CN110954590B - 一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，包括如下内容：步骤一，用引发剂对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；步骤二，选择合适的引发剂修饰的硅纳米芯片；包括：硅纳米线芯片质谱性能评估和硅纳米线芯片解吸离子化效率评估；步骤三，唾液取样及对唾液中小分子代谢物的质谱检测，得到唾液中的代谢物在0‑1000Da范围内的信息；本发明利用垂直硅纳米线芯片的纳米结构特性和半导体特性，再通过引发剂材料修饰，降低了芯片的背景噪音，并通过材料表面的相变过程，提高了待分析物的解吸效率，进一步提高了待分析物的信噪比；能够有效得到其在小分子范围的代谢物信息，辅助疾病检测和健康管理。

Description

一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法
技术领域
本发明涉及新材料和质谱检测分析技术领域，特别是一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法。
背景技术
唾液是一种常见的由腮腺、颌下腺、舌下腺和散在小唾液腺分泌的生物液体，其分泌受神经反射的调节。唾液中内源性有机小分子代谢物含量的变化直观反映了人体代谢状况，进一步反映了人体是否患有代谢性疾病如癌症，糖尿病，痛风等。目前在临床上的代谢物检测中使用的常规生化分析和免疫分析方法仅限于检测葡萄糖、尿素和尿酸等简单代谢物，难以实现多代谢物的并行分析。核磁共振(NMR)和质谱(MS)为两大新型代谢组学分析平台，能够对不同类型的代谢物进行多维度检测分析，相较而言，质谱分析具有高灵敏度、高准确性、高通量的优点，非常适合研究代谢物指纹谱图的改变与疾病发生之间的联系。
其中，以基质辅助激光解吸/电离(MALDI)具有耐盐性好、分子带电荷形式简单、谱图分析方便、通量高的特点和优势，适宜于分析血清、血浆、组织等复杂生物样本和临床样本的大数据分析，有望为新一代分子诊断、生物标志物发现、蛋白组学与代谢组学的研究提供新的研究和应用工具。然而传统的MALDI质谱仍存在一些不足，比如由于小分子有机基质的使用带来的在小分子范围检测的严重背景干扰以及分析物与有机基质的共结晶不均匀等问题，这限制了对生物液体在小分子范围内代谢组学的研究。
近年来，新型无机基质应运而生，主要包括硅基材料、碳基材料、金属纳米颗粒或基底、金属氧化物和硫化物半导体材料、金属有机框架材料(MOFs)等应运而生。其中，以硅为基底的免基质质谱分析研究较为广泛。其中专利WO2015140243-A1以玻璃片为基底，通过负载一层氧化铟锡(ITO)制备出来的复合材料在分析生物样本中分子量在30-40kDa范围内的脂质或蛋白时具有潜在优势，专利WO2018126230-A1则尝试了多种纳米结构复合的硅材料基底作为免基质分析的材料。尽管多种无机纳米材料能够通过替代有机基质从而避免小分子有机基质的碎片峰带来的背景干扰，但是无机纳米材料本身的背景干扰仍不能忽略。
市场需要一种能够具有较高解吸效率，能在降低材料本身的背景噪音的同时提高待分析物的信噪比，适用于复杂生物样本的小分子范围内代谢组学研究的质谱分析芯片，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，本发明利用垂直硅纳米线芯片的纳米结构特性和半导体特性，再通过引发剂材料修饰，降低了芯片的背景噪音，并通过材料表面的相变过程，提高了待分析物的解吸效率，进一步提高了待分析物的信噪比；能够有效得到其在小分子范围的代谢物信息，辅助疾病检测和健康管理。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，包括如下内容：
步骤一，用引发剂对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
步骤二，选择合适的引发剂修饰的硅纳米芯片；
包括：硅纳米线芯片质谱性能评估和硅纳米线芯片解吸离子化效率评估；
硅纳米线芯片质谱性能评估方法包括：
a，以混合脂肪酸标准品溶液为分析对象，在相同能量强度条件下检测其在各个硅纳米线芯片表面的质谱信号，在负离子模式下分析比较各个引发剂修饰的硅纳米线芯片对混合脂肪酸标准品溶液内各个长链脂肪酸的信噪比；
b，以唾液混合样本为分析对象，在相同能量强度下检测其在各个硅纳米线芯片表面的质谱信号与信息量，在负离子模式下分析比较各个引发剂修饰的硅纳米线芯片对唾液混合样本内小分子代谢物的信噪比及出峰数量；
在相同能量条件下，以混合脂肪酸标准品溶液和唾液混合样本的质谱信噪比最高值所对应的材料为最适宜负离子模式下检测的硅纳米线芯片；
硅纳米线芯片解吸离子化效率评估包括：以苄基吡啶辅助判断材料的解吸能力，在线性正离子模式下，比较各个纳米线芯片分别在相同能量条件下，检测得到的苄基吡啶离子总离子强度和保留率，并计算各个能量条件下，材料的内能转换；
选择苄基吡啶离子总离子强度和保留率高的引发剂修饰的硅纳米线芯片；
步骤三，唾液取样及对唾液中小分子代谢物的质谱检测，
