CN110935066A - 一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了供一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶，其制备方法为：将含有羧甲基壳聚糖和透明质酸的混合溶液A与含有抗生素和骨形态发生蛋白缓释微球的混合溶液B混合，加入交联剂交联制得所述复合水凝胶。本发明的复合水凝胶呈均匀多孔网状结构，能有效促进伤口愈合，具有良好的仿生性能、生物相容性、力学性能及可降解性能。而且，本发明的复合水凝胶能长时间持续释放抗菌的抗生素和诱导新骨形成的骨形态发生蛋白，既能有效控制感染，又能在不进行额外手术的情况下有效促进骨骼再生，减少了手术次数，缩短了治疗周期，减轻了患者的身体和经济负担，在骨髓炎治疗中具有良好的应用前景。

Description

一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程材料技术领域，尤其涉及一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶及其制备方法。
背景技术
骨髓炎是一种骨或骨髓的细菌感染，是骨科医生面临的难题。人工髋关节、膝关节置换术、环境暴露性骨折、骨外科学、软组织感染是骨髓炎的主要危险因素。虽然健康的人体骨骼对感染有很强的抵抗力，但骨髓炎的发病率在患有骨性关节炎、类风湿关节炎、骨质疏松症等免疫功能低下的老年人群中逐渐增加。病灶内的细菌释放溶骨细胞因子和骨坏死因子，导致严重的疼痛和骨质流失。
近年来，以含抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的骨接和剂为基础的局部给药系统比系统给药系统在临床中的应用更为广泛。因为它可以在有限的血管分布的情况下确保疾病部位合适的抗生素浓度，并防止大剂量的抗生素所引起的全身毒性。例如万古霉素、庆大霉素、妥布霉素、头孢呋辛、红霉素和粘菌素在内的各种抗生素已被用于PMMA骨接和剂。然而，PMMA基质中残留的单体会导致周围骨骼的坏死。另外，抗生素的快速释放以及残留在基质中的抗生素并不能保证其有效性，反而会刺激机体对抗生素产生耐药性。在临床上，清除不可降解的基质仍然是不可避免的问题。为了弥补以PMMA为基质的抗生素载药体系的局限性，具有载药能力的羟基磷灰石、磷酸三钙、硫酸钙、聚已酸内酯(PCL)、纤维蛋白胶、胶原蛋白和交联透明质酸等在实验室和临床都已经被广泛地研究。但是，目前很少有关于基质系统既能有效控制感染又能在不进行额外手术的情况下获得有效的骨骼再生的报道。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶及其制备方法。
为实现其目的，本发明采取的技术方案包括如下几方面：
第一方面，本发明提供了一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶，其制备方法为：将含有羧甲基壳聚糖和透明质酸的混合溶液A与含有抗生素和骨形态发生蛋白缓释微球的混合溶液B混合，加入交联剂交联制得所述复合水凝胶。
优选地，所述混合溶液A与混合溶液B的体积比为1:1。混合溶液A与混合溶液B的体积比会对复合水凝胶的使用性能产生影响；若混合溶液B的占比过大，会导致抗生素和骨形态发生蛋白的浓度过高而引起副作用；若混合溶液B的占比过小，会使复合水凝胶的药物浓度过低而导致促进骨髓炎愈合的效果降低。而以1:1的体积比混合时，水凝胶具有适宜的物理性能，对骨髓炎具有较好的治疗效果，且安全、不会产生副作用。
透明质酸(HA)是一种天然酸性粘多糖类高分子聚合物，是构成细胞外基质和细胞间基质的主要成分，具有强烈的亲水保湿能力，在体内通过酶降解而清除，还具有诱导骨形成和促血管生成的特性。羧甲基壳聚糖(CMCS)是壳聚糖(CS)分子羧甲基化得到的一种水溶性产物，其具备CS所有的优异性质，且更有利于与其它物质的结合，在体内可以完全降解。本发明以羧甲基壳聚糖和透明质酸作为所述复合水凝胶的基质，该基质呈均匀多孔网状结构，可很好地吸收伤口渗出液，保持合适的水分环境，增加伤口与外界氧气的接触面积，促进伤口愈合，并具有良好的仿生性能、生物相容性、力学性能及可降解性能。另外，本发明通过缓释微球在复合水凝胶中载入骨形态发生蛋白，使复合水凝胶能够长时间持续释放骨形态发生蛋白，以诱导新骨形成，促进骨骼愈合。由于透明质酸水溶液带负电，而本发明采用的抗生素溶液带正电，因此可通过静电作用将抗生素结合到复合水凝胶中，使复合水凝胶能够长时间持续释放抗生素，以起到杀菌和抵御伤口感染的功效。
优选地，所述混合溶液A中羧甲基壳聚糖和透明质酸的质量分数之和为1.5～2.5wt％。最优选地，所述混合溶液A中羧甲基壳聚糖和透明质酸的质量分数之和为2.0wt％。质量分数过低或过高都会对水凝胶的物理性能产生影响，会导致水凝胶不适用于伤口治理。而以上述质量分数获得的水凝胶具有适合伤口治理的物理性能。
优选地，所述混合溶液A中，羧甲基壳聚糖与透明质酸的质量比为(0.5～2.0)：1。最优选地，所述羧甲基壳聚糖与透明质酸的质量比为1:1。羧甲基壳聚糖与透明质酸的质量比会影响水凝胶的吸水性能，质量比为1:1时水凝胶的吸水性能最优。
