚壳聚糖的分子量、脱乙酰基程度以及其与三聚磷酸钠的质量配比，一方面会影响壳聚糖纳米微球形态特征以及包封率，另一方面会影响壳聚糖纳米微球的入脑性能。
本发明提供的纳米载药系统的制备方法，采用离子交联法的原理是利用无毒副作用的STPP对壳聚糖进行离子诱导而制备纳米粒子。由于STPP 含有多个PO-Na+基团，而壳聚糖分子链中含有NH3+结构，二者发生反应 Chitosan-NH3++STPP-PO-→Chitosan-NH++OP-PP。壳聚糖载药纳米粒子的形成主要靠正负电荷之间的吸引作用，壳聚糖的伯氨基带有阳离子，可以同STPP的阴离子在正常室温、水溶液搅拌条件下进行交联，将药物包裹于其中并形成载药纳米粒子。
令人惊讶的是本发明提供的纳米载药系统的制备方法，对不同类型的氨基酸都有良好包封率，可能是由于对pH值调节使得纳米微球的包封过程一致性较强。
本发明制备的氨基酸-壳聚糖在应用于氨基酸负载方面，根据体外释放结果分析，包裹在纳米粒子中的氨基酸载药稳定，3天内共释放60％-70％。在释放的前10h，氨基酸氨基酸释放达到40％-50％，有突释现象，可能是因为释放初始，溶液中残余的游离氨基酸和吸附粒子表面的氨基酸以较快的速度首先释放，随后逐渐减缓，在接下来的3天内一共释放量10％-20％，这说明包裹在纳米粒子中的氨基酸具有缓慢的释放行为。
以下为实施例：
实施例中通过透射电镜(TEM)观察载药纳米粒子的形貌。
实施例中通过粒径分析仪检测载药纳米粒子的粒径和电位；具体地：具体地：采用动态光散射和zeta电位分析仪(美国Brookhaven公司)分别测定纳米粒子的粒径与zeta电位；样品置于铜网，室温下自然干燥，在透射电镜(TEM-100CXII，日本JEOL公司)观察纳米粒子的形貌。
实施例中壳聚糖载药纳米粒子负载氨基酸有效性进行测定方法具体如下：
S1、脯氨酸标准曲线的绘制：称取标准品氨基酸溶解于去离子水中，精密制浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/mL的标准品氨基酸溶液，以去离子水为空白对照，水合茚三酮反应，分光光度计测定A570，绘制标准曲线并计算回归方程和线性范围；
S2、体外释放实验：采用透析法对壳聚糖载药纳米粒子负载氨基酸有效性进行测定。透析袋的一端封闭，加入壳聚糖载药纳米粒子，再将另一端封闭，放人500倍体积去离子水中，在室温条件下，磁力搅拌，透析96h，每隔一段时间取1mL透析液，再补充1mL去离子水。透析液通过水合茚三酮反应，分光光度计测定A570，根据标准曲线计算氨基酸浓度，绘制纳米粒子的释放曲线，并测定纳米粒子的负载率和载药量。
负载率＝(总氨基酸量-游离氨基酸量)/总氨基酸量*100％
载药量＝(总氨基酸量-游离氨基酸量)/纳米粒子量*100％
实施例1
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在100∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径约为266nm，Zeta电位约为14mV，载药量约为29％，氨基酸包封率约为39％，3天内体外共释放约58％。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在1mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在100∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
本实施例制备的壳聚糖纳米粒子形貌如图1E所示。
实施例2
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在150∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径约为227nm，Zeta电位约为16mV，载药量约为28％，氨基酸包封率约为40％，3天内体外共释放约55％。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在1mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在150∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
实施例3
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在100∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径约为227nm，Zeta电位约为16mV，载药量约为23％，氨基酸包封率约为30％，3天内体外共释放约66％。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：甘氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在1mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在100∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
图1显示，壳聚糖和STPP的质量比为100∶1时，壳聚糖纳米粒子形貌规整，分散性良好，包封率和载药量比较理想，纳米粒子均为表面光滑的球形结构。如图1所示，不同比例壳聚糖和STPP配置的纳米粒子粒径，A、 B不成球；E成球效果不好；C、D、F纳米粒子为表面光滑的球形结构，但是C、D粒径过大。
以实施例2制备的壳聚糖纳米粒子进行体外释放和药物入脑实验，结果如下：
实施例4体外释放实验
本实施例2制备的氨基酸-壳聚糖在应用于氨基酸负载方面，根据体外释放结果分析，包裹在纳米粒子中的氨基酸载药稳定，3天内共释放60％ -70％。在释放的前10h，氨基酸氨基酸释放达到40％-50％，有突释现象，可能是因为释放初始，溶液中残余的游离氨基酸和吸附粒子表面的氨基酸以较快的速度首先释放，随后逐渐减缓，在接下来的3天内一共释放量10％ -20％，这说明包裹在纳米粒子中的氨基酸具有缓慢的释放行为。