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白等预处理后，冷冻保存备用；测试时，在选择后得到的引发剂修饰的硅纳米线芯片表面滴加唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，得到唾液中的代谢物在0-1000Da范围内的信息。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
混合脂肪酸标准品溶液包括：月桂酸(C12:0)，棕榈酸(C16:0)，硬质酸(C18:0)，花生酸(C20:0)，木腊酸(C24:0)的混合脂肪酸标准品溶液；
唾液混合样本包括：多例健康志愿者唾液混合样本。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，引发剂包括：含氟聚合物分散液，含氟硅烷，硅氧烷，月桂酸。
一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，包括如下内容：
步骤一，用含氟聚合物分散液对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰，得到表面有含氟聚合物颗粒的硅纳米线芯片；
步骤二，唾液取样；
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白等预处理后，冷冻保存备用；步骤三，对唾液中小分子代谢物的质谱检测；
在含氟聚合物分散液修饰的硅纳米线芯片表面滴加唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，得到唾液中的代谢物在0-1000Da范围内的信息。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
步骤一，用含氟聚合物分散液对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，再在表面涂覆一层含氟聚合物分散液，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有含氟聚合物颗粒的硅纳米线芯片。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
步骤一，用含氟硅烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氟硅烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氟硅烷，晾干后得到表面有含氟硅烷修饰的硅纳米线芯片。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
步骤一，用易水解的含氨基硅氧烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氨基硅氧烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氨基硅氧烷，晾干后得到表面有含氨基硅氧烷修饰的硅纳米线芯片。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
步骤一，用不易水解的硅氧烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，再在表面涂覆一层硅氧烷，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有硅氧烷修饰的硅纳米线芯片。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，
步骤一，用月桂酸对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以氯仿为溶剂，控制严格干燥的条件下与月桂酸反应30min，后用氯仿浸泡洗涤15min除去多余的月桂酸，晾干后得到表面有月桂酸修饰的硅纳米线芯片。
前述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，步骤二，唾液取样；
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白等预处理后，冷冻保存备用；
具体过程如下：
a，收集前2个小时内不得饮食、吸烟或进行刷牙等口腔清洁过程；
b，收集唾液时，头朝下倾斜45°，静默5min，然后将分泌的唾液倾吐于离心管内，唾液体积大约3-5mL；
c，将收集的唾液依次进行低温离心和加入去离子水和乙腈进行蛋白沉降，除去不溶物和蛋白，后置于-80℃冰箱冷冻保存备用。
本发明的有益之处在于：
本发明的引发剂修饰的硅纳米线芯片既具备硅纳米线优异的吸附萃取能力，又通过表面引发剂修饰，降低了芯片的背景噪音，并通过材料表面的相变过程，提高了待分析物的解吸效率，进一步提高了待分析物的信噪比，可通过目标分析物的特性进行硅纳米线芯片的选择和优化使用；