优选地，所述混合溶液B中，所述抗生素的浓度为60～150mg/mL，所述骨形态发生蛋白缓释微球的浓度为1.5～2.5μg/mL。更优选地，所述混合溶液B中，所述抗生素的浓度为100mg/mL，所述骨形态发生蛋白缓释微球的浓度为2.0μg/mL。抗生素和骨形态发生蛋白缓释微球的浓度过低会导致水凝胶中药物浓度低，从而导致治疗效果降低，但药物浓度过高又会引起副作用。基于本发明对所述混合溶液B的用量限定，其中的抗生素和骨形态发生蛋白缓释微球的浓度控制在上述范围时，可确保水凝胶具有较好的控制感染及诱导新骨形成的效果，在骨髓炎中具有较佳疗效。
优选地，所述骨形态发生蛋白缓释微球的载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。以PLGA为载体的微球控释系统适用于半衰期短或口服生物利用度低而又需要长期使用的药物，其优点是可在几周至几个月的时间内以一定速率释放药物，维持有效血液浓度，减少药物的给药次数，从而增加病人的顺应性，提高治疗效果，减少用药的总剂量。
优选地，所述骨形态发生蛋白缓释微球负载的骨形态发生蛋白为骨形态发生蛋白2(BMP-2)。BMP-2是一种碱性降解糖蛋白质，是转化生长因子β超家族中的成员之一。BMP-2的骨诱导活性较强，是唯一能单独诱导成骨的因子，能有效促进骨骼再生。
优选地，所述抗生素为万古霉素(VCM)、盐酸环丙沙星、克林霉素、庆大霉素和妥布霉素中的至少一种。上述种类的抗生素具有较好的抑菌效果，可用作骨髓炎局部给药。
优选地，所述混合溶液A和所述混合溶液B的溶剂均为磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
优选地，所述磷酸缓冲盐溶液的pH＝7.4，其中含有质量分数为0.11wt％的Na2HPO4。
优选地，所述交联剂为京尼平，其添加量为50μg/mL。京尼平的添加量过大会带来一定的细胞毒性，添加量过小会使交联过程不完全，影响水凝胶的力学性能。以本申请上述添加量进行添加，即可确保水凝胶无细胞毒性，又可使交联过程完全，水凝胶具有适用于伤口治理的力学性能。
优选地，所述交联的条件为常温放置交联4～6h，优选为5h。
第二方面，本发明提供了一种所述骨形态发生蛋白缓释微球的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将BMP-2溶于PBS溶液中，得到BMP-2溶液；
(2)将PLGA溶于二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
(3)将BMP-2溶液滴入PLGA溶液中，得到混合溶液C；
(4)冰浴下，将PBS溶液加入混合溶液C中，超声分散，得到初乳溶液；
(5)将初乳溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，超声分散，得到复乳溶液；
(6)去除复乳溶液中的二氯甲烷后，离心，取沉淀，清洗，冷冻，干燥，即得所述骨形态发生蛋白缓释微球。
优选地，所述BMP-2溶液中BMP-2的浓度为0.8～1.2μg/mL，优选为1μg/mL。
优选地，所述PLGA溶液中PLGA的浓度为0.25～0.33g/3mL，优选为0.3g/3mL。
优选地，所述混合溶液C中，BMP-2溶液与PLGA溶液的体积比为1:6。
本申请中，BMP-2与PLGA的配比会显著影响微球中BMP-2的包载量，BMP-2的包载量低会降低水凝胶的治疗效果，包载量高会导致在释放初期产生爆释而引发副作用。以上述的浓度和体积比进行混合包载获得的微球中BMP-2具有适宜的包载量，即可确保水凝胶对骨髓炎具有较好的疗效，又可确保水凝胶在使用过程中安全、无副作用产生。
优选地，所述聚乙烯醇溶液的溶剂为去离子水，所述聚乙烯醇溶液中聚乙烯醇的浓度为1mg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的复合水凝胶呈均匀多孔网状结构，能有效促进伤口愈合，具有良好的仿生性能、生物相容性、力学性能及可降解性能。而且，本发明的复合水凝胶能长时间持续释放抗菌的抗生素和诱导新骨形成的骨形态发生蛋白，既能有效控制感染，又能在不进行额外手术的情况下有效促进骨骼再生，减少了手术次数，缩短了治疗周期，减轻了患者的身体和经济负担，在骨髓炎治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的PLGA@BMP-2缓释微球的扫描电镜图；
图2为实施例1制备的PLGA@BMP-2缓释微球的粒径分布图；
图3为实施例2、实施例3和实施例4制备的水凝胶的吸水性能；
图4为实施例5、实施例6和实施例7制备的水凝胶的降解性能；
图5为实施例5制备的水凝胶中BMP-2的累积释放量；
图6为实施例5、实施例6和实施例7制备的水凝胶中VCM随时间的累积释放量；
图7为实施例5、实施例6和实施例7制备的水凝胶对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力的影响。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，本发明通过下列实施例进一步说明。显然，下列实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。
实施例中使用的PBS溶液的pH＝7.4，其中含有质量分数为0.11wt％的Na2HPO4。
