CN110917356A - 阻断肿瘤源性ilt4在过继性t细胞治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供阻断肿瘤源性ILT4在过继性T细胞治疗中的应用。本发明通过研究发现，肿瘤源性ILT4对微环境T细胞老化具诱导作用，并详细探究了其分子及代谢机制，从临床前模型证实了靶向ILT4可以逆转肿瘤的免疫抑制性微环境，参与恶性肿瘤的靶向治疗，并进一步构建B6小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞免疫治疗模型，研究ILT4阻断联合ACT治疗的可行性，为克服ACT治疗耐药提供有效手段。

Description

阻断肿瘤源性ILT4在过继性T细胞治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及阻断肿瘤源性ILT4在过继性T细胞治疗中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

免疫系统是恶性肿瘤发生发展的天然屏障，其中适应性T细胞免疫发挥最主要的抗肿瘤效应。然而，肿瘤微环境中浸润T细胞的丰度极低，同时肿瘤细胞能利用多种机制诱导浸润性T细胞的无功能，是肿瘤免疫逃逸的主要因素之一。因此，提高肿瘤特异性T细胞的浸润数量及免疫杀伤功能是抗肿瘤免疫治疗最重要的策略。

目前临床应用的抗肿瘤免疫策略主要包括免疫检查点阻滞治疗(ICB)及过继性T细胞治疗(ACT)两类。近年来二者在恶性肿瘤的免疫治疗中取得了巨大成功，被Science杂志列为2013年十大科技突破之首。尤其是免疫检查点阻滞治疗，在大部分实体肿瘤均显示出临床获益，是目前实体肿瘤免疫治疗的基石。但是ACT在实体肿瘤的治疗中仍面临很大的局限性。

ACT治疗策略包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗及CAR-/TCR-T治疗两种方式。TIL治疗首先从自体肿瘤组织分离肿瘤特异性T细胞并进行体外扩增，然后进行体外回输杀伤肿瘤，在恶性黑色素瘤的免疫治疗中取得了很好的疗效。但是由于其毒副反应较大，且基础设施复杂，限制了更广泛的临床应用。CAR-/TCR-T通过外源性修饰淋巴细胞使其具有能够特异性识别肿瘤抗原的抗原嵌合受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，是目前临床应用最广泛的ACT手段。尤其是CAR-T治疗，在血液系统恶性肿瘤如B淋巴细胞白血病及非霍奇金淋巴瘤中取得了令人瞩目的临床疗效，于2017年被美国FDA批准用于血液系统肿瘤的治疗。然而，CAR-T治疗在实体肿瘤中的临床获益并不显著。迄今为止，只有偶发的复发性脑胶质瘤患者对CAR-T治疗显示出有效性。而TCR-T治疗仅在高表达MAGE-A3及NY-ESO-1抗原的恶性黑色素瘤、食管癌及滑膜肉瘤中显示出较好的临床缓解率。除了实体肿瘤靶点的高度异质性外，免疫抑制性微环境如免疫检查点分子、抑制性细胞群体、炎性细胞因子及抑制性代谢产物等同样可显著抑制CAR-/TCR-T细胞在肿瘤中的移行浸润及特异性杀伤效应。因此，靶向抑制性肿瘤微环境与ACT的联合免疫治疗是重塑T细胞的抗肿瘤活性、克服实体肿瘤ACT治疗耐药的关键。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供阻断肿瘤源性免疫球蛋白样转录子4(ILT4)在过继性T细胞治疗中的应用。本发明通过研究发现，肿瘤源性ILT4对微环境T细胞老化具诱导作用，并详细探究了其分子及代谢机制，从临床前模型证实了靶向ILT4可以逆转肿瘤的免疫抑制性微环境，参与恶性肿瘤的靶向治疗，并进一步构建B6小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞免疫治疗模型，研究ILT4阻断联合ACT治疗的可行性，为克服ACT治疗耐药提供有效手段，从而完成本发明。

本发明的第一个方面，提供抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下a)-g)至少一种中的应用：

a)抑制肿瘤细胞脂肪酸的合成；

b)抑制肿瘤脂滴形成；

c)抑制MAPK ERK1/2信号通路；

d)逆转ILT4诱导的T细胞免疫老化；

e)逆转过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化；

f)改善免疫微环境对肿瘤特异性T细胞的抑制效应；

g)减缓或克服ACT对实体肿瘤的耐药性。

所述肿瘤包括但不限于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌。

本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物包括：抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质，和实施过继性T细胞治疗(ACT)的物质；

其中，所述ACT为CAR-T或TCR-T。

所述组合物用于肿瘤治疗，具体为肿瘤免疫治疗；更具体的，所述组合物具有如下a)-g)至少一种中的应用：

a)抑制肿瘤细胞脂肪酸的合成；

b)抑制肿瘤脂滴形成；

c)抑制MAPK ERK1/2信号通路；

d)逆转ILT4诱导的T细胞免疫老化；

e)逆转过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化；

f)改善免疫微环境对肿瘤特异性T细胞的抑制效应；

g)减缓或克服ACT对实体肿瘤的耐药性。

所述肿瘤包括但不限于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌。

所述抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括但不限于蛋白特异的抗体、针对ILT4 mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质；进一步的，所述抗体为人抗体或鼠抗体。

进一步的，所述组合物还可以包含通常使用的适量载体、赋形剂及稀释剂。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。可以包含的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

同时，经试验验证，上述技术方案对在小鼠中的ILT4的同源分子——配对免疫球蛋白样受体B(PIR-B)而言同样有效。同时，在本发明的技术方案中，ILT4与PIR-B均为肿瘤源性。

