CN110950936A - 一种人乳头瘤病毒69型l1蛋白的突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种突变的HPV69 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV69和HPV51，或者HPV69、HPV51和HPV26)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

Description

一种人乳头瘤病毒69型L1蛋白的突变体
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV69 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV69和HPV51，或者HPV69、HPV51和HPV26)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是接种HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。
HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。
然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的
Figure BDA0002215682250000021
(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的
Figure BDA0002215682250000022
(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的
Figure BDA0002215682250000023
(其为针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58的九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPV VLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。
因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人乳头瘤病毒(HPV)69型L1蛋白中的特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV51)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV69 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV69和第二型别的HPV(例如HPV51)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV69 VLP和第二型别的HPV VLP相当，并且针对HPV69的保护效果与单独的HPV69 VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV51)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。
此外，在上述置换的基础上，还可以将HPV69 L1蛋白中的另一个特定区段进一步置换为第三型别的HPV(例如HPV26)L1蛋白的相应区段，由此所获得的含有双置换的突变的HPV69 L1蛋白能诱导机体产生针对HPV69、第二型别的HPV(例如HPV69)和第三型别的HPV(例如HPV26)的高滴度中和抗体，其保护效果可能与混合的HPV69 VLP、第二型别的HPV VLP和第三型别的HPV VLP相当。
因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV69 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV69L1蛋白与野生型HPV69 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV69 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15或16个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV69 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV69和HPV51)的中和抗体。
在某些实施方案中，所述突变的HPV69 L1蛋白任选地还具有(2)(a)、(2)(b)或(2)(c)中所定义的突变突变。
所述的(2)(a)、(2)(b)或(2)(c)中所定义的突变如下：
(2)(a)位于野生型HPV69L1蛋白第114-147位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(2)(b)位于野生型HPV69L1蛋白第262-290位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(2)(c)位于野生型HPV69L1蛋白第352-357位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV51。在某些实施方案中，(1)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述第三型别的野生型HPV为HPV26。在某些实施方案中，(2)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基。在某些实施方案中，(2)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基。在某些实施方案中，(2)(c)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26L1蛋白第350-355位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述野生型HPV69 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述野生型HPV26 L1蛋白具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51L1蛋白第52-60位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:15示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51L1蛋白第348-359位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:16示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51L1蛋白第125-147位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:19示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51L1蛋白第170-181位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:20示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV51L1蛋白第259-289位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:21示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV26L1蛋白第114-147位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:32示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV26L1蛋白第170-180位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:33示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV26L1蛋白第260-288位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:34示。
在某些实施方案中，所述野生型HPV26L1蛋白第350-355位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:35示。
在某些实施方案中，所述突变的HPV69 L1蛋白具有SEQ ID NO:3、23、25或26所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV69L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些实施方案中，本发明的分离的核酸具有SEQ ID NO:10、28、30或31所示的核苷酸序列。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV69 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV69 L1蛋白或其变体组成或形成。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69L1蛋白，其与野生型HPV69 L1蛋白相比，位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69L1蛋白，其与野生型HPV69 L1蛋白相比，位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69L1蛋白，其与野生型HPV69 L1蛋白相比，位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第262-290位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69L1蛋白，其与野生型HPV69 L1蛋白相比，位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第352-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第350-355位的氨基酸残基。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:3、23、25或26所示的序列。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:3所示的序列。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:23所示的序列。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:25所示的序列。
在某些实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV69 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:26所示的序列。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV69 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV69 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌、尖锐湿疣及其组合。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体。
在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变的HPV69 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
在另一个方面，本发明还涉及本发明的突变的HPV69 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒，其用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV69的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV51。
根据本发明，术语“第三型别的野生型HPV”是指，不同于HPV69，且不同于第二型别的野生型HPV的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第三型别的野生型HPV优选为野生型HPV26。
根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。根据本发明，术语“野生型HPV69 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒69型(HPV69)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV69 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号AHV83654.1、ALJ32844.1和ALJ32828.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV69 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV69 L1蛋白的第52-60位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第52-60位氨基酸残基。“野生型HPV69 L1蛋白的第52-60位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：1所示的多肽的第52-60位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV69可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV69的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV69 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV69分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号AHV83654.1、ALJ32844.1和ALJ32828.1)。并且，当描述野生型HPV69 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV69分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV69 L1蛋白的第52-60位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第52-60位氨基酸残基，以及各种HPV69分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV51 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒51型(HPV51)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV51 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号ACV88631.1、ALJ32930.1、CRH69903.1和AJS10540.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV51 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV51 L1蛋白的第52-60位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第52-60位氨基酸残基。“野生型HPV51 L1蛋白的第348-359位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：2所示的多肽的第348-359位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV51可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV51的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV51 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV51分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号ACV88631.1、ALJ32930.1、CRH69903.1和AJS10540.1)。并且，当描述野生型HPV51L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV51分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV51L1蛋白的第52-60位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第52-60位氨基酸残基，以及各种HPV51分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV26 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒26型(HPV26)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV26L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号NP041787.1、AHY96046.1和AHY96053.1等)。
