CN110951867A - 生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用，本发明涉及TMEM68生物标志物在制备诊断阿尔茨海默病的产品以及在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，本发明同时涉及TMEM68在筛选治疗阿尔茨海默的药物中的应用。

Description

生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用，具体的涉及生物标志物TMEM68。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)如今已经成为一类重大的医疗问题，2014年的一项研究显示，AD已经成为仅次于心血管疾病和肿瘤的第三大疾病死亡原因(James BD,Leurgans SE,Hebert LE,et al.Contribution of Alzheimer disease tomortality in the United States[J].Neurology,2014,82(12):1045-1050.)。并且，AD患者仍在逐年增加，根据统计全世界约有3700万人患有AD(张营丽，唐伟，王威.阿尔茨海默病诊断与治疗策略[[J].中国老年学杂志，2015,35(3):862-864.)，到2030年，该数字很有可能达到6570万，2050年将有超过1亿人罹患AD(Garcez ML,Falchetti AC,Mina F,etal.Alzheimer's Disease associated with PsychiatricComorbidities[J].An AcadBras Cienc,2015,87(2Suppl):1461-1473.)。而且伴随着人口老龄化的加剧，患有AD的老年人也给社会和个人带来极大负担。

阿尔茨海默病可发生在成年人的任何年龄，发病率随年龄的增长而成指数型增长。女性的发病率较男性高，农村人发病率较城市人高，受教育程度高的人群发病率相对较低。AD的致病危险因素还包括受教育程度低、头部外伤、性激素水平降低、家族遗传史、吸烟、抑郁症状、心理压力、血管因素、体温较低、社会活动较少、轻度认知损伤以及病毒感染等。阿尔茨海默病病灶一般先出现在大脑边缘系统的海马区、内嗅皮层等部位，随后蔓延到颞叶、扣带回、顶叶、额叶等大脑皮层区，一般波及不到枕叶、小脑、运动和感觉皮层区域。阿尔茨海默病人大脑的病理病变有:神经炎性老年斑(senile plaques,SPs)，神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)，神经细胞和突触的消失，脑淀粉样血管病以及颗粒空泡变形等，整体表现为弥漫性大脑皮质的萎缩和脑室的扩大。

到目前为止，阿尔茨海默病的发病机制仍然不清楚。目前有分子遗传和基因学说、炎症学说、自由基学说、胆碱能学说、金属离子假说、病毒学说、氧化应激学说、雌激素水平降低学说等。大多数研究犹如盲人摸象，分不清哪些机制是病因哪些是造成的结果。从基因表达上入手，以基因表达差异的客观现象来了解和研究AD的发病机制、治疗手段以及早期检测方法成为研究的热点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与阿尔茨海默发生发展相关的基因标志物，通过检测基因标志物，可以实现阿尔茨海默的早期诊断，同时，通过靶向该基因标志物，可以实现阿尔茨海默的分子治疗或药物筛选以及设计。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了用于测定来自阿尔茨海默患者的样品中的TMEM68的生物标志物表达的试剂在在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用。

进一步，阿尔茨海默患者具有降低量的TMEM68生物标志物。

进一步，通过基因表达分析来评估TMEM68生物标志物的量。

进一步，所述基因表达分析包括聚合酶链式反应分析。

进一步，所述聚合酶链式反应包括实时定量聚合酶链式反应。

进一步，所述实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步，所述样品包括血液。

本发明提供了TMEM68作为分子靶标在制备治疗阿尔茨海默的药物中的应用。

进一步，所述药物包括TMEM68的促进剂，所述促进剂包括提高TMEM68基因或其表达产物稳定性、上调TMEM68基因或其表达产物的表达水平、增加TMEM68基因或其表达产物有效作用时间的物质