本发明的有益技术效果：

本发明提供了阻断肿瘤源性免疫球蛋白样转录子4(ILT4)在过继性T细胞治疗中的应用。本发明通过研究发现，肿瘤源性ILT4对微环境T细胞老化具诱导作用，并详细探究了其分子及代谢机制，证明肿瘤源性ILT4通过活化MAPKERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸的合成及脂滴形成，进而诱导CD4⁺/CD8⁺T细胞的老化；进而从临床前模型证实了靶向ILT4可以逆转肿瘤的免疫抑制性微环境，参与恶性肿瘤的靶向治疗，并进一步构建B6小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞免疫治疗模型，证明肿瘤细胞ILT4/PIR-B阻滞体内逆转了过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化，增强了其杀伤能力与抗肿瘤免疫应答。ILT4阻滞与ACT的联合免疫治疗是克服免疫耐受、提高ACT临床获益极有潜力的治疗策略，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.肿瘤源性ILT4/PIR-B调控了人/小鼠肿瘤细胞脂肪酸合成酶表达；其中，A.ILT4未显著调控肿瘤细胞中糖酵解、胆固醇代谢相关酶的基因表达。用500ng/mL的anti-ILT4或同型对照抗体Isotype处理NSCLC(A549及H1299)、乳腺癌(ZR751)、恶性黑色素瘤(M628)及前列腺癌(PC-3)细胞48小时，采用real-time PCR检测葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢关键酶的基因表达；B.用anti-ILT4处理不同肿瘤细胞后48小时后，肿瘤细胞中脂肪酸合成相关酶ACC1与FASN的基因表达水平显著降低；C,D.选择ILT4相对高(A549，ZR751，M628)/低(H1650，MCF7，M628)表达的肿瘤细胞株，分别敲除/过表达肿瘤细胞中ILT4后，显著下调(C)/上调(D)了其ACC1与FASN基因表达；E.小鼠乳腺癌细胞系E0771(PIR-B相对低表达)中PIR-B的过表达显著上调了脂肪酸合成及胆固醇代谢关键酶的基因表达；F.小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16F0(PIR-B相对高表达)中PIR-B的敲除显著抑制了脂肪酸合成及胆固醇代谢关键酶的基因表达。与相应的对照组相比，***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05。

图2.肿瘤源性ILT4调控了细胞内中性脂肪的合成；其中，A.与同型对照组相比，anti-ILT4处理下调了肿瘤细胞内脂滴的形成。500ng/mL的anti-ILT4或Isotype处理NSCLC(A549及H1299)、乳腺癌(ZR751)、恶性黑色素瘤(M628)及前列腺癌(PC-3)肿瘤细胞48小时后，油红染色检测细胞内脂滴含量，胞浆中红色圆形颗粒为脂滴的染色阳性；B.Anti-ILT4/Isotype处理肿瘤细胞后油红染色统计结果，以阳性细胞所占百分比表示；对于染色背景较强的细胞株，阳性细胞定义为胞浆中脂滴含量大于1/3胞浆体积；C,D.在ILT4高(A549，ZR751，M628)/低(H1650，MCF7，M628)表达的肿瘤细胞株中，分别敲除/过表达肿瘤细胞ILT4以后，显著下调(C)/上调(D)了细胞内脂滴的数量。比例尺为10μm；与对照组比较，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

图3.肿瘤源性ILT4通过上调脂肪酸合成诱导了T细胞的老化。其中，在ILT4低表达的肿瘤细胞H1650、MCF7、M628及PC-3中过表达ILT4，同时采用5μM的FASN抑制剂C75预处理肿瘤细胞，转染48小时后完全洗净C75，再与OKT-3预活化的CD4⁺/CD8⁺T细胞共培养，SA-β-Gal结果显示C75处理逆转了ILT4诱导的CD4⁺T(A)及CD8⁺T(B)细胞的老化。***，与LV-pReceiver-Lv105组(过表达对照组)比较p<0.001；###，与LV-ILT4组比较p<0.001。

图4.ILT4活化了肿瘤细胞MAPK ERK1/2信号通路。选择ILT4相对高(A549，ZR751及M628)/低表达(H1650，MCF7，M628及PC-3)的肿瘤细胞株分别敲除/过表达ILT4，72小时后采用western blot检测了MAPK(包括ERK1/2、P38和JNK)通路分子的磷酸化水平。结果发现，肿瘤细胞中ERK1/2的磷酸化水平分别被上(A)/下(B)调，但是对P38及JNK的磷酸化水平无明显影响。

图5.ILT4通过MAPK ERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸合成。其中，A.选择ILT4低表达的肿瘤细胞株H1650、MCF7及M628，用10μM的MEK抑制剂U0126预处理24小时，然后慢病毒感染过表达ILT4，同时继续用10μM的U0126抑制ERK通路的活化。48小时后收集细胞进行real-time PCR检测。结果显示U0126显著逆转了ILT4过表达上调的脂肪酸合成酶ACC1与FASN基因表达；B.A中的细胞在转染72小时后进行脂滴的油红染色，结果显示，U0126预处理同时逆转了肿瘤细胞中脂滴形成。与LV-pReceiver-Lv105组(过表达对照组)比较，**，p<0.01，***，p<0.001；###，与LV-ILT4组比较p<0.001。

