CN110913884B - 抑制dna依赖蛋白激酶催化亚基的药物 - Google Patents

Abstract

使用血管内皮抑制素联合诱导DNA双链断裂的治疗方案治疗肿瘤或癌症的方法和药物。所述的方法和组合物用于治疗P53功能缺失的肿瘤或癌症，或者P53功能正常的肿瘤或癌症。

Description

抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基的药物

技术领域

本发明涉及治疗肿瘤或癌症的方法和药物，特别是通过抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)治疗肿瘤或癌症的方法和药物。

背景技术

肿瘤是一种多因素作用、多因素参与和多阶段发展的疾病，化学治疗在肿瘤的治疗中占有重要地位。然而，肿瘤细胞极易对化疗药物产生耐药性，严重影响了癌症患者的治疗效果。常用的化疗药物如烷化剂、铂类复合物和拓扑异构酶抑制剂类等均以DNA作为作用靶点，通过造成DNA损伤诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞，因此DNA损伤修复被认为是肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性的一个重要原因。化疗药物引起的DNA损伤有多种形式，包括碱基损伤(Base damage)、单链断裂(Single-strand break，SSB)、双链断裂(Double-strandbreak，DSB)等等，其中以DSB损伤最为严重。在哺乳动物细胞中，DSB损伤修复有2种主要的形式：同源重组(Homologous Recombination，HR)和非同源末端连接(Nonhomologous EndJoining，NHEJ)。HR修复过程以姐妹染色单体为模板，对受损的DNA双链进行精确修复，但仅能在细胞周期中的S和G2期进行。相对于HR，NHEJ是一种更为保守的修复机制，可以在细胞周期的任何一个阶段进行。这种修复不需要同源的模板，利用蛋白质的相互作用，直接将受损末端相连，是哺乳动物细胞中修复DSB的主要机制。NHEJ的基本过程是：双链断裂产生后，Ku70/Ku80结合到DSB损伤位点的末端，随后Ku招募DNA-PKcs共同构成DNA-PK复合物，启动NHEJ修复机制。DNA-PKcs通过自磷酸化和磷酸化下游蛋白传递修复信号，DNA末端加工蛋白(核酸酶、聚合酶等)将断裂末端加工成适合连接的结构，最后连接酶Ligase IV-XRCC4-XLF复合体执行连接功能。其中DNA-PKcs是DNA-PK复合物的催化亚基，属于磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶家族(PIKK)的成员，在NHEJ修复中起到核心作用。研究表明抑制DNA-PKcs可以极大地增强肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性(Elaine Willmore，et al.Blood.2004；103：4659-4665，Yan Zhao，et al.Cancer Res 2006；66(10)：5354-62)。针对DNA-PK抑制剂也在不断开发之中，部分DNA-PK抑制剂已进入临床试验。DNA修复抑制剂与化疗药物联合使用治疗肿瘤是一个发展前景广阔的领域。

P53蛋白被认为是迄今为止最著名的肿瘤抑制因子之一，在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的调控作用，参与细胞周期阻滞、细胞衰老、DNA损伤修复和细胞凋亡等多个生命活动过程。研究表明，在化疗药物的刺激下，野生型P53可以通过调控一系列下游靶基因，激活caspase家族蛋白，引发肿瘤细胞凋亡(Liz J Valente，et al.BioDiscovery 2013；8：3)；然而肿瘤中p53基因异常发生率较高，包括基因缺失或突变。异常的p53基因常常导致其正常功能的丧失，进而降低了肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。有研究表明，P53功能正常的肿瘤相比P53功能缺失的肿瘤对于化疗药物有更好的响应效果(Toshiyuki Harada，etal.Cancer Sci 2003；94：394-399)。

血管内皮抑制素(Endostatin，ES)是美国哈佛大学Folkman教授所领导的研究小组于1997年发现的一种内源性新生血管生成抑制因子。经鉴定是胶原XVIII C-末端片段，它在体外体内试验中显示出抑制激活的血管内皮细胞增殖、抑制新血管的生成、抑制肿瘤的形成与转移等活性，而且没有细胞毒性，不产生耐药性(O′Reilly MS et al.Cell 1997；88：277-285；Boehm T.et al Nature 1997；390：404-407)。后续大量研究发现，Endostatin还具有多种生物学活性，包括有抑制淋巴管内皮细胞增殖、迁移和淋巴管生成，抑制脂肪细胞分化和胰岛素耐受等等(Zhuo W et al.J Pathol 2010；222，249-260，Wang H et alDiabetes 2015；64，2442-2456)。但是到目前为止，尚未有Endostatin调控DNA损伤修复通路的相关报道。

发明概述

本发明提供使用血管内皮抑制素联合诱导DNA双链断裂的治疗方案治疗肿瘤或癌症的方法和药物。本发明的方法和组合物可用于治疗P53功能缺失的肿瘤或癌症，或者P53功能正常的肿瘤或癌症。

根据本发明的一个方面，提供药物组合物，包含血管内皮抑制素和化疗药物，其中所述化疗药物是诱导DNA双链断裂的化疗药物。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的载体。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与ES的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供联用药物，包括血管内皮抑制素和化疗药物，其中所述化疗药物是诱导DNA双链断裂的化疗药物。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述联用药物用于治疗肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素和所述化疗药物同时给药或顺序给药。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供药盒，包括：a)第一种药物，其是血管内皮抑制素或含有血管内皮抑制素的药物组合物；b)第二种药物，其是化疗药物，所述化疗药物是诱导DNA双链断裂的化疗药物。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述药盒用于治疗肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供增加细胞对于诱导DNA双链断裂的治疗方案的敏感性的方法，包括使细胞与血管内皮抑制素接触的步骤，其中所述细胞是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞或癌症细胞。

在一些实施方案中，所述肿瘤细胞或癌症细胞是非小细胞肺癌细胞或黑色素瘤细胞。

在一些实施方案中，该方法在体内或体外进行。

在一些实施方案中，所述使细胞与血管内皮抑制素接触的步骤与所述诱导DNA双链断裂的治疗方案同时进行或顺序进行。

在一些实施方案中，在进行所述诱导DNA双链断裂的治疗方案之前使细胞与血管内皮抑制素接触。

在一些实施方案中，在进行所述诱导DNA双链断裂的治疗方案之后使细胞与血管内皮抑制素接触。

在一些实施方案中，所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是放射性治疗和/或施用化疗药物。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供血管内皮抑制素在制备与诱导DNA双链断裂的治疗方案联用用于治疗肿瘤或癌症的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述诱导DNA双链断裂的治疗方案的治疗用剂量小于单独使用该治疗方案时的治疗用剂量。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是放射性治疗和/或化疗药物。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供在受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，包括：

a)给受试者进行诱导DNA双链断裂的治疗方案；以及

b)给受试者施用血管内皮抑制素。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述诱导DNA双链断裂的治疗方案的治疗用剂量小于单独使用该治疗方案时的治疗用剂量。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述使细胞与血管内皮抑制素接触的步骤与所述诱导DNA双链断裂的治疗方案同时进行或顺序进行。