在本发明中，当提及野生型HPV26 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：22所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV26 L1蛋白的第51-58位氨基酸残基”是指，SEQID NO：22所示的多肽的第51-58位氨基酸残基；表述“野生型HPV26 L1蛋白的第350-355位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：22所示的多肽的第350-355位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV26可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV26的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV26 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:22所示的蛋白，而且应包括各种HPV26分离株的L1蛋白(例如NP041787.1、AHY96046.1和AHY96053.1等所示的HPV26 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV26 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：22的序列片段，还包括各种HPV26分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV26 L1蛋白的第51-58位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：22的第51-58位氨基酸残基，以及各种HPV26分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基。例如，N端截短了9个氨基酸的HPV51 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV51 L1蛋白N末端的第1-9位氨基酸残基所获得的蛋白质。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV69L1蛋白(如SEQ ID NO：3所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV69 L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV69 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV69和HPV51)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。
发明的有益效果
研究表明，虽然HPV69和其他型别的HPV(例如HPV51和/或HPV26)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV69疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV51和/或HPV26)的风险依然很高。
本发明提供了一种突变的HPV69 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV69和其他型别的HPV(例如HPV51和/或HPV26)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HP69和HPV51，或者HPV69、HPV51和HPV26)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV69VLP和HPV51VLP的混合物，或者HPV69VLP、HPV51VLP和HPV26的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，由HPV69、HPV51和/或HPV26组成的组中选择的至少一种感染)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2:HPV69N0(全长HPV69 L1蛋白)；泳道3:HPV51N9(N端截短了9个氨基酸的HPV51 L1蛋白)；泳道4:H69N0-51T1(即SEQ ID NO：3所示的突变蛋白)；泳道5:H69N0-51T2(即SEQ ID NO：4所示的突变蛋白)；泳道6:H69N0-51T3(即SEQ ID NO：5所示的突变蛋白)；泳道7:H69N0-51T4(即SEQ ID NO：6所示的突变蛋白)；泳道8:H69N0-51T5(即SEQ ID NO：7所示的突变蛋白)；结果显示，经过色谱纯化后，蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5的纯度均达到90％以上。
图1B显示了实施例1中经纯化的突变蛋白H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。电泳结果显示，经过色谱纯化后，突变蛋白纯度均较高，纯度在80-90％左右。
图2A显示了用广谱抗体4B3检测实施例1中制备的H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4和H69N0-51T5的蛋白质免疫印迹检测的结果。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2:HPV69N0；泳道3:HPV51N9；泳道4:H69N0-51T1；泳道5:H69N0-51T2；泳道6:H69N0-51T3；泳道7:H69N0-51T4；泳道8:H69N0-51T5。结果显示，突变蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4和H69N0-51T5都能够被广谱抗体4B3特异性识别。
图2B显示了用HPV L1广谱抗体4B3检测实施例1中制备的突变蛋白H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的蛋白质免疫印迹检测的结果。检测结果显示，经过色谱纯化后，突变蛋白能够被广谱抗体4B3特异性识别。
图3显示了包含蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5和HPV69N0的样品的分子筛层析分析的结果。结果显示，包含H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4和H69N0-51T5的样品最先出现的蛋白峰均在13-14min左右，与HPV69N0 VLP相当。这表明，上述突变蛋白组装均可组装成VLP。
图4显示了突变的H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的样品的分子筛层析分析的结果。结果显示，包含H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的样品最先出现的蛋白峰均在13-14min左右，与HPV69N0 VLP相当。这表明，上述突变蛋白组装均可组装成VLP。
图5显示了H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP、H69N0-51T5 VLP和HPV69N0 VLP、HPV51N9 VLP的沉降速率分析的结果。结果显示，H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP和H69N0-51T5 VLP的沉降系数分别为145S、155S、138S、121S和139S。这表明，如上制备的5种突变的HPV69 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV69N0 VLP，147S)相似的病毒样颗粒。
图6显示了H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的沉降速率分析的结果。结果显示，H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的沉降系数分别为157S、144S、147S和161S。这表明，如上制备的5种突变的HPV69 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV69N0 VLP，147S)相似的病毒样颗粒。
图7显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)，其中：A为HPV69N0 VLP的透射电镜观察结果；B为H69N0-51T1 VLP的透射电镜观察结果；C为H69N0-51T2 VLP的透射电镜观察结果；D为H69N0-51T3 VLP的透射电镜观察结果；E为H69N0-51T4 VLP的透射电镜观察结果；F为H69N0-51T5 VLP的透射电镜观察结果；G为HPV51N9 VLP的透射电镜观察结果。结果显示，H69N0-51T1VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP和H69N0-51T5 VLP与HPV69N0 VLP类似，都能够组装成半径为25nm左右的大小均一的VLP。
图8显示了H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3 VLP-、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。结果显示，H69N0-51T1-26S2VLP、H69N0-51T1-26S3 VLP-、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP与HPV69N0 VLP类似，都能够组装成半径为25nm左右的大小均一的VLP。
图9显示了HPV26N0 VLP性质鉴定结果。其中A为HPV26N0 VLP分子筛检测结果；B为HPV26N0 VLP沉降速率分析结果；C为HPV26N0VLP透射电镜观察结果。
图10A-图10B显示了用H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP和H69N0-51T5 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图10A：铝佐剂组1(免疫剂量为5.0μg，使用铝佐剂)；图10B：铝佐剂组2(免疫剂量为1.0μg，使用铝佐剂)。结果显示，H69N0-51T1 VLP和H69N0-51T5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV69的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV69N0 VLP、混合的HPV69/HPV51 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV51N9 VLP；H69N0-51T1 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，保护效果与同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV69/HPV51VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV69N0VLP；H69N0-51T5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，保护效果虽稍弱于同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV69/HPV51 VLP，但显著优于同剂量的单独的HPV69N0 VLP；这表明，H69N0-51T1 VLP和H69N0-51T5 VLP对HPV69和HPV51具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
图11A-图11B显示了用H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图11A：铝佐剂组1(免疫剂量为5.0μg，使用铝佐剂)；图11B：铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。结果显示，H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV69的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV69N0 VLP、混合的HPV51/HPV69/HPV26 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV51N9VLP；H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV51/HPV69/HPV26 VLP相当，但显著优于同剂量的单独的HPV69N0 VLP和HPV26N0 VLP。H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV26的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV26N0VLP、混合的HPV51/HPV69/HPV26 VLP相当，但显著优于同剂量的单独的HPV51N9 VLP。这表明，H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP对HPV51、HPV69和HPV26具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0002215682250000161
Figure BDA0002215682250000171
序列1(SEQ ID NO:1)：
