CN110938148A - 靶向cd19和cd22嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接MASK编码序列、抗CD19和抗CD22单链抗体的编码序列、人CD8铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。

Description

靶向CD19和CD22嵌合抗原受体
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，具体涉及双靶向CD19和CD22的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。
近年来，CD19CAR T细胞领域竞争激烈，一些大的制药公司也和研究机构建立了合作关系。接受表达CD28或4-1BB的CD19CAR T细胞治疗后，小儿和成人复发或难治性急性B细胞淋巴瘤具有大约90％的完全缓解率。最近，CD19CAR T细胞治疗在弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤或慢性淋巴瘤中具有50％-100％的总体缓解率。CD19CAR T细胞治疗多发性骨髓瘤病人中具有临床优势，由于终末分化的浆细胞不表达CD19，恶性B细胞前体持续产生恶性浆细胞。
CD22广泛表达在B细胞前体的急性淋巴白血病(BCP-ALL)中，在研究的111病例数中有109例的原始细胞中都表达CD22抗原，表达率大于90％。Lars Nitschke报道CD22隶属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs,sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins)家族。这个家族的蛋白只在免疫系统的细胞中表达，所有自身免疫和获得性免疫系统里的细胞类型至少表达一种Siglecs家族蛋白。B细胞表达两个这个家族的成员，其中之一就是CD22，另外一个是Siglec-G。大部分Siglecs都带有酪氨酸免疫受体依赖的抑制结构(ITIMs，immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs)，对免疫进行负调节。ITIMs上的酪氨酸经过Src家族蛋白激酶磷酸化后，产生了一些含有SH2(Src homology2)结构域分子的结合位点。SHP1(SHP，SH2-domain containing protein tyrosinephosphatase)和SHP2最为重要的SH2结构域含有蛋白，这些蛋白被招募到含有ITIMs的受体后，会引起细胞内物质的去磷酸化及抑制好几条信号通路。比如CD22就是通过将SHP-1招募至自身的ITIMs从而抑制正常B细胞的BCR(B细胞受体，B-cell receptor)引起的钙离子信号通路。CD22结合带有α2-6偶联唾液酸的配体。这种结合直接的调节着CD22和BCR的结合从而调控CD22的抑制功能，可以调控B细胞的迁移及BCR信号的阈值。Nitscheke报道CD22长度是140kDa，拥有七个免疫球蛋白样结构域，特异性的表达于B细胞系，从前B细胞(pre-Bcell)时期开始表达。CD22存在于B细胞的各个时期，包括激活的B细胞和记忆B细胞；不过在终端分化的浆细胞中缺失表达。CD22在B细胞发展中的广谱表达，使其成为一个极具吸引力的靶向B细胞的分子。事实上，CD22治疗抗体已经被合成并应用于临床，David J.报道其中之一的epratuzumab成功应用于临床用于治疗非霍奇金淋巴瘤和系统性免疫疾病比如全身性红斑狼疮。Alan S.报道同时针对于CD22的偶联CD22抗体的免疫毒素也在临床上用于治疗急性淋巴瘤白血病，并取得了一定的有效性。Mansfield E报道靶向B细胞的免疫毒素(Immunotoxin)已经成功的用于B细胞白血病和淋巴瘤的治疗。这些研究都说明了通过靶向CD22治疗B细胞淋巴瘤的可行性和安全性，不会产生脱靶效应带来的不良后果。
美国国家癌症研究所(NCI)在用CD19CAR-T细胞治疗20例复发难治性ALL虽取得显著成果，完全缓解(CR)率达70％，但仍有2例患者分别在3个月和5个月之后复发，并且CD19转为阴性。Maude等报道30例儿童及成人ALL采用CD19CAR-T治疗后，27例患者获得CR，其中7例在CD19CAR-T治疗后6周至8.5个月期间复发：4例CD19阳性，3例CD19阴性。Grupp等报道2例ALL患者在经过CD19CAR-T输注治疗后均在1个月内获得CR。其中1例患儿持续缓解，另1例患儿2个月后复发，且复发后肿瘤细胞CD19为阴性。在2013美国血液学会(ASH)年会上，费城儿童医院(CHOP)报道17例患者CD19CAR-T治疗后，14例(82％)在1个月内实现CR，其中CR患者中有3个复发：2例CD19阳性，1例CD19阴性。目前研究表明，CD19CAR-T细胞治疗复发难治性B-ALL后复发存在两种模式：(1)流式细胞技术仍可检测到B系标志物CD19，即CD19阳性白血病复发；(2)流式细胞技术不能检测到B系标志物CD19，即CD19阴性白血病复发。复发的原因可能包括CAR-T细胞在部分患者体内的持续时间短，以及肿瘤抗原表达逃逸变异等。临床研究发现患者外周血的CAR-T细胞减少或者消失，随即出现白血病的复发，往往研究者为防止这部分患者复发，再次追加注射CD19CAR-T，但维持白血病缓解的效果不一。
为了防止CD19CAR-T治疗后CD19阴性复发，双特异性抗原靶点的CAR-T也许是一个治疗选择。同时采用2个B细胞特异性抗原的CAR，或者一个CAR具有2个特异性的靶点，如CD19/CD22双特异性的CAR。
本发明专利采用双靶向CD19和CD22的CAR元件，此类设计可以靶向B细胞发育的各个阶段体外实验结果显示其对CD19和CD22双靶向细胞具有强烈的杀伤作用，将为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
发明内容
本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
(1)含有依次连接的MASK编码序列、抗CD22和抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一个或多个实施方案中，在所述所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-63位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述Mask信号肽的多核苷酸序列如SEQID NO:1第64-126位多核苷酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第205-525位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD22单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第541-912位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD22单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ IDNO:1第967-1287位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第1303-1662位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第1669-1809位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第1810-1875位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1876-2016位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQID NO:1第2017-2352位核苷酸序列所示。
本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(1)含有依次连接、MASK编码序列、抗CD22单链抗体、抗CD19单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的编码序列；和
(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；
优选地，所述抗CD19单克隆抗体FMC63；