进一步，所述促进剂为上调TMEM68表达水平的试剂。

进一步，所述促进剂包括过表达TMEM68的载体。

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默的药物，所述药物包括TMEM68的促进剂。

进一步，所述促进剂促进TMEM68的表达。

进一步，所述促进剂包括过表达TMEM68的载体。

本发明提供了TMEM68作为分子靶标在筛选治疗阿尔茨海默的药物中的应用。

进一步，筛选治疗阿尔茨海默的药物的步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有TMEM68基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中TMEM68基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可以促进TMEM68基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗阿尔茨海默的药物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗阿尔茨海默的药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了TMEM68基因表达与阿尔茨海默病相关，通过检测受试者样品中TMEM68的表达水平，可以有效的区分阿尔茨海默患者与健康对照。

本发明基于TMEM68在阿尔茨海默患者中表达下调，设计过表达TMEM68的载体，发现了改变细胞中TMEM68的表达水平可以改变AD细胞的增殖活性和凋亡率，提示TMEM68作为分子靶标具有较好的应用前景。

附图说明

图1是利用QPCR检测TMEM68基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测TMEM68基因过表达情况图；

图3是利用MTT检测TMEM68基因表达对阿尔茨海默神经细胞生长的影响图；

图4是流式细胞仪检测TMEM68基因表达对阿尔茨海默神经细胞凋亡的影响图。

具体的实施方式

术语或“标志物”或“生物标志物”一般指其在组织或细胞中/上表达或分泌的可以通过已知的方法(或本文所披露的方法)来检测且是预测性的或以用于预测(或帮助预测)患者患病风险的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。本文中特别感兴趣的生物标志物是TMEM68。

TMEM68基因位于8号染色体长臂1区2带上，目前在国际公共核酸数据库GeneBank中的gene ID为137695。在本发明中，TMEM68包括野生型、突变型或其片段。对于本发明的目的，“TMEM68”指编码TMEM68的DNA或mRNA，以及编码的TMEM68蛋白，包括其中任意一种的促进样品中TMEM68检测的片段或部分。目前在genebank中存在6个转录本，核苷酸序列分别如NM_001286657.2、NM_001286660.2、NM_001286661.2、NM_001363176.1、NM_001363177.1、NM_152417.3所示。作为非限制性的实施例，一种代表性的TMEM68基因具有NM_001286657.2所示的序列。

“患者样品”指从阿尔茨海默患者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。本文中患者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液。

与阿尔茨海默患者临床受益有关的生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中可检测的水平。这些可以通过本领域中技术人员已知的的方法来测量。

术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如miRNA)。

生物标志物的“升高”或“较高”的量或水平指所述量等于或大于健康对照群体中生物标志物的中值量。

生物标志物的“降低”或“较低”的量或水平指所述量小于健康对照群体中生物标志物的中值量。

术语“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。由此，例如，如本文中定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链区和双链区的DNA、单链和双链RNA、和包含单链区和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，如本文中使用的，术语“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。此类区中的链可来自同一分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，主链为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA也是“多核苷酸”该术语在本文中的意图所在。此外，包含罕见碱基诸如肌苷或经修饰碱基诸如氚化碱基的DNA或RNA也包括在如本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)的特征性的DNA和RNA的化学形式。

术语“寡核苷酸”指相对短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物、和双链DNA。寡核苷酸(诸如单链DNA探针寡核苷酸)经常通过化学方法合成，例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪。然而，可通过多种其他方法来制备寡核苷酸，包括体外重组DNA介导的技术以及通过在细胞和生物体中表达DNA。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平或翻译水平上检测生物标志物的表达水平。

一种示例性方法为聚合酶链式反应(PCR)，“聚合酶链式反应”或“PCR”技术通常指，扩增微量的核酸(RNA和/或DNA)特定片段的规程。通常，需要获知目的区域末端或以外的序列信息，从而可设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增模板的对立链相同或相似。两条引物的5’末端核苷酸可与所扩增物质的末端一致。PCR可用于从总基因组DNA和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等扩增特定RNA序列、特定DNA序列。如本文中使用的，PCR被认为是用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一个(但非唯一的)例子，包括使用已知核酸(DNA或RNA)作为引物并利用核酸聚合酶来扩增或生成核酸的特定片段或者扩增或生成与特定核酸互补的核酸特定片段。