MALWRTSDSKVYLPPTPVSRVVSTDEYVTRTGIYYYAGSSRLLTLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAYQYRVFRVHLPDPNKFGLPDPQLYNPETERLVWACVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKLDDTENSHLATANADTDNRDNVCVDNKQTQLCIIGCTPPLGEHWGVGTVCKNAQSQVQRGDCPPLELISSVIEDGDMIDTGFGAMDFTALQATKCDVPLDINQSICKYPDYLKMSADTYGNSMFFFLRREQLFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMVTSDAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTCVDTTRSTNLTISTVSAQSASATFKPSDYKQFIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTDVMAYIHTMNSTILENWNFGLTLPPTASLEDAYRFIKNSATTCQRDAPAQPKEDPFSKLKFWDVDLKEKFSIDLDQFPLGRKFMLQAGIQRRPKLGTKRPASSLSASSSSTTRKKRKLTK
序列2(SEQ ID NO:2)：
MALWRTNDSKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
序列3(SEQ ID NO:3)：
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序列19(SEQ ID NO:19)：
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序列20(SEQ ID NO:20)：
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序列21(SEQ ID NO:21)：
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序列22(SEQ ID NO:22)：
野生型HPV26L1蛋白，HPV26L1
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序列31(SEQ ID NO:31)：
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序列33(SEQ ID NO:33)：
IGTICKNTQTQ
序列34(SEQ ID NO:34)：
YNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTS
序列35(SEQ ID NO:35)：
ASASTP
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.突变的HPV69 L1蛋白的表达与纯化
表达载体的构建
采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343–5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建编码突变的HPV69 L1蛋白的表达载体，所述突变的HPV69 L1蛋白含有来源于HPV51 L1的特定区段和/或来源于HPV26 L1的特定区段。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。
所使用的初始模板包括pTO-T7-HPV69N0C质粒(其编码全长的HPV69 L1蛋白；在表2中简写为69L1N0)、pTO-T7-HPV51N9C质粒(其编码N端截短了9个氨基酸的HPV51 L1蛋白，在表2中简写为51L1N9)和pTO-T7-HPV26N0C质粒(其编码全长的HPV26 L1蛋白；在表2中简写为26L1N0)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟(请核对扩增条件)。退火温度和时间列于表2。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒(BEYOTIME(碧云天)，货号：D0033)回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2X Gibson Assembly Master Mix，购自NEB，包含T5exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。
用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25μg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃ 220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：10、11、12、13、14、28、29、30、31其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3、4、5、6、7、23、24、25、26(所对应的蛋白分别命名为H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4、H69N0-51T1-26S5)。
突变蛋白H69N0-51T1与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T2与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第125-147位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51L1蛋白第125-147位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T3与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第170-183位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第170-181位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T4与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69L1蛋白第261-291位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第259-289位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T5与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第350-362位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第348-359位的氨基酸残基。
突变蛋白H69N0-51T1-26S2与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T1-26S3与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第170-182位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第170-180位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T1-26S4与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第262-290位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基。突变蛋白H69N0-51T1-26S5与HPV69N0的区别在于：位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基，且位于野生型HPV69 L1蛋白第352-357位的氨基酸残基被替换为野生型HPV26 L1蛋白第350-355位的氨基酸残基。
表2.用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物
Figure BDA0002215682250000291
表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:36-71)
Figure BDA0002215682250000292
Figure BDA0002215682250000301
突变蛋白的大量表达
从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H69N0-51T1、pTO-T7-H69N0-51T2、pTO-T7-H69N0-51T3、pTO-T7-H69N0-51T4、pTO-T7-H69N0-51T5、pTO-T7-H69N0-51T1-26S2、pTO-T7-H69N0-51T1-26S3、pTO-T7-H69N0-51T1-26S4和pTO-T7-H69N0-51T1-26S5的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD600为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5蛋白的菌体。
表达突变蛋白的菌体破碎
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。
突变蛋白的色谱纯化
仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)。
缓冲液：缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT)；以及，缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl)。下面的洗脱程序中用到的含有不同浓度NaCl的缓冲液是由缓冲液A和B按比例混合配置而成。
样品：如上获得的含有H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的菌体破碎上清。
洗脱程序为：
(1)用SP Sepharose 4Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液(80％缓冲液A+20％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液(60％缓冲液A+40％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有800mMNaCl的缓冲液洗脱的级分；
(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液(75％缓冲液A+25％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液(50％缓冲液A+50％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液(90％缓冲液A+10％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。
取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer(1L中含有1M TB6.8 300ml、100％甘油600ml、SDS 120g、溴酚蓝6g、β-巯基乙醇50ml)中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1A和1B中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5蛋白的纯度都大于90％。
通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV69N0C质粒制备和纯化了HPV69N0蛋白；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV51N9C质粒制备和纯化了HPV51N9蛋白；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV26N0C质粒制备和纯化了HPV26N0C蛋白
突变蛋白的免疫印迹实验
按上述方法对经纯化的H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5蛋白进行电泳。电泳结束后，使用抗HPV L1蛋白的广谱抗体4B3进行Western Blot检测，结果示于图2A和2B中。结果显示，H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5都能够被广谱抗体4B3特异性识别。
实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测
HPV病毒样颗粒的组装
取一定体积(约2ml)的蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5，分别依次透析至(1)2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)；(2)2L复性缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl)；和(3)20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0，0.5M NaCl中。在三种缓冲液中各自进行透析12h组装成相应的VLPs。
通过类似的方法，将HPV69N0、HPV51N9和HPV26N0蛋白分别组装为HPV69N0 VLP、HPV51N9 VLP和HPV26N0 VLP。
分子筛层析分析
用美国安捷伦公司的1120Compact LC高效液相色谱系统对经透析的样品进行分子筛层析分析，其中，所使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl7.8x300mm。HPV26N0 VLP的分析结果如图9所示，其他样品的分析结果如图3和4所示。结果显示，包含蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5的样品最先出现的蛋白峰均在13-14min左右，与HPV69N0 VLP相当。这表明，如上制备的蛋白H69N0-51T1、H69N0-51T2、H69N0-51T3、H69N0-51T4、H69N0-51T5、H69N0-51T1-26S2、H69N0-51T1-26S3、H69N0-51T1-26S4和H69N0-51T1-26S5均可组装成VLP。
沉降速率分析
沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV69N0 VLP、HPV51N9 VLP、HPV26N0VLP、H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP、H69N0-51T5VLP、H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3 VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP的沉降系数。HPV26N0 VLP的分析结果如图9所示，其他样品的分析结果如图5和6所示。结果显示，H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4VLP、H69N0-51T5 VLP、H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP的沉降系数分别为145S、155S、138S、121S、139S、157S、144S、147S和161S。这表明，如上制备的突变的HPV69 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV69N0 VLP，147S)相似的病毒样颗粒。
病毒样颗粒的形态学检测
取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷炭的铜网上，然后进行透射电镜观察。HPV26N0 VLP的观察结果如图9所示，其他样品的观察结果如图7和8所示。结果显示，H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4 VLP、H69N0-51T5 VLP、H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP均可组装成半径在25nm左右的病毒样颗粒，且大小均一。这表明，由这些突变蛋白组装成的VLP与野生型HPV69VLP(HPV69N0 VLP)大小类似。