体外释放结果如图2B所示，在释放的前10h，有突释现象，氨基酸释放40％-50％，随后逐渐减缓，3天内共释放60％-70％。这可能是因为释放初始，溶液中残余的游离氨基酸和吸附粒子表面的氨基酸以较快的速度首先释放，而包裹在纳米粒子中的氨基酸则具有缓慢的释放行为。
实施例5
实施例2制备的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统应用于血脑屏障给药实验
为了说明载药纳米粒子通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑，本实施例用C57小鼠作为实验对象，静脉注射药物，分别注射FITC-Pro和实施例2制备的负载FITC-Pro壳聚糖载药纳米粒子(100mg/kg)，4小时后取脑，脑组织冰冻切片，在荧光显微镜下观察脑片中荧光物质强度。具体实验步骤如下：
一、实验主要试剂及仪器
FITC-Pro，上海淘普生物科技有限公司；OCT胶，北京中杉金桥生物技术有限公司；病理组织切片机，德国Leitz,1512型；荧光显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司。
动物SPF级ICR雄性小鼠，体重25-30g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为No.42000500006525，生产许可证号：SCXK(鄂)2014-0004。
二、实验原理
FITC(异硫氰酸荧光素)：为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长为520～530nm,呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素。
FITC-Pro：就是Pro进行荧光标记，FITC与Pro结合，通过在荧光显微镜下观察，具有强烈的黄绿色荧光，可用于Pro的定位或定量的检测。
血脑屏障(Blood Brain Barrier)：指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织，维持中枢神经系统正常的生理状态。但是，由于许多治疗中枢神经系统疾病的药物难以透过血脑屏障，限制了它们在临床上的应用。
三、实验结果
结果可见，Control为正常动物静脉注射FITC-Pro(100mg/kg)组，切片后镜下观察，无荧光标记的神经细胞；静脉注射负载FITC-Pro壳聚糖载药纳米粒子(100mg/kg)组，镜下可观察到大量绿色荧光标记(箭头所指)，表明壳聚糖纳米粒子作为穿透细胞膜的载体，可携带氨基酸穿透血脑屏障，进入大脑。
其结果如图4所示，Control为正常动物静脉注射FITC-Pro(100mg/kg) 组，切片后镜下观察，无荧光标记的神经细胞；静脉注射负载FITC-Pro壳聚糖载药纳米粒子(100mg/kg)组，镜下可观察到大量绿色荧光标记(箭头所指)，表明壳聚糖纳米粒子作为穿透细胞膜的载体，可携带氨基酸穿透血脑屏障，高效进入大脑。
实施例6静脉注射实验和药效评价
静脉注射负载氨基酸的壳聚糖载药纳米粒子，观察载药纳米粒子透过血脑屏障进入大脑后，对相关蛋白的影响。具体步骤如下：
一、实验主要试剂及仪器
动物SPF级ICR雄性小鼠，体重25-30g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为No.42000500006525，生产许可证号：SCXK(鄂)2014-0004。
二、实验原理
Akt是一种通过磷酸肌醇被募集到质膜而被激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。磷酸化Akt(p-Akt)为其活化状态。
三、实验结果
取12只小鼠，简单分为三组，分别注射生理盐水(control)，脯氨酸水溶液(Pro)，以及实施例6制备的壳聚糖载药纳米粒子(CsP)。4小时后取脑，破碎脑组织提取蛋白。结果可见，三组蛋白中Akt含量基本相同，但是CsP组中p-Akt含量明显增高，表明壳聚糖纳米粒子作为穿透细胞膜的载体，可携带氨基酸穿透血脑屏障，进入大脑，促进大脑中的Akt活化，起到更好的神经保护作用。
其结果如图5结果所示，三组蛋白中Akt含量基本相同，但是CsP组中p-Akt含量明显增高，表明壳聚糖纳米粒子作为穿透细胞膜的载体，可携带氨基酸穿透血脑屏障，进入大脑，促进大脑中的Akt活化，起到更好的神经保护作用。
实施例7小鼠线栓(MCAO)模型和药效评价
制备小鼠线栓(MCAO)模型，静脉注射负载氨基酸的壳聚糖载药纳米粒子，24h后灌注取脑，进行TTC染色，观察载药纳米粒子入脑后对小鼠脑梗死面积的影响。具体步骤如下：
一、实验主要试剂及仪器
动物SPF级ICR雄性小鼠，体重25-30g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为No.42000500006525，生产许可证号：SCXK(鄂)2014-0004。
二、实验原理
2,3,5-氯化三苯基四氮唑，又称四唑红，简称TTC，TTZ，或TPTZ，一种脂溶性光敏感复合物可用来检测动物组织的缺血梗塞。TTC作为一种氧化还原指示剂，活细胞内的脱氢酶(尤其是线粒体内的琥珀酸脱氢酶) 可以将TTC还原为红色甲臢化合物TPF(1,3,5-triphenylformazan)。染色结果为活组织被染成不同程度的红色，死组织或者无生命力的组织不着色。对于缺血梗塞组织，因组织坏死脱氢酶活力丧失呈现苍白色，而正常组织呈深红色。
三、实验结果
取12只小鼠，简单分为三组，一组为假手术组(Sham)，另外两组分别注射生理盐水(Con)和以及实施例2制备的壳聚糖载药纳米粒子(CsP)。 24小时后灌注取脑，进行TTC染色，观察载药纳米粒子入脑后对小鼠脑梗死面积的影响。结果如图6可见，CsP组中梗死面积明显减少，表明壳聚糖纳米粒子可携带氨基酸进入大脑，起到了很好的神经保护作用。
对比例1
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在15∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；无法形成纳米粒子。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在10mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在15∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