优选地，所述抗CD22单克隆抗体M971。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗融合蛋白前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1-63位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述Mask信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第64-126位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第69-175位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD22单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第181-304位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD22单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第323-429位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第435-554位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO:2第557-603位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:2第604-625位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:2第626-672位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:2第673-784位氨基酸序列所示。
本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。
本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。
本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白片段。
本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。
本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。
本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗CD19和CD22介导的疾病的药物中的用途；
优选地，所述CD19和CD22介导的疾病为白血病、淋巴瘤。
更优选地，所述CD19和CD22介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
附图说明
图1为RV-MASK-CD19-CD22逆转录病毒表达载体示意图。
图2：mCAR模式图。
具体实施方式
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1：MASK-CD19scFV-CD22scFV-41BB-CD3ζ基因序列的确定
1.1从NCBI网站数据库搜索到人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区基因序列，抗BCMA单链抗体克隆号为M971，抗CD19单链抗体克隆号为FMC63,这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。各氨基酸和基因序列信息见SEQENCE LISTING(SEQUNCEID NO.1-2)。
将上述序列依次进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的MASK-CD19scFV-CD22scFV-41BB-CD3ζ基因序列信息。
1.2重组质粒测序
将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的BCMA-CD19-BBz序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
正义序列:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQUNCE ID NO.3)
反义序列:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQUNCE ID NO.4)
本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。
实施例2：包含CAR分子的核酸序列的病毒载体的构建
将实施例1中制备的CAR分子的核苷酸序列经NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切、经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒RV载体的NotI-EcoRI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。
实施例3：逆转录病毒包装
1.第1天293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜；
2.第2天293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为RV-BCMA-CD19-BBz为12.5ug，Gag-pol为10ug，VSVg为6.25ug，CaCl2 250ul，H2O为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37度培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；
3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。
序列表
<110> 上海恒润达生生物科技有限公司
<120> 靶向CD19和CD22嵌合抗原受体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3459
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctcaagggc agtctggaca atgtatctca ccccgcggtt gccctgatgg tccatacgtc 120
atgtatggct caagcggagg aagtggcggt tccggaggat ccggcctgag cggcagatct 180
gacaaccacg gatccagcgg taccgacatc gttttgacac aatctcctgc gtcattggcc 240
atgagtctcg ggaagcgcgc aacaatatcc tgtcgcgcca gtgaatctgt gtctgtgata 300
ggagcgcact tgatccattg gtatcagcag aaacctggac aacctcccaa gctgctcatc 360
tacctcgcca gtaaccttga aacaggagta cctgctcggt tttcaggttc cgggtcaggg 420
acggatttca ctttgactat cgacccagtt gaggaagacg acgtagccat atatagctgc 480
ctgcagtctc ggatcttccc gcgcacgttc gggggaggaa ctaagctgga gattaagggc 540
ggcgggggtt ctggtggcgg cggcagcggc ggtggaggat cacaaatcca actggttcag 600
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tataccttca ccgattacag catcaattgg gtaaagcggg ctccagggaa aggtctgaaa 720
tggatgggtt ggatcaacac agaaacccga gaaccagcct atgcttacga ctttcgaggt 780
cgattcgctt tttccttgga aacttccgca agcacagcct atctgcaaat caacaatctc 840
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atcaaggaca acagcaagag ccaggtgttc ctgaagatga acagcctgca gaccgacgac 1260
accgccatct actactgcgc caagcactac tactacggcg gcagctacgc catggactac 1320
tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc agcggcagca cctccggcag cggcaagcct 1380