实施例3：用VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价-1
在本实验中，免疫方案如表4所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：铝佐剂组1(免疫剂量为5μg，使用铝佐剂)，铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为8个亚组，对照亚组1-3分别用单独的HPV69N0 VLP、单独的HPV51N9 VLP和混合的HPV69/HPV51 VLP(即，HPV69N0 VLP和HPV51N9 VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组1-5分别用H69N0-51T1 VLP、H69N0-51T2 VLP、H69N0-51T3 VLP、H69N0-51T4VLP和H69N0-51T5 VLP进行免疫。
采用腹腔注射方式免疫5只小鼠/亚组，免疫剂量分别为5μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV69和HPV51抗体的滴度。分析结果如图10A和图10B所示。结果显示，H69N0-51T1 VLP和H69N0-51T5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV69的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV69N0 VLP、混合的HPV69/HPV51 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV51N9 VLP；H69N0-51T1 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，保护效果与同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV69/HPV51 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV69N0 VLP；H69N0-51T5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，保护效果虽稍弱于同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV69/HPV51 VLP，但显著优于同剂量的单独的HPV69N0 VLP。这表明，H69N0-51T1 VLP和H69N0-51T5 VLP对HPV69和HPV51具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表4.免疫方案
Figure BDA0002215682250000351
实施例4：用VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价-2
在本实验中，免疫方案如表5所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：铝佐剂组1(免疫剂量为5μg，使用铝佐剂)，铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为8个亚组，对照亚组1-4分别用单独的HPV69N0 VLP、单独的HPV51N9 VLP、单独的HPV26 VLP和混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP(即，HPV69N0 VLP、HPV51N9 VLP和HPV26N0VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组1-4分别用H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S3 VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5VLP进行免疫。
采用腹腔注射方式免疫5只小鼠/亚组，免疫剂量分别为5μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV69、HPV51和HPV26抗体的滴度。分析结果如图11A和图11B所示。结果显示，H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV69的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV69N0 VLP、混合的HPV69/HPV51/HPV26VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV51N9VLP；H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV51的中和抗体，保护效果与同剂量的单独的HPV51N9 VLP、混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV69N0 VLP和单独的HPV26N0VLP；H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP也能诱导小鼠产生较高滴度的针对HPV26的中和抗体，保护效果与同剂量的单独的HPV26N9 VLP、混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV51N9 VLP。这表明，H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP对HPV69、HPV51和HPV26具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表5.免疫方案
Figure BDA0002215682250000361
Figure BDA0002215682250000371
实施例5：病毒样颗粒诱导血清转换的ED50的评价
本实验中，所用病毒样颗粒为H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP。
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4VLP或H69N0-51T1-26S5 VLP(免疫剂量为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg或0.011μg)；对照组使用单独的HPV69N0 VLP、单独的HPV51N9 VLP或单独的HPV26N0 VLP(免疫剂量为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg或0.011μg)，或者混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP(即，HPV69N0 VLP、HPV51N9 VLP和HPV26N0VLP的混合物，每种VLP的免疫剂量各为0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg)；免疫体积为1mL。另外，还将用于稀释疫苗的稀释液用作空白对照。每组免疫8只小鼠，并且在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，检测血清中的HPV抗体，并通过Reed-Muench法(Reed LJMH.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表6所示。
表6H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4VLP和H69N0-51T1-26S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV69、抗HPV51和抗HPV26抗体(血清转换)的ED50
Figure BDA0002215682250000381
结果显示，在免疫小鼠5周后，H69N0-51T1-26S2 VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP诱导小鼠产生抗HPV69的ED50与单独的HPV69N0VLP以及混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP相当，且显著优于单独的HPV51N9 VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV51的ED50与单独的HPV51N9 VLP以及混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP相当，且显著优于单独的HPV69N0 VLP以及单独的HPV26N0 VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV26的ED50与单独的HPV26N0 VLP以及混合的HPV69/HPV51/HPV26 VLP相当，且显著优于单独的HPV51N9VLP。这表明，H69N0-51T1-26S2VLP、H69N0-51T1-26S4 VLP对HPV39、HPV68以及HPV70具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种人乳头瘤病毒69型L1蛋白的突变体
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100 105 110
Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Tyr Asp Asp Thr
115 120 125
Glu Asn Ser Arg Ile Ala Asn Gly Asn Ala Gln Gln Asp Val Arg Asp
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Asn Thr Ser Val Asp Asn Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys
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Ser Ser Val Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Phe Gly Ala
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Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Ala Thr Lys Cys Asp Val Pro Leu Asp
210 215 220
Ile Asn Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala
225 230 235 240
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245 250 255
Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Lys Ala Gly Thr Ile Gly Asp Pro Val
260 265 270
Pro Val Ser Met Tyr Ile Lys Gly Ala Gly Gln Gly Arg Glu Pro Pro
275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
Ser Ala Ser Ala Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ile Arg
355 360 365
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Ser Ser Thr Thr Arg Lys Lys Arg Lys Leu Thr Lys
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<210> 5
<211> 506
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H69N0-51T3
<400> 5
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1 5 10 15
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20 25 30
Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Leu Gly His Pro
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala Asp Thr
225 230 235 240
Tyr Gly Asn Ser Met Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala
245 250 255
Arg His Phe Phe Asn Lys Ala Gly Thr Ile Gly Asp Pro Val Pro Val
260 265 270
Ser Met Tyr Ile Lys Gly Ala Gly Gln Gly Arg Glu Pro Pro Thr Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val Asp Thr
325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Ser Thr Val Ser Ala Gln Ser Ala
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<213> Artificial Sequence
<220>
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130 135 140
Asn Val Cys Val Asp Asn Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys
145 150 155 160
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165 170 175
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Ser Ser Val Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Phe Gly Ala
195 200 205
Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Ala Thr Lys Cys Asp Val Pro Leu Asp
210 215 220
Ile Asn Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala
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<213> Artificial Sequence
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Asp Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly
305 310 315 320
His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val
325 330 335
Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Ser Thr Val Thr Ala Ala
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Asp Ala Pro Ala Gln Pro Lys Glu Asp Pro Phe Ser Lys Leu Lys Phe