图6.ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路促进了T细胞的老化。选择ILT4低表达的肿瘤细胞株，用10μM的MEK抑制剂U0126预处理24小时，然后慢病毒感染过表达ILT4，同时继续用10μM的U0126抑制ERK通路的活化。48小时后完全洗净U0126，进行上述肿瘤细胞与OKT-3预活化的CD4+及CD8+T细胞的共培养。SA-β-Gal结果显示U0126预处理逆转了ILT4诱导的CD4+T(A)及CD8+T(B)细胞的老化。与LV-pReceiver-Lv105组(过表达对照组)比较，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。与LV-ILT4组比较，##，p<0.01；###，p<0.001。

图7.小鼠体内PIR-B阻断提高了过继性T细胞治疗疗效。其中，A,B,C.小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型中，过继转移的Pmel-CD8⁺T细胞显著抑制了B16F0肿瘤的生长，而B16F0中PIR-B基因敲除进一步减慢了肿瘤的生长。野生型C57BL/6小鼠皮下注射PIR-B敲除/对照的B16F0肿瘤细胞(2×10⁵/只)，在肿瘤生长的第8天，当肿瘤大小达5-6mm时，X线照射小鼠(500cGy/只×1次)去除自身的T细胞。第9天时将小鼠CD3抗体及CD28抗体预活化的CD8⁺Pmel T细胞(2×10⁶/只)通过尾静脉注射至小鼠体内，之后定期观察肿瘤生长。每3天测量肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积并绘制生长曲线。待肿瘤最大径生长至2cm时，CO₂处死小鼠，剥离肿瘤进行称重。A为肿瘤生长曲线图，B为移植瘤的最终大小图像，C为不同组肿瘤重量。**，与LV-Ctr-shRNA组比较p<0.01。

图8.PIR-B阻断逆转了肿瘤特异性CTLs的老化。其中，A.C57BL/6小鼠处死后分离外周血(BL)、肿瘤、淋巴结(LN)及脾脏(SP)中的淋巴细胞，并磁珠分选CD8⁺T细胞，SA-β-Gal检测老化CD8⁺T细胞的比例，结果显示，肿瘤种植显著诱导了外周血中过继转移的肿瘤特异性CD8⁺T细胞的老化，而肿瘤细胞B16F0中PIR-B的敲除部分逆转了CD8⁺T细胞的老化；B.B16F0中PIR-B基因敲除逆转了小鼠肿瘤组织中浸润的肿瘤特异性CD8⁺T细胞的老化；C,D.移植肿瘤不能诱导淋巴结(LN)及脾脏(SP)中淋巴细胞的老化，而肿瘤源性PIR-B对也未影响上述组织中T细胞老化。***，与LV-control shRNA组比较p<0.001。###，与Pmel CD8alone组比较，p<0.001。

图9.PIR-B阻断增强了过继转移的肿瘤特异性CTLs的杀伤能力。其中，A,B.C57BL/6小鼠处死后分离外周血(BL)及肿瘤中浸润的淋巴细胞，流式细胞术检测不同组织的CD8⁺T细胞中IFN-γ的表达，结果发现，B16F0中PIR-B基因敲除增强小鼠外周血(BL)及肿瘤组织(TIL)中Pmel-CD8+T细胞IFN-γ的产生。***，与LV-control shRNA组比较p<0.001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1

1.细胞培养

小鼠细胞系B16F0用含10％FBS及1％青链霉素双抗的RPMI-1640或DMEM培养；小鼠肺癌细胞系MLE12采用含2％胎牛血清、0.005mg/ml胰岛素、ITS(1:100)、10nM氢化可的松、10nMβ-雌二醇、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养；小鼠肺癌细胞系LL/2采用含10％FBS、2％L-谷氨酰胺及1％青链霉素双抗的高糖DMEM培养；MCF10A采用含2％胎牛血清、1μg/ml氢化可的松、20ng/ml表皮生长因子及1.2μg/ml胰岛素的DMEM培养基培养；FSK4采用含2％FBS、1％HEPES溶液、10μg/ml胰岛素及5ng/ml表皮生长因子的DMEM培养。

Pmel小鼠CD8⁺T细胞由小鼠脾脏细胞分离。处死小鼠后无菌环境取出脾脏，轻轻磨碎释放细胞，采用红细胞裂解液室温处理5分钟，待红细胞完全破碎后将脾脏细胞培养于2μg/ml抗鼠CD3与1μg/ml抗鼠CD28预包被的6孔板中，培养基为含10％人AB血清、100IU/ml重组IL-2的RPMI-1640。每2-3天更换新鲜培养基并保持细胞活性，9-11天后可进行小鼠尾静脉注射。

肿瘤细胞ILT4的阻滞

将不同的肿瘤细胞以合适的密度接种于6孔板，使24小时后细胞融合度达50-60％。24小时后待细胞贴壁良好，加入0.5μg/ml的anti-ILT4或对照IgG处理48小时或72小时，分别检测肿瘤细胞中代谢酶基因水平的表达或细胞内脂滴的油红含量。

肿瘤细胞脂肪酸合成或信号通路抑制

选择ILT4低表达的细胞株(A549，ZR751及M628)，以相应密度接种于6孔板中，接种的同时用5μM的C75(FASN抑制剂)或10μM的U0126(MEK抑制剂)处理24小时，然后进行ILT4的过表达，以及后续的油红染色及肿瘤细胞-T细胞共培养。

2.质粒扩增与制备

2.1质粒构建

本实验所用ILT4及PIR-B过表达与对照质粒购自美国GeneCopoeia公司；ILT4及PIR-B shRNA及对照质粒购自Sigma-Aldrich公司，慢病毒包装质粒psPAX2及PMD2.G购自Origene。