ggcagcggcg agggcagcac caagggcgac atccagatga cccagaccac ctccagcctg 1440
agcgccagcc tgggcgaccg ggtgaccatc agctgccggg ccagccagga catcagcaag 1500
tacctgaact ggtatcagca gaagcccgac ggcaccgtca agctgctgat ctaccacacc 1560
agccggctgc acagcggcgt gcccagccgg tttagcggca gcggctccgg caccgactac 1620
agcctgacca tctccaacct ggaacaggaa gatatcgcca cctacttttg ccagcagggc 1680
aacacactgc cctacacctt tggcggcgga acaaagctgg aaatcaccga gagcaagtac 1740
ggaccgccct gccccccttg ccctatgttc tgggtgctgg tggtggtcgg aggcgtgctg 1800
gcctgctaca gcctgctggt caccgtggcc ttcatcatct tttgggtgaa acggggcaga 1860
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1920
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg 1980
aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc taccagcagg gccagaatca gctgtacaac 2040
gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac 2100
cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag aacccccagg aaggcctgta taacgaactg 2160
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg 2220
ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac 2280
gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg cgagctaaac gaggctcagg cgcgacgaac 2340
tttagtttgc tgaagcaagc tggggatgta gaggaaaatc cgggtcccat gttgctcctt 2400
gtgacgagcc tcctgctctg cgagctgccc catccagcct tcctcctcat cccgcggaag 2460
gtgtgcaatg gcataggcat tggcgagttt aaagattctc tgagcataaa tgctacgaat 2520
attaagcatt tcaagaattg tacttctatt agtggcgacc tccatattct tccggttgcc 2580
ttcaggggtg actctttcac ccacacacct ccattggatc cacaagaact tgacatcctg 2640
aagacggtta aagagattac aggcttcctc cttatccaag cgtggcccga gaacagaacg 2700
gacttgcacg cctttgagaa cctcgaaata atacggggtc ggacgaagca acacggccaa 2760
tttagccttg cggttgttag tctgaacatt acttctctcg gccttcgctc tttgaaagaa 2820
atcagcgacg gagatgtcat cattagtgga aacaagaacc tgtgctacgc gaacacaatc 2880
aactggaaga agctcttcgg tacttcaggc caaaagacaa agattattag taacagagga 2940
gagaatagct gtaaggctac cggacaagtt tgtcacgcct tgtgtagtcc agagggttgc 3000
tggggaccgg aaccaaggga ttgcgtcagt tgccggaacg tgagtcgcgg acgcgagtgt 3060
gtggataagt gcaatcttct ggaaggggaa ccgcgagagt ttgtagaaaa ttccgaatgt 3120
atacagtgtc atcccgagtg tcttccacaa gcaatgaata tcacatgtac agggaggggt 3180
cctgataact gtatccaatg tgcacactac atagatggtc ctcactgtgt aaagacgtgc 3240
cccgccggag taatgggtga aaacaacacc ctcgtgtgga agtacgccga tgccgggcat 3300
gtctgtcatt tgtgtcatcc caactgcaca tatggctgta ccggtcctgg attggagggc 3360
tgtccaacaa acgggccgaa aataccgagt atcgcaacag gcatggtggg agcacttttg 3420
cttctcctcg ttgtcgccct gggcatcggc ttgttcatg 3459
<210> 2
<211> 1153
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Ile Ser Pro Ala
20 25 30
Gly Cys Pro Ala Gly Pro Thr Val Met Thr Gly Ser Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Ala Ser Ala Ala His Gly
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Ala Ile Val Leu Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala
65 70 75 80
Met Ser Leu Gly Leu Ala Ala Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
85 90 95
Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Thr Thr Gly Gly Leu Pro
100 105 110
Gly Gly Pro Pro Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ala Ser Ala Leu Gly Thr
115 120 125
Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr
130 135 140
Leu Thr Ile Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Val Ala Ile Thr Ser Cys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Ala Ile Pro Pro Ala Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Gly Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Ile Gly Leu Val Gly Ser Gly Pro Gly Leu Leu Leu Pro
195 200 205
Gly Gly Thr Val Leu Ile Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr
210 215 220
Ala Thr Ser Ile Ala Thr Val Leu Ala Ala Pro Gly Leu Gly Leu Leu
225 230 235 240
Thr Met Gly Thr Ile Ala Thr Gly Thr Ala Gly Pro Ala Thr Ala Thr
245 250 255
Ala Pro Ala Gly Ala Pro Ala Pro Ser Leu Gly Thr Ser Ala Ser Thr
260 265 270
Ala Thr Leu Gly Ile Ala Ala Leu Leu Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr
275 280 285
