CN1109506A - 合成的人γ-干扰素基因(CDNA)在大肠杆菌中的高效表达 - Google Patents

Abstract

γ型干扰素(IFN-γ)具有免疫调节、抗病毒和抗 肿瘤等多种生物功能，是世界上竞相开发的基因工程 产品。本发明是将设计的化学合成人γ型干扰素基团插入含有λ噬菌体P_L启动基因的大肠杆菌载体，组建了γ型干扰素表达质粒。包含此种表达质粒的工程菌所产生的γ型干扰素可达到细菌可溶蛋白总量的60—80％。所产生的γ型干扰素浓集于包涵体中，分离包涵体，IFH-γ纯度可达90％。以后只经一步分子筛柱层析即可将IFH-γ纯化到96％以上纯度，比活数为2×10⁷国际单位/mg蛋白。具有极高的生产价值。

Description

本发明为一种用基因工程技术生产人γ-型干扰素的方法。

干扰素是一类蛋白质，又称免疫干扰素分为α、β和γ三大类型，简称IFN-α、β和γ。其中IFN-γ是1965年Wheelock发现的（Wheelock，F，W;Science[1965]，149，P310）。干扰素具有重要的生物学活性，主要表现为抗病毒、抗肿瘤（抑制细胞增殖）和对免疫系统的调节作用等。这包括它能激活巨噬细胞、促进多种免疫细胞的成熟与淋巴因子的分泌、诱导Ⅰ和Ⅱ型MHC基因的表达等。IFN-γ在癌症治疗中有一定作用。已发现它对肾细胞癌、小细胞肺癌、结肠癌和黑色素瘤等有一定疗效;IFN-γ与肿瘤坏死因子（TNF）、IFN-α、IFN-β合用，有协同作用，而且效果更好（Shah，P.，et al，Br.J.Cancer，[1989]59，P206;Fleischmann，W.R.，et al，Infect and Immun.，[1979]26，P248）。因此，研究和生产INF-γ，将它作为一类新型抗病毒和抗肿瘤药物已成为世界许多国家生物学和药学界的一项重要课题。美国Amgen、Biogen、Genetech等公司已在进行IFN-γ的生产，几家日本公司也在生产。

常规的从人血中分离IFN-γ技术费用昂贵，无法满足人们的需要。用基因工程技术生产IFN-γ已是大势所趋，而且是切实可行的。

IFN-γ基因位于染色体12q24.1处，由3个内含子和4个外显子成（Naylor，S.L，et al.J.Exp.Med.，[1983]，157，P1020）。IFN-γ cDNA克隆已经得到（Gray，P.W.，et al，Nature，[1982]，295，03和Devos，R. et al，Nucleic Acids Res.，[1982]，10，P2487），基因的全部顺序已经测定;用INF-γ的cDNA在细菌中表达已成为大量生产IFN的途径。

由于大肠杆菌对蛋白质中氨基酸密码子的偏爱性与人细胞是不同的，并鉴于氨基酸密码子的简并性，本发明采用人工设计的方法，将人IFN-γ中的一些氨基酸的密码子改为大肠杆菌喜爱的密码子，其目的在于使合成IFN-γ基因能在大肠杆菌中高效表达，而不改变IFN-γ的氨基酸组成和排列顺序，故能大量生产IFN-γ。

本发明包括构建含合成的IFN-γ基因的表达质粒，质粒在大肠杆菌中发酵表达后，IFN-γ可达菌体总蛋白的60-80%，这比用cDNA直接表达（一般在35%左右）高得多，它们以包涵的形式存在于细菌中，也为分离纯化提供了优越的条件。本发明的工程菌大肠杆菌Escherichia coli SIB-203-2 pLY4-γ，保藏在中国典型培养物保藏中心（中国.武汉.珞珈山武汉大学校内），保藏编号CCTCC NO。

本发明也提供了一个分离纯化IFN-γ的方法，在制得包涵体后，只用一步Sephacryl S-200柱层析就可得到纯度≥96%，比活约2×10⁷国际单位/毫克蛋白产品。这为高效、大量生产IFN-γ开创了有利途径。

