CN110938605B - 一种体外组装的HBV cccDNA核小体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种体外组装的HBV cccDNA核小体，包括HBV cccDNA片段和组蛋白，所述HBV cccDNA片段为选自如SEQ ID No.1所示的X1、如SEQ ID No.2所示的X2、如SEQ ID No.3所示的PreX或如SEQ ID No.4所示的C1中的至少一种。本发明还公开了所述体外组装的HBV cccDNA核小体的制备方法，包括以下步骤：S1：通过PCR扩增或原核扩增，得到HBV cccDNA片段；S2：原核表达组蛋白，所得到的组蛋白经体外重组，得到蛋白复合物；S3：将所述HBV cccDNA片段与所述蛋白复合物进行体外组装，得到HBV cccDNA核小体。所述制备方法能稳定产出足量的、结构高度均一的cccDNA核小体，能满足如疾病药物研究等相关功能实验的需求。

Description

一种体外组装的HBV cccDNA核小体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种体外组装的HBV cccDNA核小体的制备方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)简称乙肝病毒，该病毒的慢性感染是包括我国在内的重大的全球性公共卫生问题。乙型肝炎病毒也是导致东亚地区原发性肝细胞癌发生的重要因素之一，给人们的健康带来了严重的威胁。
目前应用于临床治疗乙型肝炎病毒的药物主要有两类：(1)干扰素类药物，包括IFNα-2b，PEG-IFNα-2a等，可通过调节宿主抗病毒的免疫反应来增强机体对乙肝病毒的清除；(2)核苷酸类似物，包括lamivudine(拉米夫定)，adefovir(阿德福韦)，entecavir(恩替卡韦)，telbivudine(替比夫定)，tenofovir(替诺福韦)等，可通过抑制病毒的逆转录达到治疗目的。但这些治疗都不能从根本上清除或完全抑制乙肝病毒，主要原因是无法根除HBV感染过程中产生的用于维持病毒基因组与扩增的共价闭合环状DNA(covalently closedcircular DNA，cccDNA)。
而cccDNA核小体是组成cccDNA微小染色体的基本单位，并参与cccDNA的转录调控。cccDNA能与宿主细胞的组蛋白、非组蛋白以及病毒自身编码蛋白X蛋白、C蛋白结合，形成微小染色体结构，是HBV感染复发的根本原因。
因此，为了更好的研究乙肝病毒，结构均一的cccDNA核小体便成为研究cccDNA微小染色体结构与功能的理想模型。但是，从受乙肝病毒感染的细胞中分离得到的cccDNA核小体的不仅量较小，而且cccDNA核小体的种类多样，不均一，无法满足实际的需求。目前尚未有更好的获取或制备HBV cccDNA核小体的方法。
因此，提供一种体外组装HBV cccDNA核小体的制备方法是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种体外组装HBV cccDNA核小体及其制备方法，能够稳定产出足量的、结构高度均一的HBVcccDNA核小体，可满足各种相关功能实验的需求(如用于疾病药物的研究)。
一种体外组装的HBV cccDNA核小体，包括HBV cccDNA片段和组蛋白，所述HBVcccDNA片段为选自如SEQ ID No.1所示的X1、如SEQ ID No.2所示的X2、如SEQ ID No.3所示的PreX或如SEQ ID No.4所示的C1中的一种。
HBV cccDNA基因组的长度约为3200bp，但不同的HBV cccDNA片段与组蛋白发生体外组装时的亲和力具有显著的差异。大量研究表明，核小体在基因组上的分布并不是随机的，而是具有“序列偏好性”。在确定的基因组中，核小体有着独特的分布规律，而表现出核小体对于基因组DNA的序列偏好性。本发明通过实验分析，筛选，从而得到上述具有核小体序列偏好性的HBV cccDNA片段。
优选的，所述组蛋白来源于真核生物或原核生物。
更优选的，所述组蛋白为人组蛋白。
优选的，所述组蛋白为H2A、H2B、H3和H4组成的蛋白复合物。所述蛋白复合物具体为：两分子H2A、H2B形成的异二聚体与两分子H3、H4形成的异四聚体相互结合，从而形成组蛋白八聚体。
优选的，所述蛋白复合物可发生氨基酸残基的取代。
更优选的，所述蛋白复合物可通过烷基化反应或酶促反应进行修饰。
通过对组蛋白H2A、H2B、H3和H4的基因序列进行核苷酸位点的突变，使组蛋白产生氨基酸残基的取代，并通过如烷基化反应、酶促反应等，可模拟出组蛋白八聚体在体内翻译后修饰的产物。
一种体外组装的HBV cccDNA核小体的制备方法，包括以下步骤：
S1：通过PCR扩增或原核扩增，得到HBV cccDNA片段；
S2：原核表达组蛋白，所得到的组蛋白经体外重组，得到蛋白复合物；
S3：将所述HBV cccDNA片段与所述蛋白复合物进行体外组装，得到HBV cccDNA核小体。
