CN110938585B - 基于细胞团簇3d打印的血管化组织构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医疗材料领域，具体涉及一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,包括如下步骤：微孔板制备、内皮化细胞团簇生成、3D打印和血管化组织的构建，得到血管化组织。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织快速构建方法和应用。
背景技术
人体内细胞密度为108-109细胞/cm3，一个有效的体外模型需要同时满足可比拟体内的细胞密度、细胞功能及发生血管化现象。具有高细胞密度与细胞功能的体外仿生血管化组织模型在创伤修复、器官置换、肿瘤微环境机制研究和药物毒性检测领域都具有重要的应用前景。
从组织结构的致密性而言：传统的组织工程制备方法，一般是将单个细胞包埋在胞外基质(例如,明胶体系)中进行组织培养，这样制备的组织其细胞密度不高。传统的喷墨式生物打印技术中细胞密度常限制在105到106量级，依靠单个细胞增殖生成团簇，长成的团簇大小均一性差，空间分布呈无序性，同时打印过程中力学、电场、温度等条件易对细胞造成损伤，导致构建的组织模型无法实现与体内可比拟的细胞分布和细胞密度。如图7所示。
从组织的培养时间而言：传统的细胞打印依靠单个细胞增殖，利用细胞的自组装能力在体外环境中先形成团簇，再进一步形成所需的组织，一般而言形成细胞团簇需要一周左右的时间，进一步形成血管化组织需要一周左右的时间，整个培养周期长，时效性差。如图7(Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drugresistance of epithelial ovarian cancer cells.Biomaterials.2010 Nov；31(32):8494-506)和图8(Coaxial bioprinting of cell-laden vascular constructs using agelatin-tyramine bioink.Biomater Sci.2019 Aug 21)所示。
从组织的血管化程度而言：传统的血管化组织制备方法，依靠组织表面内皮涂附，或依靠组织内内皮细胞的自组装，形成的组织内部未发生血管化或血管化程度低，这样获得的组织，无法实现长期培养、与体内比拟的功能性，因而不可作为一种有效的病理模型用于指导精确的药物评价，也难以预期可进行体内移植、并与原生组织融合。如图7(Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drugresistance of epithelial ovarian cancer cells.Biomaterials.2010 Nov；31(32):8494-506)和图8(Coaxial bioprinting of cell-laden vascular constructs using agelatin-tyramine bioink.Biomater Sci.2019 Aug 21)所示。
也就是说，现有技术中缺乏快速制备血管化致密结构的体外组织的方法，用来克服现有技术中的上述缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提供一种细胞密度高、培养时间短的血管化组织构建方法。
为了解决上述技术问题：
本发明提供一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,包括如下步骤：
(1)微孔板制备：制备微孔板，并对微孔板进行表面疏水处理；
(2)内皮化细胞团簇生成：在微孔板中接种包含内皮细胞的异质细胞液，培养，得到内皮化细胞团簇；
(3)3D打印：将生物墨水与步骤(2)中的内皮化细胞团簇混合，3D打印，得到内皮化的组织结构；
(4)结构表面内皮涂附：将步骤(3)中的内皮化的组织结构表面进行胶原包被，在胶原表面铺设内皮细胞，完成内皮涂附，培养，得到血管化组织。
其中,所述步骤(1)中，使用透氧型高分子聚合物，制备微孔板，包含但不限于如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、明胶、壳聚糖、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、丝素蛋白等，使用聚季铵盐进行表面处理。
其中,所述步骤(2)中，培养时间为24h-48h，所述异质细胞液的接种密度与微孔板的尺寸正向相关，微孔板尺寸越大，对应的接种密度越大，但针对每种尺寸的微孔板，其最佳接种密度需要通过优化后，根据团簇成形效果最终确定。
其中,所述步骤(2)中的异质细胞液包括：针对尺寸120μm的微孔板，欲形成内皮化的肝癌细胞团簇，经优化后的最佳接种条件为：内皮细胞与肝癌细胞以数量比1:1混合，异质细胞接种密度8×105cm-2(即内皮或肝癌细胞的接种密度分别为4×105cm-2)，培养基为两种细胞各自使用培养基的混合物(体积比1:1混合)。