本发明实施例提供一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将CMCS与HA按(0.5～2.0)：1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为1.5～2.5wt％的混合溶液A；
(2)将骨形态发生蛋白缓释微球和抗生素加入4℃的PBS溶液中，得到混合溶液B；混合溶液B中抗生素的浓度为60～150mg/mL，骨形态发生蛋白缓释微球的浓度为1.5～2.5μg/mL；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后按50μg/mL的添加量加入京尼平，常温放置交联4～6h，制得所述复合水凝胶。
所述骨形态发生蛋白缓释微球的制备方法，具体步骤如下：
(1)将0.25g PVA溶于250mL去离子水中，在60～80℃下搅拌至PVA完全溶解后冷却至室温，得到PVA溶液；
(2)将BMP-2溶于PBS溶液中，得到0.8～1.2μg/mL的BMP-2溶液；
(3)将0.25～0.33g PLGA溶于3mL二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
(4)将500μL BMP-2溶液滴入3mL PLGA溶液中，得到混合溶液C；
(5)冰浴下，将500μL PBS溶液加入混合溶液C中，超声分散，得到初乳溶液；
(6)将初乳溶液滴加到PVA溶液中，超声分散，得到复乳溶液；
(7)将复乳溶液放置于磁力搅拌器上搅拌4～6h，以挥发二氯甲烷；
(8)待微球成型后，离心，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，冷冻，干燥，即得所述骨形态发生蛋白缓释微球。
实施例1
骨形态发生蛋白缓释微球(下文简称PLGA@BMP-2缓释微球)的制备：
(1)将0.25g PVA溶于250mL去离子水中，在70℃下搅拌至PVA完全溶解后冷却至室温，得到PVA溶液；
(2)称取0.3g PLGA溶于3mL二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
(3)将BMP-2溶解在PBS溶液中，配成1.0μg/mL的BMP-2溶液；
(4)取500μL BMP-2溶液滴入3mL的PLGA溶液中，得到混合溶液C；
(5)将PVA溶液和混合溶液C分别放入盛有冰块的烧杯中进行冰浴使其降温；
(6)取500μL PBS溶液加入混合溶液C中，用超声细胞破碎仪在200W功率下超声分散15秒，至液体呈乳白色，得到初乳溶液；
(7)用滴管将初乳溶液滴加到PVA溶液中，继续超声分散2分钟至液体呈淡乳白色，得到复乳溶液；
(8)将复乳溶液放置于磁力搅拌器上搅拌5h，以挥发二氯甲烷有机溶剂；
(9)待微球成型后，在4000rpm转速条件下离心5分钟，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心清洗三次，最后放入-20℃冰箱中冷冻，真空干燥后即得PLGA@BMP-2缓释微球。
从图1可以看出，PLGA@BMP-2缓释微球呈球形，表面比较粗糙。从图1可以看出，PLGA@BMP-2缓释微球的平均水动力直径为50.87μm。从图2可看出，PLGA@BMP-2缓释微球的粒径范围在20～50μm之间。
实施例2
CMCS(0.5)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按0.5:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)用冷PBS溶液(4℃)和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球配制浓度为2.0μg/mL的混合溶液B；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后按50μg/mL的添加量加入京尼平，取400uL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到CMCS(0.5)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶。
实施例3
CMCS(1)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按1:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)用冷PBS溶液(4℃)和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球配制浓度为2.0μg/mL的混合溶液B；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后按50μg/mL的添加量加入京尼平，取400uL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到CMCS(1)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶。
实施例4