在一些实施方案中，在进行所述诱导DNA双链断裂的治疗方案之前给受试者施用血管内皮抑制素。

在一些实施方案中，在进行所述诱导DNA双链断裂的治疗方案之后给受试者施用血管内皮抑制素。

在一些实施方案中，所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是放射性治疗和/或化疗药物。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供诱导细胞凋亡的方法，包括：

a)诱导细胞产生DNA双链断裂；以及

b)使细胞与血管内皮抑制素接触。

在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤或癌症细胞。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症细胞是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症细胞是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述诱导细胞产生DNA双链断裂的步骤的应用剂量小于单独使用该治疗方案时的应用剂量。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述诱导细胞产生DNA双链断裂的步骤与所述使细胞与血管内皮抑制素接触的步骤同时进行或顺序进行。

在一些实施方案中，在诱导细胞产生DNA双链断裂之前使细胞接触血管内皮抑制素。

在一些实施方案中，在诱导细胞产生DNA双链断裂之后使细胞接触血管内皮抑制素。

在一些实施方案中，通过对细胞进行放射照射或使细胞接触化疗药物诱导细胞产生DNA双链断裂。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述方法在体外或体内进行。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供血管内皮抑制素在制备诱导细胞凋亡的药物中的应用，所述细胞被诱导产生DNA双链断裂。

在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤或癌症细胞。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症细胞是P53功能缺失的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症细胞是P53功能正常的。

在一些实施方案中，所述肿瘤或癌症是非小细胞肺癌或黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述细胞通过放射照射或接触化疗药物被诱导产生DNA双链断裂。

在一些实施方案中，所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

根据本发明的另一个方面，提供抑制生物样品中的DNA-PKcs活性的方法，包括使血管内皮抑制素与所述生物样品接触。

在一些实施方案中，所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

附图说明

图1A：考马斯亮蓝染色显示SDS-PAGE检测肿瘤细胞中与Endostatin结合的蛋白。CNBr表示溴化氢活化琼脂糖凝胶4B亲和介质。

图1B：免疫印迹检测肿瘤细胞中与Endostatin结合的蛋白。

图1C：免疫共沉淀检测肿瘤细胞中Endostatin与DNA-PKcs的相互作用。

图2A：免疫印迹检测发现Endostatin抑制化药诱导的H1299细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

图2B：免疫印迹检测发现Endostatin抑制化药诱导的A549细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

图3A：免疫印迹检测发现Endostatin延缓H1299细胞中DNA-PKcs介导的DNA损伤修复。

图3B：免疫印迹检测发现Endostatin延缓A549细胞中DNA-PKcs介导的DNA损伤修复。

图4A：Endostatin协同Etoposide促进H1299细胞的凋亡依赖于DNA-PKcs的存在。**代表P＜0.01；ns，无显著差异。

图4B：Endostatin协同Etoposide促进A549细胞的凋亡依赖于DNA-PKcs的存在。***代表P＜0.001；ns，无显著差异。

图5A：Endostatin协同Etoposide抑制H1299-NC细胞的活性。*代表P＜0.05；***代表P＜0.001。

图5B：Endostatin不能增强Etoposide对H1299-P53细胞活性的抑制效果。

图5C：Endostatin不能增强Etoposide对A549-NC细胞活性的抑制效果。

图5D：Endostatin协同Etoposide抑制A549-shP53细胞的活性。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01。

图6A：Endostatin协同Etoposide抑制H1299-NC细胞的生存。***代表P＜0.001。

图6B：Endostatin不能增强Etoposide对H1299-P53细胞生存的抑制效果。ns，无显著差异。

图6C：Endostatin不能增强Etoposide对A549-NC细胞生存的抑制效果。ns，无显著差异。

图6D：Endostatin协同Etoposide抑制A549-shP53细胞的生存。***代表P＜0.001。

图7A：Endostatin协同Etoposide促进H1299-NC细胞的凋亡。***代表P＜0.001。

图7B：Endostatin不能增强Etoposide对H1299-P53细胞凋亡的促进效果。ns，无显著差异。

图7C：Endostatin不能增强Etoposide对A549-NC细胞凋亡的促进效果。ns，无显著差异。

图7D：Endostatin协同Etoposide抑制A549-shP53细胞的凋亡。***代表P＜0.001。

图8A：Endostatin协同Doxorubicin抑制H1299-NC细胞的活性。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01。

图8B：Endostatin不能增强Doxorubicin对H1299-P53细胞活性的抑制效果。

图8C：Endostatin不能增强Doxorubicin对A549-NC细胞活性的抑制效果。

图8D：Endostatin协同Doxorubicin抑制A549-shP53细胞的活性。*代表P＜0.05；***代表P＜0.001。

图9A：Endostatin协同Etoposide抑制MDA-MB-435S细胞的活性。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01。

图9B：Endostatin不能增强Etoposide对A375细胞活性的抑制效果。

图10A：免疫印迹检测发现Endostatin抑制DNA-PKcs对细胞损伤的修复，促进H1299-NC细胞的凋亡通路激活和DNA-PKcs的降解。

图10B：免疫印迹检测发现Endostatin对Etoposide诱导的H1299-P53细胞的DNA损伤、凋亡通路激活以及DNA-PKcs的降解没有影响。

图10C：免疫印迹检测发现Endostatin对Etoposide诱导的A549-NC细胞的DNA损伤、凋亡通路激活以及DNA-PKcs的降解没有影响。

图10D：免疫印迹检测发现Endostatin抑制DNA-PKcs对细胞损伤的修复，促进A549-shP53细胞的凋亡通路激活和DNA-PKcs的降解。

图11A：Endostatin协同Etoposide上调H1299-NC细胞中促凋亡分子BAX，NOXA，PUMA，P21的mRNA表达水平。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01；***代表P＜0.001。

图11B：Endostatin对Etoposide上调的H1299-P53细胞中促凋亡分子BAX，NOXA，PUMA，P21的mRNA表达水平没有影响。ns，无显著差异。

图11C：Endostatin对Etoposide上调的A549-NC细胞中促凋亡分子BAX，NOXA，PUMA，P21的mRNA表达水平没有影响。ns，无显著差异。

图11D：Endostatin协同Etoposide上调A549-shP53细胞中促凋亡分子BAX，NOXA，PUMA，P21的mRNA表达水平。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01。