本发明通过实验验证得到含氟聚合物分散液修饰后的硅纳米线芯片最适用于唾液辅助检测糖尿病，患病样本与健康样本代谢物相对强度差异大，方便识别判断；芯片的批间稳定性和批内稳定都较好；
本发明制备出的硅纳米线芯片应用到复杂生物样本唾液的检测，能够有效得到其在小分子范围的代谢物信息，实现疾病检测和健康管理的目标。
本发明的硅纳米线芯片具备良好的解吸能力，能促进生物样本中低丰度的代谢物出峰，有效获取尽可能多的代谢谱信息。
本发明的芯片和质谱检测方法，操作简单，应用范围广，可应用于食品安全、环境检测、刑侦监控、健康管理及临床诊断等重要领域。
附图说明
图1是本发明硅纳米线芯片的扫描电镜图，(A)只经过金属辅助刻蚀的硅纳米线芯片A，(B)经过聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片B的侧视图，(C)经过聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片B的俯视图，(D)经过聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片B的放大俯视图，(E)经过聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片B在激光轰击后的俯视图，(F)经过聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片B在激光轰击后的放大俯视图；
图2是本发明不同引发剂修饰的硅纳米线芯片的质谱背景噪音比较，(A)全氟辛基三氯硅烷修饰的硅纳米线芯片，(B)3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(C)只经过金属辅助刻蚀的硅纳米线芯片，(D)聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片，(E)聚四氟乙烯分散液修饰的硅纳米线芯片，(F)三氯十八烷基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(G)月桂酸修饰的硅纳米线芯片，(H)六甲基二硅醚修饰的硅纳米线芯片，(I)3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(J)3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的多孔硅芯片，(K)只经过电化学刻蚀制备的多孔硅芯片；
图3是本发明不同引发剂修饰的硅纳米线芯片在负离子模式下对脂肪酸检测的信噪比比较；
图4是本发明不同引发剂修饰的硅纳米线芯片在负离子模式下对生物样本人体唾液检测的信噪比比较；
图5是本发明聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片在负离子模式下对生物样本人体唾液检测的质谱图；
图6是本发明硅纳米线芯片在线性正离子模式下对材料解析效率和内能转换的表征，(A)苄基吡啶的总离子强度，(B)苄基吡啶的保留率，(C)纳米线芯片的内能转换；
图7是本发明硅纳米线芯片解吸离子化效率评估实验的以苯并吡啶盐[BP]+为参考物的质谱图；
图8是本发明硅纳米线芯片解吸离子化效率评估实验的离解速率系数(kexp)与能量相关的速率系数曲线；
图9是本发明聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片基于唾液检测对健康志愿者和糖尿病患者的区分示意图；
图10是本发明聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片的稳定性测试，(A)聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片的批间稳定性，(B)聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片的批内稳定性。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，包括如下内容：
步骤一，用引发剂对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰，得到表面有含氟聚合物颗粒的硅纳米线芯片；
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白等预处理后，冷冻保存备用；
具体过程如下：
a，收集前2个小时内不得饮食、吸烟或进行刷牙等口腔清洁过程；
b，收集唾液时，头朝下倾斜45°，静默5min，然后将分泌的唾液倾吐于离心管内，唾液体积大约3-5mL；
c，将收集的唾液依次进行低温离心和加入去离子水和乙腈进行蛋白沉降，除去不溶物和蛋白，后置于-80℃冰箱冷冻保存备用。
步骤三，对唾液中小分子代谢物的质谱检测；
在含氟聚合物分散液修饰的硅纳米线芯片表面滴加唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，得到唾液中的代谢物在0-1000Da范围内的信息。