“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”指PCR的一种形式，其中在PCR反应的每个步骤测量PCR产物的量。

一种示例性方法为RNA-Seq(也称为全转录物组鸟枪法测序(WTSS))，指使用高通量测序技术来对cDNA测序以得到关于样品的RNA内容物的信息。

一种示例性方法为微阵列。在这种方法中，在微芯片基片上涂布或排列感兴趣多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。然后使排列的序列与来自感兴趣细胞或组织的特异性DNA探针杂交。正如在PCR方法中一样，mRNA的来源典型的是从人样品中分离的总RNA。

在微阵列技术的一个具体实施方案中，将cDNA克隆的PCR扩增插入物以密集阵列应用至基片。优选的是，将至少10,000种核苷酸序列应用至基片。以每片10,000种成分固定化在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过从感兴趣样品提取的RNA的逆转录中掺入荧光核苷酸来生成。应用至芯片的经标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点以特异性发生杂交。严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜检测技术或通过其它检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每种阵列成分的杂交的定量容许评估相应mRNA的丰度。凭借双重有色荧光，将从两种RNA来源生成的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。如此同时测定来自两种来源的对应于每种指定基因的转录物的相对丰度。

一种示例性方法为基因表达连续分析(SAGE)，基因表达连续分析(SAGE)是容许同时且定量分析大量基因转录物且不需要为每种转录物提供个别杂交探针的一种方法。首先，生成包含足以唯一鉴定一种转录物的信息的一种短序列标签(约10-14bp)，前提是该标签是从每种转录物内的一个唯一位置得到的。然后，将许多转录物连接起来以形成长、连续分子，它们可测序，以同时揭示多种标签的身份。任何转录物群的表达样式可通过测定个别标签的丰度并鉴定与每种标签对应的基因来定量评估。

一种示例性方法为MassARRAY技术，该技术将质谱术(MS)用于检测的一种自动化、高通量的基因表达分析方法。依照这种方法，在分离RNA、逆转录和PCR扩增之后，将cDNA进行引物延伸。将cDNA衍生的引物延伸产物纯化，并分配到预先加载了MALTI-TOF MS样品制备所需要的成分的芯片阵列上。通过分析所得质谱中的峰面积，对反应中存在的各种cDNA定量。

一种示例性方法为免疫组织化学，该方法使用对每种标志物特异的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体来检测表达。抗体可通过直接标记抗体自身来检测，例如用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物诸如生物素、或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记一抗与经标记二抗(包括对一抗特异的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体)联合使用。免疫组织化学方案和试剂盒是本领域众所周知的，而且可通过商业途径获得。

如本文所用的药物，它含有有效量的所述的TMEM68的促进剂，以及药学上可接受的载体，所述的药物可用于治疗阿尔茨海默。

作为本发明的一种优选方式，所述的TMEM68的促进剂是一种TMEM68的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本发明所述药物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。

作为一种优选的实施方式，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将TMEM68的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带TMEM68的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明的药物还可以与其他治疗阿尔茨海默的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的药物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1QPCR测序验证TMEM68基因的表达情况

1、样本收集

收集49例阿尔茨海默患者和35例同龄健康对照组的血液样本。纳入的阿尔茨海默患者符合美国国立神经病研究所和老年性痴呆相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)所制定的标准，并且经过病史调查、临床检查、影像学检查、常规实验室检查等排除其他神经系统疾病和常见老年病。