图12A：Endostatin增强Etoposide对H1299-NC肿瘤生长的抑制作用。**代表P＜0.01。

图12B：Endostatin不能增强Etoposide对H1299-P53肿瘤生长的抑制作用。ns，无显著差异。

图12C：Endostatin不能增强Etoposide对A549-NC肿瘤生长的抑制作用。ns，无显著差异。

图12D：Endostatin增强Etoposide对A549-shP53肿瘤生长的抑制作用。**代表P＜0.01。

图13A：Endostatin与Etoposide联合使用对延长H1299荷瘤小鼠生存期具有协同效应。*代表P＜0.05。

图13B：Endostatin与Etoposide联合使用不能进一步延长Etoposide单独用药组A549荷瘤小鼠生存期。ns，无显著差异。

图14A：使用免疫荧光方法发现Endostatin协同Etoposide抑制H1299-NC肿瘤的增殖和DNA-PKcs的表达水平。*代表P＜0.05；**代表P＜0.01。

图14B：使用免疫荧光方法发现Endostatin不能增强Etoposide对H1299-P53肿瘤的增殖和DNA-PKcs的表达水平的抑制作用。ns，无显著差异。

图14C：使用免疫荧光方法发现Endostatin不能增强Etoposide对A549-NC肿瘤的增殖和DNA-PKcs的表达水平的抑制作用。ns，无显著差异。

图14D：使用免疫荧光方法发现Endostatin协同Etoposide抑制A549-shP53肿瘤的增殖和DNA-PKcs的表达水平。***代表P＜0.001。

图15A：免疫印迹检测发现ZBP-Endostatin以及PEG-Endostatin抑制化药诱导的H1299细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

图15B：免疫印迹检测发现ZBP-Endostatin以及PEG-Endostatin抑制化药诱导的A549细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

具体实施方式

本发明发现血管内皮抑制素可以直接作用于肿瘤细胞并调节肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。在体外细胞学实验中发现血管内皮抑制素可以显著增强化疗药物对于P53缺失型肿瘤细胞活性和细胞集落生成能力的抑制作用，促进化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。同时，在小鼠异种移植瘤模型中，血管内皮抑制素可以显著增强化疗药物对P53缺失的非小细胞肺癌移植瘤的生长抑制作用，延长荷瘤小鼠的生存期。

本发明中，为了探索血管内皮抑制素调控肿瘤细胞化疗敏感性的机制，通过筛选肿瘤细胞中与血管内皮抑制素相互作用的蛋白，发现血管内皮抑制素可以与DNA-PKcs特异性相互作用。DNA-PKcs是哺乳动物细胞中非同源末端连接途径的关键蛋白，参与细胞中DNA双链断裂的损伤修复。血管内皮抑制素与DNA-PKcs的相互作用可以抑制其活性进而抑制DNA损伤修复。P53缺失型肿瘤细胞对化疗药物表现出抗性，细胞的存活依赖于DNA-PKcs介导的DNA修复过程。在这种情况下，血管内皮抑制素通过抑制DNA-PKcs的活性，造成细胞中DNA损伤的累积，进而诱导细胞凋亡，增强化疗药物的治疗效果。而具有正常P53功能的细胞对于化疗药物较为敏感，单独化疗药物处理下P53就会激活Caspase-3介导的细胞凋亡，而DNA-PKcs作为Caspase-3的底物，也会在这个过程中被剪切而减少，因此利用血管内皮抑制素抑制DNA-PKcs的效果就十分有限。

血管内皮抑制素在P53缺失型肿瘤细胞中的作用机理可以如下理解：由于P53可以通过调控一系列下游靶基因，激活caspase家族蛋白，引发肿瘤细胞凋亡，因此P53缺失型的肿瘤细胞具有较高的凋亡阈值，在DNA损伤诱导剂如依托泊苷刺激下，DNA-PKcs信号通路被激活，通过非同源末端连接途径介导DNA损伤修复。在这种情况下，血管内皮抑制素可直接与DNA-PKcs结合并抑制其活性，导致DNA损伤在细胞中累积，细胞从DNA修复转变为走向凋亡，此时Caspase通路激活又导致DNA-PKcs降解，进一步阻断DNA修复和促进细胞死亡。相比之下，在DNA损伤时，P53功能正常的肿瘤细胞具有较低的凋亡阈值，P53会引发凋亡相关效应因子的激活，在这种情况下，在凋亡的早期DNA-PKcs就会被P53通路所激活的Caspase-3所降解，这又进一步削弱DNA修复，因此P53信号通路本身就能形成一个反馈调节回路。通过血管内皮抑制素靶向P53功能正常的肿瘤细胞中的DNA-PKcs来增加化疗敏感性的效果并不理想。

因此，本发明实质上是基于发现血管内皮抑制素可以直接与DNA-PKcs结合并抑制其活性，即发现血管内皮抑制素是DNA-PKcs的抑制剂。对于P53缺失型的细胞，当其通过任何治疗方法(例如化疗药物或放射治疗)被诱导DNA损伤时，血管内皮抑制素都可以通过上述机理促进细胞凋亡，从而增加细胞对于该治疗方法的敏感性。即使对于P53功能正常的细胞，血管内皮抑制素的使用也可以减少化疗药物的使用剂量或放射治疗的剂量，此时虽然因化疗药物的使用剂量或放射治疗的剂量减少而使得细胞DNA损伤减少，但是血管内皮抑制素可以抑制DNA-PKcs的活性，从而促进DNA损伤在细胞中积累，促进细胞凋亡，因此可以在化疗药物的使用剂量或放射治疗的剂量减少的情况下还可以达到原剂量的效果，从而可以降低化疗药物或放射治疗的副作用，提高其依从性。

本文所述的“血管内皮抑制素”(Endostatin，ES)使用其最广泛的含义，包括具有天然血管内皮抑制素活性，例如抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成活性的各种蛋白。

本文所述的“血管内皮抑制素”可以是天然血管内皮抑制素，优选是天然人血管内皮抑制素，但不限于此，例如，还可以是来自于其它哺乳动物，例如小鼠、大鼠、猪、狗、兔、绵羊、山羊、猫等的天然血管内皮抑制素。所述血管内皮抑制素可以是从天然来源纯化的，或是重组蛋白。

本发明中所使用的天然人血管内皮抑制素的序列例如可以是：

MHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK；其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

本文所述的“血管内皮抑制素”还可以是天然血管内皮抑制素的功能性变体，例如工程化的功能性变体，它与天然血管内皮抑制素相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，并具有基本相同的生物学功能，例如抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的活性。

本文使用的术语“功能性变体”包括在氨基酸序列中含有一个或多个(例如1-5个、1-10个或者1-15个，具体地，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个甚至更多个)氨基酸的取代、缺失或添加的血管内皮抑制素的突变体，并且所述突变体具有与血管内皮抑制素类似的抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的生物学活性。血管内皮抑制素的“功能性变体”的生物学活性例如可以是天然血管内皮抑制素，例如天然人血管内皮抑制素的30％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高或90％或更高。所述“功能性变体”可以是自然产生的突变体，也可以是人工突变体，例如通过定点诱变获得的突变体，或通过基因重组方法产生的突变体。