其中,所述步骤(3)中，所述生物墨水为包含或者不包含高密度分散的单个内皮细胞的材料体系，进行挤出式打印时，可使用的材料为明胶/海藻酸钠体系、明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原体系或者甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；进行震荡式打印时，可使用的材料为海藻酸钠、纤维蛋白原或者GelMA。
其中,所述步骤(3)中，所述生物墨水与内皮化细胞团簇的体积比为：5:5-7:3。
其中,所述步骤(3)中，所述3D打印的打印方式为挤出式打印和震荡式打印。
其中，所述震荡式打印是指：细胞喷射技术通过交变滞惯力驱动，即利用振动过程中粘性力和惯性力的交替作用实现含细胞微滴的制备，其中，振动过程通过压电陶瓷的受控形变来实现，并受波形发生器精确调控。通过改变输出波形的频率和振幅参数可方便地调节微滴的大小和体积，具有高度的一致性和可控性。该喷射打印技术不需高温高压条件，对细胞损伤小，细胞存活率可达到90％以上。同时，该技术还具有结构简单、微滴一致性好、定位精度高的优点。此外，通过调节喷嘴形状和悬浮液中的细胞密度可实现单细胞微滴的制备。
其中，所述挤出式打印：采用注射器推挤的方式进行驱动，实现多种凝胶材料的挤出，构建较高细胞密度的体外组织结构。
本发明的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法在制备血管化组织或者制备生物医疗材料中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：
1)能够得到多细胞共培养结构。团簇内细胞可以由两种或两种以上异质细胞组成(其中一种为内皮细胞)，结构中分散的高密度单细胞可以是内皮细胞(或内皮细胞与成纤维细胞两种细胞)，另外，结构外层可以涂附内皮细胞。
2)包含内皮化的细胞团簇。微孔板中种入细胞时，异质细胞单细胞悬液中含有一定比例的内皮细胞，团簇生成时，可生成内皮化的细胞团簇。
3)实现细胞精确定位。基于成像系统的实时打印，由于观测坐标系与机械坐标系的确定关系，可进一步得到目标点在机械坐标系中的位置。图像系统一方面提供了打印过程的实时观测和在线反馈，提高了细胞排列的可控性和精度；另一方面，细胞定位可根据凝胶中的微球分布实时确定，提供了一种不需预先路径规划的随形打印方式，提高细胞排列精度到100微米。
4)得到高细胞密度的组织。通过微孔板技术可以得到致密团簇(细胞与细胞间紧密接触，聚集成团)；打印的结构中团簇体积占比高，紧密排布；组织结构内细胞密度高(～108/mL)，且细胞存活率可高达90％以上，细胞功能正常(细胞功能几乎不受影响，代谢能力等维持正常)。
5)快速生成血管化结构。细胞团簇中分散存在的内皮细胞，可快速实现细胞团簇内部的血管化；团簇间分散存在的，以及结构表面涂附的高密度内皮细胞，可快速实现结构内外的血管化，并与团簇内部的血管相互连接，形成血管网。
附图说明
图1为本发明的基于细胞团簇3D打印的血管化组织构建示意图；
图2为本发明的团簇、异质团簇生成，其中，注：HepG2、HUVEC细胞分别使用不同颜色的荧光标记物进行标记；
图3为本发明的团簇制备工艺；
图4为本发明的实施例1血管化组织形成的荧光共聚焦图片；
图5为本发明的实施例2血管化组织形成的荧光共聚焦图片；
图6为本发明的实施例3血管化组织形成的荧光共聚焦图片；
图7为现有技术中包埋形成的团簇形态；
图8为现有技术构建的血管化组织的形成。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
聚二甲基硅氧烷购自道康宁公司(美国)。
聚季铵盐购自日油株式会社(NOF，日本)
人内皮细胞HUVEC购自ATCC(美国)；人肝细胞系HepaRG购自Gibco(美国)；人肝癌细胞系HepG2、人肺腺癌细胞系A549、人宫颈癌细胞系Hela购自国家实验细胞资源共享服务平台(北京)；小鼠胰岛β细胞株Min6购自AddexBio(美国)；间充质干细胞MSC购自上海研发公共服务平台(上海)。
培养基列表：
EGM-2：Lonza公司
DMEM：Gibco公司
实施例1
通过本发明的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法构建血管化组织，具体方法如下：
1.微孔板的制备
使用PDMS(聚二甲基硅氧烷)制备微孔板，微孔板表面依次进行氧等离子处理、PMB(聚季铵盐)处理，得到表面处理后的微孔板。聚季铵盐(由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸丁酯形成的共聚物)具有类细胞膜的亲水亲油两亲性，共聚物的亲水端与微孔板表面亲和，从而将亲油端露在外层，从而达到表面疏水的效果，促进团簇成形且成形团簇均一度好。