435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505
<210> 8
<211> 1527
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 69
<400> 8
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cacaacaacg gtatctgctg gggtaaccag ctgttcgtta cctgcgttga caccacccgt 1020
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tctgactaca aacaatttat ccgtcacggt gaagaatacg aactgcagtt catcttccag 1140
ctgtgcaaaa tcaccctgac caccgacgtt atggcttaca tccacaccat gaactctacc 1200
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<210> 9
<211> 1515
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 9
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aacaagctgg gcagcgtggg cgaggacatc cccaccgact actacatcaa gggcagcggc 840
aacggcaggg accccatcga gagctacatc tacagcgcca cccccagcgg cagcatgatc 900
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<210> 10
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T1的DNA序列
<400> 10
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atccccaagg tgagcgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
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ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgctaa cgctgacacc 420
gacaaccgtg acaacgtttg cgttgacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
accccgccgc tgggtgaaca ctggggtgtc ggtaccgttt gcaaaaacgc tcagtctcag 540
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gttccgctgg acatcaacca gtctatctgc aaataccccg actacctgaa aatgtctgct 720
gacacctacg gtaactctat gttcttcttc ctgcgtcgtg aacagctgtt cgctcgtcac 780
ttcttcaaca aagctggtac catcggtgac cctgttccgg tttctatgta catcaaaggt 840
gctggtcagg gtcgtgaacc gccgaccaca tccatctact ctgctacccc gtctggttct 900
atggttacat ccgacgctca gctgttcaac aaaccgtact ggctgcagcg tgctcagggt 960
cacaacaacg gtatctgctg gggtaaccag ctgttcgtta cctgcgttga caccacccgt 1020
tctaccaacc tgaccatctc taccgtttct gctcagtctg cttctgctac cttcaaaccg 1080
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taccgtttca tcaaaaactc tgctaccacc tgccagcgtg acgctccggc tcagccgaaa 1320
gaagacccgt tctctaaact gaaattctgg gacgttgacc tgaaagaaaa attctctatc 1380
gacctggacc agttcccgct gggtcgtaaa ttcatgctgc aggctggtat ccagcgtcgt 1440
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cgtaaaaaac gtaaactgac caaataa 1527
<210> 11
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T2的DNA序列
<400> 11
atggctctgt ggcgtacctc tgactctaaa gtttacctgc cgccgacccc ggtttctcgt 60
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cgtctgctga ccctgggtca cccgtacttc ccgatcccga aatctggttc taccgctgaa 180
atcccgaagg tctctgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
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tgcgttggtg tcgaggtcgg caggggccag cccctgggcg tgggcctgag cggccacccc 360
ctgttcaaca agtacgacga caccgagaac agcaggatcg ccaacggcaa cgcccagcag 420
gacgtgaggg acaacaccag cgtggacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
accccgccgc tgggtgaaca ctggggtgtc ggtaccgttt gcaaaaacgc tcagtctcag 540
gttcagcgtg gtgactgccc gccgctggaa ctgatctctt ctgttatcga agacggtgac 600
atgatcgaca ccggtttcgg tgctatggac ttcaccgctc tgcaggctac caaatgcgac 660
gttccgctgg acatcaacca gtctatctgc aaataccccg actacctgaa aatgtctgct 720
gacacctacg gtaactctat gttcttcttc ctgcgtcgtg aacagctgtt cgctcgtcac 780
ttcttcaaca aagctggtac catcggtgac cctgttccgg tttctatgta catcaaaggt 840
gctggtcagg gtcgtgaacc gccgaccaca tccatctact ctgctacccc gtctggttct 900
atggttacat ccgacgctca gctgttcaac aaaccgtact ggctgcagcg tgctcagggt 960
cacaacaacg gtatctgctg gggtaaccag ctgttcgtta cctgcgttga caccacccgt 1020
tctaccaacc tgaccatctc taccgtttct gctcagtctg cttctgctac cttcaaaccg 1080
tctgactaca aacaatttat ccgtcacggt gaagaatacg aactgcagtt catcttccag 1140
ctgtgcaaaa tcaccctgac caccgacgtt atggcttaca tccacaccat gaactctacc 1200
atcctggaaa actggaactt cggtctgacc ctgccgccga ccgcttctct ggaagacgct 1260
taccgtttca tcaaaaactc tgctaccacc tgccagcgtg acgctccggc tcagccgaaa 1320
gaagacccgt tctctaaact gaaattctgg gacgttgacc tgaaagaaaa attctctatc 1380
gacctggacc agttcccgct gggtcgtaaa ttcatgctgc aggctggtat ccagcgtcgt 1440
ccgaaactgg gtaccaaacg tccggcttct tctctgtctg cttcttcttc ttctaccacc 1500
cgtaaaaaac gtaaactgac caaataa 1527
<210> 12
<211> 1521
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T3的DNA序列
<400> 12
atggctctgt ggcgtacctc tgactctaaa gtttacctgc cgccgacccc ggtttctcgt 60
gttgtttcta ccgacgaata cgttacccgt accggtatct actactacgc tggttcttct 120
cgtctgctga ccctgggtca cccgtacttc ccgatcccga aatctggttc taccgctgaa 180
atcccgaagg tctctgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
aaattcggtc tgccggaccc gcagctgtac aatccagaaa ccgaacgtct ggtttgggct 300
tgcgttggtg tcgaggtcgg tcgtggtcag ccgctgggtg tcggtctgtc tggtcacccg 360
ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgctaa cgctgacacc 420
gacaaccgtg acaacgtttg cgttgacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
accccgccgc tgggtgaaca ctggggcatc ggcaccacct gcaagaacac ccccgtgccc 540
cccggcgact gcccccccct ggaactgatc tcttctgtta tcgaagacgg tgacatgatc 600
gacaccggtt tcggtgctat ggacttcacc gctctgcagg ctaccaaatg cgacgttccg 660
ctggacatca accagtctat ctgcaaatac cccgactacc tgaaaatgtc tgctgacacc 720
tacggtaact ctatgttctt cttcctgcgt cgtgaacagc tgttcgctcg tcacttcttc 780
aacaaagctg gtaccatcgg tgaccctgtt ccggtttcta tgtacatcaa aggtgctggt 840
cagggtcgtg aaccgccgac cacatccatc tactctgcta ccccgtctgg ttctatggtt 900
acatccgacg ctcagctgtt caacaaaccg tactggctgc agcgtgctca gggtcacaac 960
aacggtatct gctggggtaa ccagctgttc gttacctgcg ttgacaccac ccgttctacc 1020
aacctgacca tctctaccgt ttctgctcag tctgcttctg ctaccttcaa accgtctgac 1080
tacaaacaat ttatccgtca cggtgaagaa tacgaactgc agttcatctt ccagctgtgc 1140
aaaatcaccc tgaccaccga cgttatggct tacatccaca ccatgaactc taccatcctg 1200
gaaaactgga acttcggtct gaccctgccg ccgaccgctt ctctggaaga cgcttaccgt 1260
ttcatcaaaa actctgctac cacctgccag cgtgacgctc cggctcagcc gaaagaagac 1320
ccgttctcta aactgaaatt ctgggacgtt gacctgaaag aaaaattctc tatcgacctg 1380
gaccagttcc cgctgggtcg taaattcatg ctgcaggctg gtatccagcg tcgtccgaaa 1440
ctgggtacca aacgtccggc ttcttctctg tctgcttctt cttcttctac cacccgtaaa 1500
aaacgtaaac tgaccaaata a 1521
<210> 13
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T4的DNA序列
<400> 13
atggctctgt ggcgtacctc tgactctaaa gtttacctgc cgccgacccc ggtttctcgt 60
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atcccgaagg tctctgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
aaattcggtc tgccggaccc gcagctgtac aatccagaaa ccgaacgtct ggtttgggct 300
tgcgttggtg tcgaggtcgg tcgtggtcag ccgctgggtg tcggtctgtc tggtcacccg 360
ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgctaa cgctgacacc 420
gacaaccgtg acaacgtttg cgttgacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
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atcctggaaa actggaactt cggtctgacc ctgccgccga ccgcttctct ggaagacgct 1260
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<210> 14
<211> 1524
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T5的DNA序列
<400> 14
atggctctgt ggcgtacctc tgactctaaa gtttacctgc cgccgacccc ggtttctcgt 60
gttgtttcta ccgacgaata cgttacccgt accggtatct actactacgc tggttcttct 120
cgtctgctga ccctgggtca cccgtacttc ccgatcccga aatctggttc taccgctgaa 180
atcccgaagg tctctgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
aaattcggtc tgccggaccc gcagctgtac aatccagaaa ccgaacgtct ggtttgggct 300
tgcgttggtg tcgaggtcgg tcgtggtcag ccgctgggtg tcggtctgtc tggtcacccg 360
ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgctaa cgctgacacc 420