所述“功能性变体”的生物学活性可以通过本领域众所周知的用于检测血管内皮抑制素活性的方法来检测。例如可以选择HMEC细胞，采用Migration(Tranwell Assay)方法分析功能性变体对HMEC细胞迁移的抑制率，计细胞数反映蛋白活性(可参考Luo yongzhang等，Endostatin inhibits tumourlymphangiogenesis and lymphatic metastasis viacell surface nucleolin on lymphangiogenic endothelial cells(J Pathol 2010；222：249-260))。

在本发明的一些实施方案中，所述“血管内皮抑制素”可以是天然人血管内皮抑制素的功能性变体，例如ZBP-Endostatin(商品名为恩度，Endostar)，它是在天然人ES的N-末端添加了9个额外氨基酸(MGGSHHHHH)而得到的ES变体，以便于增加可溶性表达和方便纯化(Fu Y et al.Biochemistry 2010，49，6420-6429，通过合并的方式将其全部内容合并入本文)。ZBP-Endostatin的氨基酸序列是：

MGGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK；当其由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

血管内皮抑制素功能性变体的其它实例还包括PCT国际申请PCT/CN2012/081210中公开的那些血管内皮抑制素突变体，如ES006、ES008、ES011、S02、S09、Z006、Z008、ZN1等(通过引用的方式将其全部内容合并入本文)。血管内皮抑制素功能性变体还包括PCT国际公开号WO2016/070798中公开的那些血管内皮抑制素突变体，如003、007、Z101、009、S03、36、249、381、57、114、124、125、160、163、119(通过引用的方式将其全部内容合并入本文)。

本文所述的“血管内皮抑制素”还可以是天然血管内皮抑制素或其功能性变体的衍生物或修饰产物，例如聚乙二醇修饰产物，其具有与天然血管内皮抑制素基本相同的生物学功能，例如抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的活性。

在本发明的一些实施方案中，所述“血管内皮抑制素”可以是天然人血管内皮抑制素的衍生物，例如由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人ES得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与ES的N-末端α-氨基。

本文所述的“DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是DNA-PK复合物的催化亚基，属于磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶家族(PIKK)的成员，在非同源末端连接(NonhomologousEnd Joining，NHEJ)修复中起到核心作用。

本文所述的“诱导DNA双链断裂的治疗方案”可以是任何形式的治疗方案，只要该治疗方案可以最终导致DNA双链断裂。所述治疗方案可以是例如直接使DNA发生双链断裂的治疗方案。所述治疗方案还可以是例如使DNA发生单链断裂，由此最终导致DNA双链断裂的治疗方案。所述治疗方案还可以是例如导致染色体损伤，由此最终导致DNA双链断裂的治疗方案。所述治疗方案还可以是例如通过DNA-PKcs抑制导致DNA双链断裂的治疗方案。所述治疗方案可以是放射治疗，或化疗药物，可以是一种化疗药物或更多种不同化疗药物的组合，或者还可以是一种或更多种化疗药物和放射治疗的联合治疗方案。

诱导DNA双链断裂的放射治疗方案是本领域众所周知的，可以通过任何适合的技术进行放射治疗，包括但不限于电磁辐射或电离辐射等，电磁辐射可以是例如X-射线、gamma射线，电离辐射可以是例如电子束等。放射治疗的剂量测定方法也是本领域众所周知的。

本文使用的术语“化疗药物”是指对肿瘤或癌症具有治疗作用的化合物。本发明中可以使用的化疗药物是可以诱导DNA双链断裂的化疗药物，例如可以是拓扑异构酶II抑制剂、烷化剂、铂类复合物、博来霉素或阿霉素，例如但不限于依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

本发明中，血管内皮抑制素可以和诱导DNA双链断裂的治疗方案联合使用，用于治疗肿瘤或癌症。所述肿瘤或癌症是适合于使用诱导DNA双链断裂的治疗方案治疗的肿瘤或癌症。

本文所述的“p53”是一种抑癌基因，该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，被称为P53。正常P53的生物功能类似于“基因组卫士(guardian of the genome)”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性，如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡；如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，导致P53蛋白失去正常功能，则对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。

可使用本文所述的药物或治疗方案治疗的肿瘤或癌症可以是P53功能缺失的。P53功能缺失的肿瘤或癌症包括其中部分或全部细胞的P53功能缺失的肿瘤或癌症。P53功能缺失的细胞可以是P53功能完全缺失的肿瘤或P53功能部分缺失的细胞。P53功能完全缺失例如可以是与P53为野生型的细胞相比，P53的生物学功能完全丧失。P53功能部分缺失例如可以是与P53为野生型的细胞相比，P53的生物学功能部分丧失或减弱。P53功能缺失的细胞例如可以是与正常细胞相比，P53蛋白的表达和/或活性减少或被破坏，例如可以通过其编码核酸的突变，或者通过编码其调控因子的核酸的突变导致。P53蛋白的表达和/或活性减少或被破坏可以表现为P53蛋白不存在、P53蛋白完全失活、P53蛋白的量减少或P53蛋白功能降低。所述“突变”可以包括一个或更多个核苷酸的插入、缺失或取代。

在P53功能完全缺失的细胞中，对于放射治疗或化疗药物不敏感，这是因为虽然放射治疗或化疗药物在细胞中造成DNA损伤，使得DNA-PKcs信号通路被激活，通过非同源末端连接途径介导DNA损伤修复，但因P53功能缺失，Caspase不容易被激活，DNA-PKcs存在的情况下可以及时修复损伤，使得细胞对治疗方案具有一定抗性，不容易产生凋亡。血管内皮抑制素可以抑制DNA-PKcs的活性，使得促进DNA损伤在细胞中积累，促进细胞凋亡。因此，对于使用放射治疗或化疗药物等诱导DNA双链断裂的治疗方案进行治疗的P53功能缺失的细胞，特别是肿瘤或癌症细胞来说，血管内皮抑制素能够增加这些细胞对于诱导DNA双链断裂的治疗方案的敏感性，促进诱导DNA双链断裂的治疗方案对于它们的治疗效果。

对于P53功能不缺失(即P53功能正常)的细胞，细胞对于放射治疗或化疗药物比较敏感，在凋亡的早期DNA-PKcs就会被P53通路所激活的Caspase-3所降解，血管内皮抑制素并不能明显增加其敏感性，但由于血管内皮抑制素能够抑制DNA-PKcs活性，因此血管内皮抑制素的使用可以减少放射治疗或化疗药物等诱导DNA双链断裂的治疗方案的剂量。所述“减少诱导DNA双链断裂的治疗方案的剂量”是指与单独使用该诱导DNA双链断裂的治疗方案相比，当与血管内皮抑制素联合使用时诱导DNA双链断裂的治疗方案的应用剂量可以更小，但还可以达到同样的治疗效果。或者说，当所述诱导DNA双链断裂的治疗方案与血管抑制素联用时，其应用剂量不超过在单独使用该诱导DNA双链断裂的治疗方案时通常应用的剂量。