CMCS(2)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按2:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)用冷PBS溶液(4℃)和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球配制浓度为2.0μg/mL的混合溶液B；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后按50μg/mL的添加量加入京尼平，取400uL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到CMCS(2)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶。
实施例5
VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按1:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)将VCM和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球用冷PBS溶液(4℃)配制混合溶液B；混合溶液B中VCM的浓度为60mg/mL，PLGA@BMP-2缓释微球的浓度为2.0μg/mL；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后加入1mL浓度为100mg/mL的京尼平水溶液，取400uL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶。
实施例6
VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按1:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)将VCM和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球用冷PBS溶液(4℃)配制混合溶液B；混合溶液B中VCM的浓度为100mg/mL，PLGA@BMP-2缓释微球的浓度为2.0μg/mL；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后加入1mL浓度为100mg/mL的京尼平水溶液，取400μL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶。
实施例7
VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2凝胶的制备：
(1)将CMCS与HA按1:1的质量比混合，溶于PBS溶液中，得到质量分数为2.0wt％的混合溶液A；
(2)将VCM和实施例1的PLGA@BMP-2缓释微球用冷PBS溶液(4℃)配制混合溶液B；混合溶液B中VCM的浓度为150mg/mL，PLGA@BMP-2缓释微球的浓度为2.0μg/mL；
(3)将混合溶液A与混合溶液B按1:1的体积比混合，随后加入1mL浓度为100mg/mL的京尼平水溶液，取400μL均匀的液体转入48孔板，常温放置交联5h，得到VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶。
试验：
(1)吸水性能测试
用天平称量支架的重量，记为Mo，将支架置于PBS(10mmol/L，pH＝7.4)溶液中，30min后快速用滤纸吸去表面的水分，称重记录样品质量为Mw。每个样品平行做三次实验，求其平均值，样品吸水率按照公式(4-1)计算：
Figure BDA0002350908230000091
其中，Mo为干支架的重量(g)；Mw为吸水后支架的重量(g)；X为支架的吸水率(％)。
图3为实施例2、实施例3和实施例4制备的水凝胶的吸水性能。从图3可看出：实施例2的CMCS(0.5)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的吸水率为1487.3±90.07，证明了该材料具有良好的吸水性。实施例2的CMCS(0.5)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。实施例3的CMCS(1)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的吸水率为1524.38±127.54，证明了该材料具有良好的吸水性。实施例3的CMCSHA/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。实施例4的CMCS(2)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶的吸水率为1235.19±207.15，证明了该材料具有良好的吸水性。实施例4的CMCS(2)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。
实施例2～4的水凝胶虽然都能满足敷料的临床应用要求，但可看出，CMCS与HA的质量比会显著影响水凝胶的吸水性能，CMCS:HA＝1:1时，水凝胶的吸水性能最优。
(2)机械性能测试