本实施例制备的壳聚糖纳米粒子形貌如图1B所示。
对比例2
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在5∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径3μm，粒径过大，不适合作为透膜、入脑载体。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在10mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在5∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
本实施例制备的壳聚糖纳米粒子形貌如图1C所示。
对比例3
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在10∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径1μm，粒径过大，不适合作为透膜、入脑载体。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在5mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在10∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
本实施例制备的壳聚糖纳米粒子形貌如图1D所示。
对比例4
一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在50∶1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠；平均粒径400nm，粒径过大，不适合作为透膜、入脑载体。
所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
所述氨基酸活性成分为：脯氨酸。
本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌的同时，逐滴滴加浓度在5mg/mL三聚磷酸钠(STPP)水溶液，使壳聚糖和STPP的质量比在50∶1 之间，制得本实施例提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
本实施例制备的壳聚糖纳米粒子形貌如图1E所示。
对比例5
本对比例与实施例2的操作步骤相同，仅制备步骤(2)pH值调节为 3。制备得到的壳聚糖纳米粒子电位为20mV，不适合作为透膜、入脑载体，同时纳米粒子形成团聚状态，分散性能不佳(图7A)。
对比例6
本对比例与实施例2的操作步骤相同，仅制备步骤(2)pH值调节为 13。制备得到的壳聚糖纳米粒子电位为-14mV，不适合作为透膜、入脑载体，同时纳米粒子形成结晶状态，分散性能不佳(图7B)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，包括壳聚糖纳米微球及其包装的氨基酸活性成分；所述壳聚糖纳米微球为含有质量比例在100～150:1的低聚壳聚糖以及三聚磷酸钠，氨基酸包封率30-40％。
2.如权利要求1所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述壳聚糖纳米微球平均粒径大约200-300nm，Zeta电位为14-16mV。
3.如权利要求1所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述载药系统载药量20-30％。
4.如权利要求1所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述载药系统3天内体外共释放60％-70％。
5.如权利要求1所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述低聚壳聚糖Mw800-1000，脱乙酰度：≥93％。
6.如权利要求1所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述氨基酸活性成分为：碱性氨基酸、或亲水性氨基酸。
7.如权利要求6所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统，其特征在于，所述氨基酸活性成分为脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、和/或天门冬氨酸。
8.如权利要求1至7任意一项所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中配置浓度为10-50mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)对步骤(1)中制得的壳聚糖溶液，加入待负载的氨基酸10-100mg/mL，均匀混合，调节pH值在5-7之间，制得混合溶液；
(3)将步骤(2)中获得的混合溶液不断搅拌30min以上，同时逐滴滴加浓度在1-10mg/mL三聚磷酸钠水溶液，使壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比在100～150:1之间，制得本发明提供的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统。
9.如权利要求8所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述低聚壳聚糖Mw 800-1000，脱乙酰度：≥93％。
10.一种如权利要求1至7任意一项所述的氨基酸-壳聚糖纳米载药系统的应用，其特征在于，应用于制备入脑药物，优选应用于制备缺血性脑卒中、出血性脑卒中、脑创伤、阿尔兹海默病、帕金森病机、或其他神经退行性疾病的防治药物；更优选为注射药物。
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