当所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是放射治疗时，所述剂量是指放射剂量。单独进行放射治疗通常应用的剂量可以是例如1-100Gy。当放射治疗与血管内皮抑制素联合应用时，与单独进行放射治疗相比，放射剂量可以减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者甚至90％。

当所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是化疗药物时，所述剂量是指化疗药物施用剂量。当化疗药物与血管内皮抑制素联合应用时，与单独施用化疗药物相比，化疗药物的施用剂量可以减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者甚至90％。

对于使用诱导DNA双链断裂的治疗方案进行治疗的P53功能部分缺失的细胞来说，血管内皮抑制可以兼有上述两种效果，既能增加这些细胞对于诱导DNA双链断裂的治疗方案的敏感性，促进诱导DNA双链断裂的治疗方案对于它们的治疗效果，又可以减少诱导DNA双链断裂的治疗方案的剂量。

本发明的药物组合物、联用药物或药盒中的血管内皮抑制素的量，或者本发明的应用或方法中的血管内皮抑制素的量，是能够有效抑制肿瘤细胞中的DNA-PKcs的量。

本文中所述的肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤，肿瘤细胞的倍增是不受控制和进行性的组织细胞生长。这种生长中的一些是良性的，但另一些是“恶性的”并且可导致生物体死亡。恶性肿瘤除了展现出侵袭性的细胞增殖外，它们还可侵润周围的组织并转移。本文中所述的癌症通常包括恶性实体瘤，以及白血病、淋巴瘤和通常不作为肿瘤块存在而是分布在血管或淋巴网状系统中的其他癌症。

利用本发明的方案对肿瘤或癌症的治疗是通过诱导细胞凋亡实现的，因此本发明方案对肿瘤或癌症的治疗效果与肿瘤细胞或癌细胞来源并无密切联系，而与细胞的分子分型有关，例如适合于用本发明的方法治疗的肿瘤或癌症可以是P53缺失的。可利用本发明的方案治疗的肿瘤或癌症包括但不限于实体瘤/恶性肿瘤、粘液样和圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌症、人软组织肉瘤(包括尤因氏肉瘤)、癌转移物(包括淋巴转移物)、鳞状上皮细胞癌(尤其是头颈鳞状上皮细胞癌、食管鳞状上皮细胞癌)、口腔癌、血细胞恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤)、白血病(包括急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病)、渗出性淋巴瘤(基于体腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤、肺癌(包括小细胞癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质的癌症、产生ACTH的肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌(包括小细胞癌和导管癌)、胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌)、与结肠直肠瘤形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、泌尿系统癌症(包括膀胱癌，包括原发性浅表膀胱肿瘤、膀胱的浸润性移行细胞癌和肌肉浸润性膀胱癌)、前列腺癌、雌性生殖道的恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮细胞肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵泡实体癌)、雄性生殖道的恶性肿瘤(包括睾丸癌和阴茎癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、脑癌(包括内源性脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑肿瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中的转移肿瘤细胞浸润)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑色素瘤、人皮肤角质细胞的进行性肿瘤、鳞状细胞癌)、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、腹膜渗漏、恶性胸膜渗漏、间皮瘤、维尔姆斯肿瘤、胆囊癌、滋养层瘤、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。在一些实施方案中，本发明的方案适用于治疗非小细胞肺癌或黑色素瘤。

本发明中所述的“治疗”或“治疗效果”包括例如抑制或减少肿瘤或癌症细胞的生长、浸润或转移等，或者减轻症状、延长生存期等。

本文所述的受试者可以包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如仓鼠、大鼠、小鼠)、犬类(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马、猪、牛、绵羊、山羊、灵长类动物(例如黑猩猩、猿或候)、或人。本文所述的细胞可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如仓鼠、大鼠、小鼠)、犬类(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马、猪、牛、绵羊、山羊、灵长类动物(例如黑猩猩、猿或候)、或人的细胞。

本发明中，血管内皮抑制素的施用和诱导DNA双链断裂的治疗方案可以同时进行或顺序进行。当顺序进行时，可以先施用血管内皮抑制素，再进行诱导DNA双链断裂的治疗方案，或者可以先进行诱导DNA双链断裂的治疗方案，再施用血管内皮抑制素。

本发明还提供抑制生物样品中的DNA-PKcs活性的方法，包括使血管内皮抑制素与所述生物样品接触。其中所述的“生物样品”指活生物体外的样品，包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；以及血液、唾液、尿、粪便、精液、泪液或其他体液或它们的提取物。对生物样品中的DNA-PKcs活性的抑制可用于本领域技术人员已知的多种目的。实例包括但不限于在生物测定法中抑制DNA-PKcs。在一个实施例中，抑制生物样品中的DNA-PKcs活性的方法局限于非治疗方法。

本文所使用的术语“药学可接收的载体”是指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。

本文使用的术语“联用药物”或“联用”包括联用的各种药物或治疗方案的各种具体组合形式。例如当不同的药物联用时，联用的各种药物可以以混合物或复合物的形式存在，也可以分别以单独的实体存在，同时给受试者施用或者顺序给受试者施用。当药物和非药物性治疗方案联用时，该药物和该治疗方案可以同时给受试者施用或顺序给受试者施用。

本文的药物组合物、血管内皮抑制素和/或诱导DNA双链断裂的治疗方案可以以治疗有效量施用。所使用的术语“治疗有效量”指的是足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明中，血管内皮抑制素的治疗有效量例如可以是能够有效抑制肿瘤细胞中的DNA-PKcs的量。本发明中，药物组合物、血管内皮抑制素和/或诱导DNA双链断裂的治疗方案的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，对于药物组合物、血管内皮抑制素和/或化疗药物来说，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分，对于放射治疗来说，典型的日剂量范围可以是1-5Gy。

本发明所提供的药物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径给受试者施用本发明的药物组合物、血管内皮抑制素和/或化疗药物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。

本发明提及的各种方法，可以在体内进行或在体外进行。

本发明提及的各种方法，可以是非治疗性的。

除非另有说明，否则本说明书中所使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。通常，本说明书中所使用的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学有关的命名及其技术是本领域公知和常用的。

除非另有说明，否则本说明书中所使用的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法和本说明书中所阐述的或引用的各种参考文献中所述的方式来进行。

实施例

以下实施例中，所使用的血管内皮抑制素是大肠杆菌表达的重组天然人血管内皮抑制素，来自北京普罗吉生物科技发展有限公司(Protgen)，其具有下述的氨基酸序列：

MHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK；其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

所使用的ZBP-Endostatin是在以上天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸(MGGSHHHHH)而得到的血管内皮抑制素变体(Fu Y et al.Biochemistry 2010，49，6420-6429)。由北京普罗吉生物科技发展有限公司(Protgen)提供，其氨基酸序列如下所示：

MGGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK；其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

所使用的PEG-Endostatin是聚乙二醇(PEG)修饰的天然人血管内皮抑制素，它是一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个上述天然人血管内皮抑制素分子得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与Endostatin N-末端α-氨基。由北京普罗吉生物科技发展有限公司(Protgen)提供。