拉伸试验按照医药行业标准YY/T 0471.4-2004进行。在25℃、相对湿度为70％的条件下，用通用试验机(济南川白仪器LDS-05S)测定水凝胶的抗拉强度和断裂伸长率。负载能力为500N，效率在±1％以内。每个水凝胶支架的矩形试样(25mm宽×1.5mm厚)以300mm/min的十字头速度拉伸。
表1实施例5、实施例6和实施例7制备的水凝胶的机械性能
水凝胶 断裂伸长率(％) 拉伸强度(MPa)
VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2 9.3±1.37 0.874±0.0946
VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2 10.7±1.3 1.1233±0.2131
VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2 8.1±1.245 0.834±0.1366
从表1可知：
实施例5的VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的拉伸强度为0.874±0.0946MPa，在可应用范围0.8～1.4MPa内，另外，其断裂伸长率为9.3±1.37，在可允许应用的范围5％～15％之间，由此可见，实施例3的VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。
实施例6的VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的拉伸强度为1.1233±0.2131MPa，在可应用范围0.8～1.4MPa内，另外，其断裂伸长率为10.7±1.3，在可允许应用的范围5％～15％之间，由此可见，实施例4的VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。
实施例7的VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的拉伸强度为0.834±0.1366MPa，在可应用范围0.8～1.4MPa内，另外，其断裂伸长率为8.1±1.245，在可允许应用的范围5％～15％之间，由此可见，实施例5的VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶能满足敷料的临床应用要求。
其中，实施例6的水凝胶的机械性能最优。
(3)体外降解
对实施例5、实施例6和实施例7制备的水凝胶的降解行为进行了监测。将冻干的水凝胶进行初始称重(W0)后，浸泡在含10000U/mL溶菌酶的PBS溶液中，置于恒温摇床(37℃，70rpm)。在测量的时间点，取出水凝胶并称重(Wt)。具体为分别于3、7、14、21、28天取出样品，超纯水清洗，冻干称重。并在特定的时间点对水凝胶进行扫描电镜观察水凝胶形貌，采用公式计算出水凝胶的体外降解率：
降解率(％)＝(Wo-Wt)/Wo×100％
结果如图4所示。从图4可看出，实施例5的VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的重量随着孵育时间的增加而逐渐减少，两周内可降解62％。实施例6的VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的重量随着孵育时间的增加而逐渐减少，两周内可降解66％。实施例7的VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶的重量随着孵育时间的增加而逐渐减少，两周内可降解60％。其中，实施例6的水凝胶的降解性能最优。
(4)体外药物释放
将水凝胶沉浸在20mL的PBS缓冲溶液中，密封后置于37℃、100rpm的恒温摇床中模拟体外释放。每次取样1mL之后再补充1mL去离子水，测定第一次取样浓度为c1，第一次释放浓度为C1，第二次取样浓度为c2，释放浓度为C2，以此类推，则：c1＝C1；C2＝c2+0.1C1；C3＝c3+0.1C2….
图5为实施例5的水凝胶中BMP-2的释放性能。从图5可看出，第一天BMP-2释放较快，之后BMP-2释放速率降低，三天之后还在持续释放。这一结果可以理解为BMP-2在水凝胶表面区域的快速脱附，然后由于水凝胶中的网络结构延缓BMP-2的释放。同时说明，本发明的水凝胶能长时间持续释放BMP-2。
图6为实施例5、实施例6和实施例7的水凝胶中抗生素VCM的释放性能。从图6可看出，实施例5、实施例6和实施例7的VCM的释放速率基本保持稳定，主要是因为VCM与CMCS/HA基质之间是通过静电作用结合的。其中，实施例6的累计释放量比实施例5略高，实施例7的累计释放量比实施例6略高。实施例5、实施例6和实施例7的水凝胶间的VCM释放趋势无明显差异，但释药量与电荷间相互作用成正比，CMCS/HA和带正电的VCM在生理环境(如PBS、体液和血液)中缓慢地与CMCS/HA解离，其持续释放可满足作为局部给药系统治疗骨髓炎的基本要求。
(5)细胞存活率：将培养细胞用0.25％胰酶消化悬浮后，以每孔密度为2×104个/mL的细胞悬液接种在48孔板上。培养12h后取出原培养液，并分别在每孔皿中加入加入500μL新鲜培养基，再加入1cm3的水凝胶，以只添加500μL完全培养基为空白对照组。每组至少设5孔，在指定的时间间隔取出相应的孔板，每孔加100μL CCK8工作液，在37℃恒温二氧化碳培养箱(含5％的CO2)中孵育1～2h后，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度(OD)。