2、Trizol法提取样本中的RNA

将血液与Trizol等体积混合均匀，室温静置5分钟，再加入Trizol试剂1/5体积的氯仿，充分混匀，然后在室温下静置5分钟，12000g于4℃的条件下离心15分钟，取上清液于新的1.5mL离心管中，加入提前预冷的异丙醇0.5-1.0mL/管，缓慢摇匀，室温静置10分钟。12000g，4℃离心10分钟，弃掉上清液，在离心管内加入预冷过的75％乙醇1mL/管，7500g，4℃离心5分钟，弃去上清液，沉淀并用无菌风干燥，直至透明状，向沉淀中加入10μL无酶水溶解。

3、逆转录

取总RNA2μg进行逆转录，加入2×RT Reaction Mix 10μl，RT Enzyme Mix2μl，补无核酶水至20μl。25℃反应10min，50℃反应30min，85℃反应5min，所得产物cDNA贮存在-20℃条件下备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计，序列如下：

SEQ ID NO.1F：5’-CTCTACAGCCAGTGAAGT-3’；

SEQ ID NO.2R：5’-GAGGTCAGGAGTTCAAGA-3’(TMEM68基因)

SEQ ID NO.3F：5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’；

SEQ ID NO.4R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(内参GAPDH)。

(2)配制PCR反应体系：Power

Green Master Mix 10μl，正(反)向引物各0.5μl，cDNA模板1.0μl，加入去离子水8.0μl。

95℃10min，(95℃15s，60℃30s)×40个循环，55-95℃绘制熔点曲线，2-^ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS17.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。对变量TMEM68进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

6、结果

结果如图1所示，与健康对照相比，TMEM68基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达显著下调，下调约5倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

ROC曲线分析表明TMEM68可以作为生物标志物应用于阿尔茨海默的诊断，其曲线下面积为0.897，可以有效的区分阿尔茨海默患者与健康对照。

实施例2TMEM68基因的过表达

1、细胞培养

使用DMEM高糖完全培养基培养SH-SY5Y细胞系，置于37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱内孵育培养。

2、转染

1)基因过表达载体的构建

根据GeneBank中TMEM68的序列合成特异的PCR扩增引物，在5’端引物和3’端引物分别添加KpnI和XhoI两个限制性酶切位点。以阿尔茨海默患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到经KpnI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中，连接获得的重组载体pcDNA3.1(+)-2用于后续实验。

2)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种4×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，待细胞融合度约为50％～70％时进行转染。

3)转染

将神经细胞分为3组，分别为对照组(SH-SY5Y)、空白对照组(转染pcDNA3.1(+)-NC)、实验组(转染pcDNA3.1(+)-2)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法如下：

分别用100μL opti-MEM稀释3.75μL的pcDNA(3.1+)-2以及7.5μL的Lipo2000，轻轻混匀，将稀释好的pcDNA(3.1+)-2和Lipo2000轻轻吹打混匀，室温孵育20min形成复合物，将上述复合物逐滴加到更换新鲜培养基的六孔板中，边加边轻晃混匀，于37℃，5％CO₂培养相中培养6h后，更换成含血清和抗生物的常规培养基继续培养24h。

3、QPCR检测TMEM68基因的转录水平

1)Trizol法提取细胞总RNA

弃掉6孔板中的培养基，加入1mL 1×PBS后缓慢清洗两遍，每孔加入1mL TrizoI试剂，混匀，使用移液枪反复吹打涡旋细胞，将所得细胞的悬液转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟，加入氯仿200μL/管，剧烈振荡摇匀至乳白色，然后在室温下静置5分钟，12000g于4℃的条件下离心15分钟，取上清液于新的1.5mL离心管中，加入提前预冷的异丙醇0.5-1.0mL/管，缓慢摇匀，室温静置10分钟。12000g，4℃离心10分钟，弃掉上清液，在离心管内加入预冷过的75％乙醇1mL/管，7500g，4℃离心5分钟，弃去上清液，沉淀并用无菌风干燥，直至透明状，向沉淀中加入10μL无酶水溶解。