非小细胞肺癌H1299(P53缺失型)、A549(P53野生型)细胞系以及黑色素瘤MDA-MB-435S(P53突变型)和A375(P53野生型)细胞系购自国家实验细胞资源共享平台(ChinaInfrastructure of Cell Line Resource)；P53稳定过表达的H1299细胞系(H1299-P53)和P53稳定敲低的A549细胞系(A549-NC)利用慢病毒试剂盒(购自上海Genepharma公司)构建，其中用于敲低的A549细胞中P53的shRNA所靶向的P53序列为5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3’。病毒转染及稳定细胞株构建方法按试剂盒说明书进行。H1299-NC和A549-NC分别是用空白慢病毒转染H1299细胞和A549细胞获得的稳定细胞系。

实施例1、Endostatin与DNA-PKcs直接相互作用。

本实施例所用的CNBr-activated Sepharose 4B购自Sigma。首先，按说明书操作将Endostatin及牛血清白蛋白(BSA)分别偶联CNBr-activated Sepharose 4B上，与A549细胞裂解液孵育，将pull down的蛋白进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，通过质谱分析鉴定，发现DNA-PKcs是Endostatin的一个相互作用蛋白(图1A)。之后免疫印迹实验证明H1299和A549细胞裂解液中的DNA-PKcs蛋白，都可被偶联Endostatin的CNBr-activatedSepharose 4B沉淀下来(图1B)。进一步验证二者的相互作用，用Endostatin孵育H1299和A549细胞2小时使其内吞。将细胞裂解液与DNA-PKcs的抗体混合孵育，再与蛋白A/G beads共孵育，免疫印迹检测验证Endostatin可以被DNA-PKcs共沉淀下来，反向证明了二者的相互作用(图1C)。

实施例2、Endostatin抑制化药诱导的肿瘤细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

本实施例选用已知的DNA-PKcs的底物AKT和P53作为检测指标，验证Endostatin对于DNA-PKcs通路的抑制作用。将肿瘤细胞(包括非小细胞肺癌H1299和A549细胞)分为六个处理组。第一组：阴性对照；第二组：Etoposide(10μM，1h)处理；第三组，Endostatin(10μg/ml，1h)处理；第四组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，1h)联合处理；第五组，NU7026(10μM，1h)处理；第六组，NU7026(10μM，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，1h)联合处理。其中NU7026为DNA-PKcs抑制剂。免疫印迹结果显示(图2，其中p-DNA-PKcs(S2056)表示DNA-PKcs的磷酸化水平，S2056表示其磷酸化位点；其中p-AKT(S473)表示AKT的磷酸化水平，S473表示其磷酸化位点；其中p-P53(S15)表示P53的磷酸化水平，S15表示其磷酸化位点)，与对照组相比，Etoposide处理激活了DNA-PKcs信号通路水平；Endostatin处理不影响DNA-PKcs信号通路水平；Endostatin和Etoposide联合用药抑制了Etoposide对DNA-PKcs信号通路的激活。NU7026处理不影响DNA-PKcs信号通路水平；NU7026和Etoposide联合用药抑制了Etoposide对DNA-PKcs信号通路的激活。

实施例3、Endostatin延缓DNA-PKcs介导的DNA损伤修复。

本实施例中用γH2AX的水平来反映DSBs损伤程度。将肿瘤细胞(包括H1299和A549细胞)被分为八个处理组。第一组：阴性对照，0小时收集细胞；第二组：Etoposide(10μM)处理1h后收集细胞；第三组，Etoposide(10μM)处理1h后换成新鲜培养基，2小时后收集细胞；第四组，Etoposide(10μM)处理1h后换成新鲜培养基，5小时后收集细胞；第五组至第八组首先用Endostatin(10μg/ml)对细胞进行预处理1h，随后的处理分别对应第一组至第四组的处理方式。免疫印迹结果显示，第一组至第四组，Etoposide处理细胞所产生的DNA损伤随着培养基中除去药物之后慢慢得到修复，5小时后γH2AX水平回到基线。而第五组至第八组，Endostatin的联合用药延缓了γH2AX水平的降低，证明细胞中对于DSBs损伤的修复被延缓(图3)。

实施例4、Endostatin调控肿瘤细胞化疗敏感性依赖于DNA-PKcs的存在。

本实施例中将肿瘤细胞(包括H1299和A549细胞)分为八个处理组。前四组细胞转染对照siRNA，后四组细胞转染特异性敲低DNA-PKcs的siRNA。DNA-PKcs的siRNA序列为：正向5’-CAGGGUUUAAUCAGAAUAUTT-3’，反向5’-AUAUUCUGAUUAAACCCUGTT-3’。siRNA转染方法按转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行。随后对这八组细胞进行给药处理。第一组和第四组：对照组；第二组和第五组，Endostatin(10μg/ml，16h)处理；第三组和第六组：Etoposide(H1299为10μM，A549为1μM，16h)处理；第四组和第八组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(H1299为10μM，A549为1μM，16h)联合处理。收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。A549细胞为P53野生型细胞，H1299细胞为P53缺失型细胞。结果显示，A549细胞对于化疗药物更为敏感，在引起同等凋亡程度的情况下处理H1299细胞的Etoposide浓度相比A549细胞高出很多，在此基础上加入Endostatin会进一步促进Etoposide引发的细胞凋亡(图4)。而当敲低DNA-PKcs之后，Endostatin促进Etoposide诱导凋亡的作用则被削弱。

实施例5、Endostatin协同Etoposide抑制P53缺失型肿瘤细胞的活性。

首先利用慢病毒试剂盒(购自上海Genepharma公司)构建P53稳定过表达的H1299细胞系(H1299-P53)和P53稳定敲低的A549细胞系(A549-NC)。用于敲低的A549细胞中P53的shRNA所靶向的P53序列为5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3’。病毒转染及稳定细胞株构建方法按试剂盒说明书进行。将构建好的肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)接种到96孔板(每孔1000个细胞)，分为八个处理组。第一组至第四组向每个孔中添加含有不同浓度Etoposide(0μM，0.1μM，1μM，10μM)的培养基。第五组至第八组首先用含有10μg/mlEndostatin的培养基预处理1h，再加入含有不同Etoposide浓度的培养基使得第五组至第八组Etoposide的终浓度分别0μM，0.1μM，1μM，10μM。处理12小时后，用正常培养基替换含有药物的培养基，继续培养72小时。根据CCK8试剂盒(Dojindo，Tokyo，Japan)说明书测定细胞活性。结果显示，对于P53缺失型肿瘤细胞(图5A和D)，Endostatin可以增强Etoposide对肿瘤细胞的毒性。而对于P53功能正常的肿瘤细胞(图5B和C)，Etoposide可以显著抑制肿瘤细胞的活性，Endostatin对于Etoposide的抑制作用没有明显的增强效果。