Pro Cys Ala Leu Ala Thr Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly
290 295 300
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Leu Leu Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly Ser Leu Ser Val Thr
340 345 350
Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Val Ser Thr Ile
355 360 365
Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu Gly Val Ile Thr Gly
370 375 380
Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ser Ala Leu Thr Ile
385 390 395 400
Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu Leu Met Ala Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala Leu His Thr Thr Thr
420 425 430
Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ser Val Thr
435 440 445
Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Pro Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Thr Leu Gly Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly
485 490 495
Ala Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr
500 505 510
Val Leu Leu Leu Ile Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro
515 520 525
Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile
530 535 540
Ser Ala Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly
545 550 555 560
Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr
565 570 575
Gly Ser Leu Thr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Pro Thr Val
580 585 590
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Leu Leu Val Thr
595 600 605
Val Ala Pro Ile Ile Pro Thr Val Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu
610 615 620
Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly
625 630 635 640
Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys
645 650 655
Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly
660 665 670
Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly
675 680 685
Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly
690 695 700
Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu
705 710 715 720
Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly
725 730 735
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser
740 745 750
Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro
755 760 765
Pro Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ser Gly Ala Thr Ala Pro Ser Leu Leu
770 775 780
Leu Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu
785 790 795 800
Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Gly Leu Pro His Pro Ala Pro Leu Leu
805 810 815
Ile Pro Ala Leu Val Cys Ala Gly Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Ala
820 825 830
Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Ala Ile Leu His Pro Leu Ala Cys Thr
835 840 845
Ser Ile Ser Gly Ala Leu His Ile Leu Pro Val Ala Pro Ala Gly Ala
850 855 860
Ser Pro Thr His Thr Pro Pro Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ala Ile Leu
865 870 875 880
Leu Thr Val Leu Gly Ile Thr Gly Pro Leu Leu Ile Gly Ala Thr Pro
885 890 895
Gly Ala Ala Thr Ala Leu His Ala Pro Gly Ala Leu Gly Ile Ile Ala
900 905 910
Gly Ala Thr Leu Gly His Gly Gly Pro Ser Leu Ala Val Val Ser Leu
915 920 925
Ala Ile Thr Ser Leu Gly Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ile Ser Ala Gly
930 935 940
Ala Val Ile Ile Ser Gly Ala Leu Ala Leu Cys Thr Ala Ala Thr Ile
945 950 955 960
Ala Thr Leu Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Leu Thr Leu Ile Ile
965 970 975
Ser Ala Ala Gly Gly Ala Ser Cys Leu Ala Thr Gly Gly Val Cys His
980 985 990
Ala Leu Cys Ser Pro Gly Gly Cys Thr Gly Pro Gly Pro Ala Ala Cys
995 1000 1005
Val Ser Cys Ala Ala Val Ser Ala Gly Ala Gly Cys Val Ala Leu Cys
1010 1015 1020
Ala Leu Leu Gly Gly Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Ala Ser Gly Cys
1025 1030 1035 1040
Ile Gly Cys His Pro Gly Cys Leu Pro Gly Ala Met Ala Ile Thr Cys
1045 1050 1055
Thr Gly Ala Gly Pro Ala Ala Cys Ile Gly Cys Ala His Thr Ile Ala
1060 1065 1070
Gly Pro His Cys Val Leu Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Gly Ala
1075 1080 1085