本发明的示意图说明如下：

图1，设计并合成的IFN-γ基因及其相应的氨基酸顺序。

图2，合成IFN-γ26个小片段的顺序。

图3，部分小片段放射自显影鉴定。

图4，IFN-γ基因大片段合成及完整基因组装示意图。

图5，IFN-γDNA大片段的克隆。

图6，IFN-γ合成基因的全顺序分析。

图7，完整IFN-γ基因的组装。

图8，含完整IFN-γ基因的M13mp18-LW-γ₅重组DNA的酶切鉴定。

图9，IFN-γ表达质粒pLY4-γ之构建。

图10，IFN-γ表达产物的鉴定。

图11，对图10的黑度扫描。

图12，全菌与包涵体中IFN-γ含量的比较。

图13，所得包涵体中IFN-γ蛋白电泳图。

1为标准分子量，粗黑带为溶菌酶。

2、4、6为包涵体。

3、5、7为相应上清液。

图14，图13中蛋白质扫描结果。

图15，用Sephacryl S-200纯化IFN-γ。

图16，Sephacryl S-200色层中各峰的电泳。

图17，对图16的黑度扫描。

通过下述实施例对本发明的技术特征作详细描述。

材料与方法：

a.人工合成DNA片段的试剂，包括^bzA二异丙基亚磷酰胺、^bzC二异丙基亚磷酰胺、^bzG二异丙基亚磷酰胺、T异丙基亚磷酰胺、^bzA-CPG、^bzC-CPG、^bzG-CPG、T-CPG和其他合成试剂均购自ABI公司。退火液（10X）为0.5M Tris.HCl，pH7.6，0.1M MgCl₂，0.5MNaCl。

b.限制性内切酶EcoRⅠ.BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、BglⅡ、PVUⅡ和ScaⅠ、T₄DNA连接酶、CIP碱性磷酸酯酶、T₄核苷酸激酶和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段等来自Boehringer公司、New England公司和BioLabs公司。

c.菌种及质粒：JM101、JM105和K802为本组传代菌种;JF1125由刘爱萍惠赠;M13mp18和M13mp19为本组库存;pLY-质粒系列由虞建良构建。

d.放射性同位素α-³²P-dATP、α-³²P-dCTP和γ-³²P-ATP购自Amersham公司。

e.分离载体：Sephadex G25、G100、G200，Sephacryl S-200和DEAE-Sephacryl购自Pharmacia-LKB公司。

f.基他试剂：琼脂糖、IPTG、X-gal和盐酸胍购自BRL公司;聚丙烯酰胺购自Sigma公司;EB购自Fluka chemical公司;SDS购自Serva公司;PEG购自Koch Light公司。

g.DNA片段合成用ABI公司的DNA合成仪，用亚磷酸三酯法进行。

h.DNA克隆和转化按照文献方法（Messing J.et al N.A. Res.9[1981]309;Maniatis T.et al. Molecular Cloning[1982]P254;Sanger F.et al Proc Natl.Acad Sci 2 USA.74[1977]5463）进行。

i.DNA序列测定按照文献方法（Messing J. et al N.A. Res.9[1981]309;Sanger F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA74[1977]5463;Sanger F. et al. J.Mol Biol. 143[1980]161）进行。

j.表达质粒的构建：将合成的IFN-γ基因片段回收后组装成完整的IFN-γ基因，然后将它连接到表达载体上并构建成表达质粒。

k.INF-γ的诱导表达。当基因工程菌生长到对数期时进行热诱导，表达产生IFN-γ。

l.IFN-γ产物的电泳鉴定参照文献的方法（Laemmli U.K.Nature 227[1970]680）进行。

m.干扰素抗病毒活力参照文献（Familletti P.C. et al. Method Enzymol 78[1981]387）进行。

n.IFN-γ产品鉴定方法：SDS-PAGE见上述之l;HPLC鉴定，用Beckman公司的Golden System和TSK柱，平衡及洗脱液均用PBS，pH7.0，比活测定见m;氨基酸组成分析用酸水解法，由生化所陈德明测定;N末端测定用Edman法，由复旦大学柴常青测定。

实施的具体步骤分别叙述如下：

实施例1，IFN-γ基因的合成及鉴定

第一步是基因设计。第二步是小片段合成。第三步是大片段合成。第四步是完整基因的组装。第五步是鉴定。

A.基因设计（图1）。

IFN-γ由143个氨基酸组成，其基因有429bp，加上起始密码子ATG，两个终止密码子TAA、TAG及克隆用的EcoRⅠ及SalⅠ限制性内切酶接头，共有447bp。将它分为24个小片段来合成。24个小片段的序列见图2。这些片段中一些氨基酸密码子是选用了大肠杆菌使用频率高的密码子。