2.2质粒转化及扩增

(1)将感受态细菌从-80℃取出，并在冰上融化(大约20-30分钟)；

(2)从4℃冷库取出提前制备好的琼脂糖凝胶板，恢复至室温或37℃；

(3)在EP管中将质粒原液1-5μl加入感受态细菌(20-50μl)中，轻弹混匀；

(4)将上述混合物冰上静置20-30min；

(5)将EP管下端1/2-2/3放入42℃水浴进行热休克处理30-60s，随后继续冰上静置2min；

(6)加入250-500μl的预冷的LB液体培养基，轻轻混匀，放在恒温摇床(200rpm)，37℃摇晃45分钟；

(7)将部分或全部的转化物加入含有相应抗生素的10cm凝胶板中，置入37℃恒温孵箱培养，胶板向上培养1小时，后倒置培养过夜(16小时)；

(8)待琼脂糖凝胶板中长出细菌菌落时，挑取单克隆菌落置于5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床，250rpm摇晃过夜。

2.3质粒提取

(1)2ml离心管中加入上述过夜的大肠杆菌培养基，离心≥12000g×1分钟；弃上清，颠倒EP管在纸上，去掉所有水痕；必要时重复上面步骤；

(2)重悬：加入250μl含有RNA酶的重悬缓冲液，上下颠倒重悬细胞；

(3)溶解：加入250μl细胞裂解缓冲液，上下颠倒4-6次以彻底混匀(注意：这一步不能超过5分钟；不要旋转，以防剪短基因组DNA)；

(4)中和：加入350μl中和缓冲液，立即上下颠倒4-6次混匀，离心≥12000g×10分钟；

(5)纯化柱准备：将核酸纯化柱中加入500μl准备液，离心≥12000g×1分钟，弃去收集管中的液体；

(6)结合：将4中的上清转移到核酸纯化柱中，离心≥12000g×1分钟；去掉收集管中的液体，将核酸纯化柱放回收集管中；

(7)洗涤：核酸纯化柱中加入500μl洗涤缓冲液，离心≥12000g×1分钟，去掉收集管中的液体，将核酸纯化柱放回收集管中；

(8)晾干：再次离心≥12000g×1分钟，后将核酸纯化柱转移至干净的1.5ml的EP管中；

(9)洗提：核酸纯化柱中加入50μl的溶解缓冲液，室温放置1分钟。

(10)离心≥12000g×1分钟提洗DNA(也可以将DNA溶于30μl的溶解缓冲液中以增加质粒DNA浓度)。

3.慢病毒包装与细胞感染

3.1慢病毒包装

(1)将1×10⁶的293T细胞种在10cm平板中，使转染时细胞融合度达70％-80％；

(2)质粒转染前将细胞培养液更换为9ml含10％FBS的RPMI-1640；

(3)制备转染混合物：

a)ILT4/PIR-B shRNA慢病毒的转染混合物：1.2ml opti-MEM+12μlX-tremeGENE^TMHP DNA转染试剂+6μg对照/ILT4/PIR-B shRNA+4μgpsPAX2+2μg pMD2.G质粒，混匀后室温放置25分钟；

b)ILT4/PIR-B过表达慢病毒的转染混合物：EP管中加入200μl opti-MEM稀释2.5μg对照/ILT4/PIR-B过表达质粒+5μl Lenti-Pac HIV mix(0.5g/L)，另外准备一个EP管用200μl opti-MEM稀释15μl的EndoFectinLenti，将后者逐滴加入DNA溶液后轻轻混匀，室温放置10-25分钟；

(4)将转染混合物轻轻逐滴加入细胞培养液中，轻晃混匀，37℃培养箱恒温培养293T细胞；

(5)8小时后去掉上述细胞培养液，更换为含5％FBS的RPMI-1640培养液+200μlTiterBoost；

(6)分别于细胞培养的48小时及72小时收集293T上清液，1000g离心10分钟去掉细胞碎片，分装病毒上清并快速置入-80℃冰箱冷冻备用。

3.2细胞慢病毒感染

(1)用含10％FBS的RPMI-1640或DMEM培养待转染的肿瘤细胞，使慢病毒感染前肿瘤细胞融合度为30％左右；

(2)用含5％FBS的RPMI-1640或DMEM制备慢病毒混合物，根据不同待感染细胞株分别将慢病毒稀释10-100倍，并加入终浓度为5ng/ml polybrene；

(3)24孔板中加入500μl/孔的慢病毒混合物；

(4)4℃离心，1000g×60分钟，后将细胞放回37℃细胞培养孵箱培养；

(5)8小时后更换培养液为含5％FBS的RPMI-1640或DMEM；

(6)感染48h-72h后收集细胞准备下一步实验。

4.RT-PCR

4.1总RNA提取

(1)匀浆处理：

a)组织：肿瘤组织称重并剪成50-100mg大小，干冰上快速冷却后置入-80℃冰冻备用；研磨前用RNase ZAP清洗研磨器1次，并用dH₂O洗3-5次；组织中加入1ml TRIzol，用研磨棒磨碎组织至匀浆状态；

b)单层培养细胞：弃掉细胞培养基，PBS清洗细胞2遍，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，按10cm²/ml加入TRIzol，使用移液器吹打使细胞充分裂解；

(2)匀浆样品静室温放置5min，使核酸蛋白复合物充分分离；

(3)每ml样品中加入0.2ml氯仿，振荡15s，室温静置2min；

(4)4℃离心，12000g×15min，取上清至新的EP管中；

(5)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(6)4℃离心，12000g×10min，弃上清；