2)反转录反应和QPCR同实施例1

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS17.0统计软件来进行统计分析的，过表达TMEM68基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比转染空载组和空白对照组，转染pcDNA(3.1+)-2的实验组中TMEM68基因的表达水平显著增加(P<0.05)，而转染空载组和空白对照组之间没有显著的差异。

实施例3TMEM68基因对神经细胞的影响

采用MTT和细胞凋亡实验检测TMEM68基因对SH-SY5Y阿尔茨海默病细胞模型细胞存活率的影响。

1、细胞分组：

空白对照组，Aβ_1-40(16μM Aβ_1-40处理48h)处理组，利用Aβ_1-40处理后的NC对照组、实验组(pcDNA3.1(+)-1)

2、细胞培养转染步骤同实施例2。

3、MTT检测细胞活力

将细胞接种于96孔板中过夜培养，铺板1d后，向每孔加入15μL MTT(0.5kg/mLPBS)，继续孵育4h，然后每孔加入200μL DMSO，震荡10min，室温放置10min，使蓝紫色结晶物充分溶解。以空白孔校零，使用酶标仪测定570nm波长下每孔的吸光度。根据公式计算细胞生存率：细胞生存率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。

4、流式细胞仪检测细胞凋亡

使用胰酶消化细胞，将细胞悬液转移到离心管内，在1000rpm条件下离心5min，弃掉上清，用PBS轻轻重悬细胞，并计数。取0.5-1×10⁵个重悬的细胞，在1000rpm条件下4℃离心5min，弃掉上清；加入1mL预冷的PBS，轻轻震荡混匀使细胞悬浮，在1000rpm，4℃离心5min，弃上清，重复该步骤2次；使用200μL的Binging缓冲液进行重悬，加入Annexin V-FITC和PI各10μL，轻轻混匀，4℃避光反应30min；加入Binging缓冲液300μL，使用C6流式细胞仪检测。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，使用SPSS17.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

MTT实验结果(图3)显示，与对照组相比，Aβ_1-40处理后显著抑制SH-SY5Y细胞活力(P<0.05)，转染pcDNA3.1(+)-2组的细胞活力损伤得到明显的改善，也即pcDNA3.1(+)-2组提高了Aβ_1-40处理后SH-SY5Y的细胞活力(P<0.05)，说明TMEM68的差异表达影响神经细胞的增殖活性。

细胞凋亡实验结果(图4)显示，与空白对照组相比，Aβ_1-40处理后的SH-SY5Y细胞凋亡率显著增加，表明Aβ_1-40能够显著促进SH-SY5Y细胞的凋亡(P<0.05)，而与NC对照组相比，pcDNA3.1(+)-2质粒转染的过表达则抑制了Aβ_1-40诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡(P<0.05)，说明TMEM68的差异表达影响了神经细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 青岛泱深生物医药有限公司

<120> 生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctacagcc agtgaagt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtcagga gttcaaga 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactctggta aagtggatat tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (10)

1.用于测定来自阿尔茨海默患者的样品中的TMEM68的生物标志物表达的试剂在在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，阿尔茨海默患者具有降低量的TMEM68生物标志物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过基因表达分析来评估TMEM68生物标志物的量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因表达分析包括聚合酶链式反应，优选的，所述聚合酶链式反应包括实时定量聚合酶链式反应，优选的所述实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述样品包括血液。

6.TMEM68作为分子靶标在制备治疗阿尔茨海默的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括TMEM68的促进剂，优选的，所述促进剂促进TMEM68的表达。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进剂包括过表达TMEM68的载体。

9.一种治疗阿尔茨海默的药物，其特征在于，所述药物包括TMEM68的促进剂，优选的，所述促进剂促进TMEM68的表达，优选的，所述促进剂包括过表达TMEM68的载体。

10.TMEM68作为分子靶标在筛选治疗阿尔茨海默的药物中的应用。

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