Ala Thr Leu Val Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gly His Val Cys His Leu
1090 1095 1100
Cys His Pro Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Gly Gly
1105 1110 1115 1120
Cys Pro Thr Ala Gly Pro Leu Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val
1125 1130 1135
Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Pro
1140 1145 1150
Met
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
agcatcgttc tgtgttgtct c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 4
tgtttgtctt gtggcaatac ac 22

Claims (14)

1.一个mCAR结构，其特征在于：
(1)一段掩盖肽结构；
(2)抗原特异性识别区域；
(3)跨膜区域；
(4)一种或一种以上的共刺激因子区域；
(5)胞内信号区域。
2.权利要求1所述的一段掩盖肽序列为QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY。
3.权利要求1所述的抗原识别区域为scFv片段。
4.权利要求3所述的scFv片段包括针对CD22的scFv和针对CD19的scFv。
5.权利要求1所述的掩盖肽结构和特异性识别区域通过蛋白酶剪切点和两段链接片段(linker)连接。
6.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
(1)含有依次连接的MASK编码序列、抗CD22和抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
7.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，
在所述所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-63位核苷酸序列所示；和/或
所述Mask信号肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第64-126位多核苷酸所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第205-525位核苷酸序列所示；和/或
所述抗CD22单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第541-912位核苷酸序列所示；和/或
所述抗CD22单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第967-1287位核苷酸序列所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第1303-1662位核苷酸序列所示；和/或
所述人CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第1669-1809位核苷酸序列所示；和/或
所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第1810-1875位核苷酸序列所示；和/或
所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1876-2016位核苷酸序列所示；和/或
所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第2017-2352位核苷酸序列所示。
8.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(1)含有依次连接、MASK编码序列、抗CD19单链抗体、抗CD22单链抗体、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的编码序列；和
(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；
优选地，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体FMC63。
优选地，所述抗CD22单链抗体为抗CD22单克隆抗体M971。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：
在所述所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1-63位氨基酸序列所示；和/或
所述Mask信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第64-126位氨基酸序列所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第69-175位氨基酸序列所示；和/或
所述抗CD22单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第181-304位氨基酸序列所示；和/或
所述抗CD22单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第323-429位氨基酸序列所示；和/或
所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第435-554位氨基酸序列所示；和/或
所述人CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO:2第557-603位氨基酸序列所示；和/或
所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:2第604-625位氨基酸序列所示；和/或
所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:2第626-672位氨基酸序列所示；和/或
所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:2第673-784位氨基酸序列所示。
10.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求6-7中任一项所述的多核苷酸序列；
优选地，所述核酸构建物为载体；
更优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，以及权利要求6-7中任一项所述的多核苷酸序列。
11.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求10所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。
12.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求6-7中任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求10所述的核酸构建物，或感染了权利要求11所述的逆转录病毒，或稳定表达权利要求8中任一项所述的融合蛋白。
13.权利要求6-7中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求8-9中任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的核酸构建物或权利要求11所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。
14.权利要求6-7中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求8-9中任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的核酸构建物、权利要求11所述的逆转录病毒、或权利要求12所述的基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗CD19和CD22介导的疾病的药物中的用途；
优选地，所述CD19和CD22介导的疾病为白血病、淋巴瘤。
更优选地，所述CD19和CD22介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
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