实施例6、Endostatin协同Etoposide抑制P53缺失型肿瘤细胞的生存。

将肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)分为四个处理组。第一组：阴性对照；第二组，Endostatin(10μg/ml，16h)处理；第三组：Etoposide(1μM，16h)处理；第四组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(1μM，16h)联合处理。处理结束后，用胰酶消化，计数，重新铺于六孔板中，每孔1000个细胞。正常培养基培养14天，生成细胞集落。细胞集落计数结果显示，对于P53缺失型肿瘤细胞(图6A和D)，Endostatin可以增强Etoposide对于肿瘤细胞集落生成能力的抑制作用，降低肿瘤细胞的生存能力。而对于P53功能正常的肿瘤细胞(图6B和C)，Etoposide可以显著抑制肿瘤细胞的集落生成能力，Endostatin对于Etoposide的抑制作用没有明显的增强效果。

实施例7、Endostatin协同Etoposide促进P53缺失型肿瘤细胞的凋亡。

将肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)分为四个处理组。第一组：阴性对照；第二组，Endostatin(10μg/ml，16h)处理；第三组：Etoposide(10μM，16h)处理；第四组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，16h)联合处理。收集培养基中漂浮的凋亡细胞和贴壁细胞，将细胞悬浮于500μl含有0.05mg/ml碘化丙啶(PI)的PBS中，室温避光染色15min，流式上机进行检测(BD FACS Calibur)，PI阳性的细胞代表凋亡细胞。结果显示，对于P53缺失型肿瘤细胞(图7A和D)Endostatin可以增强Etoposide促进肿瘤细胞凋亡的功能。而对于P53功能正常的肿瘤细胞(图7B和C)，Etoposide可以显著促进肿瘤细胞的凋亡，Endostatin对于Etoposide的促凋亡效果没有明显的增强作用。

实施例8、Endostatin协同Doxorubicin抑制P53缺失型肿瘤细胞的活性。

本实施例选用另一种化学药物Doxorubicin，验证Endostatin可以增强P53缺失型肿瘤细胞对化疗的敏感性。操作过程同实施例5。结果显示，对于P53缺失型肿瘤细胞(H1299-NC和A549-shP53)(图8A和D)，Endostatin可以增强Doxorubicin对于肿瘤细胞的毒性。而对于P53功能正常的肿瘤细胞(H1299-P53和A549-NC)(图8B和C)，Doxorubicin可以显著抑制肿瘤细胞的活性，Endostatin对于Doxorubicin的抑制作用没有明显的增强效果。

实施例9、Endostatin协同Etoposide的抑制作用适用于其他类型肿瘤细胞。

本实施例选用另外一种肿瘤类型(黑色素瘤)的两个细胞系，MDA-MB-435S(P53突变型)和A375(P53野生型)细胞系，验证Endostatin对P53状态不同的其它类型肿瘤细胞化疗敏感性的调控功能。操作过程同实施例5。结果显示，对于MDA-MB-435S细胞(图9A和D)，Endostatin可以增强Etoposide对于肿瘤细胞的毒性。而对于A375细胞(图9B和C)，Etoposide可以显著抑制肿瘤细胞的活性，Endostatin对于Etoposide的抑制作用没有明显的增强效果。

实施例10、Endostatin抑制DNA-PKcs对细胞损伤的修复，诱导P53缺失型肿瘤细胞的凋亡通路激活和DNA-PKcs的降解。

有研究显示DNA-PKcs是Caspase-3的底物，激活状态的Caspase-3会剪切DNA-PKcs使其降解(T.Itoh et al.Journal of dermatological science，2001；25，72-77，K.M.Henkels et al.Cancer research，1997；57，4488-4492)。本实施例中，我们将肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)分为六个处理组。第一组：阴性对照；第二组，Endostatin(10μg/ml，16h)处理；第三组：Etoposide(10μM，16h)处理；第四组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，16h)联合处理；第五组，z-DEVD-fmk(10μM，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，16h)联合处理；第六组，z-DEVD-fmk(10μM)和Endostatin(10μg/ml)先于Etoposide 1h加入，然后加入Etoposide(10μM，16h)联合处理。其中z-DEVD-fmk为caspase-3抑制剂。免疫印迹检测DNA-PKcs，PARP，γH2AX和Caspase-3信号通路。结果(如图10所示，其中p-DNA-PKcs(S2056)表示DNA-PKcs的磷酸化水平，S2056表示其磷酸化位点)显示，与对照组相比，无论是P53缺失型肿瘤细胞(图10A和D)还是P53功能正常的肿瘤细胞(图10B和C)，Endostatin均不影响上述信号通路水平；对于P53缺失型肿瘤细胞，Etoposide对上述信号通路没有明显影响；Endostatin和Etoposide联合用药相比Etoposide明显促进了Caspase-3的激活，DNA-PKcs和PARP的降解，γH2AX有明显增加；z-DEVD-fmk与Etoposide联合用药对上述信号水平没有明显影响；z-DEVD-fmk可以一定程度逆转Endostatin和Etoposide的协同效果。对于P53功能正常的肿瘤细胞，Etoposide单独处理以及Endostatin和Etoposide联合用药都观察到明显的Caspase-3的激活，DNA-PKcs和PARP的降解，以及γH2AX的增加；z-DEVD-fmk与Etoposide联合用药一定程度逆转了Etoposide的作用效果；z-DEVD-fmk，Endostatin和Etoposide联合用药组显示，由于z-DEVD-fmk逆转了Etoposide的作用，DNA-PKcs的蛋白水平得到恢复，Endostatin与Etoposide的协同作用又一定程度得到体现。

实施例11、Endostatin协同Etoposide上调P53缺失型肿瘤细胞中促凋亡分子的表达。

将肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)分为四个处理组。第一组：阴性对照；第二组，Endostatin(10μg/ml，16h)处理；第三组：Etoposide(10μM，16h)处理；第四组，Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，16h)联合处理。细胞按上述处理结束后，提取细胞总RNA，通过荧光定量Real-Time PCR检测细胞中BAX，NOXA，PUMA，P21的mRNA水平的相对变化。所用引物如下表所示。

结果显示，对于P53缺失型肿瘤细胞(图11A和D)Endostatin可以增强Etoposide对促凋亡分子的上调功能。而对于P53功能正常的肿瘤细胞(图11B和C)，Etoposide可以显著上调以上促凋亡分子，Endostatin对于Etoposide的促凋亡效果没有明显的增强作用。