垂直阵列结构的硅纳米线芯片通过单晶硅片经表面洗涤预处理后经过金属辅助刻蚀得到，具体过程如下：
步骤一，单晶硅片的表面洗涤预处理的步骤具体为：利用金刚石刀在无尘布上对p型<100>晶面的单晶硅片进行切割，得到规整的长方形尺寸，一般尺寸为2cm×2cm；使用浓硫酸/过氧化氢混合溶液、丙酮、乙醇、异丙醇、去离子水等进行超声清洗，除去材料表面的有机物、灰尘等。
步骤二，单晶硅片的金属辅助刻蚀步骤具体为：将表面光滑洁净的单晶硅片浸入含0.02mol/L硝酸银和4.8mol/L氢氟酸的混合溶液中于室温下刻蚀15min。刻蚀完成后，用去离子水冲洗硅片表面，洗涤三次至表面没有氢氟酸残留，并浸入稀硝酸中浸泡2h，除去沉积在硅片表面的银，除银完成后，用去离子水冲洗硅片表面，洗涤三次至表面没有稀硝酸残留，最终得到亲水性的无修饰的硅纳米线芯片。该纳米线长度为1-3μm，线尺寸为50-200nm。
需要说明的是：垂直阵列结构的硅纳米线芯片是将单晶硅片经表面洗涤预处理后经过金属辅助刻蚀得到的，垂直阵列结构的硅纳米线芯片以及芯片的表面修饰在本公司之前的专利中已经详细描述过了，在此不再赘述。
作为一种实施例，引发剂包括：含氟聚合物分散液，含氟硅烷，硅氧烷，月桂酸。
用含氟聚合物分散液对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，再在表面涂覆一层含氟聚合物分散液，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有含氟聚合物颗粒的硅纳米线芯片。
用含氟硅烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氟硅烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氟硅烷，晾干后得到表面有含氟硅烷修饰的硅纳米线芯片。
用易水解的含氨基硅氧烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氨基硅氧烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氨基硅氧烷，晾干后得到表面有含氨基硅氧烷修饰的硅纳米线芯片。
用不易水解的硅氧烷对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，再在表面涂覆一层硅氧烷，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有硅氧烷修饰的硅纳米线芯片。
用月桂酸对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以氯仿为溶剂，控制严格干燥的条件下与月桂酸反应30min，后用氯仿浸泡洗涤15min除去多余的月桂酸，晾干后得到表面有月桂酸修饰的硅纳米线芯片。
以下应用本发明在糖尿病检测，删选出适用于糖尿病检测的分散液修饰的硅纳米线芯片；过程如下：
步骤一，制备硅纳米线芯片；
将单晶硅片经表面洗涤预处理后经过金属辅助刻蚀得到具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片；
对硅纳米线芯片进行引发剂材料修饰，
引发剂材料修饰包括：含氟聚合物分散液修饰，含氟硅烷修饰，含氨基硅氧烷修饰，硅氧烷修饰，月桂酸修饰；
步骤二，硅纳米线芯片质谱性能评估，
在制备出的硅纳米线芯片表面滴加标准品溶液或生物样本，在室温下自然干燥，通过碳导电胶将硅纳米线芯片贴于靶板上，于干燥真空环境中保存至质谱检测；
标准品溶液或生物样本包括：月桂酸(C12:0)，棕榈酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，花生酸(C20:0)，木腊酸(C24:0)的混合脂肪酸标准品溶液；20例健康志愿者唾液混合样本；样本源：浙江大学校医院内科及体检科。
在质谱仪器中在相同能量强度条件下检测标准品溶液或生物样本在引发剂修饰后的硅纳米线芯片表面的质谱信号；
评估结果：以只进行金属辅助化学刻蚀法制备的硅纳米线为对照，比较多个经过各种引发剂修饰后的硅纳米线芯片的背景噪音和对分析物的信噪比，(A)全氟辛基三氯硅烷修饰的硅纳米线芯片，(B)3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(C)只经过金属辅助刻蚀的硅纳米线芯片，(D)聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片，(E)聚四氟乙烯分散液修饰的硅纳米线芯片，(F)三氯十八烷基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(G)月桂酸修饰的硅纳米线芯片，(H)六甲基二硅醚修饰的硅纳米线芯片，(I)3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的硅纳米线芯片，(J)3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的多孔硅芯片，(K)只经过电化学刻蚀制备的多孔硅芯片，在相同能量条件下，激光能量88％，以混合脂肪酸标准品溶液和唾液混合样本的质谱信噪比最高值所对应的材料为最适宜负离子模式下检测的硅纳米线芯片。