(7)每个EP管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清(尽量将管内残留液体吸净)；

(8)待RNA晾干后，加入适量的去离子水溶解；

(9)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及质量，-80℃保存。

4.2逆转录反应

(1)将高容量cDNA逆转录试剂盒放置冰上提前融化；

(2)将2μg的mRNA稀释至10μl Nuclease-free H₂O中；

(3)参照如下比例配制2×RT混合物，总体系为20μl：

(4)准备cDNA逆转录体系：每个反应管中加入上述准备好的10μl mRNA及10μl2×RT混合物，轻轻混匀后快速离心避免损失液体，冰上转移至PCR仪；

(5)按照下列温度进行逆转录：

(6)取出cDNA，-20℃保存备用。

4.3Real-time PCR

(1)按照以下比例配置反应体系(10μl)，每组设置3个重复孔：

(2)反应条件：

(3)基因表达量计算：2-ΔΔCT法计算基因表达差异。

5.流式细胞术

5.1 肿瘤细胞表面分子ILT4、PIR-B染色

(1)将待检测细胞系用胰酶消化后PBS洗2次，1500rpm离心5分钟，尽量去掉培养基；

(2)每个试验管中加入0.5-1×10⁶个细胞，用含5％BSA的PBS 100μl稀释一抗并重悬细胞，充分混匀(按1:100稀释)；

(3)室温反应1小时；

(4)PBS洗涤2次，1500rpm离心5分钟；

(5)按推荐浓度将细胞重悬于荧光标记的二抗中，室温避光孵育30分钟；

(6)离心洗涤细胞2-3次；

(7)用0.5ml PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

5.2 T细胞表面分子染色(荧光标记的一抗)

(1)每个试验管中加入0.5-1×10⁶个待检测细胞，用含5％BSA的PBS 100μl稀释荧光标记的一抗，充分混匀(抗体稀释浓度参照相应抗体说明书)；

(2)冰上避光孵育30分钟；

(3)PBS洗涤2次，1500rpm离心5分钟；

(4)用0.5ml PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

5.3 T细胞中胞浆分子p53、p21染色

(1)收集待检测T细胞，每个试验管中加入0.5-1×10⁶个细胞，离心去上清，PBS洗涤两次；

(2)加入4％多聚甲醛37℃固定10分钟，冰上1分钟；

(3)加入90％的冰甲醇，冰上孵育30分钟破膜；

(4)PBS离心洗涤2-3次；

(5)加入含5％BSA的PBS稀释的一抗100μl(一抗按1:200稀释)，重悬细胞并充分混匀，室温孵育1小时；

(6)PBS离心洗涤2-3次；

(7)加入100μl AF-488标记的抗兔二抗(1:1000稀释)，室温避光孵育30分钟；

(8)PBS离心洗涤2-3次后用0.5ml PBS重悬，流式细胞仪检测荧光强度。

5.4 T细胞中细胞因子染色

(1)将不同组织中的T细胞用PMA、ionomycin及GolgiStop处理5小时后进行后续染色；

(2)参考6.2中表面分子染色方法，先进行T细胞表面CD3/CD4/CD8分子染色；

(3)用含0.5％BSA的PBS洗两遍，加入100μl/孔BD cytofix/cytoperm液，4℃20min；

(4)加入100μl/孔1×perm/wash buffer(用dH₂O稀释10×perm/wash buffer)，离心洗涤一次；

(5)加入200μl/孔1×perm/wash buffer再洗2次；

(6)用上述1×perm/wash buffer液稀释抗体(抗体稀释比例参照相应说明书)，每孔50μl，4℃孵育30min；

(7)用200μl/孔1×perm/wash buffer洗涤2次；

(8)加入200μl PBS重悬，流式细胞仪检测。

5.5 T细胞中转录因子FOXP3染色

(1)参考6.2中表面分子染色方法，先进行T细胞表面CD3/CD4/CD8分子染色；

(2)用0.5％BSA的PBS洗两遍，加入1×Fix solution(用True nuclear fixdiluent稀释4×fix concentration)每孔200μl，室温避光孵育1小时；

(3)离心去除Fix solution，加入200μl/孔的1×perm液(用dH₂O稀释Truenuclear 10×Perm)，离心洗涤三次；

(4)用上述1×perm液稀释FOXP3抗体(按1:100稀释)，每孔50μl，室温避光孵育30min；

(5)用200μl/孔1×perm液离心液洗三次；

(6)加入PBS重悬，流式细胞仪检测。

6.Western blot检测

6.1细胞总蛋白的提取

(1)将待检测细胞用PBS洗两次，吸净PBS；

(2)根据细胞数量每孔细胞加入50-100μl含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，水平放于冰上裂解30min，在此期间每隔10min晃动孔板1次；

(3)用细胞刮刀收集已裂解的细胞，超声仪裂解细胞2分钟；后12000g×4℃离心15min；

(4)将离心后的上清转移至新的EP管中，用蛋白变性仪变性蛋白100℃×10分钟，然后利用酶标仪测定蛋白浓度；

(5)将每组内所有蛋白样品用PBS稀释至相同浓度，后加入1/4体积的4×Loadingbuffer后-80℃保存备用。

6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)用去离子水仔细清洗配胶的玻璃板，干燥备用；

(2)用夹板固定好双层玻璃板，将配置好的SDS-PAGE分离胶快速加入玻璃板中，并使用ddH₂O封闭。分离胶(10％)配置方法如下：

(3)等分离胶凝固后，倒掉并吸水纸吸净上层ddH₂O，快速加入浓缩胶，然后垂直插入梳子(注意不要产生气泡)，待其凝固。浓缩胶(5％)配置方法如下：

(4)上样：将含胶玻璃板固定于电泳夹板内，放于电泳槽中，在内外室分别加入适量的1×电泳缓冲液。小心垂直拔出上样梳，每孔加入10-20μl的蛋白样品或蛋白Marker；