gacaaccgtg acaacgtttg cgttgacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
accccgccgc tgggtgaaca ctggggtgtc ggtaccgttt gcaaaaacgc tcagtctcag 540
gttcagcgtg gtgactgccc gccgctggaa ctgatctctt ctgttatcga agacggtgac 600
atgatcgaca ccggtttcgg tgctatggac ttcaccgctc tgcaggctac caaatgcgac 660
gttccgctgg acatcaacca gtctatctgc aaataccccg actacctgaa aatgtctgct 720
gacacctacg gtaactctat gttcttcttc ctgcgtcgtg aacagctgtt cgctcgtcac 780
ttcttcaaca aagctggtac catcggtgac cctgttccgg tttctatgta catcaaaggt 840
gctggtcagg gtcgtgaacc gccgaccaca tccatctact ctgctacccc gtctggttct 900
atggttacat ccgacgctca gctgttcaac aaaccgtact ggctgcagcg tgctcagggt 960
cacaacaacg gtatctgctg gggtaaccag ctgttcgtta cctgcgttga caccacccgt 1020
tctaccaacc tgaccatctc taccgttacc gccgccgtga gccccacctt cacccccagc 1080
aactacaaac aatttatccg tcacggtgaa gaatacgaac tgcagttcat cttccagctg 1140
tgcaaaatca ccctgaccac cgacgttatg gcttacatcc acaccatgaa ctctaccatc 1200
ctggaaaact ggaacttcgg tctgaccctg ccgccgaccg cttctctgga agacgcttac 1260
cgtttcatca aaaactctgc taccacctgc cagcgtgacg ctccggctca gccgaaagaa 1320
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ctggaccagt tcccgctggg tcgtaaattc atgctgcagg ctggtatcca gcgtcgtccg 1440
aaactgggta ccaaacgtcc ggcttcttct ctgtctgctt cttcttcttc taccacccgt 1500
aaaaaacgta aactgaccaa ataa 1524
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 15
Leu Pro Lys Thr Ser Thr Arg Ala Ala
1 5
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 16
Thr Ala Ala Val Ser Pro Thr Phe Thr Pro Ser Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 496
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 17
Met Lys Val Tyr Leu Pro Pro Ala Pro Val Ser Arg Ile Val Asn Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Ile Thr Arg Thr Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser
20 25 30
Arg Leu Ile Thr Leu Gly His Pro Tyr Phe Pro Leu Pro Lys Thr Ser
35 40 45
Thr Arg Ala Ala Ile Pro Lys Val Ser Ala Phe Gln Tyr Arg Val Phe
50 55 60
Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Asn
65 70 75 80
Leu Tyr Asn Pro Asp Thr Asp Arg Leu Val Trp Gly Cys Val Gly Val
85 90 95
Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro
100 105 110
Leu Phe Asn Lys Tyr Asp Asp Thr Glu Asn Ser Arg Ile Ala Asn Gly
115 120 125
Asn Ala Gln Gln Asp Val Arg Asp Asn Thr Ser Val Asp Asn Lys Gln
130 135 140
Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys Ala Pro Pro Ile Gly Glu His Trp
145 150 155 160
Gly Ile Gly Thr Thr Cys Lys Asn Thr Pro Val Pro Pro Gly Asp Cys
165 170 175
Pro Pro Leu Glu Leu Val Ser Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Ile
180 185 190
Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Ala Ala Leu Gln Ala Thr Lys
195 200 205
Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Ser Gln Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp
210 215 220
Tyr Leu Lys Met Ser Ala Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Met Phe Phe His
225 230 235 240
Leu Arg Arg Glu Gln Ile Phe Ala Arg His Tyr Tyr Asn Lys Leu Gly
245 250 255
Ser Val Gly Glu Asp Ile Pro Thr Asp Tyr Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
260 265 270
Asn Gly Arg Asp Pro Ile Glu Ser Tyr Ile Tyr Ser Ala Thr Pro Ser
275 280 285
Gly Ser Met Ile Thr Ser Asp Ser Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp
290 295 300
Leu His Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Asn Asn Gln
305 310 315 320
Leu Phe Ile Thr Cys Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile
325 330 335
Ser Thr Ala Thr Ala Ala Val Ser Pro Thr Phe Thr Pro Ser Asn Phe
340 345 350
Lys Gln Tyr Ile Arg His Gly Glu Glu Tyr Glu Leu Gln Phe Ile Phe
355 360 365
Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Thr Glu Val Met Ala Tyr Leu His
370 375 380
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385 390 395 400
Pro Pro Ser Ala Ser Leu Glu Asp Ala Tyr Arg Phe Val Arg Asn Ala
405 410 415
Ala Thr Ser Cys Gln Lys Asp Thr Pro Pro Gln Ala Lys Pro Asp Pro
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Leu Ala Lys Tyr Lys Phe Trp Asp Val Asp Leu Lys Glu Arg Phe Ser
435 440 445
Leu Asp Leu Asp Gln Phe Ala Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Val
450 455 460
Gly Val Gln Arg Lys Pro Arg Pro Gly Leu Lys Arg Pro Ala Ser Ser
465 470 475 480
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Lys Arg Lys Arg Val Lys Lys
485 490 495
<210> 18
<211> 1491
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 18
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tacagggtgt tcagggtgca gctccccgac cccaacaagt tcggcctgcc cgaccccaac 240
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gcctacctgc acaccatgga ccccaccatc ctggagcagt ggaacttcgg cctgaccctg 1200
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<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 19
Tyr Asp Asp Thr Glu Asn Ser Arg Ile Ala Asn Gly Asn Ala Gln Gln
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Asp Val Arg Asp Asn Thr Ser
20
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 20
Ile Gly Thr Thr Cys Lys Asn Thr Pro Val Pro Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 51
<400> 21
Tyr Tyr Asn Lys Leu Gly Ser Val Gly Glu Asp Ile Pro Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Gly Arg Asp Pro Ile Glu Ser Tyr
20 25 30
<210> 22
<211> 503
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 26
<400> 22
Met Ala Leu Trp Arg Thr Ser Asp Ser Lys Val Tyr Leu Pro Pro Thr
1 5 10 15
Pro Val Ser Arg Val Val Asn Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Leu Gly His Pro
35 40 45
Tyr Phe Ser Ile Pro Lys Thr Gly Gln Lys Ala Glu Ile Pro Lys Val
50 55 60
Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val His Leu Pro Asp Pro Asn
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Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Gln Leu Tyr Asn Pro Asp Thr Glu Arg
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Gly Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Leu Asp Asp Thr
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Asn Val Ser Val Asp Asn Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys
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Thr Pro Pro Leu Gly Glu His Trp Gly Ile Gly Thr Ile Cys Lys Asn
165 170 175
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180 185 190
Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp
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Phe Thr Ala Leu Gln Ala Thr Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Ser
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Gln Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala Asp Thr
225 230 235 240
Tyr Gly Asn Ser Met Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala
245 250 255
Arg His Phe Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Val Gly Asp Ala Ile Pro Thr
260 265 270
Thr Leu Tyr Ile Lys Gly Ala Glu Ser Gly Arg Glu Pro Pro Thr Ser
275 280 285
Ser Ile Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala
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Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn
305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val Asp Thr
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420 425 430
Ala Pro Pro Val Pro Lys Glu Asp Pro Phe Gln Lys Phe Lys Phe Trp
435 440 445
Asp Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ile Asp Leu Asp Gln Phe Pro
450 455 460
Leu Gly Arg Lys Phe Met Leu Gln Ala Gly Ile Gln Arg Arg Pro Lys
465 470 475 480