如图2所示，是不同引发剂材料修饰后的纳米线芯片的背景噪音比较，从图中可以看出，聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片(D)在小分子范围(0-500Da)的背景干扰最小。如图3所示，是不同引发剂材料修饰后的纳米线芯片对标准脂肪酸混合液检测的信噪比比较，从图中可以看出，聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片对于各个分子量脂肪酸的检测信噪比较高，值得注意的是，月桂酸修饰的硅纳米线芯片在脂肪酸出峰处都有较大背景干扰(如图2G所示)。如图4所示，是不同引发剂材料修饰后的纳米线芯片对生物样本唾液检测的信噪比比较，从图中可以看出，聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片对于生物样本唾液中小分子代谢物的检测信噪比最好，并且检测效果相对于空白硅纳米线有较大幅度提高。故选择聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片为最适合小分子检测的纳米线芯片。
实验结果如图2、3、4所示。说明与待分析物的检测信噪比更高。
引发剂修饰的硅纳米线芯片质谱检测方法的性能评估方法的具体步骤如下：
a，以混合脂肪酸标准品溶液为分析对象，在相同能量强度条件下检测其在不同硅纳米线芯片表面的质谱信号。在负离子模式下分析比较不同引发剂修饰的硅纳米线芯片对混合脂肪酸标准品溶液内不同长链脂肪酸的信噪比。
b，以唾液混合样本为分析对象，在相同能量强度下检测其在不同硅纳米线芯片表面的质谱信号与信息量。在负离子模式下分析比较不同引发剂修饰的硅纳米线芯片对唾液混合样本内小分子代谢物的信噪比及出峰数量。
需要说明的是：步骤一和二中的质谱检测均在无有机小分子基质的情况下进行。
实验结果如图5所示：
结果分析：
如图5所示，是选择聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片进行唾液检测的质谱图，A、B、C是不同的分子量范围。从图中可以看出，负离子检测模式下，可以检测到小分子代谢物如γ-氨基丁酸、缬氨酸、甜菜碱、丁二酸、烟酸、牛磺酸、哌啶酸、苹果酸、谷氨酰胺、尿酸、葡萄糖、乳酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸等；聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片质谱信号好。
步骤三，硅纳米线芯片解吸离子化效率评估，
以苄基吡啶辅助判断材料的解吸能力；在筛选出的质谱信号最好的聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片表面滴加用50％乙醇溶液配制成的低浓度苄基吡啶溶液，在室温下自然干燥，通过碳导电胶将硅纳米线芯片贴于靶板上，于干燥真空环境中保存至质谱检测；
评估结果：以只进行金属辅助化学刻蚀法制备的硅纳米线为对照，在线性正离子模式下，比较不同纳米线芯片分别在相同能量条件下，检测得到的苄基吡啶离子总离子强度和保留率，并计算不同能量条件下，材料的内能转换。苄基吡啶离子在正离子模式下进行检测，其主要以M+和[M-79]+两峰存在。
实验结果如图6所示。
计算过程：主要涉及总离子强度、保留率以及平均内能的计算。
以苯并吡啶盐[BP]+为参考物，研究聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片与空白硅纳米线的解吸效率以及内能转换，当E>Eact时，[BP]+发生离解反应，如下所示：
[BP]+→[BP-吡啶]++吡啶
分子量170分子量91
对应质谱如图7所示；
用总离子强度(I170+I91)表示解吸效率，由公式1计算不同激光能量下的保留率。
计算公式：保留率SY＝I170/(I170+I91)——公式1
实验确定的反应的离解速率系数(kexp)的计算如公式2所示，其中t为MALDI源加速区离解反应的时间，近似为MALDI源的延迟提取时间。
计算公式：离解速率系数(kexp)＝－(1/t0)ln(SY)——公式2
根据RRKM统计理论可以得到离解速率系数(kexp)与能量相关的速率系数曲线，如图8所示，将计算所得的kexp与曲线相关联，即可得到脱附离子的平均内能。
数据分析；如图6所示，聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片的保留率以及总离子强度均高于空白硅纳米线，证明修饰后的材料离子解吸能力较空白硅纳米线更好。然而，内能转换的顺序则相反，聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片的内能转换低于空白硅纳米线芯片。传统的热解吸并不能够解释材料解吸能力与内能转换相反的趋势，因此得出在芯片的免基质激光解吸离子化过程中涉及到了非热解吸过程的结论，推测与引发剂气化导致的相变过程有关。