图7为不同VCM浓度的实施例5(60)、实施例6(100)和实施例7(150)的水凝胶对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力的影响。从图7可看出，实施例5和实施例6的细胞存活率与对照组无明显差异，证明实施例5和实施例6的水凝胶具有良好的生物相容性。实施例7的细胞存活率与对照组相比存活率较低，证明实施例7的水凝胶的生物相容性较差。
(6)抑菌圈试验
将水凝胶(直径8mm)的圆型试样，在超净工作台紫外照射30min灭菌。在固体LB培养基上滴取100μL上述菌悬液，用涂布棒均匀涂布贴上待测样品，正置15min后将培养皿放置于37℃生化培养箱中倒置培养。根据不同的天数取出观察培养基上的细菌生长情况并记录抑菌圈直径(D)。
表2为实施例3、实施例5、实施例6和实施例7的水凝胶对金黄色酿脓葡萄球菌的抑菌圈实验结果。
表2
Figure BDA0002350908230000131
从表2可以看出：实施例3的CMCS(1)/HA(1)/PLGA@BMP-2水凝胶对骨髓炎的优势菌金黄色酿脓葡萄球菌有一定的抑菌性能，但与载入VCM的实施例5～7的水凝胶相比，实施例3的抑菌性能差较多。实施例3表现出的抑菌性能可能与CMCS本身具有的抑菌性有关。实施例5的VCM(60)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶对骨髓炎的优势菌金黄色酿脓葡萄球菌有明显的抑菌性，且随着时间的延长抑菌圈逐渐增大，第七天为31.4±0.005。实施例6的VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶对骨髓炎的优势菌金黄色酿脓葡萄球菌有明显的抑菌性，且随着时间延长抑菌圈逐渐增大，第七天为36.8±0.021。实施例7的VCM(150)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶对骨髓炎的优势菌金黄色酿脓葡萄球菌有明显的抑菌性，且随着时间延长抑菌圈逐渐增大，第七天为45.4±0.71。实施例5～7三种水凝胶的抑菌圈可知，水凝胶的抑菌性能与VCM的浓度成正比。
综合分析上述机械性能、降解性能、生物相容性和抑菌性能的测试结果，实施例6的VCM(100)/CMCS/HA/PLGA@BMP-2水凝胶为用于治疗骨髓炎的最佳材料。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将含有羧甲基壳聚糖和透明质酸的混合溶液A与含有抗生素和骨形态发生蛋白缓释微球的混合溶液B混合，加入交联剂交联制得所述复合水凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液A与所述混合溶液B的体积比为1:1。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液A中羧甲基壳聚糖和透明质酸的质量分数之和为1.5～2.5wt％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液A中，羧甲基壳聚糖与透明质酸的质量比为(0.5～2.0)：1；最优选地，所述混合溶液A中，羧甲基壳聚糖与透明质酸的质量比为1:1。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液B中，所述抗生素的浓度为60～150mg/mL，所述骨形态发生蛋白缓释微球的浓度为1.5～2.5μg/mL。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白缓释微球的载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白缓释微球负载的骨形态发生蛋白为骨形态发生蛋白2。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液A和所述混合溶液B的溶剂均为磷酸缓冲盐溶液。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白缓释微球的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将BMP-2溶于PBS溶液中，得到BMP-2溶液；
(2)将PLGA溶于二氯甲烷中，得到PLGA溶液；
(3)将BMP-2溶液滴入PLGA溶液中，得到混合溶液C；
(4)冰浴下，将PBS溶液加入混合溶液C中，超声分散，得到初乳溶液；
(5)将初乳溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，超声分散，得到复乳溶液；
(6)去除复乳溶液中的二氯甲烷后，离心，取沉淀，清洗，冷冻，干燥，即得所述骨形态发生蛋白缓释微球。
10.一种促进骨髓炎愈合的复合水凝胶，其特征在于，由如权利要求1～9任一项所述的制备方法制得。
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