优选的，步骤S1中所述PCR扩增包括以下步骤：以插入HBV cccDNA基因组的重组质粒为模板，进行PCR扩增。
所述PCR扩增中的引物包括X1引物、X2引物、PreX引物或C1引物，其序列为：
X1-F：5’-AATTCTGTCGTGCTCTCCCGCAAG-3’，
X1-R：5’-AGCCCCAAGCGGCCCCG-3’；
X2-F：5’-CTCCGCCTCTTGTACCGACCG-3’，
X2-R：5’-CAGGTTCCTGTGGGCGTTCAC-3’；
PreX-F：5’-GGAACATATTGTAAGAAAAATCAAAATG-3’，
PreX-R：5’-AAGGCATTAAAGCAGGATATCCAC-3’；
C1-F：5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCC-3’，
C1-R：5’-AGCAGAGGCGGTGTCGAGG-3’。
所述引物均委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
通过上述引物扩增得到的HBV cccDNA片段分别为X1、X2、PreX、C1。所述HBVcccDNA片段的长度均为146bp。
所述HBV cccDNA基因组的来源为化学合成或从感染乙肝病毒的宿主细胞中提取。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃，30s；95℃10s，48～58℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
优选的，步骤S1中所述原核扩增包括以下步骤：化学合成目的序列，构建重组质粒，导入宿主细胞进行扩增后，使用核酸内切酶进行消化；所述目的序列包括HBV cccDNA片段和核酸内切酶位点序列。
所述HBV cccDNA片段的拷贝数为12～24，所述核酸内切酶位点为EcoRⅤ限制性核酸内切酶位点。
优选的，步骤S1中对扩增后的产物进行纯化，纯化的方法包括电洗脱法、色谱法或试剂盒纯化法中的一种。
优选的，步骤S2中所述原核表达的宿主菌选用大肠杆菌。
其中四种组蛋白H2A、H2B、H3和H4的核苷酸序列分别为：
H2A：SEQ ID No.5，H2B：SEQ ID No.6，H3：SEQ ID No.7，H4：SEQ ID No.8。
优选的，步骤S2中体外重组的方法为：将组蛋白H2A、H2B、H3和H4混合，蛋白变复性，透析，纯化，得到蛋白复合体。
更优选的，所述组蛋白H2A、H2B、H3和H4为等比例混合。
优选的，步骤S3中体外组装的方法包括盐透析法或依赖ATP及蛋白因子的方法。所述蛋白因子为NAP(核小体装配蛋白)和ACF(重塑因子)。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述体外组装的乙肝病毒核小体稳定性高，不易被核酸酶消化降解；
(2)与从受乙肝病毒感染的细胞中分离提取HBV cccDNA核小体的方法相比，本发明所述体外组装HBV cccDNA核小体的方法能够获得更高的产量，以满足实际的需求；
(3)本发明所制得的HBV cccDNA核小体纯度高、且结构均一性好。
附图说明
图1为实施例1中组蛋白八聚体的洗脱曲线以及聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果。
图2为实施例1中制得的HBV cccDNA核小体的结晶体。
图3为H3K9C/C110A类似物和H3K27C/C110A类似物的免疫印迹结果。
图4表示X1、X2、PreX和C1四种HBV cccDNA片段的长度。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
实施例1
一种体外组装的HBV cccDNA核小体，包括蛋白复合物和HBV cccDNA片段X1(SEQID No.1)。
上述HBV cccDNA核小体的制备方法包括以下步骤：
HBV cccDNA片段的制备
委托生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成HBV cccDNA，并整合到pUC-D质粒中，得到重组质粒；
以重组质粒为模板，采用X1引物进行PCR扩增；使用Source 15Q 4.6/100 PE离子柱(厂家：通用电气医疗)对PCR产物进行分离纯化，得到HBV cccDNA片段X1(SEQ ID No.1)。
其中X1引物的序列为X1-F：5’-AATTCTGTCGTGCTCTCCCGCAAG-3’，X1-R：5’-AGCCCCAAGCGGCCCCG-3’。
其中PCR扩增的条件为：95℃，30s；95℃10s，54℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
组蛋白H2A、H2B、H3、H4的制备
将表达人组蛋白H2A、H2B、H3、H4的DNA序列分别插入pET3a质粒中，将质粒导入不同的BL21(DE3)pLysS菌株(购买自北京康为世纪生物科技有限公司)进行原核表达，纯化和收集目的组蛋白；其中H2A、H2B、H3、H4的DNA序列均根据E.coli表达的密码子进行优化后经化学合成得到。