步骤四，唾液取样及对唾液中小分子代谢物的质谱检测，
a，收集前2个小时内不得饮食、吸烟或进行刷牙等口腔清洁过程；
b，收集唾液时，头朝下倾斜45°，静默5min，然后将分泌的唾液倾吐于离心管内，唾液体积大约3-5mL；
c，将收集的唾液依次进行低温离心和加入去离子水和乙腈进行蛋白沉降，除去不溶物和蛋白，后置于-80℃冰箱冷冻保存备用。
d，测试时，在制备的引发剂修饰的硅纳米线芯片表面滴加2μL唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，得到唾液中的代谢物在0-1000Da范围内的信息。
收集20例健康志愿者和21例糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白等预处理后，冷冻保存备用；测试时，在制备的聚全氟乙烯丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片表面滴加2μL唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测。(样本源：浙江大学校医院体检科及内科)
实验结果如图9所示，是选择聚全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片进行糖尿病人和健康志愿者的唾液检测的结果图，从图中可以看出，通过唾液中小分子代谢物的检测，比较代谢物相对强度的差异，可以有效实现对健康志愿者和糖尿病人的区分。
实验五：引发剂修饰的硅纳米线芯片的稳定性测试：
实验材料实验设备:3片不同批次制备的全氟乙丙烯分散液修饰的硅纳米线芯片,每片芯片上均切割下三个0.5cm×0.5cm的小方块，在9片小方块上分别滴加2μL同一唾液混合样本(n＝20)，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，平行测定3次。
实验数据处理：同一片芯片上切割下来的三个小方块即同一批次，对同一批次内不同方块上唾液质谱信号计算相对离子强度，作图比较相对离子强度的差异，即批内稳定性。对3片不同批次的方块上唾液质谱信号计算相对离子强度，作图比较相对离子强度的差异，即批间稳定性。
实验结果如图10，结果分析：
图10A即表示3片不同批次的芯片对唾液检测的批间稳定性，图10B即表示同一批次内芯片对唾液检测的批内稳定性，从图中可以看出，该芯片对于唾液检测的批间稳定性和批内稳定都较好。
综上的实验可知，本发明的引发剂修饰的硅纳米线芯片作为质谱基底，有良好的能量吸收和电荷传递功能，同时与空白未修饰的硅纳米线芯片相比，具有良好的解析效率和更低的背景噪音，对于待分析物的检测信噪比更高，因此将其应用于生物液体唾液中小分子代谢物的检测具有潜在优势。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，其特征在于，包括如下内容：
步骤一，用含聚全氟乙丙烯分散液对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰，得到表面有聚全氟乙丙烯颗粒的硅纳米线芯片；
步骤二，唾液取样；
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白预处理后，冷冻保存备用；
步骤三，对唾液中小分子代谢物的质谱检测；
在含氟聚合物分散液修饰的硅纳米线芯片表面滴加唾液样本，自然干燥后固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测，得到唾液中的代谢物在0-500Da范围内的信息。
2.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，其特征在于，
步骤一，用聚全氟乙丙烯分散液对垂直阵列结构的硅纳米线芯片进行修饰；
具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米线芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，再在表面涂覆一层聚全氟乙丙烯分散液，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有聚全氟乙丙烯颗粒的硅纳米线芯片。
3.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线芯片的唾液样本检测方法，其特征在于，唾液取样的具体过程为：
收集糖尿病患者静息状态下的唾液，对唾液样本进行离心蛋白预处理后，冷冻保存备用；
具体过程如下：
a，收集前2个小时内不得饮食、吸烟或进行刷牙；
b，收集唾液时，头朝下倾斜45°，静默5min，然后将分泌的唾液倾吐于离心管内，唾液体积为3-5mL；
c，将收集的唾液依次进行低温离心和加入去离子水和乙腈进行蛋白沉降，除去不溶物和蛋白，后置于-80℃冰箱冷冻保存备用。
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