(5)电泳：先设定电压70V使样品充分浓缩，待Marker进入分离胶后，增加电压至100V，至蛋白Marker清晰显示出所有条带，停止电泳；

(6)转膜：电泳结束后切割出含有目的条带的凝胶，剪一块稍大于胶条的PVDF膜，浸泡于甲醇中1min激活，做好正反面标记，再浸泡于4℃预冷的1×转膜缓冲液中。然后依次将海绵、厚滤纸、薄滤纸、凝胶、PVDF膜、薄滤纸、厚滤纸、海绵置于转膜夹上，卡进转移槽中。放置时注意正负极，PVDF膜靠近电源正极，凝胶靠近电源负极。设置恒压90V，根据目的蛋白分子量大小，4℃冷库内转膜150-180分钟；

(7)封闭：转膜结束后取出PVDF膜，放入TBST配置的5％脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h；

(8)一抗孵育：用1×TBST稀释一抗，将对应位置的PVDF膜分别放入相应的一抗稀释液内，4℃震荡孵育过夜，一抗稀释浓度参照不同抗体说明书；

(9)二抗孵育：一抗孵育结束后，拿出PVDF膜，室温复温1小时，TBST震荡洗涤3×10min。然后把PVDF膜放入含对应的二抗稀释液中，室温孵育1h；

(10)显色：拿出PVDF膜，1×TBST震荡洗涤3×10min，将配好的ECL发光工作液均匀涂在PVDF膜上，2-3分钟后去掉发光液，将PVDF膜放置于保鲜膜上封好，置入显色盒内压片，5-10分钟后至暗室内显色仪显色。

6.3相关缓冲液配方

(1)5×电泳缓冲液：Tris-HCL 15.1g+甘氨酸70.2g+SDS 5g；dH₂O定容至1L。

(2)10×转膜液：Tris HCL 30.3g+甘氨酸144.1g；dH₂O定容至1L。

(3)1×转膜液：10×转膜液100ml+甲醇200ml；dH₂O定容至1L，充分混匀后预冷至4℃备用。

(4)10×TBS：Tris HCl 121.1g+NaCl 87.25g；dH₂O定容至1L，室温保存。

(5)1×TBST：10×TBS 100ml+Tween 1ml；dH2O定容至1L，室温保存。

7.老化相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色

7.1染色步骤

(1)收获T细胞并PBS洗两次，1000rpm离心5分钟，去上清后PBS重悬，使细胞浓度为2-5×10⁶/ml；

(2)取5μl细胞悬液，用枪头轻轻涂抹在在玻片上，注意动作轻柔，以免细胞破碎；

(3)等水分晾干后，4％多聚甲醛50μl固定3-5min；

(4)甩掉多聚甲醛，PBS轻轻洗涤2次；

(5)充分晾干载玻片后加入100μl显色液，37℃恒温箱避光孵育24小时；

(6)用水轻轻洗涤玻片，盖上盖玻片，400倍放大显微镜观察，细胞浆内蓝黑色颗粒为染色阳性细胞。

7.2 SA-β-Gal显色液的配制

8.脂滴的油红染色(Oil red O staining)

(1)将不同处理的肿瘤细胞胰酶消化后用PBS重悬；

(2)将细胞按合适的密度涂在载玻片上，2％多聚甲醛室温固定30分钟；

(3)配制油红染液：3体积Oil red O+2体积dH₂O，混合均匀后室温放置10min；0.45μl滤膜过滤油红染液后备用；

(4)去掉载玻片上的福尔马林，用dH₂O洗2-3次；

(5)加60％的异丙醇(用dH₂O稀释)，2-5min；

(6)去掉异丙醇，在载玻片上滴加50μl油红染液，室温染色5min；

(7)60％isopropenal快速冲洗片子1-2次，每次2-3秒，然后用dH₂O洗净异丙醇，保持细胞湿润，加盖玻片观察计数阳性细胞。细胞浆内红色或红黄色圆形颗粒为脂滴染色阳性。

9.过继性T细胞转移治疗模型

因小鼠恶性黑色素瘤细胞B16F0自身表达肿瘤特异性抗原肽gp100，而PmelCD8⁺T细胞转基因表达gp100特异性TCR，可以特异性杀伤B16F0肿瘤细胞。因此本模型中我们选择B16F0种植小鼠。6-8周大小的C57BL/6J小鼠小鼠皮下注射PIR-B过表达/基因敲除的小鼠恶性黑色素瘤细胞B16F0(2×10⁵细胞/只)。每3天测量肿瘤长、短径评估大小。第8天当肿瘤生长至5mm左右时，用XRAD320辐射器照射小鼠(500cGy/只)消除小鼠自身T细胞。第9天时尾静脉注入小鼠CD3(2μg/ml)及CD28(1μg/ml)抗体预激活的Pmel CD8⁺T细胞2×10⁶/只)。每3天用游标卡尺测量肿瘤长、短径评估大小。5周后当肿瘤生长至最大径20mm左右时，CO₂处死小鼠，肿瘤称重并评估大小；免疫磁珠分选外周血、脾脏及肿瘤组织中过继性CD8⁺T细胞进行后续的SA-β-Gal染色及流式细胞术检测。

10.统计分析

统计分析采用GraphPad Prism 5软件完成。数据采用均数±SD表示。多组间比较采用单向ANOVA方差分析，两组间比较采用Student’s t检验完成。如果样本量过小且不符合正态分布，采用非参t检验统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