目的组蛋白的纯化方法为：体外原核表达后，裂解宿主菌，离心收集沉淀物。将沉淀物加入Unfolding Buffer(6M盐酸胍，20mM Tris-HCl pH 7.5，5mM DTT(二硫苏糖醇))孵育。离心收集上清，并于室温透析至Low-salt Buffer(100mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8.0，6M Urea(尿素)，1mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇)中。串联Hitrap Q HP 5mL(厂家：通用电气医疗)和Hitrap SP HP 5mL离子柱(厂家：通用电气医疗)，用Low-salt Buffer(A泵)平衡并洗柱后，取下Hitrap Q HP 5mL离子柱，以High-salt Buffer(2M NaCl，20mM Tris-HCl pH8.0，6M Urea，1mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇)(B泵)对Hitrap SP HP 5mL离子柱以线性梯度进行洗脱，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同组分，收集目的组蛋白。
蛋白复合物的制备
取等比例的四种组蛋白H2A、H2B、H3、H4，通过蛋白变复性与温和缓慢透析，体外重组，并用分子排阻色谱法进行组蛋白八聚体的分离纯化；
其中蛋白复变性与温和缓慢透析的具体方法为：取组蛋白H2A、H2B、H3、H4各3～4mg分别溶解于Unfolding Buffer中，使组蛋白浓度调整为2mg/mL，孵育0.5-3h。分别测定四种组蛋白浓度，按等摩尔比准确取出四种组蛋白混合，并用Unfolding Buffer把总蛋白浓度调整为1mg/mL。于4℃透析至Refolding Buffer(复性Buffer：2M NaCl，10mM Tris-HClpH 7.5，1mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇)。共透析三次，每次至少6h，第二或第三次透析需要过夜。超滤浓缩至1mL，用Hiload 16/600Superdex 200pg(厂家：通用电气医疗)进行分子排阻色谱法分离纯化，得到组蛋白八聚体。
其中分子排阻色谱法的具体方法为：Hiload 16/600Superdex 200pg柱接上AktaPure Chromatography System(厂家：通用电气医疗)后，先用ddH2O(双蒸水)洗柱1.5个柱体积(CV)，再用Refolding Buffer平衡柱子1.5CV。上样1mL，分离收集不同组分，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
如图1A所示，67mL的峰表示组蛋白八聚体；如图1B所示，亮度相当的4条条带代表组成组蛋白八聚体的四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)。
HBV cccDNA核小体的制备
将组蛋白八聚体与HBV cccDNA片段等摩尔比混合，将混合物至于400ml RB-highBuffer(2M KCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT)中，于4℃下进行透析并快速搅拌，用蠕动泵以1.5mL/min的流速不断加入RB-low Buffer(0.25M KCl，10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT)至2L，同时用蠕动泵以等流速抽走透析池中的Buffer。梯度透析结束后，取出样品继续4℃透析至400ml RB-low Buffer至少3h。浓缩样品后，使用Model491Prep Cell(美国伯乐，大力神)制备级凝胶电泳进行纯化，并监测A260和A280，用TCSBuffer(20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM DTT)以1mL/min的流速洗脱，收集得到HBVcccDNA核小体。
晶体学检测
运用晶体学的实验方法，对体外组装得到的HBV cccDNA核小体进行检测。由于样品的纯度和均一性是影响结晶的重要因素，通过对实施例1制得的HBV cccDNA核小体的晶体生长条件进行筛选和优化，如图4所示，最终获得重组HBV cccDNA核小体的晶体，证实该体外组装的HBV cccDNA核小体的纯度高，且分子结构高度均一。
实施例2
与实施例1相比，实施例2的区别之处在于：PCR扩增的引物为X2引物，得到的HBVcccDNA片段为X2(SEQ ID No.2)；
其中X2引物的序列为X2-F：5’-CTCCGCCTCTTGTACCGACCG-3’，X2-R：5’-CAGGTTCCTGTGGGCGTTCAC-3’；