B.小片段DNA合成。

用DNA合成仪进行DNA小片段合成。反应结束后，取出带有合成DNA片段的CPG柱，用硫酚：二氧六环：三乙胺（1：1：2）在室温下处理半小时，脱去寡核苷酸中磷酸上的保护基甲基，再先后用甲醇和乙醚洗涤，经空气干燥后，加浓氨水并密封，于55℃保温过夜。将DNA小片段从硅胶树脂上洗脱下来，同时也脱去N-酰基上的保护基。冻干样品，经醋酸处理和NaOH中和，再冻干。溶于水，用乙醇使之沉淀，将沉淀再溶于水。然后，用20%PAG-7M脲素（urea）电泳分离。回收含所需要DNA片段的凝胶。凝胶经切碎后用含0.3M NaCl的TE（pH8.0）浸泡过夜，离心后取上清液，用乙醇沉淀DNA。再经SephadexG25脱盐，就回收到各个DNA小片段。为鉴定这些片段的纯度，用T4多核苷酸激酶和γ-³²P-ATP标记这些片段后经7M Urea-20%PAGE，放射自显影显示为均一条带（图3）。

C.大片段DNA合成。

将24个小片段分成若干组（图4），将相应片段用上述方法在其5′末端加上磷酸后，与没有被磷酸化的片段用T4-DNA连接酶相连接。产物用7M  Urea-8%PAGE分离。割下含大片段的凝胶后用上述方法回收DNA片段。共得到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个大片段。为了鉴定合成片段的准确性，将三个大片段分别与M13mp19RFDNA重组（图5），筛选到重组DNA后，用Sanger方法测定DNA序列。得到含正确DNA序列的三个大片段重组DNA：M13mp19-Ⅰ、M13mp19-Ⅱ和M13mp19-Ⅲ（图4）。其DNA序列测定结果见图6。

D.完整基因的组装。

如图7所示，先用BamHⅠ和HindⅢ水解M13mp19-Ⅱ，分离188bp的INF-γ大片段，与用BamHⅠ和HindⅢ切开的M13mp19-Ⅰ重组，得到M13mp19-LW-γ4，它含有合成的IFN-γ大片段Ⅰ和Ⅱ。为了与片段Ⅲ连接，将M13mp19-LW-γ4中的IFN-γ片段用EcoRⅠ和HindⅢ切出来后克隆人M13mp18，得到M13mp18-LW-γ4，然后再用BglⅡ和HindⅢ切开这一重组DNA，与由M13mp19-Ⅲ中用BglⅡ和HidⅢ切出的IFN-γⅢ大片段重组，就得到含有完整IFN-γ基因的M13mp18-LW-γ5。通过酶切鉴定说明上述连接是正确的。

从上述过程可知，含IFN-γ的M13mp18-LW-γ5的RF  DNA中有2个EcoRⅠ切点，一个来自IFN-γ基因的5′末端，另一个来自M13mp18DNA的MCS区，这一DNA只含一个SalⅠ的切点。因此，用EcoRⅠ水解时可产生2个片段（图8）。其中一个片段大小与M13mp18DNA接近，另一片段为447bp，用SalⅠ水解，则只得到一个线性DNA，其大小相当于M13mp18DNA与IFN-γ基因之和。这些结果证明，这一重组质粒中含有完整正确的IFN-γ基因。

实施例2，表达质粒pLY4-γ的构建与鉴定。

表达载体是用我们构建的pLY4-γ，它带有P_L强启动子，CⅠts857温度敏感阻遏蛋白基因，合适的ATG-SD顺序间距和强5SrRNA基因的终止子t₁t₂。

实施例3，IFN-γ的发酵生产及表达产物的鉴定。

将pLY4-γ转化受体菌K802和JF1125。挑单个菌落接种于3mlLB培养液中，在30℃振荡培养过夜。然后以2%比例接种于补充VitBl（4mg/L）、AMP（50mg/L）的M9培养基，30℃培养至OD₆₀₀为0.35-0.55。然后将温度增至42℃，再培养3小时，诱导IFN-γ的产生。其IFH-γ的量可达菌体可溶质总蛋白的60-80%（图10-12）。

采用2个方法鉴定发酵生产的IFN-γ。第一个是SDS-PAGE。浓缩胶是4.5%丙烯酰胺，分离胶是15%丙烯酰胺。按方法中所引文献的电泳方法，结果如图10所示。在30℃培养时IFN-γ产物极少，而在42℃诱导后有大量产物。黑度扫描表示IFN-γ占菌体总蛋白量的68.7%（图11）。第二个方法是测定表达IFN-γ的抗病毒活性及比活。发酵菌经5000rpm离心10分钟后，菌体用TE（pH8.0）-100mM NaCl洗涤，然后用8M盐酸胍破碎细菌，离心后取上清液测活性。人羊膜细胞Wish株在96孔板上贴壁生长过夜（5%CO₂，37℃），每孔有4万个细胞。然后加入不同稀释度的待测样品或标准干扰素，在5%CO₂再培养15-18小时，加入水泡性口类病毒（VSV）攻击一定时间后，用0.1%结晶紫柠檬酸染色。结果如表1所示。由结果可知，一般每升发酵液可得到10⁹国际单位约相当于200-300mg的IFH-γ用发酵罐高密度发酵，产量更高（数字未列出）。