实验结果

1.肿瘤源性ILT4/PIR-B调控了人/小鼠肿瘤细胞脂肪酸合成酶的表达。

由于糖脂代谢是酶促反应过程，我们首先检测了ILT4对肿瘤细胞糖、脂代谢关键酶表达的影响。选择之前的NSCLC(A549及H1299)、乳腺癌(ZR751)、恶性黑色素瘤(M628)及前列腺癌(PC-3)细胞株，用500ng/ml的ILT4中和抗体(anti-ILT4)或同型对照抗体(Isotype)处理细胞48小时，然后采用real-timePCR检测葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢过程中关键酶的表达变化。结果发现，anti-ILT4对肿瘤细胞葡萄糖摄取、糖酵解、胆固醇代谢等相关酶基因表达无明显影响(图1A)，但是显著下调了脂肪酸合成关键酶ACC1与FASN的基因表达(图1B)。之后我们过表达/敲除了ILT4相对高(A549、ZR751、M628)/低(H1650、MCF7、M628)表达细胞株中的ILT4，再次检测了ACC1及FASN的基因表达变化。相应的，敲除/过表达肿瘤细胞ILT4也分别下/上调了ACC1与FASN的基因表达水平(图1C，D)。同时我们选择相对低/高表达PIR-B(小鼠中ILT4同源基因)的小鼠肿瘤细胞E0771/B16F0，分别过表达/敲除肿瘤细胞PIR-B进行了脂代谢酶基因表达水平的检测。结果发现，PIR-B的过表达/敲除同样相应的上/下调了肿瘤细胞中脂代谢酶的表达(图1E，F)。综合上述结果，肿瘤源性ILT4可能通过调控脂肪酸合成的关键酶影响其脂质代谢过程。

2.肿瘤源性ILT4调控了细胞内中性脂肪的合成。

由于细胞内脂肪酸通常通过酶促反应形成甘油三酯并储存于脂滴中[30]，我们对上述anti-ILT4处理及ILT4过表达/敲除的肿瘤细胞进行了脂滴的油红染色以明确ILT4对肿瘤细胞中脂代谢产物的调控。结果显示，与同型对照组比较，anti-ILT4处理72小时显著减少了NSCLC(A549及H1299)、乳腺癌(ZR751)、恶性黑色素瘤(M628)及前列腺癌(PC-3)肿瘤细胞中脂滴的形成(图2A，B)；同样，ILT4高(A549，ZR751，M628)/低(H1650，MCF7，M628)表达的肿瘤细胞中ILT4基因敲除/过表达分别抑制/增加了细胞中脂滴的形成(图2C，D)。上述结果提示ILT4促进了肿瘤细胞中脂肪酸的合成与储存。

3.肿瘤源性ILT4通过调控脂肪酸合成诱导了T细胞的老化。

为评估ILT4调控的肿瘤细胞脂肪酸合成是否介导了T细胞的免疫老化，我们用脂肪酸合成抑制剂C75(FASN抑制剂)预处理了ILT4过表达的肿瘤细胞，之后进行了肿瘤细胞与T细胞的共培养实验。我们选择ILT4相对低表达的细胞株H1650、MCF7、M628及PC-3，转染ILT4过表达/对照慢病毒，同时采用5μM的C75进行处理。转染48小时后完全洗净C75，进行上述肿瘤细胞与OKT-3预活化的CD4⁺/CD8⁺T细胞的共培养。之后的SA-β-Gal染色结果显示C75处理显著逆转了ILT4过表达诱导的CD4⁺及CD8⁺T细胞的老化(图3A，B)。由此我们可以得出结论：ILT4上调的肿瘤细胞脂肪酸合成介导了T细胞的老化。

4.ILT4活化了肿瘤细胞MAPK ERK1/2信号通路。

为研究ILT4调控肿瘤细胞脂肪酸合成及T细胞老化的信号通路，我们首先筛选了ILT4调控的下游信号通路分子。我们分别选择了ILT4相对高(A549，ZR751及M628)/低表达(H1650，MCF7，M628及PC-3)的肿瘤细胞株，慢病毒转染敲除/过表达肿瘤细胞ILT4，72小时后采用western blot检测了常见代谢通路分子包括AKT/mTOR、AMPK、MAPK、STAT1、STAT3、NF-κB等的变化。结果发现，肿瘤细胞中ILT4过表达/敲除分别显著上/下调了ERK1/2的磷酸化水平(图4A，B)，但未调控P38、JNK、mTOR、AMPK、STAT1、STAT3、NF-κB等信号通路分子的磷酸化。

5.ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸合成。

为确认MAPK ERK1/2信号通路是否参与肿瘤细胞的脂肪酸合成，我们用MEK抑制剂U0126预处理ILT4过表达的肿瘤细胞，并进行了脂肪酸合成相关酶基因表达及脂滴形成的检测。首先我们选择ILT4低表达的肿瘤细胞株H1650、MCF7及M628，用10μM的MEK抑制剂U0126预处理24小时，然后慢病毒感染过表达ILT4，同时继续用10μM的U0126抑制ERK1/2通路的活化。48小时/72小时后收集细胞分别进行real-time PCR检测/细胞的油红染色。结果显示，U0126的预处理逆转了ILT4上调的ACC1与FASN基因表达(图5A)以及细胞内脂滴的形成(图5B)。