其中所述微孔为圆柱状孔，下文所述的微孔尺寸，均指微孔的底面直径。
2、人肝癌细胞系HepG2-人内皮细胞异质细胞团簇的构建
将含有人内皮细胞的EGM-2培养基溶液与含有人肝癌细胞HepG2的DMEM培养基溶液混合制备成异质细胞悬液，其中所述含有人内皮细胞的EGM-2培养基溶液，与含有人肝癌细胞HepG2的DMEM培养基溶液，以体积比1:1混合；所述异质细胞悬液中人内皮细胞与人肝癌细胞HepG2的数量比为1:1。
将配置好的异质细胞溶液接种至表面处理后的微孔板中，根据微孔板尺寸大小，种入合适密度的异质细胞溶液，培养48h后，得到人肝癌细胞系HepG2-人内皮细胞异质细胞团簇，如图2所示。其中，微孔板尺寸与细胞接种密度正向相关，即微孔板尺寸越大，接种密度越大，但针对每种尺寸的最佳接种密度，需要通过优化后，根据最终团簇成形效果确定。例如，尺寸为70μm的微孔板最优接种密度为4×105cm-2；尺寸为120μm的微孔板最优接种密度为8×105cm-2、尺寸为200μm的微孔板最优接种密度为1.2×106cm-2、尺寸为320μm的微孔板最优接种密度为1.6×106cm-2。本实施例中选用尺寸为120μm的微孔板，接种密度为8×105cm-2。
3.细胞团簇直接3D打印。
将步骤2中得到的人肝癌细胞HepG2-人内皮细胞异质细胞团簇与生物墨水按照体积比为2:3比例混合,其中生物墨水为含有人内皮细胞的明胶/海藻酸钠溶液，得到高细胞密度的预打印体系(其中，团簇体积占比40％，单个分散内皮细胞密度5×106/mL，整个体系中细胞密度1.05×108/mL)。
使用专利201510455765.9中异质细胞三维打印系统进行3D打印，将上述预打印体系装入异质细胞三维打印系统的注射器中，启动所述控制单元和观测单元，结合设计的宏观模型，首先进行挤出式细胞打印，形成凝胶模型，得到包含异质细胞团簇和单个分散人内皮细胞的组织模型。
相比于目前3D打印细胞，之后通过细胞自组装能力形成细胞团簇的方法，该方法制备团簇的时间短、效率高(成团簇能力高、团簇成形好、形成的团簇均一性好)，如图2所示；打印的结构中细胞间距小、密度高(团簇内细胞致密；团簇在体系中占比高，团簇排布紧凑)，而通过自组装形成的细胞团簇,细胞间距远大于此，如图7所示；细胞损伤小(存活率高于90％)、功能得以维持，而目前的喷墨打印方式，对细胞的损伤大。
4.血管化组织的构建
之后进行震荡式打印，使用专利201510455765.9中异质细胞三维打印系统进行3D打印，将人内皮细胞溶液装入异质细胞三维打印系统的微喷管中，启动所述控制单元和观测单元，结合模型设计和实时观测结果，在凝胶模型中进行震荡式细胞打印。震荡打印的内皮细胞可按照设计的路径有序排布在团簇周围，实现细胞精确定位，结构中内皮细胞的滴落位置可根据凝胶中的团簇分布实时确定，提高了细胞排列的可控性和精度，而目前的其他细胞打印方式，无法实现。
将上述得到的结构的表面进行胶原包被，之后在胶原表面上铺设一层人内皮细胞，所述人内皮细胞的铺设密度1×105cm-2，之后在培养基(体积比为1：1的EGM-2和DMEM混合培养基)中培养一周，团簇内、团簇间、结构表面血管化形成，结构内外形成血管网，其荧光共聚焦图片如图4所示。
本实施例所得到的人肝癌细胞HepG2-人内皮细胞构建的血管化组织，其细胞密度为1.05×108/mL，细胞活性高于90％。
以上构建方法，还适用于HepaRG/HUVEC血管化组织、A549/HUVEC血管化组织、Hela/HUVEC血管化组织、MSC/HUVEC血管化组织的构建。
比较图2、图4和现有技术中的结果图(图7和图8)做对比：
相比于图7中包埋形成的团簇,使用本发明中的方法,得到的团簇大小均一性好,且制备时间短,此外,结构中团簇间距小,排布致密。相比于图8中血管化组织形成方法，使用本发明中的方法，团簇内分布的内皮，可促进团簇内部的快速血管化(可通过血管特异性荧光标记物显示)；团簇间分布的内皮，可促进团簇间血管网的快速形成；结构外涂附的内皮，可促进结构外血管网的快速形成；且团簇内、团簇间、结构外的血管网相互连接，促进整个结构内外血管化的快速形成(如，图4中单个HUVEC细胞之间、团簇周围的丝状网络，即为形成的血管网)。
实施例2
在实施例1的方法的基础上,做如下更改：
步骤(2)中的培养时间为24h；
异质细胞悬液的成分为“含有人内皮细胞的EGM-2培养基溶液与含有人肝细胞系HepaRG的DMEM培养基溶液”；
所述异质细胞悬液中人内皮细胞与人肝细胞系HepaRG数量比为1:5；
所述生物墨水与内皮化细胞团簇的体积比为7:3。
通过上述方法制备的组织，团簇内、团簇间、结构表面均有血管化形成，结构内外形成血管网，其荧光共聚焦图片如图5所示。
比较图5和现有技术中的结果图(图7和图8)做对比：