实施例12、Endostatin增强Etoposide对P53缺失型肿瘤生长的抑制作用。

将肿瘤细胞(H1299-NC，H1299-P53，A549-NC，A549-shP53)接种至6-8周龄裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下。将荷瘤裸鼠随机分为四组，每组6-8只，进行不同的给药处理。第一组：阴性对照；第二组，Endostatin(20mg/kg，腹腔注射，每天一次)给药处理；第三组，Etoposide(2mg/kg，腹腔注射，两天一次)给药处理；第四组，Endostatin(20mg/kg，腹腔注射，每天一次)和Etoposide(2mg/kg，腹腔注射，两天一次)联合给药。每隔一天测量肿瘤体积大小。给药2-4周后，处死小鼠，取出肿瘤组织备用。结果显示，在P53缺失型小鼠肿瘤模型中(图12A和D)，与对照组相比，Endostatin抑瘤率为19.6％(H1299-NC，第19天)和37.1％(A549-shP53，第27天)；Etoposide抑瘤率为28.0％(H1299-NC，第19天)和39.3％(A549-shP53，第27天)；Endostatin与Etoposide联合用药对于抑制肿瘤生长具有协同作用，抑瘤率为66.9％(H1299-NC，第19天)和65.8％(A549-shP53，第27天)；在P53功能正常的小鼠肿瘤模型中(图12B和C)，与对照组相比，Endostatin抑瘤率为33.8％(H1299-P53，第19天)和40.9％(A549-NC，第27天)；Etoposide抑瘤率为30.0％(H1299-P53，第19天)和34.0％(A549-NC，第27天)；Endostatin不能增强Etoposide抑制肿瘤生长的作用，联合用药抑瘤率为37.7％(H1299-P53，第19天)和32.2％(A549-NC，第27天)。

实施例13、Endostatin与Etoposide联合使用对延长P53缺失型荷瘤小鼠生存期具有协同效应。

培养处于旺盛增殖状态的H1299和A549细胞，接瘤、分组及给药方式同实施例12。25天后停止给药，每天记录小鼠生存情况，绘制小鼠生存曲线。结果显示，在H1299小鼠肿瘤模型中(图13A)，与对照组相比，Endostatin处理组中位生存期比对照组延长24.2％；Etoposide处理组中位生存期比对照组延长30.3％；Endostatin与Etoposide联合用药对于延长小鼠生存期具有协同作用，中位生存期比对照组延长72.7％；在P53功能正常的小鼠肿瘤模型中(图13B)，与对照组相比，Endostatin处理组和Etoposide处理组都能一定程度延长小鼠生存时间，Endostatin与Etoposide联合用药对于延长小鼠生存期并没有协同作用。

实施例14、Endostatin协同Etoposide抑制P53缺失型肿瘤的增殖和DNA-PKcs的表达水平。

将实施例12中取出的肿瘤组织，固定包埋，切片。采用免疫荧光技术，对肿瘤组织中的PCNA(表示肿瘤细胞旺盛增殖状态的标志分子)和DNA-PKcs蛋白进行染色，通过激光共聚焦显微镜(Nikon A1)观察并成像。实验结果如图14所示，其中蓝色为DAPI染的细胞核，绿色表示DNA-PKcs蛋白，红色表示PCNA蛋白。以图14A显示的H1299-NC肿瘤组织为例，左一列为DNA-PKcs单染，绿色的面积代表DNA-PKcs蛋白表达水平。左二列为DNA-PKcs(绿色)和细胞核(蓝色)merge的结果，重叠部分显示为青色。左三列为PCNA单染，红色的面积代表PCNA蛋白表达水平，表示肿瘤细胞增殖状态的强弱。左四列为PCNA(红色)和细胞核(蓝色)merge的结果，重叠部分显示为紫色。同样的，图14B，C，D分别显示了H1299-P53，A549-NC和A549-shP53肿瘤组织中PCNA和DNA-PKcs表达情况，图中蛋白染色和图像排列顺序与图12A相一致。定量结果显示，在P53缺失型小鼠肿瘤模型中(图14A和D)，与对照组相比，Endostatin和Etoposide都能一定程度削弱肿瘤细胞增殖状态，降低DNA-PKcs的蛋白水平；Endostatin与Etoposide联合用药可以协同发挥功能，相比Etoposide处理组能更加显著抑制肿瘤的增殖和DNA-PKcs的蛋白水平；在P53功能正常的小鼠肿瘤模型中(图14B和C)，与对照组相比，Endostatin，Etoposide，以及Endostatin和Etoposide联合用药都能削弱肿瘤细胞增殖状态，降低DNA-PKcs的蛋白水平，Endostatin并没有增强Etoposide对于肿瘤增殖的抑制功能和对DNA-PKcs的蛋白水平的影响。

实施例15、ZBP-Endostatin以及PEG-Endostatin抑制化药诱导的肿瘤细胞中DNA-PKcs信号通路的激活。

本实施例通过检测DNA-PKcs和AKT的激活水平，验证ZBP-Endostatin以及PEG-Endostatin对于DNA-PKcs通路的抑制作用。将肿瘤细胞(包括H1299和A549细胞)分为六个处理组。第一组：阴性对照；第二组：Etoposide(10μM，1h)处理；第三组，ZBP-Endostatin(10μg/ml，1h)处理；第四组，ZBP-Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，1h)联合处理；第五组，PEG-Endostatin(10μg/ml，1h)处理；第六组，PEG-Endostatin(10μg/ml，先于Etoposide 1h加入)与Etoposide(10μM，1h)联合处理。免疫印迹结果显示(图15)，在H1299与A549细胞中，与对照组相比，Etoposide处理激活了DNA-PKcs信号通路水平(如图中p-DNA-PKcs(S2056)和p-AKT(S473)的免疫印迹结果所示，其中p-DNA-PKcs(S2056)表示DNA-PKcs的磷酸化水平，S2056表示其磷酸化位点，其中p-AKT表示AKT的磷酸化水平，S473表示其磷酸化位点)；ZBP-Endostatin或PEG-Endostatin和Etoposide联合用药抑制了Etoposide对DNA-PKcs信号通路的激活。

Claims (7)

1.血管内皮抑制素在制备用于增加细胞对于诱导DNA双链断裂的治疗方案的敏感性的药物中的应用，其中所述细胞是P53功能缺失的，其中所述诱导DNA双链断裂的治疗方案是施用化疗药物，所述细胞是肿瘤细胞。

2.权利要求1的应用，其中所述细胞是癌症细胞。

3.权利要求2的应用，其中所述癌症细胞是非小细胞肺癌细胞或黑色素瘤细胞。

4.权利要求1-3任一项的应用，其中所述化疗药物是依托泊苷(Etoposide)或阿霉素(Doxorubicin)。

5.权利要求1-3任一项的应用，其中所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

6.抑制生物样品中的DNA-PKcs活性的、非治疗目的的方法，包括使血管内皮抑制素与所述生物样品接触，其中所述生物样品是活生物体外的样品。

7.权利要求6的方法，其中所述血管内皮抑制素是：

天然人血管内皮抑制素；

在天然人血管内皮抑制素的N-末端添加了9个额外氨基酸MGGSHHHHH而得到的血管内皮抑制素变体，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除；或者

由一个分子量为20kDa的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰一个天然人血管内皮抑制素得到的产物，偶联的位点是活化的mPEG-ALD醛基与天然人血管内皮抑制素的N-末端α-氨基。

Images