6.ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路调控了T细胞的老化。

之后我们检测了ERK1/2信号通路阻滞对肿瘤诱导的T细胞老化的影响。我们选择ILT4低表达的肿瘤细胞株H1650、MCF7、M628及PC-3，用10μM的MEK抑制剂U0126预处理24小时，然后慢病毒感染过表达ILT4，同时继续用10μM的U0126抑制ERK通路的活化。48小时后完全洗净U0126，进行上述肿瘤细胞与OKT-3预活化的CD4⁺及CD8⁺T细胞的共培养。结果显示，U0126处理能够逆转ILT4过表达诱导的CD4⁺及CD8⁺T细胞的老化(图6A，B)。提示肿瘤源性ILT4通过激活MAPK ERK1/2信号通路上调了肿瘤细胞脂肪酸的合成，进而诱导T细胞的老化。

7.小鼠体内PIR-B阻断提高了过继性T细胞治疗疗效。

为研究PIR-B阻断是否可以逆转ACT耐药，提高其抗肿瘤免疫应答，我们采用小鼠恶性黑色素瘤B16F0细胞株(gp100高表达)及Pmel-CD8⁺T细胞(具有gp-100特异性杀伤能力)构建了小鼠恶性黑色素瘤的过继性T细胞治疗模型。首先，野生型C57BL/6小鼠皮下注射PIR-B敲除/对照的B16F0肿瘤细胞(2×10⁵/只)，在肿瘤生长的第8天，当肿瘤大小达5-6mm时，X线照射小鼠(500cGy/只×1次)去除自身的T细胞。第9天时将小鼠CD3抗体及CD28抗体预活化的CD8⁺Pmel T细胞(2×10⁶/只)通过尾静脉注射至小鼠体内，之后定期观察肿瘤生长。每3天测量肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积并绘制生长曲线。待肿瘤最大径生长至2cm时，CO₂处死小鼠，剥离肿瘤进行称重。结果显示，gp100特异性T细胞的过继转移明显减慢了B16F0的体内生长，而B16F0中PIR-B阻滞进一步抑制了肿瘤的生长(图7A-C)。提示肿瘤细胞PIR-B阻滞可以提高过继性T细胞治疗疗效。

8.PIR-B阻断逆转了肿瘤特异性CTLs的老化。

待小鼠处死后，我们分别制备外周血(BL)、肿瘤组织、淋巴结(LN)及脾脏(SP)的单细胞悬液，分离不同组织中CD8⁺T细胞进行SA-β-Gal染色，结果发现，移植瘤组外周血中SA-β-Gal染色阳性的CD8⁺T细胞较正常小鼠显著增加(图8A)，提示肿瘤可以体内诱导外周血T细胞的老化。而肿瘤细胞PIR-B敲除显著减少了外周血及TILs中老化的CD8⁺T细胞数量(图8B)，提示PIR-B阻断可以逆转肿瘤特异性T细胞的老化及其介导的免疫逃逸。但是，肿瘤移植及肿瘤细胞PIR-B阻断均未影响淋巴结(LN)及脾脏(SP)中CD8⁺T细胞免疫老化(图8C,D)，提示外周血及肿瘤浸润性T细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥最主要的作用。

9.PIR-B阻断增强了过继转移的肿瘤特异性CTLs的杀伤功能。

为验证上述不同组织中CD8⁺T淋巴细胞的免疫杀伤效应，我们采用流式细胞术检测了上述不同组织中分离的CD8⁺T细胞中杀伤性细胞因子IFN-γ、GranzymeB及Perforin的表达。结果发现，肿瘤细胞PIR-B阻断显著提高了外周血及TILs中IFN-γ的水平，但是对GranzymeB与Perforin的表达无显著影响。而淋巴结及脾脏中上述细胞因子的表达也未见明显差异，与我们的SA-β-Gal染色结果相一致。

结论

肿瘤源性ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸的合成及脂滴形成，进而诱导CD4⁺/CD8⁺T细胞的老化；这一发现为恶性肿瘤免疫治疗提供了新的信号及代谢靶点。

肿瘤细胞ILT4/PIR-B阻滞体内逆转了过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化，增强了其杀伤能力与抗肿瘤免疫应答。ILT4阻滞与ACT的联合免疫治疗是克服免疫耐受、提高ACT临床获益极有潜力的治疗策略。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下a)-g)至少一种中的应用：

a)抑制肿瘤细胞脂肪酸的合成；

b)抑制肿瘤脂滴形成；

c)抑制MAPK ERK1/2信号通路；

d)逆转ILT4诱导的T细胞免疫老化；

e)逆转过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化；

f)改善免疫微环境对肿瘤特异性T细胞的抑制效应；

g)减缓或克服ACT对实体肿瘤的耐药性。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质，和实施过继性T细胞治疗的物质。

4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述ACT为CAR-T或TCR-T。

5.如权利要求2所述的所述组合物，其特征在于，所述组合物用于肿瘤治疗，优选为肿瘤免疫治疗。

6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有如下a)-g)至少一种中的应用：

a)抑制肿瘤细胞脂肪酸的合成；

b)抑制肿瘤脂滴形成；

c)抑制MAPK ERK1/2信号通路；

d)逆转ILT4诱导的T细胞免疫老化；

e)逆转过继转移的肿瘤特异性CTLs的免疫老化；

f)改善免疫微环境对肿瘤特异性T细胞的抑制效应；

g)减缓或克服ACT对实体肿瘤的耐药性。

7.如权利要求5或6所述的组合物，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌。

8.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抑制ILT4基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括但不限于蛋白特异的抗体、针对ILT4 mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质；进一步的，所述抗体为人抗体或鼠抗体。

9.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含载体、赋形剂及稀释剂。

10.权利要求1或2所述应用，或权利要求3-9任一项所述组合物，其特征在于，ILT4为肿瘤源性ILT4。

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