相比于图7中包埋形成的团簇,使用本发明中的方法,得到的团簇大小均一性好,且制备时间短,此外,结构中团簇间距小,排布致密。相比于图8中血管化组织形成方法，使用本发明中的方法，团簇内分布的内皮，可促进团簇内部的快速血管化(可通过血管特异性荧光标记物显示)；团簇间分布的内皮，可促进团簇间血管网的快速形成；结构外涂附的内皮，可促进结构外血管网的快速形成；且团簇内、团簇间、结构外的血管网相互连接，促进整个结构内外血管化的快速形成(如，图5中单个HUVEC细胞之间、团簇周围的丝状网络，即为形成的血管网)。
实施例3
在实施例1的方法的基础上，做如下更改:
步骤(2)中的培养时间为24h；
异质细胞悬液的成分为“含有人内皮细胞的EGM-2培养基溶液与含有人宫颈癌细胞系Hela的DMEM培养基溶液”；
所述异质细胞悬液中人内皮细胞与人宫颈癌细胞数量比为5:1；
所述生物墨水与内皮化细胞团簇的体积比为1:1。
通过上述方法制备的组织，团簇内、团簇间、结构表面均有血管化形成，结构内外形成血管网，其荧光共聚焦图片如图6所示。
比较图6和现有技术中的结果图(图7和图8)做对比:
相比于图7中包埋形成的团簇,使用本发明中的方法,得到的团簇大小均一性好,且制备时间短,此外,结构中团簇间距小,排布致密。相比于图8中血管化组织形成方法，使用本发明中的方法，团簇内分布的内皮，可促进团簇内部的快速血管化(可通过血管特异性荧光标记物显示)；团簇间分布的内皮，可促进团簇间血管网的快速形成；结构外涂附的内皮，可促进结构外血管网的快速形成；且团簇内、团簇间、结构外的血管网相互连接，促进整个结构内外血管化的快速形成(如，图6中单个HUVEC细胞之间、团簇周围的丝状网络，即为形成的血管网)。
本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。
Claims (9)
1.一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,包括如下步骤：
(1)微孔板制备：制备微孔板，并对微孔板进行表面疏水处理；
(2)内皮化细胞团簇构建：在微孔板中接种包含内皮细胞的异质细胞液，培养，得到内皮化细胞团簇，其中，所述异质细胞溶液为由含有人内皮细胞的培养基溶液与含有其他细胞的培养基溶液组成的异质细胞悬液，所述其他细胞为人肝癌细胞系HepG2、人肺腺癌细胞系A549、人宫颈癌细胞系Hela、人肝细胞系HepaRG、鼠胰岛β细胞株Min6或间充质干细胞MSC；
(3)3D打印：将生物墨水与步骤(2)中的内皮化细胞团簇混合，3D打印，得到内皮化组织结构，所述生物墨水为包含高密度分散的单个内皮细胞的材料体系；所述3D打印的打印方式为先进行挤出式打印再进行震荡式打印；
(4)血管化组织的构建：将步骤(3)中的内皮化组织结构表面进行胶原包被，在胶原表面铺设人内皮细胞，完成内皮涂附，之后进行组织培养，得到血管化组织。
2.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中，所述微孔板的表面疏水处理为：将微孔板进行氧等离子处理后在聚季铵盐溶液中浸泡，取出烘干，得到表面疏水的微孔板。
3.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中，所述微孔板为用于三维培养的商用微孔板，或者使用透氧型高分子聚合物制备的微孔板，包含聚二甲基硅氧烷、明胶、壳聚糖、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、丝素蛋白中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中，培养时间为24h-48h，所述异质细胞液的接种密度与微孔板的尺寸正向相关。
5.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中，所述异质细胞悬液中人内皮细胞与其他细胞数量比为1:5-5:1。
6.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中，进行挤出式打印时，所述材料为明胶/海藻酸钠体系、明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原体系或者甲基丙烯酰化明胶；进行震荡式打印时，可使用的材料为海藻酸钠、纤维蛋白原或者甲基丙烯酰化明胶。
7.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中，所述生物墨水与内皮化细胞团簇的体积比为：5:5-7:3。
8.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(4)中，所述人内皮细胞的铺设密度大于1×105cm-2。
9.权利要求1-8任一所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法在制备血管化组织或者制备生物医疗材料中的应用。
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