表1：表达IFN-γ的活性鉴定：

注：表中数字为每立升的IFN-γ活性单位（国际标准）

实施例4，IFN-γ的分离纯化。

外源基因在大肠杆菌中表达时，如果表达速度快，产量高，而产物又有较强的疏水性时，它们将通过疏水键相互聚集形成包涵体，这为表达产物的制备提供了基础。我们使用的包涵体制备和一步柱层析是纯化基因工程生产IFN-γ最好方法之一。

（a）包涵体制备

发酵结束后，经5000rpm离心10分钟，沉淀细菌。用PBS洗涤后，以50ml  PBS/克湿菌的比例悬浮细菌，用超声波破碎细菌，250A，每次30秒钟，间隔30秒钟，共10次。然后离心15000rpm，15分钟，沉淀就是包涵体。再用PBS-NaCl充分洗涤，用本法制备的包涵体其中IFN-γ含量为90%左右（图13、14）。这些结果证明我们分离包涵体的方法十分有效，这为进一步纯化IFN-γ打下了良好的基础。

（b）一步色层纯化IFN-γ

将上述分离到的包涵体用PBS洗后，加入盐酸胍至8M（pH7.5）溶解，离心除去不溶物杂质。清液进行上Sephacryl S-200柱层析，柱先用同一溶液平衡，结果见图15。主峰比活为2×10⁷国际单位/mg蛋白，每升发酵液产量为200-300mg。对图16中分离到的IFN-γ峰及杂峰进行电泳鉴定，结果见图16。扫描表明，主峰中IFN-γ的纯度为96-97%（图17）。

Claims (3)

1、一种合成的人γ-型干扰素(IFN-γ)基因(cDNA)在大肠杆菌中的高效表达，其特征是：

(a)使用人工设计，化学合成的基因，基因结构式如下：

ATG CAG GAC CCG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAG AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT

Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His

TCT GAC GTT GCT GAC AAT GGT ACC CTG TTC CTC GGG ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA

Ser Asp Val Asa Asp Asn Gly Thr Leu Gly Thr leu Phe leu Glt Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu

TCT GAC CGT AAA ATC ATG CAA TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC AAA AAC

Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn

TTT AAA GAT GAT CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTT

Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val

AAA TTT TTC AAC TCT AAC AAG AAG AAA CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAC TAC TCT

Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser

GTT ACC GAT CTG AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC CAC GAG CTC ATC CAG GTT ATG GCT GAA

Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu

CTG TCT CCC GCG GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA AGA TCT CAG ATG CTG TTC CGC GGT CGT

Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg

CGT GCT TCT CAG TAA TAG

Arg Ala Ser Gln TermTerm

IFN-γ由143个氨基酸组成，合成的该基因有429bp，加上起始密码子ATG，两个终止密码子TAA、TAG及克隆用的EcoRI及SalI限制性内切酶接头，共有447bp，选用了大肠杆菌使用频率高的密码子，使合成的IFN-γ基因能在大肠杆菌中高效表达，产生大量人IFN-γ，而不改变IFN-γ而不改变IFN-γ的氨基酸顺序；

(b)将合成的IFN-γ基因克隆人带有P_L启动子、CIts857温控阻遏蛋白基因、核糖体5SrRNA基因的终止信号t₁t₂和MCS区的表达载体pLY₄后，构建成IFN-γ的表达质粒pLY₄-γ，转化大肠杆菌后获得高效表达，IFN-γ占菌体可溶性总蛋白的60-80%；本发明的工程菌为大肠杆菌Escherichia coli SIB-203-2 pLY₄-γ，保藏编号CCTCC NO (中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.珞珈山.武汉大学校内)；

2、根据权利要求1中所述设计的人γ-型干扰素基因结构序列，其特征在于全部连续碱基序列在大肠杆菌中能高效表达，并涵盖其5′末端有≥15个连续碱基序列（ATG CAG GAC CCG TAC GTT）与本结构有同源顺序的DNA均能高效表达，因为这一片段含有使基因在大肠杆菌中高效表达的所必需的结构元件。

3、根据权利要求1、2中所述的含设计的基因结构序列的表达质粒pLY4-γ，其特征在于不仅在大肠杆菌体系中高表达，而且能在任何原核细胞体系中高表达。

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