其中PCR扩增的条件为：95℃，30s；95℃10s，57℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
实施例3
与实施例1相比，实施例3的区别之处在于：PCR扩增的引物为PreX引物，得到的HBVcccDNA片段为PreX(SEQ ID No.3)；
其中PreX引物的序列为PreX-F：5’-GGAACATATTGTAAGAAAAATCAAAAT G-3’，PreX-R：5’-AAGGCATTAAAGCAGGATATCCAC-3’；
其中PCR扩增的条件为：95℃，30s；95℃10s，48℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
实施例4
与实施例1相比，实施例4的区别之处在于：PCR扩增的引物为C1引物，得到的HBVcccDNA片段为C1(SEQ ID No.4)；
其中C1引物的序列为C1-F：5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCC-3’，C1-R：5’-AGCAGAGGCGGTGTCGAGG-3’。
其中PCR扩增的条件为：95℃，30s；95℃10s，55℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
实施例5
与实施例1相比，实施例5的区别之处在于：对含有人组蛋白H3基因序列的质粒进行点突变，使组蛋白H3发生氨基酸残基的取代，分别得到H3K9C/C110A(即K9与C110位点产生突变)组蛋白与H3K27C/C110A(即K27与C110位点产生突变)组蛋白，采取实施例1中纯化目的组蛋白的方法对组蛋白突变体进行纯化后，再对组蛋白突变体进行烷基化反应，分别得到H3K9C/C110A类似物与H3K27C/C110A类似物；
烷基化反应的具体实验步骤：取5-10mg组蛋白突变体与980μL alkylationbuffer(1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸pH7.8，4M盐酸胍，20mM DTT，10mM蛋氨酸)混匀，37℃孵育1h后，加入100mg(2-溴乙基)三甲基溴化铵，50℃避光孵育2.5h。加入10μL的1M DTT，50℃孵育2.5h。最后加入4.9μL的14.3Mβ-巯基乙醇终止反应。反应产物用Hitrap Desalting 5mL(厂家：通用电气医疗)进行层析脱盐。
由于组蛋白在体内会进行翻译后修饰(如组蛋白H3的甲基化，形成H3K9me3或H3K27me3)。在一些情况下，为获得组蛋白翻译后修饰的产物，通常采用特定位点对应的生物酶进行体外合成，但是该方法成本高昂，不适合大量生产。因此，本发明通过体外重组制得相应类似物，以模拟组蛋白体内翻译后修饰的产物。
如图3所示，免疫印迹结果显示：本发明对组蛋白突变体进行烷基化反应制得的H3K9C/C110A类似物和H3K27C/C110A类似物，可与H3K9me3与H3K27me3对应的抗体特异性结合。由此可见，本发明制得的类似物与组蛋白H3K9me3、H3K27me3的相似程度高，模拟效果好，完全满足实验需求。
实施例6
如图4所示，本发明所制得的HBV cccDNA片段的长度均为146bp，且使用核酸酶对实施例1-5所制得的乙肝病毒核小体进行消化后，结果均显示核小体中HBV cccDNA片段的长度未随消化时间的增长而缩短，片段长度仍为146bp。
因此，在实施例1-5所制得的乙肝病毒核小体中，组蛋白八聚体与HBV cccDNA片段的结合能力强，且不易被消化降解，具有良好的稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第五医院
<120> 一种体外组装的HBV cccDNA核小体及其制备方法
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aactggatcc tgcgcgggac gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tcccgcggac 120
gacccctccc ggggccgctt ggggct 146
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<211> 146
<212> DNA
<213> HBV cccDNA
<400> 2
ctccgcctct tgtaccgacc gaccacgggg cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct 60
gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga 120
ccaccgtgaa cgcccacagg aacctg 146
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<211> 146