Leu Gly Thr Lys Arg Pro Leu Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Lys Arg
485 490 495
Lys Lys Arg Lys Leu Thr Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 23
Met Ala Leu Trp Arg Thr Ser Asp Ser Lys Val Tyr Leu Pro Pro Thr
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Pro Val Ser Arg Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Gly
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Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Leu Gly His Pro
35 40 45
Tyr Phe Pro Leu Pro Lys Thr Ser Thr Arg Ala Ala Ile Pro Lys Val
50 55 60
Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val His Leu Pro Asp Pro Asn
65 70 75 80
Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Gln Leu Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Arg
85 90 95
Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu
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Gly Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Leu Asp Asp Thr
115 120 125
Glu Asn Ser His Leu Ala Thr Val Asn Ala Asp Thr Asp Asn Arg Asp
130 135 140
Asn Val Ser Val Asp Asn Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys
145 150 155 160
Thr Pro Pro Leu Gly Glu His Trp Gly Val Gly Thr Val Cys Lys Asn
165 170 175
Ala Gln Ser Gln Val Gln Arg Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile
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Ser Ser Val Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Phe Gly Ala
195 200 205
Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Ala Thr Lys Cys Asp Val Pro Leu Asp
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Ile Asn Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala
225 230 235 240
Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Met Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Leu
245 250 255
Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Lys Ala Gly Thr Ile Gly Asp Pro Val
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Pro Val Ser Met Tyr Ile Lys Gly Ala Gly Gln Gly Arg Glu Pro Pro
275 280 285
Thr Thr Ser Ile Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser
290 295 300
Asp Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly
305 310 315 320
His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val
325 330 335
Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Ser Thr Val Ser Ala Gln
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Ser Ala Ser Ala Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ile Arg
355 360 365
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405 410 415
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Arg Asp Ala Pro Ala Gln Pro Lys Glu Asp Pro Phe Ser Lys Leu Lys
435 440 445
Phe Trp Asp Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ile Asp Leu Asp Gln
450 455 460
Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Met Leu Gln Ala Gly Ile Gln Arg Arg
465 470 475 480
Pro Lys Leu Gly Thr Lys Arg Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ser
485 490 495
Ser Ser Thr Thr Arg Lys Lys Arg Lys Leu Thr Lys
500 505
<210> 24
<211> 506
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H69N0-51T1-26S3
<400> 24
Met Ala Leu Trp Arg Thr Ser Asp Ser Lys Val Tyr Leu Pro Pro Thr
1 5 10 15
Pro Val Ser Arg Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Leu Gly His Pro
35 40 45
Tyr Phe Pro Leu Pro Lys Thr Ser Thr Arg Ala Ala Ile Pro Lys Val
50 55 60
Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val His Leu Pro Asp Pro Asn
65 70 75 80
Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Gln Leu Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Arg
85 90 95
Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu
100 105 110
Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Leu Asp Asp Thr
115 120 125
Glu Asn Ser His Leu Ala Thr Ala Asn Ala Asp Thr Asp Asn Arg Asp
130 135 140
Asn Val Cys Val Asp Asn Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys
145 150 155 160
Thr Pro Pro Leu Gly Glu His Trp Gly Ile Gly Thr Ile Cys Lys Asn
165 170 175
Thr Gln Thr Gln Arg Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Ser Ser
180 185 190
Val Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp
195 200 205
Phe Thr Ala Leu Gln Ala Thr Lys Cys Asp Val Pro Leu Asp Ile Asn
210 215 220
Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ser Ala Asp Thr
225 230 235 240
Tyr Gly Asn Ser Met Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala
245 250 255
Arg His Phe Phe Asn Lys Ala Gly Thr Ile Gly Asp Pro Val Pro Val
260 265 270
Ser Met Tyr Ile Lys Gly Ala Gly Gln Gly Arg Glu Pro Pro Thr Thr
275 280 285
Ser Ile Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala
290 295 300
Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn
305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val Asp Thr
325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Ser Thr Val Ser Ala Gln Ser Ala
340 345 350
Ser Ala Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ile Arg His Gly
355 360 365
Glu Glu Tyr Glu Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu
370 375 380
Thr Thr Asp Val Met Ala Tyr Ile His Thr Met Asn Ser Thr Ile Leu
385 390 395 400
Glu Asn Trp Asn Phe Gly Leu Thr Leu Pro Pro Thr Ala Ser Leu Glu
405 410 415
Asp Ala Tyr Arg Phe Ile Lys Asn Ser Ala Thr Thr Cys Gln Arg Asp
420 425 430
Ala Pro Ala Gln Pro Lys Glu Asp Pro Phe Ser Lys Leu Lys Phe Trp
435 440 445
Asp Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ile Asp Leu Asp Gln Phe Pro
450 455 460
Leu Gly Arg Lys Phe Met Leu Gln Ala Gly Ile Gln Arg Arg Pro Lys
465 470 475 480
Leu Gly Thr Lys Arg Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ser Ser Ser
485 490 495
Thr Thr Arg Lys Lys Arg Lys Leu Thr Lys
500 505
<210> 25
<211> 508
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H69N0-51T1-26S4
<400> 25
Met Ala Leu Trp Arg Thr Ser Asp Ser Lys Val Tyr Leu Pro Pro Thr
1 5 10 15
Pro Val Ser Arg Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Leu Gly His Pro
35 40 45
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Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Gln Leu Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Arg
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Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu
100 105 110
Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Leu Asp Asp Thr
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<213> Artificial Sequence
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gttgttaaca ccgacgaata cgttacccgt accggtatct actactacgc tggttcttct 120
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ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgttaa cgctgacacc 420
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<213> Artificial Sequence
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<210> 31
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H69N0-51T1-26S5的DNA序列
<400> 31
atggctctgt ggcgtacctc tgactctaaa gtttacctgc cgccgacccc ggtttctcgt 60
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cgtctgctga ccctgggtca cccgtacttc cccctgccca agaccagcac cagggccgcc 180
atccccaagg tgagcgctta ccagtaccgg gtattccgtg tccacctgcc ggacccgaac 240
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tgcgttggtg tcgaggtcgg tcgtggtcag ccgctgggtg tcggtctgtc tggtcacccg 360
ctgttcaaca aactggacga caccgaaaac tctcacctgg ctaccgctaa cgctgacacc 420
gacaaccgtg acaacgtttg cgttgacaac aaacagaccc agctgtgcat catcggttgc 480
accccgccgc tgggtgaaca ctggggtgtc ggtaccgttt gcaaaaacgc tcagtctcag 540