<212> DNA
<213> HBV cccDNA
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ggaacatatt gtaagaaaaa tcaaaatgtg ttttaggaaa cttcctgtaa acaggcctat 60
tgattggaaa gtatgtcaac gaattgtggg tcttttgggg tttgccgccc ctttcacgca 120
atgtggatat cctgctttaa tgcctt 146
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<212> DNA
<213> HBV cccDNA
<400> 4
ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc tttggggcat ggacattgac ccgtataaag 60
aatttggagc ttctgtggag ttactctctt ttttgccttc tgacttcttt ccttctattc 120
gagatctcct cgacaccgcc tctgct 146
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gcggaaatcc tggaactggc gggtaacgcg gcgcgtgaca acaaaaaaac ccgtatcatc 240
ccgcgtcacc tgcagctggc gatccgtaac gacgaagaac tgaacaaact gctgggtaaa 300
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<212> DNA
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atgtctggtc gtggtaaagg tggtaaaggt ctgggtaaag gtggtgctaa acgtcaccgt 60
aaagttctgc gtgacaacat ccagggtatc accaagccgg ctatccgtcg tctggctcgt 120
cgtggtggtg ttaaacgtat ctccggtctg atctacgaag aaacccgcgg tgttctgaaa 180
gttttcctgg aaaacgttat ccgtgacgct gttacctaca ccgaacacgc taaacgtaaa 240
accgttaccg ctatggacgt tgtttacgct ctgaaacgtc agggtcgtac cctgtacggt 300
ttcggtggtt aa 312

Claims (8)

1.一种体外组装的HBV cccDNA核小体，其特征在于，包括HBV cccDNA片段和组蛋白，所述HBV cccDNA片段为选自如SEQ ID No.1所示的X1、如SEQ ID No.2所示的X2、如SEQ IDNo.3所示的PreX或如SEQ ID No.4所示的C1中的一种；所述组蛋白为H2A、H2B、H3和H4组成的蛋白复合物。
2.根据权利要求1所述的HBV cccDNA核小体，其特征在于，所述组蛋白来源于真核生物或原核生物。
3.根据权利要求1所述的HBV cccDNA核小体，其特征在于，所述蛋白复合物可发生氨基酸残基的取代。
4.根据权利要求1所述的HBV cccDNA核小体，其特征在于，所述蛋白复合物可通过烷基化反应或酶促反应进行修饰。
5.一种根据权利要求1至4任一项所述的HBV cccDNA核小体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：通过PCR扩增或原核扩增，得到HBV cccDNA片段；所述原核扩增包括以下步骤：化学合成目的序列，构建重组质粒，导入宿主细胞进行扩增后，使用核酸内切酶进行消化；所述目的序列包括HBV cccDNA片段和核酸内切酶位点序列；
S2：原核表达组蛋白，所得到的组蛋白经体外重组，得到蛋白复合物；
S3：将所述HBV cccDNA片段与所述蛋白复合物进行体外组装，得到HBV cccDNA核小体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述PCR扩增包括以下步骤：以插入HBV cccDNA基因组的重组质粒为模板，进行PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃，30s；95℃10s，48～58℃30s，72℃15s，40个循环；72℃10min。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中体外组装的方法包括盐透析法或依赖ATP及蛋白因子的方法。
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