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atgatcgaca ccggtttcgg tgctatggac ttcaccgctc tgcaggctac caaatgcgac 660
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gacacctacg gtaactctat gttcttcttc ctgcgtcgtg aacagctgtt cgctcgtcac 780
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<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 26
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Val Ser
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 26
<400> 33
Ile Gly Thr Ile Cys Lys Asn Thr Gln Thr Gln
1 5 10
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 26
<400> 34
Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Val Gly Asp Ala Ile Pro Thr Thr Leu Tyr
1 5 10 15
Ile Lys Gly Ala Glu Ser Gly Arg Glu Pro Pro Thr Ser
20 25
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 26
<400> 35
Ala Ser Ala Ser Thr Pro
1 5
<210> 36
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 36
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<210> 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 37
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<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 38
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<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 39
tgatgcacag ctgggtctgt ttgttgtcca cgctggtgtt gtccc 45
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 40
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<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 41
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<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 42
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<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 43
aaccatagaa ccagacgggg tagcgctgta gatgtagctc tcgat 45
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 44
accaacctga ccatctctac cgttaccgcc gccgtgagcc ccacc 45
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 45
cgtgacggat aaattgtttg tagttgctgg gggtgaaggt ggggc 45
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 46
gtacgggtga cccagggtca gcag 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 47
gcttaccagt accgggtatt ccgt 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 48
gacctcgaca ccaacgcaag ccca 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 49
acaaacagac ccagctgtgc atca 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 50
ttcacccagc ggcggggtgc aacc 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 51
cgctggaact gatctcttct gtta 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 52
gtgacgagcg aacagctgtt cacg 24
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 53
gctaccccgt ctggttctat ggtt 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 54
aacggtagag atggtcaggt tggt 24
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 55
actacaaaca atttatccgt cacg 24
<210> 56
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 56
tgggcttgcg ttggtgtcga ggtcggtcgt ggtcagccgc tgggt 45
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 57
cggggtgcaa ccgatgatgc acagctgggt ctgtttgttg tcaac 45
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 58
gacctcgaca ccaacgcaag ccca 24
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 59
ctgtgcatca tcggttgcac cccg 24
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 60
ctgtgcatca tcggttgcac cccgccgctg ggtgaacact gg 42
<210> 61
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 61
accgtcttcg ataacagaag agatcagttc cagcggcggg ca 42
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 62
cggggtgcaa ccgatgatgc acag 24
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 63
atctcttctg ttatcgaaga cggt 24
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 64
atgttcttct tcctgcgtcg tgaacagctg ttcgctcgtc acttc 45
<210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 65
agcgtcggat gtaaccatag aaccagacgg ggtagcagag tagat 45
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 引物
<400> 66
ttcacgacgc aggaagaaga acat 24
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 67
ggttctatgg ttacatccga cgct 24
<210> 68
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 68
gttacctgcg ttgacaccac ccgttctacc aacctgacca tctctaccgt g 51
<210> 69
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 69
gaagatgaac tgcagttcgt attcttcacc gtgacggatg aactgtttgt a 51
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 引物
<400> 70
acgggtggtg tcaacgcagg taac 24
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 71
gaatacgaac tgcagttcat cttc 24

Claims (10)

1.一种突变的HPV69 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV69L1蛋白与野生型HPV69L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)位于野生型HPV69 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPVL1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV69 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15或16个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV69 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV69和HPV51)的中和抗体；
任选地，所述突变的HPV69 L1蛋白还具有(2)(a)、(2)(b)或(2)(c)中所定义的突变突变；
所述的(2)(a)、(2)(b)或(2)(c)中所定义的突变为：
(2)(a)位于野生型HPV69L1蛋白第114-147位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(2)(b)位于野生型HPV69L1蛋白第262-290位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(2)(c)位于野生型HPV69L1蛋白第352-357位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
优选地，所述第二型别的野生型HPV为HPV51；
优选地，(1)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV51 L1蛋白第52-60位的氨基酸残基；
优选地，所述第三型别的野生型HPV为HPV26；
优选地，(2)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26 L1蛋白第114-147位的氨基酸残基；优选地，(2)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基；优选地，(2)(c)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV26L1蛋白第350-355位的氨基酸残基；
优选地，所述野生型HPV69 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述野生型HPV51 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述野生型HPV26 L1蛋白具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
优选地，所述突变的HPV69 L1蛋白具有SEQ ID NO:3、23、25或26所示的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体，
优选地，所述分离的核酸具有SEQ ID NO:10、28、30或31所示的核苷酸序列。
3.包含权利要求2所述的分离的核酸的载体。
4.包含权利要求2所述的分离的核酸和/或权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.一种HPV病毒样颗粒，其含有权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体，或者由权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体组成。
6.一种组合物，其包含权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体，或权利要求2的分离的核酸，或权利要求3的载体，或权利要求4的宿主细胞，或权利要求5的HPV病毒样颗粒。
7.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求5的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂，
优选地，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在；
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌、尖锐湿疣及其组合。
8.制备权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体；
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；
优选地，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV69L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体；优选地，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV69 L1蛋白或其变体。
9.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求5的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
10.权利要求1所述的突变的HPV69 L1蛋白或其变体或权利要求5的HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病，
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，由HPV69感染、HPV51感染和HPV26感染组成的组中选择的至少一种感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌、尖锐湿疣及其组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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